CN101333521B

CN101333521B - 细胞色素p450bm-3d168w变体酶以及应用其制备靛玉红的方法

Info

Publication number: CN101333521B
Application number: CN2008100613999A
Authority: CN
Inventors: 梅乐和; 胡升; 虞青; 黄�俊
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2008-04-25
Filing date: 2008-04-25
Publication date: 2010-12-15
Anticipated expiration: 2028-04-25
Also published as: CN101333521A

Abstract

本发明公开了一种细胞色素P450BM-3D168W变体酶以及应用其制备靛玉红的方法。该酶是采用定向进化技术，以P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/E435T)为父本，通过在父本基因中编码第168位天冬氨酸残基的密码子处进行定点饱和突变后经筛选获得的。其碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，原位点处的密码子由GAT突变为TGG，对应的氨基酸残基由天冬氨酸突变为色氨酸。本发明的P450BM-3D168W变体酶在催化吲哚时，所得产物以靛玉红为主，产物呈现明显的红色特征。

Description

细胞色素P450BM-3D168W变体酶以及应用其制备靛玉红的方法

技术领域

本发明涉及生物工程中的基因工程领域和生物制药领域，具体地说是涉及具有新的催化性质的细胞色素P450BM-3D168W突变酶、其基因及这种酶在生物催化中的用途，特别是在靛玉红制备中的应用。

背景技术

靛玉红是我国科学家上世纪经过多年研究从传统药方当归龙荟丸中发现的一种新型的白血病治疗药物。上世纪六十年代中期，中国医学科学院血液病研究所在慢性粒细胞性白血病的治疗研究中发现当归龙荟丸具有较好的疗效，经过中国医学科学院血液病研究所与成都中医学院等多家机构对该丸剂中11种成分历时10多年的药理分析，其中的青黛最终被确定为抗白血病的有效组分。经过进一步的研究，从青黛中分离得到的靛玉红被确认为确切的抗白血病成分并在临床试验中得到验证。采用靛玉红治疗慢性白血病具有起效快、疗效显著，剂量小，副作用小等优点，特别是靛玉红对机体免疫功能无抑制、对机体正常的造血功能无明显影响，显著优于马利兰等传统化疗药物，目前靛玉红已成为治疗慢性白血病的临床用药。靛玉红的发现及其在慢性白血病治疗中的成功应用是我国科学家在白血病治疗领域应用传统中药遗产做出的卓越贡献。

随着对靛玉红治疗机理研究的进一步深入，国内外科学家发现靛玉红及其衍生物除了用于白血病治疗外还能用于多种癌症的治疗。研究发现：靛玉红能抑制细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)，从而抑制细胞增殖；靛玉红及其衍生物可结合在一些重要细胞周期调节子的ATP结合位点上，对实验性实体瘤具有广谱抑制作用；某些靛玉红衍生物可诱导包括人乳腺癌细胞和前列腺癌细胞在内的肿瘤细胞凋亡。尤其引人注目的是靛玉红对CDK的抑制具有广谱性，即它对一个家族的蛋白激酶都具有抑制活力，而这些激酶恰好是某些特定肿瘤中出现异常的激酶。英国牛津大学分子生物物理实验室的Jane Endicott教授认为，这种特异地同时对一定数量靶点起作用的化合物对癌症治疗具有重要价值，因为如今已逐渐认识到单靶点治疗癌症的作用有限，因为癌细胞常常能逃避单一靶点的抑制。靛玉红及其衍生物的这种相对广谱的选择性激酶抑制特性使它们成为了未来极具潜力的抗癌药物。

除白血病和癌症治疗外，靛玉红在其他疾病治疗方面也极具价值。我国曾开展了利用靛玉红治疗银屑病的研究并取得了较好的治疗效果；英国阿伯丁大学的研究人员正研发能专一抑制疟原虫的靛玉红衍生物。

