KR20040079053A - 유전자변형 식물체 분석용 프라이머 세트, 프로브 및표준플라스미드 - Google Patents

유전자변형 식물체 분석용 프라이머 세트, 프로브 및표준플라스미드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자변형 식물체에 대한 PCR 검정용 프라이머에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 예를 들면, 감자 계통 NewLeaf, NewLeaf Plus 및 NewLeaf Y를 검출할 수 있는 PCR 프라이머 및 이들의 혼입율 분석을 위한 정량용 프라이머, 프로브 및 표준플라스미드에 관한 것이다.
본 발명의 유전자변형감자 검정용 PCR 프라이머와 프로브 및 표준플라스미드는 각 유전자변형감자 계통을 특이적으로 검출할 수 있어, 현재 유통 중이거나 수입되는 농산물 및 식품 중의 유전자변형감자를 정성 및 정량적으로 검정하는 GMO 판별에 이용할 수 있다.

Description

유전자변형 식물체 분석용 프라이머 세트, 프로브 및 표준플라스미드{Primer Sets, Probes and A Standard Plasmid for Qualitative and Quantitative Detection of GMO}
본 발명은 유전자변형 식물체에 대한 PCR 검정용 프라이머에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 예를들면, 감자 계통 NewLeaf, NewLeaf Plus 및 NewLeaf Y를 검출할 수 있는 PCR 프라이머 및 이들의 혼입율 분석을 위한 정량용 프라이머, 프로브 및 표준플라스미드에 관한 것이다.
유전자변형 식물(Genetically Modified Organism : GMO)이란 통상적으로 유전공학기술로 기존의 번식방법으로는 나타날 수 없는 형질이나 유전자를 지니도록 개발된 식물을 통칭한다. 유전자변형식물 중 농작물의 유전자 변형은 주로 생산량을 증가시키는 형질, 병충해에 저항적인 형질, 고농도의 농약에 저항적인 형질, 긴 유통기간에도 쉽게 상하지 않는 형질 등으로 이미 상용화되었거나 준비 중에 있다.
유전자변형식물의 상업화는 1994년 미국 칼젠(Calgene)사가 잘 물러지지 않는 토마토를 개발한 이후 빠르게 진행되었으며, 1996년 몬산톤사의 대두와 노바티스사의 옥수수가 본격적으로 상품화되었다. 초기 유전자변형식물 재배는 유전자변형식물을 개발한 회사가 일반종자 보다 비싸게 판매함에도 불구하고 농민의 입장에서는 농약과 비료의 비용이 크게 줄고 병충해가 감소해 그 사용이 급격하게 증가하였다. 1994년부터 2002년까지 FDA의 검증을 마치고 시판이 허용된 유전자재조합식물은 옥수수, 토마토, 감자, 대두 등을 중심으로 77종에 이른다.
현재 식물 또는 식품의 유전자변형여부를 확인하기 위한 방법은 유전자변형식물의 DNA를 검출하는 방법과 단백질을 검출하는 방법 두 가지이다.
(1) 단백질 검출에 의한 검정 기술
EPSPS 유전자가 도입된 콩 및 CryIA(b), Cry9C, PAT 유전자가 도입된 옥수수에 대하여 EPSPS 또는 CryIA(b), Cry9C, PAT 유전자가 발현하는 EPSPS 또는 Bt 단백질을 항체로 이용하여 검출하는 스트립(strip) 키트가 이미 상품화되어 있고, 효소면역학적 방법(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)에 의한 EPSPS과 CryIA(b) 유전자 단백질 정량용 분석 키트도 최근 상품화되었다. 그러나 단백질의 발현양은 유전자변형농산물에 따라 다르며, 개발회사에서 사용한 유전자 발현 조절부위(프로모터)에 따라 종자에서 발현되지 않는 경우도 있으며, 보관상태 또는 가공식품의 경우에 가공과정에서 분해되는 경우도 있어 검정에 한계가 있다.
(2) DNA 검출에 의한 검정기술
핵산중합효소 연쇄 반응법(polymerase chain reaction, PCR)에 의한 검정기술이다. 현재 유전자변형식물에 많이 사용되는 컬리플라워 모자이크 바이러스 프로모터(CaMV 35S promoter)에 대한 특이적인 PCR 프라이머로 유전자변형 여부를 확인할 수 있다. 특히 스위스, 독일 등 EU에서는 35S 프로모터 또는 Nos 터미네이터특이적인 프라이머를 이용한 PCR 검정법이 유전자변형식품을 검정하는 공인기술로 이용되고 있다.(A. Jankiewicz 등, Eur. Food res. Technol. 209:77-82, 1999; Pietsch 등, DG JRC 보고서, 1999) 또한 현재 상품화되고 있는 PCR 검정킷트(kit)도 역시 35S 프로모터 또는 Nos 터미네이터 특이 프라이머를 이용한 것이다. 그러나 이들의 35S 프로모터 또는 Nos 터미네이터 특이 프라이머를 이용한 PCR 결과에서 의사양성(false positive) 또는 의사음성(false negative)가 나타날 가능성이 있으며(Lipp 등, J. AOAC International 82:923-928, 1999), 유전자변형농산물의 종류에 따라 이들 조절부위 유전자를 이용하고 있지 않는 경우도 있다. 따라서 스위스 등 EU에서는 이들 조절부위 특이적인 프라이머를 이용한 PCR은 유전자변형농산물의 1차적인 스크리닝에 이용하고 있으며, 유전자변형농산물의 계통 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 검정을 2차 검정으로 확인하고 있다.(Huber 등, Nat. Biotechnol. 17:1137-1138, 1999) 그러나 개발회사에 따라 유전자변형농산물에 도입시킨 유전자의 염기서열이 변경되어 있으며 도입유전자의 발현방법도 다를 뿐만 아니라 상기한 유전정보를 개발회사의 비밀정보(confidential business information, CBI)로 하여 도입유전자에 대한 유전정보를 확보하기에 곤란한 점이 많다. 따라서 2차 검정에 이용하고 있는 프라이머의 정보도 공개하지 않고 있어 계통별 특이 프라이머 개발이 국내외적으로 시급한 실정이다.
