RU2658352C2 - ДНК-маркер для количественного определения геномной ДНК картофеля в растительном сырье и в продуктах, получаемых на его основе, в том числе при количественной идентификации ГМО - Google Patents
ДНК-маркер для количественного определения геномной ДНК картофеля в растительном сырье и в продуктах, получаемых на его основе, в том числе при количественной идентификации ГМО Download PDFInfo
- Publication number
- RU2658352C2 RU2658352C2 RU2015149456A RU2015149456A RU2658352C2 RU 2658352 C2 RU2658352 C2 RU 2658352C2 RU 2015149456 A RU2015149456 A RU 2015149456A RU 2015149456 A RU2015149456 A RU 2015149456A RU 2658352 C2 RU2658352 C2 RU 2658352C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- potato
- products
- tuberosum
- quantitative
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к ДНК-маркеру для количественного определения геномной ДНК картофеля S. tuberosum в растительном сырье, а также в продуктах, получаемых на его основе, путем проведения массового анализа методом ПЦР в режиме реального времени по технологии TaqMan. Изобретение позволяет эффективно определять количество геномной ДНК картофеля S. tuberosum в растительном сырье, а также в продуктах, получаемых на его основе. 6 ил., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для количественного обнаружения продуктов переработки картофеля в растительном сырье и пищевых продуктах, в том числе генетически модифицированных.
Изобретение представляет собой ДНК-маркер для количественного определения геномной ДНК картофеля S. tuberosum в растительном сырье, а также в продуктах, получаемых на его основе, путем проведения массового анализа методом ПЦР в режиме реального времени по технологии TaqMan с использованием оригинальной нуклеотидной последовательности фрагмента гена Stp23 картофеля, кодирующего фермент α-глюкан фосфорилазу, специфичных олигонуклеотидных ПЦР-праймеров и зонда для амплификации этого фрагмента ДНК.
Изобретение предназначено для количественного и качественного обнаружения ДНК картофеля в растительном сырье (в том числе генетически модифицированном) и производимых из него продуктах питания (крупа, чипсы, экстракты и пр.). Использование ДНК-маркера позволяет определить содержание ДНК картофеля в исследуемом образце и избежать возможности получения ложного результата. Оригинальный подбор олигонуклеотидных последовательностей для количественного определения геномной ДНК картофеля в растительном сырье и производимых из него продуктах питания, обеспечивает высокую чувствительность предлагаемого метода и достоверность получаемых результатов. Чувствительность предлагаемого метода составляет не менее 0,05% содержания ДНК картофеля в общей ДНК исследуемого материала. Положительная амплификация наблюдается уже при наличии в тотальной ДНК исследуемого образца не менее 15 копий картофельной ДНК (предел чувствительности, LOD), а количественное определение содержания ДНК картофеля возможно при наличии не менее 25 копий в тотальной ДНК исследуемого образца (предел количественного определения, LOQ).
Особенностью проведения реакции по технологии TaqMan является наличие в реакционной смеси не двух синтетических олигонуклеотов, а трех, причем третий олигонуклеотид - TaqMan зонд - в реакции полимеризации прямо не участвует, а только гибридизуется (специфично связывается) с внутренним участком вновь синтезированной цепи ДНК получаемого в реакции ПЦР-фрагмента. При разрушении в процессе реакции TaqMan-зонда, гибридизовавшегося с целевой нуклеотидной последовательностью, освобождающийся из зонда флуоресцентный краситель под действием возбуждающего лазерного излучения приобретает способность к свечению, регистрация которого свидетельствует о наличии в образце искомой ДНК, в том числе из генетически модифицированного источника (Фиг. 1).
Предлагаемое изобретение представляет собой ДНК-маркер (оригинальная нуклеотидная последовательность фрагмента гена Stp23 картофеля, кодирующего α-глюкан фосфорилазу, последовательность праймеров для амплификации фрагмента и последовательность TaqMan зонда) для количественного определения геномной ДНК картофеля S. tuberosum в растительном сырье, а также в продуктах, получаемых на его основе. В качестве стандарта (образца с известной концентрацией) при количественном определении содержания ДНК картофеля используют ДНК, выделенную из листового материала растений картофеля. Стандарт ДНК может быть выделен из растений любого сорта картофеля вида S. tuberosum.
