KR20060011646A - 유전자 변형 생물체 진단용 ｄνａ 칩, 칩을 포함하는키트 및 키트를 이용한 진단 방법 - Google Patents

유전자 변형 생물체 진단용 ｄνａ 칩, 칩을 포함하는키트 및 키트를 이용한 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 변형 생물체(LMO, Living Modified Organism)을 검출하기 위한 DNA 칩, 칩을 포함하는 키트 및 키트를 이용한 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 DNA칩을 이용하면 신속하고 정확하게 유전자 변형 생물체의 외래 유전자를 정성 및 정량적으로 검출할 수 있으므로, 수입농산물의 통관 및 유전자 변형 작물 판정에 널리 활용될 수 있다.
유전자 변형 생물체(LMO), DNA 칩, 유전자 변형 생물체 진단 키트

Description

유전자 변형 생물체 진단용 ＤΝＡ 칩, 칩을 포함하는 키트 및 키트를 이용한 진단 방법{DNA chip for diagnosing living modified organism, kit comprising the chip and diagnostic method using the kit}
도 1은 DNA 칩상의 탐침의 배열도를 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 DNA 칩을 이용하여 유전자 변형 생물체를 검출한 결과를 보여 주는 사진이다.
도 3은 유전자 변형 생물체 유래 유전자의 농도에 따른 본 발명의 DNA 칩의 민감도를 보여주는 결과이다(패널 1: 2*10 카피, 패널 2: 2*102 카피, 패널 3: 2*103 카피, 패널 4: 2*104 카피, 패널 5: 2*105 카피, 패널 6: 2*106 카피, 패널 7: 2*107 카피, 패널 8: 2*108 카피, 패널 9: 2*109 카피).
본 발명은 유전자 변형 생물체(LMO, living modified organism) 진단용 DNA 칩, 칩을 포함하는 키트 및 키트를 이용한 진단방법에 관한 것이다.
유전자 변형 생물체(LMO) 또는 GMO(Genetically modified organism)는 현대 생명공학을 이용하여 얻어진 새로운 유전물질의 조합을 포함하고 있는 모든 살아있는 생물체(Living Organism)를 의미하는 것으로, 일반적으로 유전자 변형 생물체의 생산성을 증가시키기 위하여 제초제 저항성, 내충성, 알칼리토양 내성, 내병성, 내한성 등에 관련된 유전자를 농산물에 도입하고 있다.
유전자변형 생물체는 주로 미국, 캐나다, 아르헨티나 등지에서 생산되고 있다. 가장 많이 상업화 되어 있는 유전자 변형 생물체로는 옥수수, 토마토, 면화, 콩, 감자 등이 있으며 그 밖에 다른 작물에도 넓게 적용되고 있는데, 유전자 변형 생물체 생산에 있어 최대 규모를 자랑하는 몬산토는 '라운드-업'이라는 제초제에 내성인 유전자 조작 콩인 '라운드-업-레디'를 개발하였다. 듀퐁, 다우케미칼, 노바티스와 같은 화학회사들 역시 동일한 목적으로 유전자 변형 농산물을 개발하고 있으며, 현재 세계적으로, LMO나 GMO의 재배면적은 늘어나고 있는 추세이다. 이는 LMO가 특별한 농약을 사용하지 않고서도 일반 작물보다 높은 생산량을 보이기 때문이다. 또한, 특별한 유전자의 삽입을 통해 생산성의 증가 및 원하는 특정 단백질을 많이 생산할 수 있는 기능성 작물을 만들기 유용하기 때문에, 유전자 변형 생물체는 가히 유전적인 혁명으로 받아들여지고 있다.
현재 유전자 변형 생물체에 도입된 외부 유전자로는 EPSPS(enolpyruvylshikimate-3-phophate synthase), PAT(Phosphinothricin acetyl transferase) 및 BT(Bacillus thuringiensis)의 cry(crystal 단백질) 계열의 유전자 등이 가장 대표적이다. EPSPS 유전자는 글리포세이트(glyphosate)라는 제초제 에, PAT 유전자는 글루포시네이트(gluphosinate)라는 제초제에 내성을 갖도록 하는 유전자이며, cry 계열 유전자는 해충 저항성을 갖도록 하는 유전자이다(Harrison 등, (1996), The Journal of Nutrition 126:728-740; Crickmore 등, (1998), Microbiology and molecular biology reviews. Sept p.807-813). 상기 유전자를 포함하는 유전자 변형 생물체에는 글리포세이트/해충 내성 옥수수(Agrobacterium sp. 종 CP4 EPSPS 유전자 + Ochrobactrum anthropi의 glyphosphate oxidoreductase 유전자 포함, 몬산토사), 글리포세이트 내성 면실(Agrobacterium spp. CP4 EPSPS 유전자 포함), 글리포세이트 내성 캐놀라(Agrobacterium spp. CP4 EPSPS 유전자 포함), 글루포시테이트 내성 옥수수(Streptomyces hygroscopicus의 phophinothricin acetyl hydrolase 유전자 포함, Dekalb Genetics Corp.), 글루포시네이트 내성 캐놀라(Streptomyces virodochromogenes의 PAT 유전자 포함, Agevo Inc.), 글로포시네이트 내성 옥수수(Streptomyces virdochromogenes의 PAT 유전자 포함), 해충 내성 옥수수(cryIA(b) 유전자 포함, 몬산토사), 해충 내성 감자(cryIII A 유전자 포함, 몬산토사), 해충 내성 옥수수(cryIA(b) 유전자 포함, Northrup King), 해충 내성 옥수수(cryIA(b) 유전자 포함, Ciba-Geigy Corp.) 등이 있다.
그러나, 외래유전자의 삽입을 통해 얻어진 작물의 잠재적 인체 및 환경 위해성에 대한 논란이 끊이지 않고 있는 현실이다. 이러한 위해성에 대한 논란이 계속 되는 이유는 LMO 산물이 전통 작물 또는 식품과는 동일하지 않다는 가정에서 출발한다. 이러한 이유로 인하여, 현재 세계 여러 곳에서는 자국의 이익 및 국민보건을 위해 GMO의 수입 등을 철저히 관리하는 중에 있다. 우리나라도 1999년 농수산 물품질관리법 개정과 2000년 유전자변형농산물표시요령 고시에 의하여 콩, 옥수수, 콩나물에 대하여 표시제를 시행하였고(유전자변형농산물표시요령(농림부고시 제2000-31호)), 가공식품의 경우 2000년 식품위생법 개정과 유전자재조합 식품 등의 표시기준 고시에 의하여 농림부에서 표시하도록 지정한 콩, 옥수수, 콩나물을 주요 원재료로 사용하여 제조 또는 가공한 27개 품목의 가공식품에 대하여 표시제를 시행하도록 하여 비의도적 혼입 허용치(현재와 같은 관리체계 하에서 자연교잡, 수송 또는 보관 등의 과정에서 GMO가 섞일 수 있는 최대 허용량)를 농산물에서는 3%이하로, 가공 식품에 있어서는 최종 제품에 대해서 허용치를 설정하지 않고 농산물의 허용치(3%)를 준용하는 규정을 의무사항으로 두고 있다.
