CN103382444B - 一种能降解结晶纤维素的基因重组酿酒酵母 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及遗传工程和发酵工程领域，具体公开了一种能降解结晶纤维素的基因重组酿酒酵母。该基因重组酿酒酵母是将内切β-1,4-葡聚糖酶基因、外切β-1,4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因按照1:3:2的比例通过酿酒酵母表达载体同时转入酿酒酵母并获得正确的分泌表达而构建成的。本发明将上述三种酶基因按1:3:2的比例同时转入酿酒酵母中实现分泌表达，从而使得本发明的重组酵母能够按1:3:2的最佳协同作用比例同时分泌EG、CBH、BGL三种纤维素酶，因此能够较高效地降解结晶纤维素，进一步提高了纤维素-乙醇的转化效率。
Description
技术领域
本发明涉及遗传工程和发酵工程领域，更具体地，涉及一种能降解结晶纤
维素的基因重组酿酒酵母。
背景技术
目前我国车用燃料乙醇几乎都是用粮食玉米等为原料生产，大量生产燃料乙醇势必会带来车与人争粮的问题，直接推动粮食价格的不断上涨，并且会有引发食物短缺的危机。解决方式是尽量由纤维素生产乙醇而避免用淀粉和糖类来生产乙醇。在我国每年玉米秆、小麦秆、稻草、高粱秆有7亿吨的总量，但目前大部分秸秆都是焚烧，造成了环境污染，用这些农林废弃物作为原料来生产燃料乙醇是一个重点的发展方向，这种做法还可以缓解汽车尾气污染，减少温室效应，这也是目前全世界都在攻克的难关。
纤维素（Cellulose）是自然界中存在最广泛的碳水化合物，也是地球上数量最大而且廉价的可再生资源。由于纤维素具有水不溶性的结晶构造，韧性和刚性很强，使其很不容易降解，因此要利用纤维素则必须首先找到有效的办法破坏它的结晶结构。用物理方法既无法完全破坏纤维素的结构，又十分耗能；而化学方法虽然可以较完全地降解纤维素，但操作复杂、污染严重且不经济；因此，利用温和、低碳、环保的生物技术对纤维素进行生物转化才是今后前景看好的研究方向。
纤维素分子是由D-葡萄糖以β-1,4-糖苷键相联结而成的直链高分子。纤维素酶（Cellulase）是以能水解纤维素的β-1,4-糖苷键从而具有纤维素降解能力的一组酶的总称。一个完整的纤维素酶系，通常由作用方式不同但能相互协同催化水解纤维素的三类酶组成，即：(1)内切β-1,4-葡聚糖酶（Endoβ-1, 4-glucanase, EG），这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素片段；(2)外切β-1,4-葡聚糖酶（Exoβ-1, 4-glucanase, CBH），这类酶可以破坏纤维素的结晶结构，同时可以作用于纤维素链末端，每次切下一个纤维二糖分子；(3)β-葡萄糖苷酶（β-D-Glucosidase, BGL），这类酶能将纤维二糖水解成葡萄糖。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种便于培养和进行遗传操作的模式真核生物和模式实验系统，也是工业上乙醇发酵的首选菌种，具有将葡萄糖高效转化为乙醇的能力，但其缺乏有效降解纤维素生成葡萄糖的酶，在自然条件下不能直接利用纤维素类物质发酵产生乙醇，若能将纤维素酶系的酶基因导入酿酒酵母，以基因工程手段弥补了酿酒酵母纤维素降解能力的缺陷，从而可实现利用农业纤维素废弃物发酵生产燃料乙醇的工业化目的。然而，简单地将上述三种纤维素酶基因按1:1:1的比例共表达到酿酒酵母中的研究，近年来已在国内外多次出现，其中用于重组酵母发酵的碳源无一例外的均为去结晶化的纤维素原料。如最早由日本神户大学的Fujita等人于2004年率先完成的利用表面展示技术构建的共表达EG、CBH及BGL的重组酵母，使用了去结晶化的磷酸膨胀纤维素（phosphoric-acid swollen cellulose, PASC）发酵乙醇；又如2010年日本的Yanase等人将来源于里氏木霉的EG和CBH以及来源于曲霉的BGL基因在酿酒酵母中同时进行了表面展示和分泌的共表达，也使用了去结晶化的PASC发酵乙醇；2008年11月，青岛科技大学的张媛媛等在专利（CN 101311271A）中则使用了用硫酸高温高压处理过的去结晶化纤维素为原料进行EG、CBH及BGL共表达的重组酵母发酵；还有2008年12月暨南大学的刘泽寰等于公开的专利（CN 101319196）中构建了一种能同时分泌表达EG、CBH及BGL的重组酵母，使用了去结晶化的羧甲基纤维素（CMC）为原料进行乙醇发酵。可惜的是，上述这些研究所使用的发酵原料均为去结晶化的纤维素，如磷酸膨胀纤维素、羧甲基纤维素和硫酸处理过的纤维素等等，究其原因主要是因为按1:1:1克隆表达的EG、CBH及BGL三种纤维素酶之间的协同作用并不理想，对结晶纤维素的结晶破坏作用和降解能力仍然十分有限。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述不足，提供一种能