靛玉红作为一种从传统中药中发现的具有多种治疗用途的物质，已成为一种高附加值的天然产物，目前国内报价为6-8万人民币/公斤。这一方面是因为国际、国内市场对其需求量很大，另一方面也与靛玉红在天然植物中的含量很低有关。现在可用于靛玉红提取的中药材有大青叶、板蓝根多种，但即使在靛玉红含量最高的大青叶中，靛玉红相对于大青叶干重的含量也仅为0.03％左右；《中国药典》2005版中就规定大青叶干燥品中靛玉红含量不少于0.02％即为合格。这不仅使得靛玉红生产成本高、产品价格昂贵，而且生产过程还会消耗大量的有机溶剂和能源，造成环境负担。此外，由于天然药材资源有限，如果原料药材大量从自然界获取将破坏生态平衡；如果采用人工种植，又会产生与粮争地的问题。

虽然靛玉红也可以通过化学合成生产，但目前青睐天然产物的潮流和化学合成产物的复杂性使得天然靛玉红更受重视和欢迎。

为了克服从天然植物植物中提取靛玉红的诸多不足，人们提出了其他的获得天然靛玉红的方式。随着可持续发展观念和环保法规的强化，在节能减排的大趋势下，目前人们已尝试采用生物技术、通过生物催化与转化的方法来获得天然靛玉红。

一种途径是采用组织工程手段对蓼蓝进行发根组织培养，期望通过培养条件的优化提高靛玉红的含量、并结合工业化的生产方式降低生产成本。但是要使蓼蓝中的靛玉红含量发生显著地提高并非易事，兼之组织培养的复杂性，这种方法目前仅有学术研究的文献报道，尚未实用化。

另一种方法是利用能催化吲哚产生靛玉红的酶来生产靛玉红。中国专利00810918.4披露了一种能催化吲哚羟基化的P450BM-3酶，并主张了利用表达该酶的微生物进行靛玉红制备的权利要求。但是，该专利披露的酶在催化吲哚时主要产物为靛玉红的结构类似物靛蓝，而“靛玉红的产量远低于靛蓝的产量”，产物颜色为蓝色；该酶催化吲哚的产物中，靛玉红产量是如此之少，以至在“确定动力学参数时，靛玉红的形成被忽略”。因此要利用该专利披露的酶进行靛玉红的制备、生产在事实上是不可行的。

要真正利用P450BM-3酶进行靛玉红的微生物制备，首先就要改变酶催化吲哚的反应性质，使靛玉红成为主要产物。只有获得了满足需要的酶才可能真正实现靛玉红的微生物或酶法制备、生产。

本专利发明人在先的专利申请CN200610022588.0中曾公开了一种通过定向进化技术改造P450BM-3获得的对吲哚具有更高催化活性的变体酶P450BM-3Glu435Thr。就催化吲哚转化为靛蓝的能力而言，与此前报道的催化活力最高的P450BM-3酶相比，该酶对吲哚的催化效率提高了4.7倍。但是，该酶催化吲哚羟基化的产物以靛蓝为主，靛玉红只是其中含量微小的副产物，即其催化产物的组成与前述的同样的中国专利00810918.4披露的能催化吲哚羟基化的P450BM-3酶类似，虽然都能在催化吲哚羟基化的反应中产生靛玉红，但催化产物的主要成分是靛蓝。因此，目前已报导的能催化吲哚羟基化的P450BM-3酶的产物组成都是以靛蓝为主的，要利用这些酶进行靛玉红的生物制备不仅靛玉红的得率低，而且要从大量的靛蓝中分离出少量的靛玉红将会增加分离、纯化成本，而且也将造成较大的浪费。可以说，要采用已有专利披露的P450BM-3酶来进行靛玉红的生物制备在成本、经济价值等方面是不具有经济价值，也难以利用已有专利披露的P450BM-3酶来进行靛玉红的大规模生物制备。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种细胞色素P450BM-3D168W变体酶以及应用其制备靛玉红的方法，该酶或表达该酶的微生物在催化吲哚时，所得产物以靛玉红为主，而副产物靛蓝则尽可能的少。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种细胞色素P450BM-3D168W变体酶，它具有SEQ ID No.1的序列。