또한 최근 각종 농산물의 수입이 예전과는 다르게 많이 개방됨에 따라, 외국에서 들여오는 농산물의 양도 점점 더 늘어가고 있는 실정이다. 따라서 수입된 농산물마다 검역을 하는 것 또한 큰 문제가 되고 있으며, 인력이 더욱더 확충되어야 하는 실정이다.
현재 많이 사용하고 있는 GMO 검사는 효소면역학적 방법(ELISA)과 PCR법으로 크게 나눌 수 있다(Rolf 등, (1999), Food Control 10; 391-399). 또는 유전자 변형 농작물의 경우에는 제초제 처리 등에 의한 생물학적 검정방법도 적용할 수 있다.
효소면역학적 방법은 유전자 변형 작물에 도입된 유전자에 의해 생산되는 단백질을 특이적으로 인지하는 항체를 이용하여 진단하는 방법이나, 도입된 유전자가 발현되지 않는 기관의 경우에는 진단이 불가능하며, 검출감도가 PCR 검정법에 비해 떨어지고, 열처리 등으로 단백질의 변성이 생길 수 있는 식품류에서의 검출에는 한계를 가지고 있다.
PCR 검정법은 GMO에 도입된 유전자 조절부위 또는 도입 유전자의 단편을 특이적으로 증폭하는 기술로 원료 농산물은 물론 가공품에서도 검정이 가능하며 0.01%까지 검정이 가능하다. 1차적으로 PCR(중합연쇄축합반응)을 이용한 유전자의 단일 검사로서 GMO에 도입된 외부 유전자의 발현을 조절하는 프로모터나 전사종결부에 대한 특이 프라이머로 PCR하여 검정하고 있으며, 1차에서 검출이 된 경우, 2차에서 좀더 정확한 GMO 포함여부를 확인하기 위해 실시간 PCR(Real time PCR)을 이용한 방법을 사용한다(Wurz 등, (1999), Food Control 10; 385-389; Farid 등, (2002) Detection of genetically modified organisms in foods. Trends in Biotechnology Vol.20 No5; 215-223). 그러나, 이 방법은 각각의 GMO 유전자를 확인하기 위해 각각의 탐침을 이용하여 각각의 튜브에서 반응을 시키고 겔상에서 확인해야 하므로, 많은 양의 검체 유전자와, 인력 등이 필요하며, PCR 반응 완료 후 겔 상에서 증폭된 유전자 산물을 구별하기 위해서는 유전자 산물의 크기가 각각 구별되어야 하는 제약이 있다.
따라서 이와 같은 방법을 보완하여, 보다 빠르고 정확하며 용이하게 GMO 유전자가 첨가여부를 확인할 수 있는 방법이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 신속하고 정확하며 용이하게 유전자 변형 생물체를 정성 및 정량적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하였다.
본 발명은 유전자 변형 생물체의 외래 유전자 서열과 특이적으로 결합할 수 있는 탐침이 프린팅됨을 특징으로 하는, 유전자 변형 생물체 진단용 DNA 칩에 관한 것이다.
또한 본 발명은 유전자 변형 생물체의 외래 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 탐침을 포함하는 DNA 칩을 포함하는 유전자변형 생물체를 진단하는 키트에 관한 것이다.
본 발명은 상기 키트를 이용하여 유전자 변형 생물체를 진단하는 방법에 관한 것이다 .
하나의 양태로서, 본 발명은 유전자 변형 생물체의 외래 유전자 서열과 특이적으로 결합할 수 있는 탐침을 포함하는 유전자 변형 생물체 진단용 DNA 칩에 관한 것이다.
본원에서 사용한 용어 "유전자변형 생물체(LMO, living modified organism)" 또는 "GMO"는 현대 생명공학(Modern Biotechnology)을 이용하여 얻어진 새로운 유전물질의 조합을 포함하고 있는 모든 살아있는 생물체(Living Organism)를 의미하는 것으로, 외래 유전자가 도입된 생물체 전체 또는 외래 유전자가 기관, 조직 엑스플란트(explnat), 종자, 화분과 같은 생물체의 일부를 포함하며, 옥수수, 토마토, 면화, 콩, 감자, 벼, 캐놀라, 고추 등이 있다.
본원에 사용된 용어 "DNA 칩(chip)"이란 고체 지지체 상에 구획으로 나누어져 분리된 일정한 영역을 가지는 1차 또는 2차의 배열(array)을 말하는 것으로, 일반적으로 수천 혹은 수만개 이상의 핵산이나 단백질 등을 일정 간격으로 배열하고 분석 대상 물질을 처리하여 그 결합 양상을 분석할 수 있는 바이오칩을 의미한다. DNA 칩의 밀도는 고체 지지체 표면에 위치한 검출하고자 하는 핵산의 총수에 따라 결정되는데, 50/cm2이상이 바람직하며, 100/cm2이상이 더욱 바람직하고 500/cm2 이상이 보다 바람직하다. 본 발명의 고체 지지체의 일정 위치에 유전자 변형 생물체의 외래 유전자 서열과 특이적으로 결합할 수 있는 탐침을 프린팅하면 각 탐침의 위치를 알 수 있기 때문에 검출하고자 하는 시료에서 분리된 DNA가 특정 위치에서 결합하는 것을 확인하여 유전자 변형 생물체의 존재 여부 및 그 품종을 확인할 수 있다. DNA 칩은 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 제조할 수 있다(Lee 등, (2002), Molecular and Cells Vol. 14. No. 2. ; 192-197).
본원에서 사용된 용어 "프린팅"은 다양한 올리고뉴클레오타이드 탐침을 DNA 칩에 고정시키는 것을 의미하며 용어 "스포팅"과 혼용된다.
DNA 칩의 제조방법은 유전자 변형 생물체의 외래 유전자 또는 그의 일부를 포함하는 10개 내지 60개, 바람직하게는 16 내지 22개의 염기서열로 된 올리고뉴클레오타이드 탐침을 제공하는 단계; 상기 탐침을 고체 지지체의 표면에 결합시키는 단계를 포함함을 특징으로 한다. 보다 상세하게는, 5' 말단에 15개의 dTTP, 6개의 CH2 사슬 및 아민(amine)기가 연결된 유전자 변형 생물체의 외래 유전자 일부서열을 포함하는 10개 내지 60개, 바람직하게는 16 내지 22개의 염기서열로 된 올리고뉴클레오타이드 탐침을 제공하는 단계; 상기 탐침을 알데히드가 결합된 고체의 표면에 시프염기(Schiff's base)반응을 통해 결합시키는 단계; 및 상기 DNA 탐침이 결합된 고체표면에서 아민과 결합하지 않고 남아 있는 알데히드를 환원시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 고체 지지체는 유리, 전기적 장치(electronic devices), 실리콘, 플라스틱, 실리카, 금속 또는 이들의 혼합물을 재료로 하여 슬라이드, 컴팩트 디스크, 겔 층, 마이크로 비드 형태로 제조할 수 있으며, 바람직하게는, 유리 슬라이드이며 추가적으로 바코드 또는 마커 등을 포함하도록 할 수 있다. 본 발명에서는 탐침과 결합이 가능하도록 알데히드 그룹을 표면에 갖는 지지체를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 탐침으로서 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 알데히드가 결합된 고체 지지체 표면상에 고정화시키기 위하여 한 쪽 말단이 아미노 그룹을 가지도록 변형될 수 있다. 탐침은 올리고뉴클레오타이드 및 지지체 사이에 스페이서를 통해 고정화 될 수 있으며, 고정화된 올리고뉴클레오타이드는 본 발명의 PCR 산물과 효율적으로 보합(hybridization)시킬 수 있다. 스페이서는 올리고뉴클레오타이드 및 지지체 사이에 상당한 스페이서를 제공하는 한 특정의 것에 제한되지 않으며, 예를 들어 보합되는 PCR 산물과 상보성이 없는 핵산 또는 알킬 쇄를 사용할 수 있다. 알킬 사슬을 스페이서로 사용하는 경우, 3개 이상, 바람직하게는 6개 이상의 탄소 원자를 갖는 알킬 사슬을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 구체적으로 5' 말단에 15개의 dTTP, 6개의 CH2 사슬 및 아민(amine)기를 포함하는 16 내지 22개의 염기서열로 된 올리고뉴클레오타이드 탐침을 사용할 수 있다 (Guo 등, Nucleic Acids Research, 1994, 22(24), p.5456 내지 5465).