한편, 2002년 3월부터 시행되는 유전자변형농산물 표시제의 표시대상 품목으로 추가된 감자 중 국내 수입 예상 가능한 상품화된 유전자변형감자는 해충 및 바이러스저항성 감자이다. 유전자변형 감자는 계통에 따라 도입된 유전자 및 운반체의 구조가 다르다. 현재 국내 수입·유통되고 있는 유전자변형 농산물에 대하여 유전자변형농산물의 안전성 심사 결과 안전성이 확인된 감자 계통의 판별이 요구된다.
따라서 본 발명은 국내 수입 예상되는 유전자변형 감자 계통인 NewLeaf, NewLeaf Plus, NewLeaf Y 계통에 대한 판별이 가능한 PCR 특이 프라이머 및 프로브를 개발하여 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 유전자변형 감자 계통에 대한 도입유전자 정량분석용 표준플라스미드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 몬산토사의 해충저항성 감자 NewLeaf에 도입된 cry3A 유전자 및 발현조절부를 나타낸 모식도이고,
도 2는 몬산토사의 NewLeaf Y 감자에 도입된 cry3A 유전자와 PVY(potyvirus Y)의 coat protein 유전자 및 발현조절부를 나타낸 모식도이고,
도 3은 몬산토사의 NewLeaf Plus 감자에 도입된 cry3A와 PLRV(potato leafroll virus)의 replicase 유전자 및 발현조절부를 나타낸 모식도이고,
도 4는 유전자변형 감자 및 천연형 감자에 대한 프라이머의 특이성을 확인한 전기영동사진이고,
도 5은 NLS-F 프라이머 및 NLL-R R1077 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것이고,
도 6A 및 6B는 NLS-F 프라이머 및 NLL-R R1077 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열에 대한 DNA 상동성(homology) 분석을 나타낸 것이고,
도 7은 NLYL-F 프라이머 및 NLYM-R 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것이고,
도 8A 및 8B는 NLYL-F 프라이머 및 NLYM-R 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열에 대한 DNA 상동성(homology) 분석을 나타낸 것이고,
도 9는 NLYL-F 프라이머 및 NLPS-R 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것이고,
도 10A 및 10B는 NLYL-F 프라이머 및 NLPS-R 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열에 대한 DNA 상동성(homology) 분석을 나타낸 것이고,
도 11은 Cry3A-F 프라이머/ Cry3A-R 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것이고,
도 12는 Cry3A-F 프라이머 및 Cry3A-R 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열에 대한 DNA 상동성(homology) 분석을 나타낸 것이고,
도 13은 UGP-F 프라이머 및 UGP-R 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것이고,
도 14는 UGP-F 프라이머 및 UGP-R 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열에 대한 DNA 상동성(homology) 분석을 나타낸 것이고,
도 15는 Cry3A-F2 프라이머 및 Cry3A-R 프라이머로 증폭된 산물과 UGP-F2 프라이머 및 UGP-R2 프라이머로 증폭된 산물을 삽입한 감자 정량분석용 표준 플라스미드 pCryugp를 나타낸 것이고,
도 16은 Cry3A-F2 프라이머 및 Cry3A-R 프라이머로 증폭된 산물과 UGP-F2 프라이머 및 UGP-R2 프라이머로 증폭된 산물을 연결하여 감자정량분석용 표준 플라스미드인 pCryugp에 삽입한 DNA 단편의 염기서열, 상기 4종의 프라이머 및 Cry3A-pb 프로브, UGP-pb 프로브를 나타낸 것이고,
도 17A 및 17B는 pCryugp 표준플라스미드의 실시간 PCR에 의한 감자 검정용 정량곡선을 나타낸 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 해충저항성 유전자변형감자를 검정할 수 있는 PCR 프라이머인 NLS-F(서열번호 1), NLL-R(서열번호 2) Cry3A-F(서열번호 6) 및 Cry3A-R(서열번호 7) 프라이머에 관한 것이다.
또한 본 발명은 해충 및 바이러스 복합 저항성 유전자변형감자를 검정할 수 있는 PCR 프라이머인 NLYL-F(서열번호 3), NLYM-R(서열번호 4), NLSP-R(서열번호 5) 및 Cry3A-F2(서열번호 8) 프라이머에 관한 것이다.
또한 본 발명은 해충 및 바이러스 복합 저항성 유전자변형감자를 검정할 수있는 프로브인 Cry3A-pb(서열번호 9) 프로브에 관한 것이다.
또한 본 발명은 천연형 및 유전자변형감자의 내재유전자를 검정할 수 있는 프라이머인 UGP-F(서열번호 10), UGP-R(서열번호 11), UGP-F2(서열번호 12) 및 UGP-R2(서열번호 13) 프라이머를 제공한다.
또한 본 발명은 천연형 및 유전자변형감자의 내재유전자를 정성 및 정량 검정할 수 있는 프로브인 UGP-pb(서열번호 14) 프로브를 제공한다.
또한 본 발명은 유전자변형감자를 정성 및 정량 검정할 수 있는 pCryugp 표준플라스미드를 제공한다.
본 발명은 상품화되어 유통 가능한 유전자변형감자인 해충 저항성과 바이러스저항성 감자를 정성 및 정량적으로 판별할 수 있는 PCR 프라이머, 프로브 및 표준플라스미드에 관한 것이다.
본 발명은 해충저항성감자인 NewLeaf와 해충 저항성인 동시에 바이러스저항성 감자인 NewLeaf Plus 및 NewLeaf Y 등 3종에 관하여 특이적으로 검정이 가능한 PCR 프라이머 4조, 즉 7종과 감자의 내재유전자에 대한 특이 프라이머 1조, 즉 2종을 포함을 포함하며, 상기의 유전자변형감자의 혼입율, 즉 정량적인 분석을 위한 PCR 프라이머 3종과 프로브 2종을 포함하며, 감자 정량분석용 표준플라스미드 1종을 포함한다. 이들 14종의 프라이머 및 프로브는 해충저항성 및 바이러스 저항성 감자에 도입된 Bt 유전자 및 바이러스 저항성 유전자의 유전정보와 운반체의 구조를 파악하여 운반체에 도입된 도입유전자 및 감자 내재유전자에 대하여 특이적으로설계하였다. 따라서 본 발명에 의한 프라이머, 프로브 및 표준플라스미드를 활용하면 NewLeaf, NewLeaf Plus, NewLeaf Y 3계통의 감자 유전자변형계통에 대하여 정성적인 판별과 정량적인 분석이 가능하다.