降解结晶纤维素的基因重组酿酒酵母。
本发明所要解决的另一技术问题是，提供一种能降解结晶纤维素的基因重
组酿酒酵母的构建方法。
一种能降解结晶纤维素的基因重组酿酒酵母，该基因重组酿酒酵母是将内切β-1,4-葡聚糖酶基因、外切β-1,4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因按照1:3:2的比例通过酿酒酵母表达载体同时转入酿酒酵母并获得正确的分泌表达而构建成的。
作为一种优选方案，所述的酿酒酵母表达载体为酿酒酵母多基因共表达载体。
作为一种优选方案，所述酿酒酵母多基因共表达载体为载体pScIKP（制备方法见专利ZL 2008 1 0029630.6）。
一种能降解结晶纤维素的基因重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将内切β-1,4-葡聚糖酶基因、外切β-1,4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因按照1:3:2的比例接入酿酒酵母表达载体中，构建重组多基因共表达载体；
S2.将上述构建得到的重组多基因共表达载体用限制性内切酶切割，使之线性化后转化到酿酒酵母中，构建转基因酿酒酵母。
作为一种优选方案，S1构建重组多基因共表达载体包括如下步骤：
S11.分别将内切β-1,4-葡聚糖酶基因、外切β-1,4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因进行PCR扩增；
S12.用限制性内切酶分别切割载体、内切β-1,4-葡聚糖酶基因、外切β-1,4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因；
S13.将内切β-1,4-葡聚糖酶基因、外切β-1,4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因分别接入载体，形成三个重组单基因载体；
S14.将含有载体启动子和终止子片段的完整的内切β-1,4-葡聚糖酶基因表达盒、外切β-1,4-葡聚糖酶基因表达盒和β-葡萄糖苷酶基因表达盒分别从三种重组单基因载体上切下，然后按照1:3:2的比例以串联表达盒eg2-cbh2-cbh2-cbh2-bgl1-bgl1的形式逐个接入同一酿酒酵母表达载体中。
作为一种优选方案，S2中所述的限制性内切酶为Apa I。
作为一种优选方案，S2中所述的转化是使用电转化法、冷冻法或化学试剂法进行转化。
作为一种优选方案，S12中用于切割内切β-1,4-葡聚糖酶基因、外切β-1,4-葡聚糖酶基因、β-葡萄糖苷酶基因的限制性内切酶均为BamH I和Spe I；S14中使用的限制性内切酶为同尾酶Nhe I和Xba I。
作为一种优选方案，所述的内切β-1,4-葡聚糖酶基因为绿色木霉的内切β-1,4-葡聚糖酶基因eg2；所述的外切β-1,4-葡聚糖酶基因为绿色木霉的外切β-1,4-葡聚糖酶基因cbh2；所述的β-葡萄糖苷酶基因为黑曲霉的β-葡萄糖苷酶基因bgl1。
作为一种最优选方案，所述的内切β-1,4-葡聚糖酶基因为绿色木霉AS3.3711（购自广东微生物所菌种保藏中心）的内切β-1,4-葡聚糖酶基因eg2；所述的外切β-1,4-葡聚糖酶基因为绿色木霉AS3.3711的外切β-1,4-葡聚糖酶基因cbh2；所述的β-葡萄糖苷酶基因为黑曲霉CICC40179（购自中国工业微生物菌种保藏中心）的β-葡萄糖苷酶基因bgl1。
绿色木霉AS3.3711的内切β-1,4-葡聚糖酶基因eg2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，绿色木霉AS3.3711的外切β-1,4-葡聚糖酶基因cbh2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，黑曲霉CICC40179的β-葡萄糖苷酶基因bgl1突变Nhe I酶切位点后的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
天然结晶纤维素的水解需要外切纤维素酶、内切纤维素酶、β-葡萄糖苷酶这三种纤维素酶的协同作用，然而简单地将三种纤维素酶基因按1:1:1的比例共表达，酶之间的协同作用效果不佳，对结晶纤维素的降解效果往往不尽人意。鉴于此，为了提高结晶纤维素的利用率和转化率，本发明将上述三种酶基因按1:3:2的比例同时转入酿酒酵母中实现分泌表达，从而使得本发明的重组酵母能够按1:3:2的最佳协同作用比例同时分泌EG、CBH、BGL三种纤维素酶，因此能够较高效地降解结晶纤维素，进一步提高了纤维素-乙醇的转化效率。
附图说明
图1重组酿酒酵母多基因表达载体pScIKP-ECCCBB的构建流程图。
图2转化子的筛选图。
图3转化子菌落PCR鉴定图；