스페이서를 도입하는 방법은 특정의 것에 한정되지 않으며, 스페이서가 이미 결합된 올리고뉴클레오타이드를 사용하거나, 스페이서를 지지체 상에 도입한 후 올리고뉴클레오타이드를 고정화하거나 또는 스페이서를 갖는 커플링 시약을 사용하여 올리고뉴클레오타이드를 지지체 상에 고정화할 수 있다.
본 발명에서는 구체적으로 탐침의 아민기와 지지체 상의 알데히드기가 공유결합을 형성하는 시프염기(Schiff's base)반응을 통해 결합시킨 후 아민과 결합하지 않고 남아 있는 알데히드를 환원시킴으로써 탐침을 지지체에 고정화시킨다. 알데히드를 환원시키는 조건은 특별히 제한되는 것은 아니나 NaBH4 등의 환원제를 사용함이 바람직하다.
본 발명에서는 유전자 변형 농작물은 이에 한정되지는 않지만, 바람직하게는 에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS, enolpyruvylshikimate- 3-phophate synthase), 포스피노트리신 아세틸 전이효소(PAT, phosphinothricin acetyl transferase) 또는 CryI, CryII, CryIII류, 특히 CryIA(b), Cry9C와 같은 크리스탈 단백질(CRY, crystal 단백질) 유전자 운반체가 도입된 농작물일 수 있다. 예를 들어 라운드업 레디 콩(RRS), 비티11(BT11), 이벤트176(Event176), 몬810(Mon810), 스타링크(Starlink), 제에이21(GA21), 티25(T25) 옥수수 등의 품종을 진단할 수 있다.
라운드업 레디 콩(RRS)은 epsps 유전자 운반체(CaMV 35S 프로모터-클로로플라스트 타게팅 펩타이드-epsps-노팔린 합성효소 전사 종결자(Tnos))를 포함하는 글리포세이트 저항성 콩 품종이다. 비티11(BT11)는 pat 유전자 운반체(CaMV 35S 프로모터-adh1-1S IVS2-합성 pat-Tnos) 및 cryIA(b) 유전자 운반체(CaMV 35S 프로모터-adh1-1S IVS6-합성 cryIA(b)-Tnos)를 가진 해충 및 글루포스네이트 저항성 옥수수 품종이며, 이벤트176(Event176)은 하나 이상의 cryIA(b) 유전자 운반체(PEPC 프로모터-cryIA(b) 및 CDPK 프로모터-cryIA(b)를 포함하는 해충 저항성 옥수수이다. 또한, 몬810(Mon810) 옥수수는 cryIA(b) 유전자 운반체(CaMV 35S 프로모터-옥수수 열 충격 단백질 70(hsp70) intron#1-합성 cryIA(b)-Tnos)를 포함하는 해충 저항성을 가지며, 스타링크(Starlink)는 Cry9C 유전자 운반체(CaMV 35S 프로모터-cry9C-노팔린 합성효소 전사 종결자(Tnos))를 포함하는 해충 저항성 옥수수이다. 지에이21(GA21)은 epsps 유전자 운반체(rice actin 1 프로모터-rice actin 1 intron-optimized targeting peptide-변형된 epsps-Tnos)가 포함된 글리포세이트(glyphosate) 저항성 옥수수 품종이며, 티에이25(TA25) 옥수수는 pat 유전자 운반체(CaMV 35S 프로모터-pat-CaMV 35S 터미네이터)를 가진 글루포시네이트 저항성을 지닌다.
따라서, 본 발명에서는 상기 유전자 변형 생물체의 외래 유전자 운반체에 특이적으로 결합하는 탐침을 선택할 수 있으며, 예를 들어 표 1의 탐침을 이용할 수 있다. 본원에서 사용한 '유전자 운반체'란 농작물에 도입된 외래 유전자를 포함하 여 상기 유전자가 상기 농작물에서 발현가능하도록 연결된 프로모터, 터미네이터, 기타 발현조절서열 등을 포함하는 DNA 서열을 의미한다.
탐침의 종류: 유전자 변형 품종 탐침의 위치 서열번호
탐침 1: BT11 adhl-1S 유전자의 뒷부분 서열번호 1
탐침 2: Event176 PEPC 프로모터 유전자의 뒷부분 서열번호 2
탐침 3: RRS EPSPS 유전자의 중간부분 서열번호 3
탐침 4: Mon810 CryIA(b) 유전자의 중간부분 서열번호 4
탐침 5: Starlink Cry9C 유전자의 중간부분 서열번호 5
탐침 6: GA21 m-EPSPS 유전자의 중간부분 서열번호 6
탐침 7: T25 35S 프로모터의 뒷부분 및 PAT 유전자의 앞부분 서열번호 7
DNA 칩상에는 보합 반응 이후 형광검출 여부를 확인하기 위한 양성대조군으로 cy5-dCTP로 라벨링된 효모의 스파이크 100(spike 100) 유전자를 프린팅할 수 있다. 또한, 비유전자 변형 생물체(non-LMO)의 내재 유전자를 양성 대조군으로 하여 프린팅할 수 있으며, 예를 들어 콩의 경우에는 렉틴(lectin) 유전자 또는 그의 일부, 옥수수의 경우에는 제인(Zein) 유전자 또는 그의 일부를 DNA 칩에 프린팅할 수 있다.
하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소(EPSPS), 포스피노트리신 아세틸 전이효소(PAT), CryI, CryII, CryIII류, 특히 CryIA(b), Cry9C와 같은 크리스탈 단백질(CRY) 계열 유전자 운반체 서열을 포함하는 탐침이 프린팅됨을 특징으로 하는, 유전자 변형 생물체, 예를 들어 EPSPS, PAT 또는 CryI, CryII, CryIII류, 특히 CryIA(b), Cry9C와 같은 CRY 유전자 운반체가 도입된 유전자 변형 생물체 진단용 DNA 칩을 제공한다. 상기 DNA 칩을 사용하여 진단 가능한 유전자 변형 생물체로는 예를 들어, 콩, 옥수수, 토마토, 감자 또는 면화, 벼, 캐놀라, 고추 등, 바람직하게는 라운드업 레디 콩(RRS), 비티11(BT11), 이벤트176(Event176), 몬810(Mon810), 스타링크(Starlink), 지에이21(GA21), 티25(T25) 옥수수 등을 들 수 있다.