Альфа-глюкан фосфорилаза (крахмал фосфорилаза) (ЕС 2.4.1.1) является ферментом фосфоролитической деградации крахмала и катализирует обратимую реакцию, в результате которой, α(1→4) глюкозидная связь на нередуцируемом конце боковой цепи глюканов претерпевает фосфоролиз.
По данным секвенирования генома картофеля было показано, что фермент кодируется однокопийным геном Stp23, а его последовательность высокоспецифична для генома картофеля (Potato Genome Sequencing Consortium, 2011). Монокопийное состояние гена, а также высокая специфичность праймерных систем делает ДНК маркер на его основе наиболее эффективными при количественном определении геномной ДНК картофеля методом ПЦР в режиме реального времени (Фиг. 2). На фиг. 2 приведен анализ продуктов амплификации ДНК картофеля и томатов с использованием предложенного ДНК-маркера. (А)- Образцы картофеля сортов Каменский, Матушка, Спиридон, Крепыш, Кортни, Лазурит, Яхонт, Атлант, Bintje; (В)- томатов сортов Чаровница, Дубок, Лотос, Росинка, Гурман, Грот, S.lycopersicum ssp. Humboldti.
Процедуру выявления геномной ДНК картофеля в анализируемом образце проводят одновременно с определением количественного содержания ДНК, что значительно упрощает процедуру выполнения анализа и позволяет повысить пропускную способность лабораторной обработки за счет уменьшения числа технологических операций.
Использование ДНК-маркера для диагностики геномной ДНК картофеля S. tuberosum в растительном сырье и продуктах на его основе позволяет быстро и с высокой точностью провести количественную оценку числа целевых фрагментов ДНК длиной 221 пар оснований.
Количественное определение содержания ДНК картофеля в тотальной ДНК исследуемого образца осуществляют путем сравнения сигнала, полученного в реакции с ДНК анализируемого образца со стандартной кривой, построенной с использованием стандарта - образца ДНК картофеля с известной концентрацией (Фиг. 3).
ДНК-маркер пригоден для массовой количественной и качественной детекции присутствия продуктов переработки картофеля в пищевых продуктах, в том числе и полученных с применением генетически модифицированных источников (Фиг. 5 и 6). На фиг. 5 приведены результаты амплификации ДНК картофеля в растительном сырье и в продуктах переработки картофеля с использованием заявленного ДНК-маркера. 1 - чипсы картофельные «Дон Густо» (ЗАО «Бриджтаун Фудс», РФ), 2 - картофельное пюре (ООО «Импрод», РФ), 3 - клубни картофеля «Ашан-Гагаринский» (РФ, г. Москва), 4 - картофельные чипсы «Лейз» ООО «Фрито Лей Мануфактуринг» (РФ, г. Кашира), 5 - Картофель сорт Елизавета (листья), 6 - Томатная паста «Первым делом» ООО «Бастион» (РФ, Санкт-Петербург). На фиг. 6 показано количественное определение содержания ДНК картофеля в пищевых продуктах с использованием заявленного ДНК-маркера. Где «
-контрольные растворы с известным содержанием ДНК картофеля (стандарты); 
- анализируемые образцы: I (картофельное пюре «Ролтон» ООО «Маревен Фуд Сантрал» (РФ, д. Ивановское), II (картофельные чипсы «Лейз» ООО «Фрито Лей Мануфактуринг» (РФ, г. Кашира).
В области практического применения подобные анализы проводят при определении компонентного состава сложных пищевых продуктов (кулинарные изделия, консервы, диетические продукты). В ряде случаев наличие сырья из картофеля может негативно отражаться на потребительских качествах пищевой продукции. Предлагаемый ДНК-маркер позволяет как количественно, так и качественно установить наличие картофельного сырья в проверяемом пищевом продукте. Чувствительность предлагаемого метода составляет не менее 0,05% содержания ДНК картофеля в общей ДНК исследуемого материала. Положительная амплификация наблюдается уже при наличии в тотальной ДНК исследуемого образца не менее 15 копий картофельной ДНК (предел чувствительности, LOD), а количественное определение содержания ДНК картофеля возможно при наличии не менее 25 копий в тотальной ДНК исследуемого образца (предел количественного определения, LOQ) (Фиг. 4).