图A：重组酵母eg2基因菌落PCR电泳结果（M：Marker DL2000；1,2：pScIKP-ECCCBB转化株eg2基因菌落PCR），
图B：重组酵母cbh2基因菌落PCR电泳结果（M：Marker DL2000；3,4,5：pScIKP-ECCCBB转化株cbh2基因菌落PCR），
图C：重组酵母bgl1基因菌落PCR电泳结果（M：Marker DL15000；6：pScIKP-ECCCBB转化株bgl1基因菌落PCR）。
图4重组酵母EG酶活检验（刚果红染色法）。
图5重组酵母BGL酶活检验（七叶灵显色法）。
图6三种酶基因比例为1:3:2的重组酵母蔗渣纤维素发酵产物液相色谱检测图。
图7三种酶基因比例为1:1:1的重组酵母蔗渣纤维素发酵产物液相色谱检测图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对发明不做任何形式的限定。
实施例1 内切β-1,4-葡聚糖酶基因eg2、外切β-1,4-葡聚糖酶基因cbh2和β-葡萄糖苷酶基因bgl1的克隆
参照GenBank上发表的里氏木霉（T.reesei）内切β-1,4-葡聚糖酶基因eg2和外切β-1,4-葡聚糖酶基因cbh2，黑曲霉（A.niger）β-葡萄糖苷酶基因bgl1序列，用Oligo 6引物设计软件设计引物，同时添加上合适的酶切位点：
eg2基因引物的参考序列为T.reesei EGII，注册号为M19373。
cbh2基因引物参考序列为T.reesei CBH II，注册号为M16190。
bgl1基因引物的参考序列为A.niger BGL I，注册号为FN430671。
提取绿色木霉AS3.3711总RNA，进行反转录PCR扩增反应，将eg2基因和cbh2基因的PCR扩增产物分别连接到pGEM-T Easy 载体（购自Promega公司）上，测序验证。
其中eg2基因的PCR反应条件为：
其中cbh2基因的PCR反应条件为：
提取黑曲霉CICC40179的总RNA，进行反转录PCR扩增反应，将bgl1基因的PCR扩增产物连接到pGEM-T Easy 载体上，测序验证。
其中bgl1基因的PCR反应条件为：
黑曲霉bgl1基因第1613bp及2168bp上有两个Nhe I酶切位点，通过如下三对引物将这两个酶切位点突变掉：
第一对引物：
1F-BamHI：5' TCGGGATCCATGAGGTTC 3'
1R-Mut：5' GTGTTGTTGCAGTTACTAGCA 3'
第二对引物：
2F-Mut：5' TGCTGCTAGTAACTGCAACA 3'
2R-Mut-2 5' CCATAACTAGCATCCCCAGAAG 3'
第三对引物：
3F-Mut-2 5' CTGGGGATGCTAGTTATGGGCA 3'
3R-SpeI：5' GATCCTCTACTAGTTTAGTGAACAG 3'
绿色木霉AS3.3711的内切β-1,4-葡聚糖酶基因eg2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，绿色木霉AS3.3711的外切β-1,4-葡聚糖酶基因cbh2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，黑曲霉CICC40179的β-葡萄糖苷酶基因bgl1突变Nhe I酶切位点后的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2 三种酶基因按1:3:2比例构建共表达重组载体
三种酶基因共表达重组质粒的构建流程如图1所示。
将实施例1得到的eg2、cbh2和bgl1编码序列用限制性内切酶BamH I和Spe I分别从pGEM-T Easy载体上双酶切切下，分别连接到用同样双酶酶切过的载体pScIKP上，获得重组质粒pScIKP-eg2、pScIKP- bgl1和pScIKP-cbh2。
用Nhe I和Xba I双酶切pScIKP-bgl1，得到含有PGK启动子和终止子的bgl1基因表达盒片段。用Nhe I单酶切pScIKP- bgl1使其线性化。将两者用T4 DNA连接酶连接（利用Nhe I和Xba I是同尾酶的原理），获得重组质粒pScIKP-BB。利用同样的原理，用Nhe I和Xba I双酶切pScIKP-cbh2，得到含有PGK启动子和终止子的cbh2基因表达盒片段，与用Nhe I单酶切后线性化的pScIKP-BB相连，得到重组质粒pScIKP-CBB。接下来继续向构建的重组质粒pScIKP-CBB中依次连入两份含有PGK启动子和终止子的cbh2基因表达盒片段及一份含有PGK启动子和终止子的eg2基因表达盒片段，最终获得eg2、cbh2和bgl1三基因比例为1:3:2的重组质粒pScIKP-ECCCBB。
实施例3 重组酵母转化子的筛选与验证
在酿酒酵母进行电转化之前，对酿酒酵母AS2.489进行抗性筛选标记G418的敏感性测定，发现在G418浓度为150 μg/ml的YPD平板上酵母已经被抑制而不能生长，因而在筛选转化子的时候可以用超过150 μg/ml的G418的浓度来筛选。