바람직하게는, 본 발명은 서열번호 1 내지 7로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 탐침을 포함함을 특징으로 하는, 유전자 변형 생물체 진단용 DNA 칩을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명의 유전자 변형 생물체의 외래 유전자 서열과 특이적으로 결합할 수 있는 탐침을 포함하는 유전자 변형 생물체 진단용 DNA 칩을 사용하여 유전자 변형 생물체를 진단하는 방법을 제공한다.
바람직한 한 양태로서, 유전자 변형 생물체로부터 DNA를 추출하는 단계; 추출한 DNA를 주형으로 하여 외래 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍 및 형광표식된 데옥시 뉴클레오타이드를 가하여 증폭시키는 단계; 증폭된 DNA를 단일가닥으로 분리하는 단계; 단일가닥으로 분리된 DNA를, 유전자변형 생물체의 외래유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 탐침을 포함하는 DNA 칩과 보합반응시키는 단계; 및 보합된 DNA 칩에 보합된 탐침부위를 검사하는 단계를 포함하여, 유전자 변형 생물체를 진단하는 방법을 제공한다. 상기 DNA 칩은, 바람직하게는 서열번호 1 내지 7로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 탐침을 포함함을 특징으로 하는, 유전자 변형 생물체 진단용 DNA 칩일 수 있다.
본 발명의 유전자 변형 생물체 진단용 DNA 칩을 이용하여 유전자 변형 생물체의 포함여부를 확인하는 방법을 단계별로 나누어 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
제1단계: 유전자 변형 생물체로부터 DNA를 추출하는 단계
유전자 변형 생물체는 생물체의 종류에 한정되지 않고 본 발명에 따라 유전자 변형 여부를 진단할 수 있다. 바람직하게는 유전자 변형 농산물, 예를 들어 콩, 옥수수, 쌀, 씨앗 등의 각종 농산물의 뿌리, 줄기, 잎, 종자, 열매 또는 꽃 부위, 또는 콩나물, 두부, 두유 등 가공식품에서 DNA를 분리할 수 있다.
유전자 변형을 갖는 생물체로 추정되는 시료로부터 분리하는 핵산은 바람직하게는 게놈 DNA이고, 이를 추출하는 방법은 PCR을 위한 주형으로서 충분히 양질의 것을 얻을 수 있다면 추출방법에 제한이 있지 않으며, 예를 들면 DNA의 분리 정제에 필요한 모든 시약이 갖추어져 있고, 칼럼 타입의 정제 시스템을 사용하여 빠른 시간 내에 간편하게 고순도의 DNA를 분리 정제할 수 있는 상업용 추출키트, 예를 들어 수퍼푸드-프렙 플랜트 키트(SureFood-PREP Plant kit, Congen, Germany) 또는 퀴아젠 플랜트 맥시 키트(QIAGEN Plant Maxi kit, QIAGEN GmbH) 등을 사용하는 것이 가능하다.
제2단계: 시료 DNA의 증폭
시료 작물로부터 추출된 DNA를 주형으로 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 증폭은 당분야에서 잘 알려진 PCR, RT-PCR, LCR, CPT, NASBA 등의 증폭 방법에 따라 실시할 수 있으며, 바람직하게는 PCR의 방법일 수 있다. PCR에 사용되는 프라이머는 유전자 변형 작물에 특이적인 재조합 DNA 서열 전체 또는 그의 일부를 포함하는 영역을 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 사용할 수 있다. 프라이머는 검출하고자 하는 목적 생물체에 따라 달라질 수 있으며, 프라이머에 따라 PCR 반응 조건이 달라질 수 있다. 상기 프라이머는 프라이머의 GC% 및 Tm에 따라 PCR 반응 조건을 조절할 수 있고, 가장 최적의 반응 조건에서 PCR될 수 있는 프라이머인 것이 바람직하다.
프라이머 설계를 위해서 유전자 변형 생물체 내의 재조합 DNA 서열 정보를 아는 것이 필요한데, 재조합 DNA 서열은 반드시 전체 서열을 알아야 하는 것은 아니며 목표로 하는 영역의 근처 DNA 서열을 아는 것으로 충분하다. 재조합 DNA 서열은 많은 경우 그 서열이 알려져 있으나 서열이 알려져 있지 않은 경우에는 필요한 부분의 DNA 서열 분석(sequencing)을 통해 그 서열을 알 수 있다. 유전자 변형 생물체에 특이한 프라이머 쌍을 설계하는 경우에 두 종류 이상의 DNA 서열에 걸친 서열영역, 예를 들어 CaMV 35S 프로모터와 cryIA(b) 유전자에 걸친 서열 영역이 증폭되도록 하여 특이성이 높은 프라이머 쌍을 얻도록 하는 것이 바람직하다. 각 프라이머 쌍은 목적하는 특정 서열을 선택적으로 증폭하는 한 어떠한 프라이머 쌍이라도 사용이 가능하며, 증폭된 산물은 150 내지 250 bp의 크기를 가지고 GC 함량이 40 내지 60%인 것이 바람직하다.
본 발명에 사용된 프라이머 및 탐침는 당분야에 잘 알려진 화학적 합성 또는 효소적 방법으로 제조할 수 있거나 천연 생성된 핵산을 화학적 또는 효소적으로 처리하여 제조할 수 있다.
본 발명에서는 구체적 프라이머의 예로 콩 또는 옥수수에 도입된 epsps, pat, cryIA(b) 유전자, 그의 프로모터 또는 터미네이터 서열 등의 도입된 서열을 이용하여 제조할 수 있으며 가능한 프라이머로서 다음의 예를 들 수 있다.
i) RRS를 검출하기 위한 PCR을 수행하기 위하여 바람직하게는, EPSPS에 특이적인 서열번호 10 및 서열번호 19의 프라이머 쌍으로 증폭시킬 수 있다.
ii) 비티11(BT11)의 경우는, 바람직하게는 adhl-1S 부위에 특이적인 서열번호 12 및 CryIA(b) 부위에 특이적인 서열번호 21 프라이머 쌍으로 증폭시킬 수 있다.
iii) 이벤트176(Event176)을 검출하기 위한 PCR을 수행하기 위하여 바람직하게는 PEPC 프로모터 부위에 특이적인 서열번호 13 및 CryIA(b) 부위에 특이적인 서열번호 22 프라이머 쌍으로 증폭시킬 수 있다.
iv) 몬810(Mon810)을 검출하기 위한 PCR을 수행하기 위하여 CryIA(b)부위에 특이적인 서열번호 14 및 서열번호 23 프라이머 쌍을 이용하는 것이 바람직하다.
v) 스타링크(Starlink)를 검출하기 위한 PCR을 수행하기 위하여 바람직하게는 Cry9c 부위에 특이적인 서열번호 15 및 서열번호 24 프라이머 쌍으로 증폭시킬 수 있다.
vi) 지에이21(GA21)을 검출하기 위한 PCR을 수행하기 위하여 바람직하게는 변 형된 EPSPS 부위에 특이적인 서열번호 16 및 서열번호 25 프라이머 쌍으로 증폭시킬 수 있다.
vii) 티에이25(TA25)를 검출하기 위한 PCR을 수행하기 위하여, 35S 프로모터 부위에 특이적인 서열번호 17 및 PAT 부위에 특이적인 서열번호 26 프라이머 쌍으로 증폭시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 탐침 또는 프라이머는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드가 결실, 삽입, 치환 등에 의해 그 서열이 서열번호 1 내지 27과 상이하더라도 탐침 또는 프라이머와 보합하는 DNA 서열과 보합이 가능한 유사체를 포함한다.