В настоящее время для обнаружения ДНК заданного объекта в растительном материале и продуктах на его основе (крупа, экстракты и проч.), в том числе и генетически модифицированных, используют два альтернативных подхода, основанных на качественной идентификации либо чужеродных белков, либо нуклеиновых кислот.
Известен способ идентификации трансгенных белков растений с использованием соответствующих антител (Stave J.W., Food Control, 1999,vol. 10, pp. 367-374), а также способ детекции генетически модифицированных растений, содержащих NPT 11 белок, с использованием канамицина и/или паромомицина (US 2003/0017599 А1). Известен метод обнаружения рекомбинантных чужеродных белков в продуктах питания с использованием специфических антител к данным белкам (патент №WO 0198523 (А2) - DETECTION METHOD OF GENETIC RECOMBINANT FOOD AND DETECTION KIT OF THAT, авторы PARK НЕЕ-YOUNG [KR], GD BIOTECH CO LTD [KR]; PARK НЕЕ YOUNG [KR], 2001). Но так как белки при химических и/или физических воздействиях различного рода способны изменять как свою конформацию, так и вторичную структуру, то обнаружение чужеродных белков в продуктах, прошедших термическую, химическую или микробиологическую обработку, указанными выше способами становится невозможным. Кроме того, эти методы обладают достаточно низкой чувствительностью, занимают много времени и требуют значительных материальных затрат.
Известен способ идентификации последовательностей ДНК в растительном материале и продуктах на его основе с использованием специфических праймеров и флуоресцентно меченых зондов, комплементарных последовательностям чужеродной (трансгенной) ДНК (заявка на патент 2008146091/13, СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ТРАНСГЕННЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ И ПРОДУКТАХ НА ЕГО ОСНОВЕ, авторы - Абрамов Д.Д., Кузнецов В.В., Митрохин И.А., Цыдендамбаев В.Д. 24.11.2008. Заявка 2009123913/10 на патент СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ И ИСТОЧНИКОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, НЕ ЗАРЕГИСТРИРОВАННЫХ В "ГОСУДАРСТВЕННОМ РЕЕСТРЕ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, МАТЕРИАЛОВ И ИЗДЕЛИЙ, РАЗРЕШЕННЫХ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ИЛИ ВВОЗА НА ТЕРРИТОРИЮ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ И ОБОРОТА", ГЕНОМ КОТОРЫХ СОДЕРЖИТ ПРОМОТОР 35S И/ИЛИ ТЕРМИНАТОР NOS, авторы - Абрамов Д.Д., Кузнецов В.В., Колин В.В, Митрохин И.А., Цыдендамбаев В.Д., 24.06.2009).
Таким образом, в патентных базах были выявлены патенты и заявки как на белковые, так и ДНК-маркеры для идентификации ГМО в объектах растительного происхождения, мониторинга пищевых продуктов и других товаров массового потребления, получаемых из различных культурных растений.
Белковые маркеры, как правило, нестабильны и методы детекции с их использованием не отличаются достаточной чувствительностью. В свою очередь, ДНК маркеры высокоспецифичны. Но известные в настоящее время ДНК-маркеры, как правило, относятся либо к другим культурам, и не распространяют свое действие на картофель, либо базируются на последовательностях чужеродных ДНК, входящих в конструкцию (последовательностей crylAb, EPSPS, 35S промотора и др.), в то время как никаких специфичных референсных маркеров на присутствие геномной ДНК Solarium tuberosum ГМО описано не было. Кроме того, использование фрагментов ДНК фитопатогенов как маркеров может приводить к ложно-позитивным результатам в случае, если исходные растения были заражены соответствующими вирусами и/или бактериями.
В настоящее время известен метод количественного и качественного анализа генетически модифицированных растений (бобы, кукуруза) и продуктов их переработки на основе масс-спектрометрии и проведения rcPCR (real-competitive PCR) с использованием наборов специфических праймеров (патент № KR20110126306, А METHOD FOR ANALYZING GMO USING COMPETITIVE PCR, авторы Lee Myung Hoon; Han Sang Mi; Lee Soo Bin; Lee Hyun Chul, D & AMP P BIOTECH LTD).