将实施例2得到的三基因共表达重组质粒pScIKP-ECCCBB用限制性内切酶Apa I线性化后，用电穿孔转化法转入酿酒酵母AS2.489中，在G418的浓度为200 μg/ml的YPD琼脂平板上培养3～4d后，挑取能够正常生长的菌落即为转有上述重组质粒的转化子，结果如图2所示。以三种纤维素酶基因各自特异性的引物进行菌落PCR，在目的片段位置有唯一条带，验证了三种酶基因确实已经转入并整合入酿酒酵母基因组中，结果如图3所示。
实施例4 重组酿酒酵母的三种纤维素酶活性检验
将实施例3得到的具有G418抗性的转化子菌落接种到含有1%（w/w）羧甲基纤维素钠（CMC）、1%（w/w）酵母提取物、2%（w/w）蛋白胨、1.5%（w/w）琼脂粉的平板上，30℃静置培养3d后用刚果红法（沈雪亮;夏黎明.产纤维素酶细菌的筛选及酶学特性研究.林产化学与工业.2002,1,47-51.）进行染色，结果如图4所示，菌落周围形成的水解圈半径越大即证明重组酿酒酵母的EG酶活越高。
将实施例3得到的具有G418抗性的转化子菌落接种到含有0.1%（w/w）的七叶灵和0.25%（w/w）的柠檬酸铁铵的YPD平板上30℃培养过夜。BGL水解七叶苷生成葡萄糖和七叶苷原, 后者与柠檬酸高铁铵的三价铁离子反应生成棕黑色化合物, 菌落周围形成的棕黑色显色圈半径越大即证明重组酿酒酵母的BGL酶活越高，结果如图5所示。
将实施例3得到的具有G418抗性的转化子菌落接种到液体YPD培养基中摇瓶生长，离心收集上清液待用。向试管中加入120μl含有D-葡萄糖酸-1,5-内酯的pNPC 溶液及 14μl 酶液，混匀，空白对照中加入等量沸水浴加热 10min 的酶液。将试管置于50℃ 水浴中反应30 min，加入66μl Na2CO3终止反应。室温静置5 min ，测OD405，根据pNP 标准曲线计算生成pNP 的量。重复三次平行实验。CBH的pNPC 酶活定义为：1 mL酶液每分钟水解pNPC释放出1 μmol pNP，称为一个酶活力单位，以 IU/mL表示。实施例3得到的重组酵母培养96h后CBH酶活为0.04 IU/mL，培养120h后CBH酶活为0.1 IU/mL，培养168h后酶活为0.15 IU/mL。
实施例5 重组酵母转化天然结晶纤维素（甘蔗渣）生产乙醇
（1）甘蔗渣预处理
蔗渣洗净、烘干，粉碎后过200目筛，待用。
（2）培养基成分
酒母培养基： 1.2%（w/w）玉米浆（液态，购自华润赛力事达玉米工业有限公司），0.7%（w/w）（NH4）2SO4，高压灭菌后加入过滤除菌的葡萄糖至质量浓度10%。用于重组酵母酒母培养。
发酵培养基：15%（w/w）甘蔗渣（过200目），2.8%（w/w）玉米浆，0.7%（w/w）（NH4）2SO4，pH4.5高压灭菌20 min。用于重组酵母的发酵培养。
发酵补料培养基：2.8%（w/w）玉米浆，0.7%（w/w）（NH4）2SO4 ，高压灭菌20 min。
（3）发酵过程
将重组酿酒酵母菌株活化两次后，转接至酒母培养基，当细胞生长至对数生长期、细胞数目达到0.8-l.0×108/mL左右，出芽率20%左右，死亡率1%以下，即为酒母成熟标志。
在5 L全自动发酵罐中加入3.0 L含有甘蔗渣的发酵培养基， 121 ℃在位灭菌20 min；灭菌后将温度调至30 ℃，搅拌速度为250 rpm。按发酵培养基体积的10%进行接种。培养好的种子液通过火焰接菌口转接至发酵罐中，开始发酵。前酵期培养条件为30 ℃，250 rpm，pH5.0，通气培养4h；主酵期和后酵期培养条件为：32 ℃，pH4.5，不搅拌，厌氧培养发酵64h。发酵结束后，用高效液相色谱法检测乙醇产量（结果见图6），计算得出重组酵母的纤维素乙醇产率为21.38 g/L，蔗渣纤维素-乙醇转化率为62.7%。
实施例6 本发明所述的三种酶基因比例为1:3:2的重组酵母与三种酶基因比例为1:1:1的重组酵母转化甘蔗渣生产乙醇的能力比较
用Nhe I和Xba I双酶切实施例2得到的重组质粒pScIKP-cbh2，得到含有PGK启动子和终止子的cbh2基因表达盒片段。用Nhe I单酶切实施例2得到的重组质粒pScIKP- bgl1使其线性化。将两者用T4 DNA连接酶连接，获得重组质粒pScIKP-CB。用Nhe I和Xba I双酶切实施例2得到的重组质粒pScIKP-eg2，得到含有PGK启动子和终止子的eg2基因表达盒片段，与用Nhe I单酶切后线性化的pScIKP-CB相连，得到eg2、cbh2和bgl1三基因比例为1:1:1的重组质粒pScIKP-ECB。将其用限制性内切酶Apa I线性化后，用电穿孔转化法转入酿酒酵母AS2.489中，在G418的浓度为200 μg/ml的YPD琼脂平板上培养3～4d后，挑取能够正常生长的菌落即为三种酶基因比例为1:1:1的重组酵母。