一种应用所述的细胞色素P450BM-3D168W变体酶制备靛玉红的方法，包括以下步骤：

(1)设计P450BM-3单加氧酶第168位密码子的随机引物并进行PCR扩增；

(2)构建突变文库；

(3)筛选催化吲哚的产物中以靛玉红为主的突变体，获得具有基因序列SEQIDNO.1的P450BM-3D168W变体酶；

(4)构建表达P450细胞色素P450BM-3D168W变体酶的基因工程菌；

(5)基因工程菌表达细胞色素P450BM-3D168W变体酶；

(6)用表达细胞色素P450BM-3D168W变体酶的基因工程菌全细胞催化吲哚；

(7)分离催化产物，获得靛玉红粗品；

(8)精制靛玉红；

本发明的有益效果是：

1.在利用本发明获得的细胞色素P450BM-3突变酶进行吲哚的羟基化转化时，所得产物以靛玉红为主，靛玉红含量在产物中的比例在60％以上，所得产物颜色为紫红色或红色；特别的，在选定的适宜条件下，靛玉红含量能达到80％以上。这不仅使利用P450BM-3酶进行靛玉红的生物转化制备成为可能，而且提高了吲哚的原料利用率、减小了靛玉红产品的分离和纯化负担，可以显著地降低生产成本。此外，由于所用的酶催化活力高，靛玉红的产量也相应较高，对降低靛玉红的生产成本、提高生产效率也具有重要的经济意义。

2.采用本发明实现靛玉红的生物转化制备不仅具有重要的经济价值，而且通过本发明披露的方法替代现有的从天然药材中用有机溶剂萃取靛玉红的生产方式还能减少有机试剂和能源的消耗，避免现有靛玉红生产方式对自然资源和环境的破坏，有益于人与自然的和谐共处，具有积极的社会意义。

具体实施方式

本发明在具有四个突变位点的P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/E435T)变体基因的基础上，采用定向进化技术，通过在编码对应酶第168位氨基酸残基的密码子位点进行饱和突变，经过高通量筛选得到了在催化吲哚时产物以靛玉红为主的P450BM-3D168W变体酶(F87V/A74G/L188Q/E435T/D168W)，其基因序列如序列表SEQID NO.1所示，原编码第168位天冬氨酸的密码子GAT突变为编码色氨酸的密码子TGG。

本发明还提供了利用所述变体基因表达的P450BM-3D168W变体酶在催化吲哚制备、生产靛玉红中的应用。吲哚可以是特别添加在反应体系中的，也可以是微生物代谢产生的内源性的吲哚。所述的酶可以游离形式或固定化形式进行催化；也可以通过适宜的载体在合适的宿主中进行表达，并用表达该酶的微生物进行吲哚的催化，所述的微生物可以游离形式进行催化，也可以固定化形式进行。

本发明采用饱和突变技术原理，在P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/E435T)变体基因编码对应酶的第168位氨基酸残基的密码子位点设计了一对能在PCR扩增该基因的过程中在该位点产生不确定碱基突变的引物，利用该对引物对模板质粒pET28α(+)P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/E435T)以高保真的Pfu_Turbo聚合酶进行循环延伸(所谓循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止)。由于引物的特殊性，PCR产生的基因将在选定的位点出现不同的碱基组成，即获得了不同的突变基因。整个PCR扩增过程结束时将获得这些不同突变基因的混合物，即得到突变基因文库。

取上述PCR产物转化适当的宿主菌，如E.coli BL21，然后用转化所得菌株涂布含有适当浓度卡那霉素，如30μg/ml，的固体培养基平板，如LB琼脂平板，以获得由那些成功转化了PCR扩增质粒的菌株组成的突变体库。