Также известен метод качественной и количественной детекции генетически модифицированного картофеля в продуктах его переработки с помощью праймеров и стандартной плазмиды. Для детекции используют наборы праймеров NLL, Cry3A, UGP-pb, в том числе праймеры на основе гена UDP-glucose phosphorylase (патент № KR20040079053, PRIMER SETS AND PROBES FOR DETECTION OF GMO, AND STANDARD PLASMID FOR QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DETECTION OF GMO TO EFFECTIVELY CARRY OUT QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DETECTION OF GMO IN AGRICULTURAL PRODUCTS AND FOODS, авторы AHN IL PYEONG; KANG SANG HO; KIM TAE SAN; KIM YEONG MI; LEE THERESA; NOH JAE GYUN; PARK YONG HWAN, REPUBLIC KOREA MAN RURAL DEV., 2004).
Также известен метод качественной и количественной детекции ДНК картофеля в продуктах его переработки с помощью праймеров, специфичных для гена UDP-glucose phosphorylase картофеля (Savini С, Foti N., Mazzara M., Charles Delobel С, Van Den Eede G.; "Event-specific Method for the Quantification of Event EH92-527-1 Potato Using Real-time PCR - Validation Report and Protocol - Sampling and DNA Extraction of Potato" Online Publication (2006), DOI 10.2788/30418), однако, релевантность этого метода является невысокой, так как маркер был разработан на основании последовательности геномной ДНК единственного генетического варианта картофеля -линии Lemhi 10.
Также известен метод качественной и количественной детекции пластидной ДНК картофеля (Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Qualitative nucleic acid based methods" ISO 21569:1-69 (2005), ISO 34614), однако этот метод обладает еще более низкой релевантностью, так как содержание пластидной ДНК в клубнях картофеля крайне низкое по сравнению с геномной ДНК.
Наиболее близким к предлагаемой системе обнаружения геномной ДНК заданного объекта в растительном сырье и продуктах его переработки является анализ ДНК с применением метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими олигонуклеотидными праймерами для ДНК картофеля (патент №2539756 ВЫСОКОСПЕЦИФИЧНЫЙ ДНК-МАРКЕР, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ЭНДОГЕННОГО РЕФЕРЕНСНОГО КОНТРОЛЯ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНОМНОЙ ДНК КАРТОФЕЛЯ В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ, В ТОМ ЧИСЛЕ ПРИ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГМО. Авторы Кочиева Е.З., Сухачева М.В., Рыжова Н.Н., Борис К.В., Кузнецов Б.Б.). Однако описанный выше метод идентификации не позволяет провести количественное определение ДНК картофеля в биологическом образце. Методы анализа, основанные на проведении качественной полимеразной цепной реакции (ПЦР), не обладают достаточной чувствительностью и не пригодны для детекции следовых количеств ДНК объекта в исследуемом материале. Применение метода ПЦР в реальном времени позволяет преодолеть указанный недостаток. Предлагаемый ДНК-маркер для количественного определения геномной ДНК картофеля S. tuberosum в растительном сырье, а также в продуктах, получаемых на его основе, позволяет не только детектировать присутствие ДНК картофеля в анализируемом образце, но и количественно определить ее содержание. Причем чувствительность предлагаемого ДНК-маркера составляет не менее 0,05% от тотальной ДНК исследуемого образца.
Задачей заявляемого изобретения является количественная идентификация геномной ДНК картофеля S. tuberosum в растительном сырье, в том числе генетически модифицированном, продуктах питания, получаемых на его основе, а также в увеличении пропускной способности лабораторной диагностики за счет уменьшения числа технологических операций при проведении анализа.
Для количественного определения геномной ДНК картофеля S. tuberosum в растительном сырье и продуктах питания предложен ДНК-маркер, включающий оригинальную нуклеотидную последовательность фрагмента гена Stp23 картофеля, используемую в качестве стандарта, разработанные специфичные олигонуклеотидные праймеры и зонд для проведения ПЦР в режиме реального времени по технологии TaqMan. Использование ДНК-маркера позволяет количественно с высокой точностью (не менее 0,05%) определить содержание ДНК картофеля в исследуемом образце и избежать возможности получения ложного результата. В этом отношении высокоспецифичные для картофеля Solarium tuberosum последовательности гена Stp23 представляют определенный интерес. Монокопийное состояние гена, а также высокая специфичность делает ДНК маркеры на его основе наиболее эффективными при количественном определении геномной ДНК картофеля методом ПЦР в режиме реального времени. Кроме того, предлагаемый ДНК-маркер прост в применении и не требует больших временных, трудовых и денежных затрат.