按照实施例5中所述的处理条件和培养方法，以三种酶基因比例为1:1:1的重组酵母发酵甘蔗渣生产乙醇，用高效液相色谱法检测乙醇产量（结果见图7），计算三种酶基因比例为1:1:1的重组酵母的纤维素乙醇产率为18.13 g/L，蔗渣纤维素-乙醇转化率为53.2%，均低于本发明所述的三种酶基因比例为1:3:2的重组酵母。
实施例7 本发明所述的三种酶基因比例为1:3:2的重组酵母与三种酶基因比例为1:2:3的重组酵母转化甘蔗渣生产乙醇的能力比较
参照实施例1~3的方法，制备内切β-1,4-葡聚糖酶基因、外切β-1,4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因比例为1:2:3的重组酵母。再按照实施例5中所述的处理条件和培养方法，以三种酶基因比例为1:2:3的重组酵母发酵甘蔗渣生产乙醇，用高效液相色谱法检测乙醇产量，计算三种酶基因比例为1:2:3的重组酵母的纤维素乙醇产率为17.11 g/L，蔗渣纤维素-乙醇转化率为50.21%，均低于本发明所述的三种酶基因比例为1:3:2的重组酵母。
实施例8 本发明所述的三种酶基因比例为1:3:2的重组酵母与三种酶基因比例为2:1:2的重组酵母转化甘蔗渣生产乙醇的能力比较
参照实施例1~3的方法，制备内切β-1,4-葡聚糖酶基因、外切β-1,4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因比例为2:1:2的重组酵母。再按照实施例5中所述的处理条件和培养方法，以三种酶基因比例为2:1:2的重组酵母发酵甘蔗渣生产乙醇，用高效液相色谱法检测乙醇产量，计算三种酶基因比例为2:1:2的重组酵母的纤维素乙醇产率为14.97 g/L，蔗渣纤维素-乙醇转化率为43.93%，均低于本发明所述的三种酶基因比例为1:3:2的重组酵母。
实施例9 本发明所述的三种酶基因比例为1:3:2的重组酵母与三种酶基因比例为2:3:1的重组酵母转化甘蔗渣生产乙醇的能力比较
参照实施例1~3的方法，制备内切β-1,4-葡聚糖酶基因、外切β-1,4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因比例为2:3:1的重组酵母。再按照实施例5中所述的处理条件和培养方法，以三种酶基因比例为2:3:1的重组酵母发酵甘蔗渣生产乙醇，用高效液相色谱法检测乙醇产量，计算三种酶基因比例为2:3:1的重组酵母的纤维素乙醇产率为14.04 g/L，蔗渣纤维素-乙醇转化率为41.2%，均低于本发明所述的三种酶基因比例为1:3:2的重组酵母。
实施例10 本发明所述的三种酶基因比例为1:3:2的重组酵母与三种酶基因比例为3:1:3的重组酵母转化甘蔗渣生产乙醇的能力比较
参照实施例1~3的方法，制备内切β-1,4-葡聚糖酶基因、外切β-1,4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因比例为3:1:3的重组酵母。再按照实施例5中所述的处理条件和培养方法，以三种酶基因比例为3:1:3的重组酵母发酵甘蔗渣生产乙醇，用高效液相色谱法检测乙醇产量，计算三种酶基因比例为3:1:3的重组酵母的纤维素乙醇产率为16.25 g/L，蔗渣纤维素-乙醇转化率为47.68%，均低于本发明所述的三种酶基因比例为1:3:2的重组酵母。
实施例11 本发明所述的三种酶基因比例为1:3:2的重组酵母与三种酶基因比例为3:2:1的重组酵母转化甘蔗渣生产乙醇的能力比较
参照实施例1~3的方法，制备内切β-1,4-葡聚糖酶基因、外切β-1,4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因比例为3:2:1的重组酵母。再按照实施例5中所述的处理条件和培养方法，以三种酶基因比例为3:2:1的重组酵母发酵甘蔗渣生产乙醇，用高效液相色谱法检测乙醇产量，计算三种酶基因比例为3:2:1的重组酵母的纤维素乙醇产率为13.06 g/L，蔗渣纤维素-乙醇转化率为38.32%，均低于本发明所述的三种酶基因比例为1:3:2的重组酵母。
SEQUENCE LISTING
<110> 暨南大学
<120> 一种能降解结晶纤维素的基因重组酿酒酵母
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1257
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.1
<400> 1
atgaacaagt ccgtggctcc attgctgctt gcagcgtcca tactatatgg cggcgccgct 60
gcacagcaga ctgtctgggg ccagtgtgga ggtattggtt ggagcggacc tacgaattgt 120
gctcctggct cagcttgttc gaccctcaat ccttattatg cgcaatgtat tccgggagcc 180