突变体库中那些能够在催化吲哚时以靛玉红为主要产物的表达特定P450BM-3变体酶的菌株可以通过逐一挑取菌株进行培养、诱导P450BM-3突变酶表达、催化吲哚、分析催化产物组成得到筛选，但优选的方法是借助一些高通量的方法进行筛选。比如可以在96孔板中进行菌株的培养、P450BM-3D168W变体酶的诱导表达和吲哚的全细胞催化，也可以在诱导P450BM-3D168W变体酶表达后破碎菌体获得粗酶液，然后分离获得粗酶液后在新的96孔板中用粗酶液进行吲哚的催化。催化一定时间后可以通过肉眼观察反应液颜色对变体酶的催化特性进行初步估计，也可以用有机溶剂，如氯仿，对反应液进行萃取。萃取物可以通过薄层层析(TLC)进行分析，也可以用分光光度计或酶标板阅读器测定产物的吸收峰或550nm及610nm(因溶剂的不同而异)来判断产物中靛玉红与靛蓝的相对比例，准确的比例则可以通过高效液相色谱(HPLC)进行测定。特别的，那些催化活力高、催化产物中靛蓝含量很少的突变酶对应的萃取液将呈现为明显的红色或紫色，直接用肉眼就可以进行判别。本发明所获得的突变酶P450BM-3D168W变体酶(F87V/A74G/L188Q/E435T/D168W)就具有这种性质。

本发明获得的P450BM-3D168W变体酶在催化吲哚时，催化产物以靛玉红为主，副产物靛蓝很少，产物呈红色或红紫色。这是目前已报道过的P450BM-3所不具有的，其性质显著不同于中国专利00810918.4所发明的P450BM-3单加氧酶。而且除了变体酶的基因序列、发明效果与其具有实质性的差异外，本发明的效果与中国专利00810918.4相比有了极大的进步，真正地实现靛玉红的微生物或酶法制备，为靛玉红的生产和应用创造了更为优良的条件。

本发明披露的细胞色素P450BM-3D168W变体酶的制备方法，具体包括以下步骤：

1.设计P450BM-3168位密码子的随机引物并进行PCR扩增

根据Stratagene公司Quik-Change Kit的原理设计了如下所列的针对168位密码子的上下游引物：

上游引物：5’-CAGCTTTTACCGANNNCAGCCTCATCC-3’

下游引物：5’-GGATGAGGCTGNNNTTGGTAAAAGCTG-3’

PCR反应体系组成：5μL的25mmol/L的MgCl₂Pfu PCR缓冲液，10nmol的dNTPs，各15pmol的上下游引物以及pET28α(+)P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/E435T)模板DNA和PfuDNA聚合酶，补加无菌水至总体积50μL。

PCR反应参数：95℃变性1min后，在95℃30s，53℃2min，72℃16min的条件下经18个循环，最后在72℃下延伸2min，得到PCR扩增产物。

2.构建突变文库

将上述PCR反应得到的PCR产物用DpnI酶解2小时后，按常规分子生物学试验方法转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，转化液再涂布到含有30μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养得到突变文库。

3.筛选催化吲哚的产物中以靛玉红为主的突变体

将平板克隆接种到每孔装有1ml LB液体培养基的96微孔板中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达到0.6左右时加入IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导(终浓度为0.5mmol/L)，在30℃诱导16h后向每孔加入1μl一定浓度的吲哚(0.1mmol/L～10mmol/L)，在30℃摇床进行全细胞催化，12h后用氯仿萃取产物分别用薄层层析、分光光度计扫描光吸收曲线和HPLC检测来分析不同突变体催化吲哚的产物组成，选出产物主要由靛玉红组成的突变体进行DNA测序。通过这种方法获得了突变酶P450BM-3D168W变体酶(F87V/A74G/L188Q/E435T/D168W)的基因序列SEQ ID NO.1。

下面测定酶催化吲哚羟基化活力。

挑取含有P450BM-3D168W变体酶(F87V/A74G/L188Q/E435T/D168W)突变基因的平板克隆LB平板上划线培养，然后挑取单菌落接种LB种子液，200rpm、37℃下培养至OD600达到0.6左右时以1％的接种量接种至发酵瓶，在200rpm、37℃条件下摇床培养至菌液OD₆₀₀达0.7左右加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，并在180rpm，30℃摇床诱导8小时后收集菌体。