Техническими результатами заявленного изобретения являются:
- возможность количественной оценки присутствующей в биологических образцах ДНК заданного объекта;
- высокая чувствительность метода (не менее 0,05%);
- выявления ДНК заданного объекта в исследуемых образцах любой консистенции;
- увеличение пропускной способности лабораторной диагностики за счет уменьшения числа технологических операций при проведении анализа.
Указанные технические результаты достигаются следующим образом: Количественное определение содержания ДНК картофеля в тотальной ДНК исследуемого образца осуществляют путем сравнения сигнала, полученного в анализируемом образце, со стандартной кривой, построенной с использованием так называемого стандарта - образца ДНК картофеля с известной концентрацией. Чувствительность предлагаемого метода составляет не менее 0,05% от общей ДНК исследуемого образца. Положительная амплификация идет при наличии в тотальной ДНК исследуемого образца не менее 15 копий картофельной ДНК, а точное количественное определение содержания ДНК картофеля возможно при наличии не менее 25 копий в тотальной ДНК исследуемого образца.
Таким образом, данное изобретение должно быть представлено:
а) специфическими праймерами и TaqMan-зондом, позволяющим количественно определять геномные копии целевой (картофельной) ДНК в растительном материале, в том числе и генетически модифицированном, а также в продуктах переработки картофеля;
SEQ ID №1 5' - TTATTAATTGGAATGCTACGTATGATA
SEQ ID №2 5' - CTCTCATGTGTAACAGTAAATATACA
Зонд SEQ ID №3 FAM-5'GTATGACTGTGCAGAGTGACCTTAAAT3'-RTQ1
б) стандартным образцом - последовательностью фрагмента гена альфа-глюкан фосфорилазы Stp23 с известной концентрацией, позволяющем оценить концентрацию искомой последовательности ДНК в исследуемом образце и избежать возможности получения ложного результата.
Предлагаемый метод позволяет быстро и с высокой точностью провести количественную оценку геномных копий ДНК картофеля в растительном сырье и продуктах на его основе, причем в образцах любой консистенции (Фиг. 5 и 6).
Регистрация результатов ПЦР осуществляется с помощью программного модуля CFX Manager, что дает возможность количественно интерпретировать полученные результаты.
Программный модуль предназначен для построения кривой титрования образцов с известным содержанием ДНК методом наименьшего среднего, определения математической зависимости порога детектирования Ct от концентрации целевого гена и последующего количественного определения содержания целевого гена в опытных образцах. Он рассчитан на анализ 96-луночного ПЦР планшета, в котором одновременно могут находиться соответствующие разведения стандарта, негативный контроль и анализируемые образцы, причем в нескольких повторностях.
ДНК-маркер применим для массового скрининга целевой ДНК картофеля в любых видах пищевых продуктов, и других товаров массового потребления, включая ГМО.
Примеры
Пример 1. Построение калибровочных кривых для количественного определения геномной ДНК картофеля в растительном сырье и продуктах, получаемых на его основе.
Реакционная смесь для проведения ПЦР в режиме реального времени содержит следующие компоненты:
Амплификацию проводили на программируемом термоциклере РТС 1000 с модулем RT-ПЦР CFX96 (BioRad, USA). Протокол проведения ПЦР в режиме реального времени:
Для приготовления стандартов (контрольных растворов с известным содержанием ДНК картофеля - 0,1%, 0,4%, 1%, 2%, 5%, 10% и т.д.) стандартный образец, представляющий собой оригинальную нуклеотидную последовательность фрагмента гена Stp23 картофеля, кодирующего фермент α-глюкан фосфорилазы, разводили в растительной ДНК (томатов) следующим образом:
Измерение концентрации ДНК в водном растворе стандартного образца проводили спектрофотометрически с помощью системы Qubit (Invitrogen). Результатом измерений является среднее значение, вычисленное по результатам проведения пяти измерений.
Анализ результатов проводили с помощью программного модуля CFX Manager. Величина наклона стандартной кривой составляет - 3,012, достоверность линейной аппроксимации - 0,998, что свидетельствует о высокой эффективности ПЦР (Фиг. 3).