actactatca ccacttcgac ccggccacca tccggtccaa ccaccaccac cagggctacc 240
tcaacaagct catcaactcc acccacgagc tctggggtcc gatttgccgg cgttaacatc 300
gcgggttttg actttggctg taccacagat ggcacttgcg ttacctcgaa ggtttatcct 360
ccgttgaaga acttcaccgg ctcaaacaac taccccgatg gcatcggcca gatgcagcac 420
ttcgtcaacg acgacgggat gactattttc cgcttacctg tcggatggca gtacctcgtc 480
aacaacaatt tgggcggcaa tcttgattcc acgagcattt ccaagtatga tcagcttgtt 540
caggggtgcc tgtctctggg cgcatactgc atcgtcgaca tccacaatta tgctcgatgg 600
aacggtggga tcattggtca gggcggccct actaatgctc aattcacgag cctttggtcg 660
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ggtccgactt gctgtgcttc cggaagcaca tgcgtctact ccaacgacta ttactcccag 180
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agagtacctc cagtcggatc gggaaccgct acgtattcag gcaacccttt tgttggggtc 360
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gctgcccttg cctcgaatgg cgaatactct attgccgatg gtggcgtcgc caaatataag 660
aactatatcg acaccattcg tcaaattgtc gtggaatatt ccgatatccg gaccctcctg 720
gttattgagc ctgactctct tgccaacctg gtgaccaacc tcggtactcc aaagtgtgcc 780
aatgctcagt cagcctacct tgagtgcatc aactacgccg tcacacagct gaaccttcca 840
aatgttgcga tgtatttgga cgctggccat gcaggatggc ttggctggcc ggcaaaccaa 900
gacccggccg ctcagctatt tgcaaatgtt tacaagaatg catcgtctcc gagagctctt 960
cgcggattgg caaccaatgt cgccaactac aacgggtgga acattaccag ccccccatcg 1020
tacacgcaag gcaacgctgt ctacaacgag aagctgtaca tccacgctat tggacctctt 1080
cttgccaatc acggctggtc caacgccttc ttcatcactg atcaaggtcg atcgggaaag 1140
cagcctaccg gacagcaaca gtggggagac tggtgcaatg tgatcggcac cggatttggt 1200
attcgcccat ccgcaaacac tggggactcg ttgctggatt cgtttgtctg ggtcaagcca 1260
ggcggcgagt gtgacggcac cagcgacagc agtgcgccac gatttgactc ccactgtgcg 1320
ctcccagatg ccttgcaacc ggcgcctcaa gctggtgctt ggttccaagc ctactttgtg 1380
cagcttctca caaacgcaaa cccatcgttc ctgtaa 1416
<210> 3
<211> 2583
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.3
<400> 3
atgaggttca ctttgatcga ggcggtggct ctgactgccg tctcgctggc cagcgctgat 60
gaattggcct actccccacc gtattaccca tccccttggg ccaatggcca gggcgactgg 120
gcgcaggcat accagcgcgc tgttgatatt gtctcgcaaa tgacattgga tgagaaggtc 180