본 발명에서는 해충저항성 감자인 NewLeaf와 해충 및 바이러스 복합저항성 감자인 NewLeaf Plus, NewLeaf Y로부터 각각 genomic DNA를 분리하여 이를 주형으로 하여 PCR한 결과, 각각에 대하여 프라이머의 특이성을 확인하였다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 유전자변형감자에 도입된 BT, rep 및 CP 유전자 및 내재유전자 UGP를 검정할 수 있는 PCR 프라이머 및 검정방법을 제공한다. 상기 BT는 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)의 합성 cry3A 유전자로 식물에 형질전환하여 해충에 내성을 가지게 한다. 상기 rep는 포테이포 리프롤 바이러스(Potato leafroll virus)의 레플리케이스(replicase) 유전자로 감자 식물체에 도입되면 잎 바이러스에 저항성을 가지는 유전자변형감자를 얻게 된다. 상기 CP는 포티바이러스(potyvirus)의 외피단백질인 코트 프로테인(coat protein) 유전자로 감자 바이러스에 내성을 부여하는 유전자이다. 상기 UGP는 유디피 글루코스 포스포리레이즈(UDP-glucose phosphorylase) 유전자로 천연형 및 유전자변형감자에 존재하는 단일(single copy)의 내재성 유전자이다
상기 Bt, rep, CP 등의 외래 유전자에 의해 형질전환된 유전자변형감자는 특정 개발회사에서 개발하여 상품화한 유전자변형감자로 본 발명에서는 특정회사에서 판매하는 유전자변형감자에 대한 PCR 프라이머를 고안하였다. 그러나 본 발명에서 비록 유전자변형 "감자"에 대한 검정용 PCR 프라이머를 제작하였지만, 동일한 외래 유전자(Bt, rep, CP 등)이 도입된, 따라서 동일한 염기서열 및 발현체제를 가지는 감자 이외의 유전자변형 "식물" 검정용으로 사용될 수 있음은 당연할 것이다.
본 발명에서 검출대상이 되는 식물의 하나는, 몬산토사가 개발한 해충저항성 감자 NewLeaf이다. NewLeaf 계통은 CaMV 35S 강화 프로모터(E35s)-Cry3A 유전자-리불로스 바이포스페이트 카르복실레이즈 스몰 서브유닛(ribulose-1,5-biphosphate carboxylase, small subunit; 이하 'E9 3'라 함)의 구조를 가진 외래유전자가 도입된 유전자변형감자이다. NewLeaf에 해당하는지 여부를 검정할 수 있는 본 발명의 프라이머는, 35S 강화 프로모터를 특이적으로 인지하는 NLS-F 프라이머(서열번호 1) 및 Cry3A를 특이적으로 인지하는 NLL-R 프라이머(서열번호 2)이다.
또한 본 발명은 몬산토사가 개발한 유전자변형 감자인 NewLeaf Y를 검정할 수 있는 프라이머를 제공한다. NewLeaf Y에 도입된 외래유전자는 피그워-트 모자이크 바이러스(Figwort Mosaic Virus, 이하 'FMV'라 함) 프로모터-포티바이러스 와이 외피단백질(potyvirus Y coat protein; 이하 'PVY cp'라 함)-E9 3'와 애기장대의 리불로스 바이포스페이트 카르복실레이즈 스몰 서브 유닛 프로모터(Arabidopsis thalianaribulose-1,5-biphosphate caboxylase small subunit promoter; 이하 'arabSSU1A'라 함)-Cry3A-노팔린 합성효소 전자종결인자(nopaline synthase terminator; 이하 'Tnos'라 함)의 구조를 가진다. NewLeaf Y 계통인지 여부를 검정하는데 이용되는 본 발명의 PCR 프라이머는 서열번호 3의 NLYL-F 프라이머와 서열번호 4의 NLYM-R 프라이머인데, 이들은 각각 FMV 프로모터 및 PVY cp를 인지한다.
또한 본 발명은 몬산토사의 NewLeaf Plus 해충 및 바이러스 복합 저항성 유전자변형감자를 검정할 수 있는 프라이머를 제공한다. NewLeaf Plus에는 Cry3A 유전자 및 감자잎 바이러스 복제유전자인 리프롤 바이러스 레플리케이스(PLRV rep) 유전자가 동시에 도입되어 있다. Cry3A 유전자의 발현구조는 ArabSSU1A-cry3A-Tnos를 포함한다. 또한 PLRV rep 유전자의 발현구조는 FMV 프로모터(P-FMV)-포테이토 리프롤 바이러스 레플리케이스(potato leafroll virus replicase; 이하 'PLRV rep'라 함)-E9 3'의 구조를 가진다. NewLeaf Plus에 대한 검정용 NLYL-F 프라이머(서열번호 3)는 FMV 프로모터를 특이적으로 인지하고, NLPS-R 프라이머(서열번호 5)는 PLRV rep를 특이적으로 인지하도록 제작된다.
또한 본 발명은 몬산토사의 NewLeaf, NewLeaf Plus와 NewLeaf Y 감자 3종을 동시에 검정할 수 있는 프라이머를 제공한다. 상기의 3종의 감자는 모두 cry3A 유전자를 포함하고 있으며 Cry3A에 대한 PCR 프라이머는 서열번호 6의 Cry3A-F 프라이머와 서열번호 7의 Cry3A-R 프라이머이다. 상기 프라이머들은 Cry3A 유전자를 인지한다.
또한 본 발명은 몬산토사의 NewLeaf, NewLeaf Plus와 NewLeaf Y 감자 3종을 동시에 정성 및 정량적 검정할 수 있는 또 다른 프라이머와 프로브를 제공한다. 상기의 3종의 감자는 모두 cry3A 유전자를 포함하고 있으며 Cry3A에 대한 PCR 프라이머는 Cry3A-F2 프라이머(서열번호 8)와 Cry3A-R 프라이머(서열번호 7) 및 의 Cry3A-pb 프로브(서열번호 11)이다. 상기 프라이머 및 프로브는 모두 Cry3A 유전자를 인지한다.