Положительная амплификация идет при наличии в тотальной ДНК исследуемого образца не менее 15 копий картофельной ДНК, а точное количественное определение содержания ДНК картофеля возможно при наличии не менее 25 копий в тотальной ДНК исследуемого образца. Чувствительность предлагаемого метода составляет не менее 0,05% ДНК картофеля в общей ДНК исследуемого образца (Фиг. 4).
Пример 2. Количественное определение содержания геномной ДНК картофеля в анализируемых образцах с использованием разработанного ДНК-маркера.
Для осуществления метода рекомендуется проводить экстракцию ДНК из исследуемых образцов согласно (Булыгина и др., 2009) или с применением любых наборов, предназначенных для выделения ДНК. Образцы с повышенным содержанием жиров (>20%) следует предварительно обработать хлороформом. Концентрация ДНК в получаемых препаратах должна составлять 50-150 мкг/мл. При этом РНК в препаратах должна присутствовать в следовых количествах - менее 1%, согласно данным электрофоретического анализа. Оценку качества и количества экстрагированной ДНК производят путем измерения оптической плотности раствора ДНК на спектрофотометре (Bio Photometer, Eppendorf или SmartSpec 3000, Bio-Rad, США, Qubit, Invitrogen) или при помощи аналитического электрофореза.
Для выявления геномной ДНК картофеля S. tuberosum в растительном сырье и в получаемых на его основе продуктах с использованием заявленного ДНК-маркера были взяты чипсы картофельные «Дон Густо» (ЗАО «Бриджтаун Фудс», РФ), картофельное пюре (ООО «Импрод», РФ), клубни картофеля «Ашан - Гагаринский» (РФ, г. Москва), картофельные чипсы «Лейз» ООО «Фрито Лей Мануфактуринг» (РФ, г. Кашира) и томатная паста «Первым делом» ООО «Бастион» (РФ, Санкт-Петербург) (фиг. 5).
При количественном определении содержания ДНК картофеля в пищевых продуктах с использованием предложенного ДНК-маркера установлено, что образец I (картофельное пюре «Ролтон» ООО «Маревен Фуд Сантрал» (РФ, д. Ивановское)) содержит 6% картофельной ДНК от тотальной ДНК исследуемого образца, а образец II (картофельные чипсы «Лейз» ООО «Фрито Лей Мануфактуринг» (РФ, г. Кашира))-40% (Фиг. 6).
Литература
1. Potato Genome Sequencing Consortium, Xu X, Pan S, Cheng S, Zhang B, Mu D, Ni P, Zhang G, Yang S, Li R, Wang J, Orjeda G, Guzman F, Torres M, Lozano R, Ponce O, Martinez D, De la Cruz G, Chakrabarti SK, Patil VU, Skryabin KG, Kuznetsov BB, Ravin NV, Kolganova TV, Beletsky AV, Mardanov AV, Di Genova A, Bolser DM, Martin DM, Li G, Yang Y, Kuang H, Hu Q, Xiong X, Bishop GJ, Sagredo B, Mejia N, Zagorski W, Gromadka R, Gawor J, Szczesny P, Huang S, Zhang Z, Liang C, He J, Li Y, He Y, Xu J, Zhang Y, Xie B, Du Y, Qu D, Bonierbale M, Ghislain M, Herrera Mdel R, Giuliano G, Pietrella M, Perrotta G, Facella P, 
K, Feingold SE, Barreiro LE, Massa GA, Diambra L, Whitty BR, Vaillancourt B, Lin H, Massa AN, Geoffroy M, Lundback S, DellaPenna D, Buell CR, Sharma SK, Marshall DF, Waugh R, Bryan GJ, Destefanis M, Nagy I, Milbourne D, Thomson SJ, Fiers M, Jacobs JM, Nielsen KL, Sonderkaer M, Iovene M, Torres GA, Jiang J, Veilleux RE, Bachem CW, de Boer J, Borm T, Kloosterman B, van Eck H, Datema E, Hekkert Bt, Goverse A, van Ham RC, Visser RG. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. Nature. 2011 Jul 10; 475(7355):189-95. Altschul, S; Gish, W; Miller, W; Myers, E; Lipman, D (October 1990). "Basic local alignment search tool". Journal of Molecular Biology 215 (3):403-410.