aatctgacca caggaactgg caacttctac atgggaattg gaactatgtg ttggtcagac 240
tggcggtgtt ccccgccggg aatgtgttta caggatagcc ctctgggcgt tcgcgactcc 300
gactacaact ctgctttccc tgccggcatg aacgtggctg caacctggga caagaatctg 360
gcataccttc gcggcaaggc tatgggtcag gaatttagtg acaagggtgc cgatatccaa 420
ttgggtccag ctgccggccc tctcggtaga agtcccgacg gtggtcgtaa ctgggagggc 480
ttctccccag accctgccct aagtggtgtg ctctttgccg agaccatcaa gggtatccaa 540
gatgctggtg tggttgcgac ggctaagcac tacattgctt acgagcaaga gcatttccgt 600
caggcgcctg aagcccaagg ttttggattt aatatttccg agagtggaag tgcgaacctc 660
gatgataaga ctatgcacga gctgtacctc tggcccttcg cggatgccat ccgtgcaggt 720
gctggcgctg tgatgtgctc ctacaaccag atcaacaaca gttatggctg ccagaacagc 780
tacactctga acaagctgct caaggccgag ctgggcttcc agggctttgt catgagtgat 840
tgggctgctc accatgctgg tgtgagtggt gctttggcag gattggatat gtctatgcca 900
ggagacgtcg actacgacag tggtacgtct tactggggta caaacttgac cattagcgtg 960
ctcaacggaa cggtgcccca atggcgtgtt gatgacatgg ctgtccgcat catggccgcc 1020
tactacaagg tcggccgtga ccgtctgtgg actcctccca acttcagctc atggaccaga 1080
gatgaatacg gctacaagta ctactacgtg tcggagggac cgtacgagaa ggtcaaccag 1140
tacgtgaatg tgcaacgcaa ccacagcgaa ctgattcgcc gcattggagc ggacagcacg 1200
gtgctcctca agaacgacgg cgctctgcct ttgactggta aggagcgcct ggtcgcgctt 1260
atcggagaag atgcgggctc caacccttat ggtgccaacg gctgcagtga ccgtggatgc 1320
gacaatggaa cattggcgat gggctgggga agtggtactg ccaacttccc atacctggtg 1380
acccccgagc aggccatctc aaacgaggtg cttaagcaca agaatggtgt attcaccgcc 1440
accgataact gggctatcga tcagattgag gcgcttgcta agaccgccag tgtctctctt 1500
gtctttgtca acgccgactc tggtgagggt tacatcaatg tggacggaaa cctgggtgac 1560
cgcaggaacc tgaccctgtg gaggaacggc gataatgtga tcaaggctgc tgcaagaaac 1620
tgcaacaaca caatcgttgt cattcactct gtcggaccag tcttggttaa cgagtggtac 1680
gacaacccca atgttaccgc tatcctctgg ggtggtttgc ccggtcagga gtctggcaac 1740
tctcttgccg acgtcctcta tggccgtgtc aaccccggtg ccaagtcgcc ctttacctgg 1800
ggcaagactc gtgaggccta ccaagactac ttggtcaccg agcccaacaa cggcaacgga 1860
gcccctcagg aagactttgt cgagggcgtc ttcattgact accgtggatt tgacaagcgc 1920
aacgagaccc cgatctacga gttcggctat ggtctgagct acaccacttt caactactcg 1980