또한 본 발명은 천연형 및 유전자변형의 모든 감자에 단일 유전자로 존재하는 내재성 유전자인 UDPase 유전자를 검정할 수 있는 프라이머를 제공한다. UDPase 유전자는 모든 감자에 존재하는 단일(single copy)유전자로 UGPase 유전자에 대한 PCR 프라이머는 서열번호 10의 UGP-F 프라이머와 서열번호 11의 UGP-R 프라이머이다. 상기 UGP-F 프라이머와 UGP-R 프라이머는 GM 감자 검정의 PCR 양성대조구로 이용가능하며 UGPase 유전자를 인지한다.
또한 본 발명은 NewLeaf, NewLeaf Y, NewLeaf Plus 등 해충저항성 감자에서 외래유전자의 함유율을 정량적으로 검정할 수 있는 정량분석용 표준플라스미드 pCryugp를 제공한다. 상기의 pCryugp 플라스미드는 Cry3A-F2 프라이머와 Cry3A-R 프라이머에 의해 증폭된 PCR 산물과 감자의 내재유전자인 UGP의 PCR 산물을 동일비율(1:1)로 연결하여 삽입한 플라스미드이다. 이 플라스미드를 단계별로 희석한 카피수를 주형으로하여 Cry3A-F2 프라이머와 Cry3A-R 프라이머 및 Cry3-pb 프로브, UGP-F2 프라이머와 UGP-R2 프라이머 및 UGP-pb 프로브를 이용한 실시간(realtime) PCR 분석으로 정량용 표준곡선을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 유전자변형감자 검정용 PCR 프라이머를 이용한 유전자변형감자 검정방법을 제공한다. 본 발명의 유전자변형감자 검정방법은 통상의 PCR 방법으로 시료의 게놈 DNA에 대한 PCR 방법이다. 하기 표 1에 가장 바람직한 PCR반응조건을 PCR 프라이머에 따라 나타내었다.
본 발명의 유전자변형식물 검정용 PCR 프라이머는 도입유전자별 특이적 계통 특이성을 가진다. 따라서 본 발명에 의한 프라이머는 유전자변형감자인 NewLeaf, NewLeaf Plus 및 NewLeaf Y를 검출하는데 이용할 수 있고, GMO 검정키트로 활용할 수 있다.
또한 본 발명의 유전자변형감자 검정용 PCR 프라이머는 Cry3A 유전자, PLRV rep 유전자 또는 PVY cp 유전자를 포함하는 감자, 다른 식물 또는 식품에 대하여 검정 프라이머로 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 및 적용예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 적용예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일뿐 본 발명의 기술적 사상이 하기의 실시예에 한정되거나 그 범위가 변경되는는 것은 아니다.
실시예 1 : NewLeaf에 대한 프라이머 제작
NewLeaf는 몬산토(Monsanto) 회사에서 개발하여 상품화한 해충저항성 감자 계통이다. 해충저항성 유전자는 합성 Cry3A 유전자(Genebank Accession No. X70979)로서, CaMV 35S 강화 프로모터(Sanders 등, 1987)와 애기장대의 E9 3'터미네이터가 발현조절인자로 연결되어있다(도 1).
NewLeaf의 특이 프라이머로 다음의 프라이머 세트를 제작하였다(표 2).
상기 NLS-F 프라이머는 CaMV 35S의 활성화영역(enhancer)를 반복하여 만든 강화 프로모터에 특이적으로 작용하고, 상기 NLL-R 프라이머는 합성 Cry3A를 특이적으로 인지한다. NLS-F 프라이머와 NLL-R 프라이머는 GC 함량이 57%, 52%이며 Tm 차이가 2℃로 적정 어닐(anneal) 온도가 59℃이며 이들 프라이머를 이용한 NewLeaf의 PCR 산물의 크기는 526 bp로 예상된다.
실시예 2 : NewLeaf Y 특이 프라이머 제작
NewLeaf Y는 몬산토(Monsanto) 회사에서 개발하여 상품화한 해충 및 바이러스 복합 저항성 감자이다. 도입된 해충 저항성 유전자는 합성 Cry3A 유전자이고 바이러스저항성 유전자는 PVY coat protein 유전자이다. 도 2에 Cry3A와 PVY-cp 유전자 및 그 발현조절부위를 나타내었다. Cry3A 유전자는 ArabSSU1A와 Nos 터미네이터가 발현조절인자로 연결되어있고, PVY cp 유전자는 Cry3A 유전자 삽입 방향과는 반대방향으로 FMV 프로모터와 E9 3' 터미네이터가 연결되어있는 형태를 나타낸 것이다.
NewLeaf Y 감자를 검정하기 위하여 2개의 프라이머를 제작하였다.
NLYL-F 프라이머와 NLYM-R 프라이머는 GC 함량이 58%이며 Tm 차이가 0 ℃로 적정 어닐온도가 59℃이며, 이들 프라이머를 이용한 NewLeaf Y의 PCR 산물의 크기는 365 bp로 예상된다.
실시예 3 : NewLeaf Plus 특이 프라이머 제작
NewLeaf Plus는 몬산토(Monsanto) 회사에서 개발하여 상품화한 해충 및 바이러스 복합 저항성 감자이며, 해충 저항성 유전자는 합성 Cry3A 유전자이고 바이러스저항성 유전자는 PLRV rep 유전자이다. 도 3에 Cry3A와 PLRV rep 유전자 및 그 발현조절부위를 나타내었다.
Cry3A 유전자는 ArabSSU1A 프로모터와 Nos 터미네이터가 발현조절인자로 연결되어있고, PLRV rep 유전자는 Cry3A 유전자 삽입 방향과는 반대방향으로 FMV 프로모터와 E9 3' 터미네이터가 연결되어있는 형태를 나타낸 것이다.
따라서, NewLeaf Plus 감자를 검정하기 위하여 2개의 프라이머를 제작하였다.