按1∶5的比例将菌体重悬于50mM pH7.5磷酸钾盐缓冲液中，然后在冰浴条件下进行超声破胞。超声破胞条件为：300W功率，3s间歇时间，4s工作时间，循环180次后在4℃下8000rpm离心半小时取上清即为粗酶液。

采用CO差示光谱法精确测定粗酶液中P450BM3单加氧酶DR浓度后测定酶对吲哚的催化活力。在总体积为1mL的pH8.2的0.1mol/LTris-HCl反应体系中，加入0.6nmol的纯化P450BM-3突变酶和2μmol的吲哚，10μL的二甲基亚砜，在室温下静置10min，然后加入5nmol的NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸)启动反应，在610nm监控吸收值的变化30min。

本发明应用细胞色素P450BM-3D168W变体酶制备靛玉红的方法，具体包括以下步骤：

利用本发明所披露的P450BM-3D168W变体酶进行靛玉红的生物转化制备可以采用游离酶催化、固定化酶催化和基因工程菌全细胞催化等方法。由于P450BM-3在催化吲哚羟基化时需要NADPH为辅酶，如果以酶进行催化，必须提供外源NADPH。由于NADPH价格相当昂贵，所以最适合大规模制备靛玉红的方法为基因工程菌全细胞催化吲哚。以下是该实施例的具体过程。

1、获得表达P450BM-3D168W变体酶的基因工程菌：

将获得的含P450BM-3D168W变体酶基因的质粒pET28α(+)P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/E435T/D168W)按常规分子生物学方法转化适宜的表达质粒，优选为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。然后取转化液涂布含有卡那霉素的LB抗性平板，尔后平板在30～37℃培养过夜，需要时也可继续培养12h，然后从平板上挑取菌落保藏，同时进行菌落PCR验证所得菌株是否已成功转化目的质粒；

2、基因工程菌表达P450BM-3D168W变体酶：

将所得工程菌在LB平板上于37℃培养过夜，然后接入适宜液体培养基，可以为LB液体培养基，也可以是TB液体培养基，在适宜温度和转速的摇床培养，优选温度为37℃，优选转速200～250rpm。待菌液OD₆₀₀达到0.6左右时以1％～2％的接种量接种至发酵瓶，发酵培养基可以是LB，但优选为TB，同时可以在培养基中加入FeCl₃以提高P450BM-3产量。FeCl₃终浓度在0.01～0.5mg/L为宜，优选为0.15mg/L。在200rpm、37℃条件下摇床培养至菌液OD₆₀₀达0.5～1.1左右时加入IPTG或乳糖进行诱导，IPTG终浓度为0.2～1.0mmol/L，优选为0.4～0.6mmol/L，乳糖终浓度为0.3～1.5mmol/L，优选为0.75～1.0mmol/L。在180rpm，30℃摇床诱导5～10小时后在4℃、8000rpm离心收集菌体。菌体用生理盐水洗涤后再次离心，于4℃保藏备用。

3、用表达P450BM-3D168W变体酶的基因工程菌进行全细胞催化吲哚羟基化：

称取10g保存于4℃的湿菌体，悬浮于500ml Tris-HCl缓冲液(50mmol/L)中，缓冲液pH值在7.0～9.5之间皆可，但优选为8.5左右，加入吲哚的二甲基亚砜溶液，吲哚终浓度范围为0.5～2mmol/L，优选为1.5mmol/L左右，在180r/min、30℃摇床进行反应。反应过程中监测吲哚浓度变化，当吲哚浓度低于0.5mmol/L时，补加吲哚，直至吲哚浓度不再减少。此时加入的绝大部分吲哚已转化为靛玉红。