aaccttgagg tgcaggtgct gagcgcccct gcatacgagc ctgcttcggg tgagaccgag 2040
gcagcgccaa ccttcggaga ggttggaaat gcgtcggatt acctctaccc cagcggattg 2100
cagagaatta ccaagttcat ctacccctgg ctcaacggta ccgatctcga ggcatcttcc 2160
ggggatgcaa gatacgggca ggactcctcc gactatcttc ccgagggagc caccgatggc 2220
tctgcgcaac cgatcctgcc tgccggtggc ggtcctggcg gcaaccctcg cctgtacgac 2280
gagctcatcc gcgtgtcagt gaccatcaag aacaccggca aggttgctgg tgatgaagtt 2340
ccccaactgt atgtttccct tggcggtccc aatgagccca agatcgtgct gcgtcaattc 2400
gagcgcatca cgctgcagcc gtcggaggag acgaagtgga gcacgactct gacgcgccgt 2460
gaccttgcaa actggaatgt tgagaagcag gactgggaga ttacgtcgta tcccaagatg 2520
gtgtttgtcg gaagctcctc gcggaagctg ccgctccggg cgtctctgcc tactgttcac 2580
taa 2583
Claims (5)
1. 一种能降解结晶纤维素的基因重组酿酒酵母，其特征在于，该基因重组酿酒酵母是将内切β-1,4-葡聚糖酶基因、外切β-1,4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因，按照1:3:2的比例，通过酿酒酵母多基因共表达载体pScIKP同时转入酿酒酵母并获得正确的分泌表达而构建成的；
所述内切β-1,4-葡聚糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，外切β-1,4-葡聚糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，β-葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2. 权利要求1所述的基因重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将内切β-1,4-葡聚糖酶基因、外切β-1,4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因按照1:3:2的比例接入酿酒酵母表达载体中，构建重组多基因共表达载体；
S2.将上述构建得到的重组多基因共表达载体用限制性内切酶Apa I切割，使之线性化后转化到酿酒酵母中，构建转基因酿酒酵母。
3. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，S1构建重组多基因共表达载体包括如下步骤：
S11.分别将内切β-1,4-葡聚糖酶基因、外切β-1,4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因进行PCR扩增；
S12.用限制性内切酶分别切割载体、内切β-1,4-葡聚糖酶基因、外切β-1,4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因；
S13.将内切β-1,4-葡聚糖酶基因、外切β-1,4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因分别接入载体，形成三个重组单基因载体；
S14.将含有载体启动子和终止子片段的完整的内切β-1,4-葡聚糖酶基因表达盒、外切β-1,4-葡聚糖酶基因表达盒和β-葡萄糖苷酶基因表达盒分别从三种重组单基因载体上切下，然后按照1:3:2的比例以串联表达盒eg2-cbh2-cbh2-cbh2-bgl1-bgl1的形式逐个接入同一酿酒酵母表达载体中。
4. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，S2中所述的转化是使用电转化法、冷冻法或化学试剂法进行转化。
5. 根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，S12中用于切割内切β-1,4-葡聚糖酶基因、外切β-1,4-葡聚糖酶基因、β-葡萄糖苷酶基因的限制性内切酶均为BamH I和Spe I；S14中使用的限制性内切酶为同尾酶Nhe I和Xba I。
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