NLYL-F 프라이머와 NLPS-R 프라이머는 GC 함량이 58%, 57%이며 Tm 차이가 1℃로 적정 어닐 온도가 59℃이며, 이들 프라이머를 이용한 NewLeaf Plus의 PCR 산물의 크기는 430 bp로 예상된다.
실시예 4 : GM 감자 3종 공통 도입유전자 Cry3A 특이 프라이머 제작
NewLeaf, NewLeaf Plus, NewLeaf Y 감자에는 해충 내성 유전자인 Cry3Aa 유전자가 공통적으로 도입되어 있다(도 1, 2, 3). GM 감자 3종의 공통적 도입유전자인 Cry3Aa 유전자의 특이 프라이머 세트로 서열번호 6 및 서열번호 7의 프라이머를 제작하였다(표 5).
Cry3A-F과 Cry3A-R 프라이머의 GC 함량은 52.6%, 57.9%, 어닐 적정온도는 59 ℃이며 PCR산물의 크기는 331 bp로 예상된다.
또한 NewLeaf, NewLeaf Plus, NewLeaf Y 감자의 함유율을 정량적으로 분석하기 위하여 Cry3Aa 유전자의 특이 프라이머로 서열번호 8 및 7인 염기서열을 가지는 프라이머 및 서열번호 9의 프로브를 제작하였다(표 6).
Cry3A-F2과 Cry3A-R 프라이머의 어닐 적정온도는 59 ℃이고 Cry3A-pb 프로브의 어닐온도는 69℃이며, PCR산물의 크기는 112 bp로 예상된다.
실시예 5 : 감자 내재유전자 UGPase 특이 프라이머 제작
GM 감자를 검정하기 위한 PCR 반응의 양성대조구로 사용가능한 감자 내재성 유전자의 프라이머로 UDP-glucose pyrophosphorylase(UGPase,GenBank No.U0345)에 대한 특이 프라이머를 2개 제작하였다(표 7).
UGP-F 프라이머와 UGP-R 프라이머는 GC 함량이 60%이며 Tm 차이가 0 ℃로 적정 어닐온도가 62℃이며, 이들 프라이머를 이용한 PCR 산물의 크기는 131 bp로 예상된다.
또한 NewLeaf, NewLeaf Plus, NewLeaf Y 감자의 혼입율을 정량적으로 분석하기 위하여 UGPase 유전자의 특이 프라이머로 서열번호 12, 13의 프라이머와, 서열번호 14의 프로브를 제작하였다(표 8).
UGP-F2 프라이머와 UGP-R2 프라이머의 어닐 적정온도는 59 ℃이고 UGP-pb 프로브의 어닐온도는 69℃이며, PCR산물의 크기는 111 bp로 예상된다.
실시예 6 : 정량분석용 표준플라스미드 제작 및 표준검량곡선 작성
(1)NewLeaf, NewLeaf Y, NewLeaf Plus 감자에 공통적으로 도입된 Cry3A 유전자 및 천연형 및 유전자변형감자에 내재하는 UGPase유전자의 카피수를 이용한 상대적 비율 산출에 의한 유전자변형감자의 혼입율(%) 즉, 정량적 분석을 위한 표준플라스미드를 제작하였다.
도 15는 Cry3A-F2 프라이머 및 Cry3A-R 프라이머로 증폭된 산물과 UGP-F2 프라이머 및 UGP-R2 프라이머로 증폭된 산물을 삽입한 감자 정량분석용 표준 플라스미드 pCryugp를 개략적으로 표현한 것이다. 도 16은 pCryugp에 삽입된 염기서열의 주요부분(아래에서 언급되는 "PCR 산물-융합물"을 보여주는 서열목록이다. 도 16에 Cry3A-F2＋Cry3A-R 프라이머 세트로 증폭된 산물 및 UGP-F2＋UGP-R2 프라이머 세트로 증폭된 산물의 염기서열이 표준플라스미드 pCryugp에 삽입되어 있으며, 상기 염기서열의 내부에 프로브인 Cry3A-pb 및 UGP-pb 서열이 표시되어 있다.
도 15 및 도 16에 도시된 바와 같이, Cry3A 유전자 및 UGPase 유전자의 PCR 산물을 1:1의 동일비율로 연결하여 pGEM-T easy(Promega A1360) 벡터에 삽입하여 표준플라스미드를 제작하였다. 상기의 Cry3A 유전자에 대한 PCR 산물은 Cry3A-F2 프라이머와 Cry3A-R2 프라이머을 이용하여 증폭한 것이고 UGP 유전자에 대한 PCR 산물은 UGP-F2 프라이머와 UGP-R2 프라이머를 이용하여 증폭한 것이다.
표준플라스미드 pCryugp의 구조 및 제작과정을 보다 상세히 기술한다.
각각 UGP-F2＋UGP-R2 프라이머 세트 및 Cry3A-F2＋Cry3A-R 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 다음,SmaI/SrfI 제한효소 인식부위를 매개로 하여 상기 두 종류의 PCR 산물을 연결하여 239개의 염기로 구성된 PCR 산물-융합물을 얻었다. 이때 상기 PCR 산물-융합물은, 도 16에 도시된 바와 같은 서열특성을 가진다. 즉, 1∼23번 염기서열은 UGP-F2 프라이머와 동일하였고, 93∼111번 염기서열은 UGP-R2 프라이머와 상보적임이 확인되었다. 또한 55∼86번 염기서열은 UGP-pb 프로브 염기서열과 일치되었다. 또한 128∼148번 염기서열은 Cry3A-F2 프라이머 염기서열과 일치하였고, 220∼239번 염기서열은 Cry3A-R 프라이머의 상보적인 염기서열과 일치하였고, 176∼193번 염기서열은 Cry3A-pb 프로브 염기서열과 일치하였다. UGPase 유전자 및 Cry3A 유전자의 PCR 산물이SmaI/SrfI 제한효소 절단부위의 염기서열(112∼119번)로 연결되어 있음을 확인하였다.
얻어진 PCR 산물-융합물을 pGEM-Teasy(Promega A1360) 벡터에, 제조사가 지시한 방법에 따라 삽입하여 표준플라스미드를 제작하였다.