본 발명은 유전자 변형 생물체의 양성 대조군 프라이머와 여러 종류의 유전자 운반체 검출용 프라이머를 혼합하여 동시에 멀티플레스 PCR을 수행하여 한번에 여러 종류의 프라이머를 사용하여 특정 유전자 변형 생물체를 검출하는 것이 가능하다. 이 경우 여러 종류의 프라이머 모두에 대한 공통의 PCR 반응조건을 설정해야 하므로 단독 PCR의 경우보다 더 엄격한 반응 조건이 요구된다. 본 발명에서는 95℃에서 5 분간 초기 변성시킨 후, 95℃에서 30초간 변성, 54℃에서 15초간 어닐링(annealing), 72℃에서 20초간 익스텐션(extension)을 40 사이클 수행한 후, 72℃ 7분 반응시키는 것이 바람직하다.
또는, 본 발명의 유전자 변형 생물체 검출용 프라이머는 본 발명의 DNA 칩을 사용하는 방법에 의하지 않고, 공지의 PCR 검정법에 따라 유전자 변형 생물체를 검출하는데 이용할 수도 있다.
본 발명의 진단방법에서 양성 대조군으로 사용하기 위해 농작물 자체에 내재 하는 유전자를 함께 증폭시킬 수 있으며, 상기 내재 유전자로서 콩의 경우 렉틴(lectin), 옥수수의 경우는 제인(zein) 등을 선택할 수 있다. 내재 유전자 검출용 프라이머는 당업계에 알려진 방법으로 설계하여 제조할 수 있으며, 한 예로 본 발명에서는 렉틴의 경우 렉틴 유전자의 1140 bp에서부터 1311 bp 까지의 위치를 증폭시킬 수 있는 서열번호 11 및 서열번호 20, 제인의 경우는 제인 유전자의 242 bp에서부터 414 bp 까지의 위치를 증폭시킬 수 있는 서열번호 18 및 서열번호 27를 사용할 수 있다.
프라이머는 미리 라벨링된 채로 제조되거나 증폭단계에서 라벨링된 뉴클레오타이드를 도입하게 함으로써 라벨링시킬 수 있다. 라벨은 Cy3, Cy5 또는 Cy7과 같은 형광색소를 사용할 수 있거나 방사성 라벨링 또는 특정 리간드(스트렙타비딘 또는 항체)에 의해 인식될 수 있는 작은 분자로 라벨링할 수 있다. 본 발명에서는 구체적으로 시아닌 5(Cyanine 5) dCTP를 사용하여 증폭단계에서 형광을 도입할 수 있다.
제 3단계: 증폭된 DNA를 가공하는 단계
증폭된 DNA 산물을 단일가닥으로 분리한다. 이때, 단일가닥으로 분리하는 방법이 특별히 제한되는 것은 아니나, 효소를 이용하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 본 발명의 람다 엑소누클레아제 (lambda exonuclease)를 이용할 수 있다. 람다 엑소누클레아제(lambda exonuclease)를 사용하기 위해서 각각의 프라이머 쌍 의 센스쪽에 인산기를 붙인 변형된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하는 것이 바람직하다. 증폭된 PCR 산물에 람다 엑소누클레아제(lambda exonuclease)를 사용하면 인산기를 발견하여 그 인산기만이 붙은 한쪽 DNA 산물만을 제거하여 단일가닥으로 분리할 수 있다.
제 4단계: 보합(hybridization) 반응시키는 단계
단일가닥으로 분리된 DNA를 DNA 칩에 적용하여 보합 반응시킨다. 보합반응의 강도는 양 핵산간의 상보적인 정도, 형성된 하이브리드의 Tm, 반응조건의 가혹도(stringency), 핵산의 GC 함량에 의해 결정될 수 있다. 시료에서 얻은 DNA와 DNA 칩상의 핵산과 보합하고 세척하는 방법은 변성제, 온도, 또는 염의 농도 등을 변화시키면서 통상의 방법으로 적절한 조건을 찾아 행할 수 있다.
제 5단계: 보합된 탐침부위를 검사하는 단계
보합된 DNA 칩을 세척하고, 스캐너를 이용하여 DNA 칩에 보합된 탐침부위를 검사한다. 시료 DNA와 DNA 칩상의 탐침와 보합여부를 확인하는 방법은 시료에서 분리한 DNA를 라벨링한 방법에 따라 다르나, DNA 칩을 세척하여 보합되지 않은 유전자를 제거한 후 보합된 유전자를 레이저 형광 분석기 등 고해상도의 형광스캐너로 검사할 수 있다. 본 발명에서는 구체적으로 시아닌 5(Cyanine 5) dCTP를 사용 하여 라벨링하므로 667nm의 파장에서 스캔하여 보합여부를 검출할 수 있다.
본 발명의 DNA 칩은 유전자 변형 생물체로 도입된 유전자의 종류뿐만 아니라 검출 신호의 강도를 측정할 수 있으므로 정성 및 정량 분석에 이용할 수 있다. 본 발명에서는 변형 유전자의 카피수가 2*10 이하인 경우에도 검출할 수 있다(실시예3). 또한, 본 발명의 DNA 칩을 이용한 진단 방법은 여러 프라이머를 사용하므로 동시에 외래 유전자를 검사할 수 있어 신속하며, PCR 산물의 크기가 유사하여 겔 상에서는 유전자 변형 생물체의 품종이 구별이 되지 않는 경우에도 진단이 가능한 장점이 있다. 또한 다양한 시료를 분석하여야 할 경우, 이에 맞는 탐침을 제작한다면 한번의 실험으로 동시에 정확한 분석을 할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 유전자변형 생물체의 외래유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 탐침을 가지는 DNA 칩을 포함하는 유전자변형 생물체를 진단하는 키트를 제공한다.
바람직한 한 양태로서, 에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소(EPSPS), 포스피노트리신 아세틸 전이효소(PAT), 크리스탈 단백질(CRY) 계열 유전자 운반체 서열과 특이적으로 결합할 수 있는 탐침이 프린팅됨을 특징으로 하는, EPSPS, PAT 또는 CRY 계열 유전자 운반체가 도입된 유전자 변형 생물체 진단용 DNA 칩을 포함하는 유전자 변형 생물체를 진단하는 키트를 제공한다.