2. Булыгина E.C., Колганова T.B., Сухачева M.B., Пантелеева А.Н., Патутина Е.О., Кузнецов Б.Б. Выделение ДНК из различных пищевых продуктов с помощью модифицированного щелочного метода. Биотехнология. №2, с. 83-90, 2009.
Claims (10)
- ДНК-маркер для количественного определения геномной ДНК картофеля S. tuberosum в растительном сырье, а также в продуктах, получаемых на его основе, путем проведения массового анализа методом ПЦР в режиме реального времени по технологии TaqMan включает:
- - оригинальную нуклеотидную последовательность фрагмента гена Stp23 картофеля длиной 221 п. н., используемую в качестве стандартного образца с известной концентрацией и позволяющей количественно оценить содержание целевой картофельной ДНК в исследуемом материале и избежать возможности получения ложного результата
- TTATTAATTGGAATGCTACGTATGATATTTATGAAAAGCTGAACATGAAGCAA
- GCGTACTATCTATCCATGGAATTTCTGCAGGTATCTCATTATTCTTACTTTCTCT
- TTTGCTCTTTTGTATGACTGTGCAGAGTGACCTTAAATTATATCTAGTAAGAAA
- TTAATCCGTTTGATATTTGCTGACAAATTAGACTGTATATTTACTGTTACACAT
- GAGAG
- - олигонуклеотидные праймеры - затравки полимеразной цепной реакции
- SEQ ID №1 5' - TTATTAATTGGAATGCTACGTATGATA и SEQ ID №2 5' -CTCTCATGTGTAACAGTAAATATACA, позволяющие амплифицировать фрагмент гена Stp23 у культурного картофеля S. tuberosum и родственных дикорастущих видов рода Solarium sect. Petota, а также в продуктах переработки картофеля
- - зонд SEQ ID №3 FAM-5'GTATGACTGTGC AGAGTGACCTTAAAT3'-RTQ1, позволяющий количественно определять фрагмент гена Stp23 у культурного картофеля S. tuberosum и родственных дикорастущих видов рода Solanum sect. Petota, а также в продуктах переработки картофеля.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015149456A RU2658352C2 (ru) | 2015-11-18 | 2015-11-18 | ДНК-маркер для количественного определения геномной ДНК картофеля в растительном сырье и в продуктах, получаемых на его основе, в том числе при количественной идентификации ГМО |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015149456A RU2658352C2 (ru) | 2015-11-18 | 2015-11-18 | ДНК-маркер для количественного определения геномной ДНК картофеля в растительном сырье и в продуктах, получаемых на его основе, в том числе при количественной идентификации ГМО |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015149456A RU2015149456A (ru) | 2017-05-19 |
| RU2658352C2 true RU2658352C2 (ru) | 2018-06-20 |
Family
ID=58715563
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015149456A RU2658352C2 (ru) | 2015-11-18 | 2015-11-18 | ДНК-маркер для количественного определения геномной ДНК картофеля в растительном сырье и в продуктах, получаемых на его основе, в том числе при количественной идентификации ГМО |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2658352C2 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040079053A (ko) * | 2003-03-06 | 2004-09-14 | 대한민국(관리부서:농촌진흥청) | 유전자변형 식물체 분석용 프라이머 세트, 프로브 및표준플라스미드 |
| RU2009123913A (ru) * | 2009-06-24 | 2010-12-27 | Закрытое акционерное общество "НПФ ДНК-Технология" (RU) | Способ выявления генно-инженерно-модифицированных организмов и источников растительного происхождения, не зарегистрированных в "государственном реестре пищевых продуктов, материалов и изделий, разрешенных для изготовления на территории российской федерации или ввоза на территорию российской федерации и оборота", геном которых содержит промотор 35 s и/или терминатор nos |
| RU2539756C1 (ru) * | 2013-09-30 | 2015-01-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" Российской академии наук | Высокоспецифичный днк-маркер, используемый в качестве эндогенного референсного контроля для обнаружения геномной днк картофеля в растительном материале и пищевых продуктах, в том числе при идентификации гмо |
-
2015
- 2015-11-18 RU RU2015149456A patent/RU2658352C2/ru not_active Application Discontinuation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040079053A (ko) * | 2003-03-06 | 2004-09-14 | 대한민국(관리부서:농촌진흥청) | 유전자변형 식물체 분석용 프라이머 세트, 프로브 및표준플라스미드 |