(2)표준플라스미드를 대장균(E.coliDH5α)에 형질전환하여 정제한 후 10 ㎍을SmaI 효소로 25℃에서 2시간 처리하여 절단한 후 1% 아가로스 전기영동하여 linear 형태로 절단된 플라스미드를 아가로스 겔로부터 회수하였다. 회수된 플라스미드를 자외선 흡광도 분석기(UV spectrophotometer)를 이용하여 A260/A280를 측정하여 정량한 후 20, 300, 4,000, 70,000, 1,000,000 copies/2.5㎕로 5 단계 희석하여 표준검량선을 작성하였다.
pCryugp 플라스미드를 5 단계의 카피수로 희석한 DNA를 주형으로 Cry3A-F2 프라이머/Cry3A-R 프라이머 및 Cry3A-pb 프로브, UGP-F2 프라이머/UGP-R2 프라이머 및 UGP-pb 프로브로 이용한 실시간 PCR을 수행한 결과, 상기의 pCryugp 플라스미드 카피수에 의하여 증폭되는 실시간 PCR의 상관계수가 0.99이상으로 나타나(도 17) 정량분석용 표준플라스미드로 이용 가능함을 확인하였다.
적용예 1 : 프라이머를 이용한 유전자변형감자 검출
상기 실시예에서 제작한 유전자변형감자 검출용 프라이머 세트를 이용하여 유전자변형감자인 NewLeaf, NewLeaf Y, NewLeaf Plus의 검출여부를 확인하였다.
먼저, NewLeaf, NewLeaf Y, NewLeaf Plus 감자 3종(4계통) 및 비교식물체로서 감자와 같은 가지과 작물인 토마토, 고추의 게놈 DNA를 분리하였다. GM 감자 4계통에 대한 감자분말을 몬산토회사로부터 입수하였다.
검체 분말 각 1 g을 50 ml 튜브에 넣고 DNeasy plant maxi kit(Qiagen 68163)를 이용하여 DNA를 분리 정제하였다. DNA 용출액은 자외선 흡광도분석기(UV spectrophotometer)로 A260/A280를 측정하여 DNA 농도를 정량하였다.
상기에서 수득한 각각의 게놈 DNA 25 ng를 주형으로 하여 총 5세트의 프라이머(NLS-F＋NLL-R, NLYL-F＋NLPS-R, NLYL-F＋NLYM-R, Cry3A-F＋Cry3A-R, UGP-F＋UGP-R)로 PCR을 실시하였다. 또한 음성대조군으로 주형 DNA는 첨가하지 않고 프라이머만 넣고 PCR을 실시하였다. 각 프라이머에 대한 PCR 조건은 상기 표 1에 나타난 바와 같이 하였다.
각각의 PCR 산물은 Tris-Acetic acid-EDTA를 포함한 2% 아가로즈 젤로 전기영동으로 분석하였다. 도 4는 PCR 산물들에 대한 전기영동사진을 나타낸 것이다.
도면에서 A, B, C, D, E는 각각 NLS-F＋NLL-R, NLYL-F＋NLPS-R, NLYL-F＋NLYM-R, Cry3A-F＋Cry3A-R, UGP-F＋UGP-R 프라이머 세트를 이용하여 실시한 PCR 산물에 대한 사진이며, No template는 음성대조군, Non GM potato는 천연형 감자, NewLeaf(S)는 NewLeaf 감자 superior(SPBT 02-5) 계통, NewLeaf(R)은 NewLeaf Plus 감자 Russet Burbank(RBMT 21-350) 계통의 DNA를 의미한다.
(A) NLS-F＋NLL-R 프라이머 세트의 PCR 결과
PCR 결과 NewLeaf 감자 2계통의 게놈 DNA를 주형으로 한 경우에만 특이적인 PCR 산물이 나타났으며 PCR 산물의 크기도 526 bp로 확인되었다. 상기 도 4의 A 패널에 나타난 PCR 산물이 NewLeaf 특이적임을 재확인하기 위하여 염기서열분석을 수행하였다.
도 5는 본 적용예에서 NLS-F＋NLL-R 프라이머 세트에 의한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것으로, PCR 산물은 526개의 염기로 구성되었으며, 1∼22번까지의 염기는 NLS-F 프라이머 염기서열과 일치하였으며 502∼526번까지의 염기는 NLL-R 프라이머와 상보적인 염기서열을 가지고 있음이 확인되었다. 또한 100번 위치의 ATG부터는 합성(synthetic) Cry3A 단백질의 아미노산을 코드함을 확인할 수 있었다.
도 6은 본 적용예에서 NLS-F＋NLL-R 프라이머 세트에 의한 PCR 산물의 염기서열과 도입유전자의 DNA 상동성(homology) 분석을 나타낸 것이다. 도에서 볼 수 있듯이, 증폭된 PCR 산물의 1∼68번까지의 염기서열은 꽃양배추 CaMV 35S 프로모터의 염기서열(GeneBank accession No. AF14064)과 완전히 일치하였으며(도 6에서 A), 100번 위치의 ATG부터 493번까지의 염기는 합성 Cry3A 유전자의 염기서열(GeneBank accession No.X70979)과 완전히 일치하였다(도 6에서 B).
따라서, 본 발명에 의한 NLS-F 및 NLL-R 프라이머를 활용한 PCR 증폭실험에 의해 CaMV 35S 프로모터 및 Cry3A 유전자가 도입된 유전자변형식물체, 예를들면 NewLeaf Y 감자인지 여부에 대한 특이적 검출이 가능함을 확인할 수 있다.
(B) NLYL-F＋NLYM-R 프라이머 세트의 PCR 결과
PCR 결과 NewLeaf Y 감자 계통의 게놈 DNA를 주형으로 한 경우에만 특이적인 PCR 산물이 나타났으며 PCR 산물의 크기도 365 bp로 확인되었다. 상기 도 4의 B 패널에 나타난 PCR 산물이 NewLeaf Y 특이적임을 재확인하기 위하여 염기서열분석을 수행하였다.