더 상세하게는 서열번호 1 내지 7로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 탐침을 포함하는 DNA 칩, 시료로부터 채취한 DNA를 증폭시키기 위한 프라이머 쌍, 증폭산물을 표식화 시킬수 있는 형광 표식된 데옥시뉴클레오타이드 및 증폭산물을 단일가닥으로 분리하기 위한 람다 엑소누클레아제를 포함하는 유전자변형 생물체 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트에서, 프라이머쌍은 서열번호 1에 대해서는 서열번호 12 및 21의 프라이머 쌍, 서열번호 2에 대해서는 서열번호 13 및 22의 프라이머 쌍, 서열번호 3에 대해서는 서열번호 10 및 19의 프라이머 쌍, 서열번호 4에 대해서는 서열번호 14 및 23의 프라이머 쌍, 서열번호 5에 대해서는 서열번호 15 및 24의 프라이머 쌍, 서열번호 6에 대해서는 서열번호 16 및 25의 프라이머 쌍 및 서열번호 7에 대해서는 서열번호 17 및 26의 프라이머 쌍인 것이 바람직하며, 형광 표식된 데옥시뉴클레오타이드는 Cy5-dCTP인 것이 바람직하다.
또다른 구체적 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 7로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 탐침을 포함하는 유전자 변형 생물체 진단용 DNA 칩, 및 서열번호 1에 대해서는 서열번호 12 및 21의 프라이머 쌍, 서열번호 2에 대해서는 서열번호 13 및 22 프라이머 쌍, 서열번호 3에 대해서는 서열번호 10 및 19의 프라이머 쌍, 서열번호 4에 대해서는 서열번호 14 및 23의 프라이머 쌍, 서열번호 5에 대해서는 서열번호 15 및 24의 프라이머 쌍, 서열번호 6에 대해서는 서열번호 16 및 25의 프라이머 쌍 및 서열번호 7에 대해서는 서열번호 17 및 26의 프라이머 쌍으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 유전자변형 생물체 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 유전자변형 생물체를 진단하는 키트를 이용하여 유전자변형 생물체를 진단하는 방법을 제공한다.
바람직한 한 양태로서, 유전자 변형을 갖는 생물체로 추정되는 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 추출한 DNA를 주형으로 하여 키트 내의 외래 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍 및 형광표식된 데옥시 뉴클레오타이드를 가하여 증폭시키는 단계; 람다 엑소뉴클레아제로 증폭된 DNA를 단일가닥으로 분리하는 단계; 단일가닥으로 분리된 DNA를, 유전자변형 생물체의 외래유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 탐침을 포함하는 DNA 칩과 보합반응시키는 단계; 및 보합된 DNA 칩에 보합된 탐침부위를 검사하는 단계를 포함하여, 유전자 변형 생물체를 진단하는 방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. DNA 칩의 제조
실시예 1-1. 탐침의 제조
유전자 변형 생물체를 검출하기 위하여 유전자 변형 생물체 특이 유전자 부위를 포함하는 18 내지 22mer의 염기서열을 가지는 단일 염기사슬(선별용 탐침)과 대조군으로 각각의 작물에 공통적으로 존재하는 내재 유전자, 렉틴(유전자 accession 번호; K00821) 또는 제인(유전자 accession 번호; AY103536)의 특이 부위를 포함하는 단일 염기사슬(대조군용 탐침)을 제노텍사(대한민국, 대전소재)에 의뢰하여 제작하였다. 각각의 단일 염기사슬은 5' 말단에 15개의 티민(dTTP), 6개의 CH2 사슬 및 아민(amine)기를 포함하도록 탐침을 제작하였다. 상기 탐침의 염기서열은 표2와 같다:
선별용 탐침
탐침 번호: 유전자 변형 품종 탐침 염기 서열 탐침 위치 서열번호
탐침 1: BT11 5'-(T)15-TGTGAACCCAAAAGACCACAA-3' adhl-1S 유전자의 뒷부분 서열번호 1
탐침 2: Event176 5'-(T)15-CATTGATCACCAATCGCATCG-3' PEPC 프로모터 유전자의 뒷부분 서열번호 2
탐침 3: RRS 5'-(T)15-GCAAATCCTCTGGCCTTTCC-3' EPSPS 유전자의 중간부분 서열번호 3
탐침 4: Mon810 5'-(T)15-CAAATCGAGCAGCTCATCAAC-3' CryIA(b) 유전자의 중간부분 서열번호 4
탐침 5: Starlink 5'-(T)15-GTCGTTCAGGTAGCTCCTGC-3' Cry9C 유전자의 중간부분 서열번호 5
탐침 6: GA21 5'-(T)15-AGCGTGACCGCTACACTTG-3' 변형된 EPSPS 유전자의 중간부분 서열번호 6
탐침 7: T25 5'-(T)15-CCGCTGAAATCACCAGTCTC-3' 35S 프로모터의 뒷부분 및 PAT 유전자의 앞부분 서열번호 7
대조군용 탐침
탐침 번호: 내재 유전자 탐침 염기 서열 서열번호
탐침 8: Lectin 5'-(T)15-TGGGACAAAGAAACCGGTAG -3' 서열번호 8
탐침 9: Zein 5'-(T)15-CCCACAATGCTCACAAGCTC -3' 서열번호 9
실시예 1-2. DNA 칩의 제조
실시예 1-1에서 작제된 탐침들을 완충용액(350mM sodium bicarbonate, pH 9.0)에 각각 50μM 농도로 용해시키고, 알데히드가 도포된 슬라이드(silylated slide, CSS-100, CEL, Houston, TX, USA) 표면에 도 1에서 나타낸 위치에 어레이어(MicroGrid II, BioRobotics, USA)를 이용하여 크기 150㎛, 간격 400㎛으로 프린팅한 후, 알데히드기와 프로브의 5' 말단의 아민기가 반응하여 물이 생성되면서 공유결합이 형성되는 시프염기(Schiff base) 반응을 수행하였다. 이어, 0.2%(w/v) 소디움 도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS)용액과 3차 증류수를 이용하여 순차적으로 세척한 다음, NaBH4 용액(0.1g NaBH4, 30㎖ phosphate buffered saline (PBS), 10㎖ ethanol)에 15분 동안 침지하여, 아민이 결합되지 않은 알데히드 잔기를 환원시킨 후, 3차 증류수로 세척하고 상온에서 건조시켜 DNA 칩을 제조하였다.
cy5-라벨링된 양성 대조군으로서 효모의 고유한 유전자인 spike 100 유전자(PCR product, Incyte)를 TA 클로닝 벡터(pGEM-T-Easy vector, promega)에 클로닝하여, 이를 주형으로 하고 이를 증폭할 수 있는 T7 프라이머 및 SP6 프라이머(promega)를 이용하여 cy5-dCTP로 라벨링하면서 PCR 증폭한 후 그 산물을 상기와 동일한 방법으로 프린팅하였다. 농도는 10 uM로서 약 2 nl 정도의 양이 프린팅되도록 하였다.
실시예 2. DNA 칩을 이용한 LMO의 검출
실시예 2-1. 시료에서 게놈 DNA 추출
식물에서 게놈 DNA를 추출하는 SureFood-PREP Plant 키트(Congen, Germany)를 사용하여 시료의 게놈 DNA를 분리하였다. 간략히 설명하면 다음과 같다. 라운드업 레디 콩(RRS, 비티11(BT11), 이벤트(Event176), 몬810(Mon810) 옥수수는 유럽 표준과학연구소(벨기에)에서 제작한 GMO 표준시료를 플루카사(Fluka Co. LTD)를 통해 구입하여 건조시키고 분쇄하여 가루로 만든 후 그 중 10mg을 95℃로 끓여 용해시키고, 키트의 작은 원심분리 컬럼을 이용하여 단백질을 제거한 후, DNA와 결합하는 작은 레진을 이용하여 DNA를 분리하였다. 이후, 다시 작은 원심분리 컬럼을 이용하여 불순물들을 제거한 후, 마지막으로 수득 버퍼를 이용해서 DNA만을 분리해 내었다. 분쇄한 작물가루 약 10 mg로부터 약 2ug의 DNA를 얻을 수 있었다.