| RU2009123913A (ru) * | 2009-06-24 | 2010-12-27 | Закрытое акционерное общество "НПФ ДНК-Технология" (RU) | Способ выявления генно-инженерно-модифицированных организмов и источников растительного происхождения, не зарегистрированных в "государственном реестре пищевых продуктов, материалов и изделий, разрешенных для изготовления на территории российской федерации или ввоза на территорию российской федерации и оборота", геном которых содержит промотор 35 s и/или терминатор nos |
| RU2539756C1 (ru) * | 2013-09-30 | 2015-01-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" Российской академии наук | Высокоспецифичный днк-маркер, используемый в качестве эндогенного референсного контроля для обнаружения геномной днк картофеля в растительном материале и пищевых продуктах, в том числе при идентификации гмо |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SAVINI С. et al., Event-specific Method for the Quantification of Event EH92-527-1 Potato Using Real-time PCR, Validation Report and Protocol - Sampling and DNA Extraction of Potato, Online Publication, 2006. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015149456A (ru) | 2017-05-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9562267B2 (en) | Standard plasmid for assaying genetically modified organism, and analysis method and assay kit using same | |
| EP1760160A2 (en) | Methods and kits for detecting genetically modified organisms (GMO) | |
| KR101159866B1 (ko) | 소맥 내재성 ｄｎａ 서열의 검출 및 정량 방법 | |
| JP4399417B2 (ja) | 食品または食品原材料中の特定植物属の定量的ｐｃｒ検出法 | |
| CN106811514B (zh) | 鳖亚科生物成分特异性实时荧光检测方法及其试剂盒 | |
| RU2658352C2 (ru) | ДНК-маркер для количественного определения геномной ДНК картофеля в растительном сырье и в продуктах, получаемых на его основе, в том числе при количественной идентификации ГМО | |
| CN107299145B (zh) | 用于检测鉴别华支睾吸虫和/或扇棘单睾吸虫的引物组及试剂盒 | |
| Chaumpluk et al. | Postharvest non-destructive determination of fruits: A model on fruit maturity assay via biosensor based on colorimetric change of gold nanoparticles | |
| KR100938415B1 (ko) | 밀의 검사 방법 | |
| JP5902517B2 (ja) | 小麦の検出方法 | |
| RU2700479C1 (ru) | Способ определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах | |
| US11060126B2 (en) | Methods for detecting genetically modified organisms (GMO) | |
| CN110408683B (zh) | 用于樱桃物种鉴定的特异性dna区段和引物 | |
| JP7091237B2 (ja) | 遺伝子組換え作物の検出方法 | |
| CN106676164B (zh) | 一种在待测样品中检测菠萝成分的方法 | |
| AL-ZAIDI et al. | CONVENTIONAL VERSUS MODERN TECHNIQUES USED FOR THE DETECTION OF PATHOGENS IN FOOD MATRICES: A REVIEW. | |
| RU2539756C1 (ru) | Высокоспецифичный днк-маркер, используемый в качестве эндогенного референсного контроля для обнаружения геномной днк картофеля в растительном материале и пищевых продуктах, в том числе при идентификации гмо | |
| RU2814552C1 (ru) | Способ идентификации ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| Çakır et al. | GMO analysis methods for food: From today to tomorrow | |
| Sieradzki et al. | Validation of procedures based on PCR reactions for detection and identification of genetically modified maize and soybean | |
| JP7446956B2 (ja) | Ｄｎａの検出方法 | |
| RU2725216C1 (ru) | Тест-система для определения ДНК ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| Miaw et al. | Bt11 event detection by real-time PCR: single-laboratory validation, comparison of DNA extraction and quantification techniques and application | |
| Žiarovská et al. | EFFECT OF DIFFERENT REVERSE TRANSCRIPTION APROACHES IN Pru p 3 TRANSCRIPTS SEMIQUANTITATIVE AMPLIFICATION. | |
| Yılmaz et al. | Single laboratory method performance evaluation for the analysis of Roundup Ready® soy flour by qualitative and quantitative detection methods |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FA92 | Acknowledgement of application withdrawn (lack of supplementary materials submitted) |
Effective date: 20171004 |
|
| FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20171221 |
|
| HE9A | Changing address for correspondence with an applicant |