도 7은 본 발명의 NLYL-F＋NLYM-R 프라이머 세트에 의한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것으로, PCR 산물은 365개의 염기로 구성되었으며, 1∼21번까지의 염기는 NLYL-F 프라이머 염기서열과 일치하였으며 347∼365번까지의 염기는 NLYM-R 프라이머와 상보적인 염기서열을 가지고 있음이 확인되었다. 또한 303번 위치의 ATG부터는 PVY 바이러스의 외피 단백질(CP)의 아미노산을 코드함을 확인할 수 있었다.
도 8은 NLYL-F＋NLYM-R 프라이머 세트로 증폭된 PCR 산물의 염기서열에 대한 DNA 상동성(homology) 분석을 보여준다. 증폭된 산물의 1∼206번까지의 염기서열은 FMV 프로모터 염기서열(EMBL accession No. X06166.1)과 99%의 상동성을 보였고(도 8에서 A), 303번 위치의 ATG부터 365번까지의 염기는 PVY-cp 유전자의 염기서열(GeneBank accession No. U09509.1)과 100%의 상동성을 나타내었다(도 8에서 B).
따라서, 본 발명에 의한 NLYL-F 및 NLYM-R 프라이머를 활용한 PCR 증폭실험에 의해 FMV 프로모터 및 PVY-cp 유전자가 도입된 유전자변형식물체, 예를 들면 NewLeaf Y 계통의 감자인지 여부에 대한 특이적 검출이 가능함을 확인할 수 있다.
(C) NLYL-F＋NLPS-R 프라이머 세트의 PCR 결과
이 경우, PCR 결과 NewLeaf Plus 감자계통의 게놈 DNA를 주형으로 한 경우에만 특이적인 PCR 산물이 나타났으며 PCR 산물의 크기도 430 bp로 확인되었다. 상기 도 4의 C 패널에 나타난 PCR 산물이 NewLeaf Plus 감자계통 특이적임을 재확인하기 위하여 염기서열분석을 수행하였다.
도 9는 본 발명의 NLYL-F＋NLPS-R 프라이머 세트에 의한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것으로, PCR 산물은 430개의 염기로 구성되었으며, 1∼21번까지의 염기는 NLYL-F 프라이머 염기서열과 일치하였으며, 410∼430번까지의 염기는 NLPS-R 프라이머와 상보적인 염기서열을 가지고 있음이 확인되었다. 또한 303번부터 PLRV 바이러스의 replicase 유전자의 단백질의 아미노산을 코드함을 확인할 수 있었다.
도 10은 NLYL-F＋NLPS-R 프라이머 세트로 증폭된 PCR 산물의 염기서열에 대한 DNA 상동성(homology) 분석을 나타낸 것이다. 도에 나타난 바와 같이, 1∼206번까지의 염기서열은 피그워-트 모자이크 바이러스 프로모터 염기서열(EMBL accession No. X06166.1)과 100%의 상동성을 보였고(도 10의 A), 289번부터는 PLRV-rep 유전자의 염기서열과 100%을 상동성을 보였다(도 10의 B).
따라서, 본 발명에 의한 NLYL-F 및 NLPS-R 프라이머를 활용한 PCR 증폭실험에 의해 피그워-트 모자이크 바이러스 프로모터 및 PLRV-rep 유전자가 도입된 유전자변형식물체, 예를들면 NewLeaf-plus 감자인지 여부에 대한 특이적 검출이 가능함을 확인할 수 있다.
(D) Cry3A-F＋Cry3A-R 프라이머 세트의 PCR 결과
Cry3A-F＋Cry3A-R 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과 NewLeaf, NewLeaf Y, NewLeaf Plus 감자 3종 4계통의 게놈 DNA를 주형으로 한 경우에만 특이적인 PCR 산물이 나타났으며 PCR 산물의 크기도 121 bp로 확인되었다(도 4의 D). 생성된 PCR산물이 Cry3A 유전자 특이적임을 재확인하기 위하여 염기서열분석을 수행하였다.
도 11는 본 발명의 Cry3A-F 프라이머/ Cry3A-R 프라이머에 의한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것으로, PCR 산물은 121개의 염기로 구성되었으며, 1∼19번까지의 염기는 Cry3A-F 프라이머 염기서열과, 103∼121번까지의 염기는 Cry3A-R 프라이머와 상보적인 염기서열을 가지고 있다.
도 12는 Cry3A-F 및 Cry3A-R 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열에 대한 DNA 상동성(homology) 분석을 나타낸 것이다. 도에서 볼 수 있듯이, PCR 산물은 식물 발현용 합성 Cry3A 유전자(EMBL No. X70979.1)와는 100% 일치하였다.
따라서, 본 발명에 의한 Cry3A-F 및 Cry3A-R 프라이머 세트를 활용한 PCR 증폭실험에 의해 합성 Cry3A 유전자(EMBL No. X70979.1)가 도입된 유전자변형식물체, 예를들면 NewLeaf, NewLeaf Y, NewLeaf Plus 감자 계통 모두를 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.
(E) UGP-F＋UGP-R 프라이머 세트의 PCR 결과
UGP-F＋UGP-R 프라이머 세트를 이용한 PCR 증폭실험 결과, 천연형 및 유전자변형인지 여부와 관계없이 감자의 게놈 DNA를 주형으로 한 경우에만 특이적인 PCR 산물이 나타났으며 PCR 산물의 크기도 131bp로 일치함을 확인하였다(도 4의 E). 프라이머를 첨가하지 않은 음성대조구 및 토마토, 고추 등의 타 가지과 작물의 게놈 DNA를 주형으로 한 경우에는 특이적인 PCR 산물이 나타나지 않았다. 상기 감자 유래의 PCR 산물에 대한 염기서열분석을 수행하였다.
도 13은 본 발명의 UGP-F＋UGP-R 프라이머에 의한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것으로, PCR 산물은 131개의 염기로 구성되었으며, 1∼20번까지의 염기는 UGP-F 프라이머 염기서열과 일치하였으며 111∼131번까지의 염기는 UGP-R 프라이머와 상보적인 염기서열을 가지고 있음이 확인되었다.
도 14는 UGP-F 프라이머 및 UGP-R 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열에 대한 DNA 상동성(homology) 분석을 보여준다. 증폭된 PCR 산물의 염기서열은 감자 내재유전자인 UGPase 유전자(GeneBank accesion No. U20345.1)의 염기서열과 100% 일치하였다.