실시예 2-2. DNA에서 멀티플렉스(multiplex) PCR을 이용한 목표 DNA 증폭 및 가공
유전자 재조합 콩 및 옥수수의 외래에서 도입된 유전자에 특이하게 결합할 수 있는 프라이머를 사용하여 유전자 재조합 콩 및 옥수수의 외래 유전자를 증폭시키고 단일가닥으로 제조하였다.
0, 1 또는 2%의 Mon810, BT11, Event176 옥수수 및 라운드업 레디 콩의 특이 유전자 증폭을 위한 각각의 멀티플렉스 PCR 믹스의 조성은 다음과 같다:
콩의 경우, 게놈 DNA 주형 200 ng, 서열번호 11/20의 렉틴(Lectin) 프라이머 쌍 0.1uM, 서열번호 10/19의 RRS 프라이머 쌍 0.8uM, 0.25mM dAGT, 10 uM dCTP, 1 uM Cy5-dCTP, 0.2M 베타인, 7.5 mM 트리스-HCl(pH 9.0), 0.2 mM MgCl2, 5 mM KCl, 2 mM (NH4)2SO4, 택 중합효소(Taq Polymerase(ultratools, Spain)) 1 U.
0, 1 또는 2%의 유전자 재조합 옥수수 Mon810, BT11 또는 Event176의 특이 유전자 증폭을 위한 각각의 멀티플렉스 PCR 믹스의 조성은 다음과 같다:
게놈 DNA 주형 200 ng, 서열번호 18/27의 제인(zein) 프라이머 쌍 0.1 uM, 서열번호 12/21의 BT11 프라이머 쌍 0.4 uM, 서열번호 13/22의 이벤트176(Event176) 프라이머 쌍 0.4 uM, 서열번호 14/23의 몬810(Mon810) 프라이머 쌍 0.4 uM, 서열번호 15/24의 스타링크(Starlink) 프라이머 쌍 0.2 uM, 서열번호 16/25의 GA21 프라이머 쌍 0.3 uM, 서열번호 17/26의 T25 프라이머 쌍 0.3 uM, 0.25mM dAGT, 10 uM dCTP, 1 uM Cy5-dCTP, 0.2M 베타인, 7.5 mM 트리스-HCl(pH 9.0), 0.2 mM MgCl2, 5 mM KCl, 2 mM (NH4)2SO4, 택 중합효소(Taq Polymerase(ultratools, Spain)) 1 U.
상기 믹스에서 베타인의 농도가 0.2M인 경우 멀티플렉스 프라이머 사이에 이형체(dimer)형성이 가장 적어서 최적의 PCR 조건을 얻을 수 있었다.
사용된 프라이머 중 센스프라이머는 5' 방향에 인산기를 붙였으며, 이 때 사용한 프라이머의 염기서열은 표 3와 같다.
콩작물용 센스 프라이머 길이
RRS 5'-AGGATTTCAGCATCAGTGG-3'(서열번호10) 251 bp
Lectin 5'-GTGACCTCCTCGGGAAA-3'(서열번호 11) 172 bp
콩작물용 안티센스 프라이머
RRS 5'-GCCTTCCTTACGGATCCT-3'(서열번호 19)
Lectin 5'-TGTCAGGGGCATAGAAGGTG-3'(서열번호 20)
옥수수작물용 센스 프라이머
BT11 5'-CAGCTAGGAAGTTCGGTT-3'(서열번호 12) 207 bp
Event176 5'-ACGACTCCCCATCCCTA-3'(서열변호 13) 165 bp
Mon810 5'-GACATCATCTGGGGCATC-3'(서열번호 14) 236 bp
Starlink 5'-GAAGTCCACAGCGGTG-3'(서열번호 15) 167 bp
GA21 5'-CTGGCGTAATAGCGAAGA-3'(서열번호 16) 177 bp
T25 5'-CCAGTTAGGCCAGTTACC-3'(서열번호 17) 153 bp
Zein 5'-GCTCCTTGGTCTTTCTGC-3'(서열번호 18) 173 bp
옥수수작물용 안티센스 프라이머
BT11 5'-GTGTCAAGGACAAGGAGA-3'(서열번호 21)
Event176 5'-GCACTCGTTGATGTTGG-3'(서열번호 22)
Mon810 5'-GCGCTGTTCATGTCGTT-3'(서열번호 23)
Starlink 5'-GGAGCAGCAACTTCATGG-3'(서열번호 24)
GA21 5'-AGGGAAGAAAGCGAAAGGAG-3'(서열번호 25)
T25 5'-ACACATGAGCGAAACCC-3'(서열번호 26)
Zein 5'-GTAAGATGCCTGCTGCGATT-3'(서열번호 27)
상기에서 PCR 반응 조건은 다음과 같다: 95℃에서 5 분간 초기 변성시킨 후, 95℃에서 30초간 변성, 54℃에서 15초간 어닐링(annealing), 72℃에서 20초간 익스텐션(extension)을 40 사이클 수행한 후, 72℃ 7분 반응.
증폭된 DNA에 람다 엑소누클레아제 (lambda exonuclease, 10 units/ul, Epicentre)를 37℃에서 1시간 처리하여 단일가닥 DNA로 만들었다.
실시예 2-3. DNA 칩을 이용한 보합반응(hybridization)
실시예 2-2의 단일가닥 DNA를 각각 보합완충액(5X SSC, 0.2% SDS, 1 mg/ml BSA)에 녹인 후 20 ul을 취하여 실시예 1에서 제조한 DNA 칩에 로딩하고 45℃에서 1시간 동안 보합반응을 실시하였다. 이어 DNA 칩을 세척액 I(washing solution Ⅰ, 0.1% SDS, 2X SSC)으로 실온에서 5분간 2회 세척하고, 세척액 Ⅱ(0.2X SSC)로 실온에서 5분간 1회 세척하였으며, 세척액 Ⅲ(0.1X SSC)으로 실온에서 5분간 1회 세척한 후 실온에서 건조시켰다. 상기 DNA 칩을 시아닌 5(Cyanine 5) dCTP 파장범위인 667nm의 파장에서 스캔하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.
각각의 시료는 교차 보합을 보이지 않고 특이성이 높으며, 유전자 변형 작물의 외래 유전자의 함유량이 높아질수록 높은 형광강도를 나타냄을 확인할 수 있었다. 다만, BT11 시료의 경우에는 게놈 DNA의 상태가 양호하지 못해 내재 유전자인 제인(zein)이 거의 검출되지 못하였다.
실시예 2-4. DNA 칩의 민감도 확인.