따라서 본 발명에서 개발된 UGPase 특이 프라이머는 감자(천연형, 유전자변형 불문)에 대하여 특이성을 나타냄을 확인하였다.
적용예 2 : 표준플라스미드를 이용한 유전자변형감자의 혼입율 분석
상기 실시예에서 제작한 프라이머와 프로브의 특이성및 표준플라스미드의 정량성을 유전자변형감자인 NewLeaf, NewLeaf Y, NewLeaf Plus에 대하여 확인하였다.
상기에서 수득한 4 계통의 유전자변형감자[NewLeaf(S), NewLeaf(R), NewLeafY 및 NewLeaf Plus] 각각의 게놈 DNA 25 ng와, 각 5 단계별 카피수로 희석한 표준플라스미드 20, 300, 4,000, 70,000, 1,000,000 copies/2.5㎕와 표준플라스미드를 첨가하지 않은 NTC(no template control)를 주형으로 하여 총 2세트의 프라이머(Cry3A-F2/Cry3A-R, UGP-F2/UGP-R2) 각 1.25 μM과 프로브(Cry3A-Pb, UGP-Pb)각 0.5 μM를 첨가하여 실시간 PCR을 실시하였다. 또한 대조군으로 표준플라스미드를 넣지 않고 실시간 PCR을 실시하였다. 각 프라이머/프로브에 대한 실시간 PCR 조건은 상기 표 1에 언급한 바와 같았다.
5 단계의 카피수로 희석한 pCryugp 표준 플라스미드의 실시간 PCR 분석치를 표준곡선으로 하여 NewLeaf 감자 superior(SPBT 02-5) 계통, NewLeaf 감자 Russet Burbank(BT6) 계통, NewLeaf Y 감자 Shepody(SEMT 15-15) 계통, NewLeaf Plus 감자 Russet Burbank(RBMT 21-350)에 대하여 UGPase 내재유전자에 대한 Cry3A 유전자의 도입 카피수의 비, 즉 보정계수를 설정하였다.
하기 표 9에 상기의 유전자변형감자 3종의 4계통에 대한 UGPase 유전자와 Cry3A 유전자 카피수 및 보정계수를 나타내었다.
따라서, 본 발명에 의한 표준플라스미드를 활용하면 식물(예를들면 감자)에서 유전자변형 개체의 혼입률을 간단하고 정확하게 분석할 수 있게 된다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 유전자변형감자 검정용 PCR 프라이머와 프로브 및 표준플라스미드는 각 유전자변형감자 계통을 특이적으로 검출할 수 있어, 현재 유통 중이거나 수입되는 농산물 및 식품 중의 유전자변형감자를 정성 및 정량적으로 검정하는 GMO 판별에 이용할 수 있다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer Sets, Probes and A Standard Plasmid for Qualitative and Quantitative Detection of GMO <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for identifying 35s Promoter sequence <400> 1 cccactatcc ttcgcaagac c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for identifying Cry3A sequence <400> 2 cgtaaccgga gatagcaaag c 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for identifying FMV Promoter sequence <400> 3 tggtgcagaa ttgttaggcg 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for identifying PVY cp sequence <400> 4 ggatgctgct ttgctctgg 19 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for identifying PVY rep sequence <400> 5 cagagtaatc cccactcgag g 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for identifying Cry3Aa sequence <400> 6 tgtggccatc cgcagttta 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for identifying Cry3Aa sequence <400> 7 caagagactg cgccaacgt 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for identifying Cry3Aa sequence <400> 8 ccgcagttta ctcaggcgtc 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for identifying Cry3Aa sequence <400> 9 cgatcagacg atgaggcca 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for identifying UGPase sequence <400> 10 gctgagggaa gcgagactga 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for identifying UGPase sequence <400> 11 caatccttct tgggcctacc t 21 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for identifying UGPase sequence <400> 12 ctctccatac tctctgctcc tcg 23 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for identifying UGPase sequence <400> 13 cggcatcagc aggagaaag 19 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for identifying UGPase sequence <400> 14 tcacaatctt cttctctgct atggtcactg ct 32

Claims (10)

  1. NLL-F 프라이머(서열번호 1), NLL-R 프라이머(서열번호 2), Cry3A-F 프라이머(서열번호 6), Cry3A-R 프라이머(서열번호 7) 및 Cry3A-F2 프라이머(서열번호 8)로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2개의 프라이머를 포함하는 해충저항성 유전자변형 식물체 검정용 PCR 프라이머 세트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 유전자 변형 식물체는 감자인 것을 특징으로 하는 해충저항성 유전자변형 식물체 검정용 PCR 프라이머 세트.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 의한 해충저항성 유전자변형 식물체 검정용 PCR 프라이머 세트에 추가하여 사용되는 Cry3A-pb 프로브(서열번호 9).
  4. NLYL-F 프라이머(서열번호 3) 또는 NLYM-R 프라이머(서열번호 4) 및 NLPS-R 프라이머(서열번호 5)로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2개의 프라이머를 포함하는 해충 및 바이러스 복합저항성 유전자변형 식물체 검정용 PCR 프라이머 세트.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 유전자변형 식물체는 감자인 것을 특징으로 하는 해충 및 바이러스 복합저항성 유전자변형 식물체 검정용 PCR 프라이머 세트.
  6. UGP-F 프라이머(서열번호 10), UGP-R 프라이머(서열번호 11), UGP-F2 프라이머(서열번호 12) 및 UGP-R2 프라이머(서열번호 13)로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2개의 프라이머를 포함하는 UDP-glucose phosphorylase 유전자 검정용 PCR 프라이머 세트.
  7. 제 6 항에 있어서,
    천연형 및 유전자변형 감자의 UDP-glucose phosphorylase 검정용 PCR 프라이머 세트.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 의한 해충저항성 유전자변형 식물체 검정용 PCR 프라이머 세트에 추가하여 사용되는 UGP-pb 프로브(서열번호 14).
  9. 유전자변형 식물체를 동시에 정성 및 정량 검정하는 용도로 사용되는 pCryugp 표준 플라스미드.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 유전자변형 식물체는 감자인 것을 특징으로 하는 pCryugp 표준 플라스미드.
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