M810 클론을 제조하기 위해, 실시예 2-1에서 추출한 Mon810 게놈에 대해 서열번호 14/23 의 프라이머쌍으로 PCR 증폭한 후 TA 클로닝 벡터 (pGEM-T-Easy vector system I, Promega)에 리게이션 시켰다. 이를 대장균 TOP10F'에 형질전환 시킨 후 추출 키트 (High pure plasmid prep kit, Roche )를 이용하여 플라스미드를 추출한 후 사용하였다.
유전자 변형이 없는 옥수수(백태, 한국)의 게놈 DNA를 실시예 2-1과 같은 방법으로 추출하였다.
추출한 게놈 DNA 200 ng를 10배씩 희석하여 제조한 2*10 내지 2*109 카피수의 Mon810 클론 플라즈미드와 혼합하여 이를 주형으로 하여 프라이머로서 실시예 2-2의 서열번호 14/23 및 서열번호 18/27을 가하여 멀티플렉스 PCR을 수행한 후 실시예 1에서와 같이 DNA 칩과 반응시켜 Mon810내 외래 유전자 농도에 따른 DNA 칩의 민감도를 측정하였다(도 3).
Mon810 클론 플라즈미드 수가 2*10 카피 정도에서도 검출이 가능하였고, 2*104 카피수 이상에서는 포화된 신호값를 보였다. 그러나, DNA 칩을 스캔할 때 레이저 파워와 PMT 값을 높여 주면, 더 낮은 copies에서도 확인 가능할 것이다.
본 발명의 유전자 변형 생물체의 외래 유전자 서열을 가지는 탐침을 포함하는 유전자 변형 생물체를 진단용 DNA 칩을 이용하여 유전자 변형 생물체의 정성 및 정량분석이 가능하고 동시에 여러 외래 유전자의 유무를 검사할 수 있어 신속한 진단을 할 수 있어 수입농산물의 통관 및 유전자 변형 작물 판정에 널리 활용될 수 있다.
<110> Korea Research Insititute of Bioscience and Biotechnology <120> DNA chip for diagnosing living modified organism, kit comprising the chip and diagnostic method using the kit <160> 27 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 1 <400> 1 tttttttttt ttttttgtga acccaaaaga ccacaa 36 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 2 <400> 2 tttttttttt tttttcattg atcaccaatc gcatcg 36 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 3 <400> 3 tttttttttt tttttgcaaa tcctctggcc tttcc 35 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 4 <400> 4 tttttttttt tttttcaaat cgagcagctc atcaac 36 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 5 <400> 5 tttttttttt tttttgtcgt tcaggtagct cctgc 35 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 6 <400> 6 tttttttttt tttttagcgt gaccgctaca cttg 34 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 7 <400> 7 tttttttttt tttttccgct gaaatcacca gtctc 35 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 8 <400> 8 tttttttttt ttttttggga caaagaaacc ggtag 35 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 9 <400> 9 tttttttttt tttttcccac aatgctcaca agctc 35 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RRS sense primer <400> 10 aggatttcag catcagtgg 19 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lectin sense primer <400> 11 gtgacctcct cgggaaa 17 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BT11 sense primer <400> 12 cagctaggaa gttcggtt 18 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Event176 sense primer <400> 13 acgactcccc atcccta 17 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mon810 sense primer <400> 14 gacatcatct ggggcatc 18 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Starlink sense primer <400> 15 gaagtccaca gcggtg 16 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GA21 <400> 16 ctggcgtaat agcgaaga 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T25 <400> 17 ccagttaggc cagttacc 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zein sense primer <400> 18 gctccttggt ctttctgc 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RRS antisense primer <400> 19 gccttcctta cggatcct 18 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lectin antisense primer <400> 20 tgtcaggggc atagaaggtg 20 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BT11 antisense primer <400> 21 gtgtcaagga caaggaga 18 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Event176 antisense primer <400> 22 gcactcgttg atgttgg 17 <210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mon810 antisense primer <400> 23 gcgctgttca tgtcgtt 17 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Starlink antisense primer <400> 24 ggagcagcaa cttcatgg 18 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GA21 antisense primer <400> 25 agggaagaaa gcgaaaggag 20 <210> 26 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T25 antisense primer <400> 26 acacatgagc gaaaccc 17 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zein antisense primer <400> 27 gtaagatgcc tgctgcgatt 20

Claims (9)

  1. 서열번호 1 내지 7로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 탐침을 포함함을 특징으로 하는, 유전자 변형 생물체 진단용 DNA 칩.
  2. 제1항에 있어서, 유전자 변형 생물체가 콩, 옥수수, 토마토, 면화, 콩, 감자, 벼, 캐놀라 또는 고추인 DNA 칩.
  3. 서열번호 1 내지 7로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 탐침을 포함하는 DNA 칩, 유전자 변형을 갖는 생물체로 추정되는 시료로부터 채취한 DNA를 증폭시키기 위한 프라이머 쌍, 형광 표식된 데옥시뉴클레오타이드 및 람다 엑소누클레아제를 포함하는 유전자변형 생물체 진단용 키트.
  4. 제3항에 있어서, 프라이머 쌍이 서열번호 1에 대해서는 서열번호 12 및 21의 프라이머 쌍, 서열번호 2에 대해서는 서열번호 13 및 22의 프라이머 쌍, 서열번호 3에 대해서는 서열번호 10 및 19의 프라이머 쌍, 서열번호 4에 대해서는 서열번호 14 및 23의 프라이머 쌍, 서열번호 5에 대해서는 서열번호 15 및 24의 프라이머 쌍, 서열번호 6에 대해서는 서열번호 16 및 25의 프라이머 쌍 및 서열번호 7에 대해서는 서열번호 17 및 26의 프라이머 쌍인 키트.
  5. 제3항에 있어서, 형광 표식된 데옥시뉴클레오타이드는 Cy5-dCTP인 키트.
  6. 제3항에 있어서, 유전자 변형 생물체가 콩, 옥수수, 토마토, 면화, 콩, 감자, 벼, 캐놀라 또는 고추인 키트.
  7. 서열번호 1 내지 7로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 탐침을 포함하는 유전자 변형 생물체 진단용 DNA 칩, 및 서열번호 1에 대해서는 서열번호 12 및 21의 프라이머 쌍, 서열번호 2에 대해서는 서열번호 13 및 22 프라이머 쌍, 서열번호 3에 대해서는 서열번호 10 및 19의 프라이머 쌍, 서열번호 4에 대해서는 서열번호 14 및 23의 프라이머 쌍, 서열번호 5에 대해서는 서열번호 15 및 24의 프라이머 쌍, 서열번호 6에 대해서는 서열번호 16 및 25의 프라이머 쌍 및 서열번호 7에 대해서는 서열번호 17 및 26의 프라이머 쌍으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 유전자변형 생물체 진단용 키트.
  8. 제3항 또는 제7항의 키트를 사용하여 유전자변형 생물체 진단하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 유전자 변형을 갖는 생물체로 추정되는 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 추출한 DNA를 증폭시키는 단계; 람다 엑소뉴클레아제로 증폭된 DNA를 단일가닥으로 분리하는 단계; 단일가닥으로 분리된 DNA를 DNA 칩과 보합반응시키는 단계; 및 보합된 탐침부위를 검사하는 단계를 포함하여, 유전자 변형 생물체 를 진단하는 방법.
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