特别地，为了延长菌体的有效催化时间，可以采用固定化细胞进行催化。固定化工程菌的方法有多种，可以采用包括吸附、交联和胶珠及微胶囊包埋等方法。优选的方法为微胶囊包埋，其过程为：取上述菌体0.15g，加入10ml 2％(w/v)的氯化钙与1％羧甲基纤维素(w/v)的混合溶液，搅拌混合均匀后，滴入到1％(w/v)的海藻酸钠溶液中进行反应，搅拌6min，形成的胶囊先用无菌水洗涤三次，再转入到1.5％(w/v)的氯化钙溶液中，搅拌20min固化，最后用无菌水洗涤以除去胶囊表面多余的氯化钙，就得到了海藻酸钙胶囊化E.coliBL21(pET28a(+)-P450BM3单加氧酶DS)细胞。固定化工程菌细胞催化吲哚的条件与游离细胞催化条件类似。

为了提高菌体细胞体内的NADPH含量，可以在催化体系中补加葡萄糖，通过为菌体内部葡萄糖脱氢酶提供脱氢底物的方法加速菌体内源NADPH的产量。葡萄糖的添加浓度为10～50g/L。

4、分离催化产物，获得靛玉红粗品：

催化过程结束后10000rpm离心15min收集固形物，然后用10ml二甲基甲酰胺、氯仿、或二氯甲烷重悬，所得溶液用超声破碎仪进行破碎，可选功率为300W，操作条件为工作3s，间歇3s，直至溶液澄清。离心收集萃取液，沉淀则继续多次萃取，直至萃取液无色。合并萃取液，在旋转蒸发仪上浓缩蒸干，即得靛玉红粗品。

5、精制靛玉红

采用适宜硅胶，如Kiesel gel 60，，230～400目，取30g装填硅胶柱，用氯仿重溶靛玉红粗品后上柱，再用适宜洗脱液洗脱，如体积比为1∶1的正己烷∶乙酸乙酯，收集红色洗脱液，在旋转蒸发仪上浓缩蒸干，即为靛玉红纯品。

靛玉红纯品的检验：

用15％CH₃CN：85％的50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)(v/v)的溶液溶解靛玉红纯品，利用

，4.6×250mm安捷伦反相C₁₈液相柱，在240nm处对产物进行分析。采用梯度洗脱，流速为1mL/min，其中步骤如下：

1)0-15min：15％乙腈的50mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)

2)15-30min：15to 40％乙腈的50mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)

3)30-40min：40to 50％乙腈的50mmol/LTri s-HCl(pH 7.5)

4)40to 45min：50to 15％乙腈的50mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)

5)45-55min：15％乙腈的50mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)

在上述的液相条件下，底物吲哚的保留时间为34.7min，副产物靛玉红的保留时间为38.4min，主产物靛蓝的保留时间为42.5min。每份样品检测两次，靛玉红含量取平均值大于90％，误差不超过1％。

序列表

<110>浙江大学

<120>细胞色素P450BM-3D168W变体酶以及应用其制备靛玉红的方法

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>3150

<212>DNA

<213>巨大芽孢杆菌

<400>1

atgacaatta aagaaatgcc tcagccaaaa acgtttggag agcttaaaaa tttaccgtta 60

ttaaacacag ataaaccggt tcaagctttg atgaaaattg cggatgaatt aggagaaatc 120

tttaaattcg aggcgcctgg tcgtgtaacg cgctacttat caagtcagcg tctaattaaa 180

gaagcatgcg atgaatcacg ctttgataaa aacttaagtc aaggtcttaa atttgtacgt 240

gattttgcag gagacgggtt ggttacaagc tggacgcatg aaaaaaattg gaaaaaagcg 300

cataatatct tacttccaag cttcagtcag caggcaatga aaggctatca tgcgatgatg 360

gtcgatatcg ccgtgcagct tgttcaaaag tgggagcgtc taaatgcaga tgagcatatt 420

gaagtaccgg aagacatgac acgtttaacg cttgatacaa ttggtctttg cggctttaac 480

tatcgcttta acagctttta ccgatggcag cctcatccat ttattacaag tatggtccgt 540

gcactggatg aagcaatgaa caagcagcag cgagcaaatc cagacgaccc agcttatgat 600

gaaaacaagc gccagtttca agaagatatc aaggtgatga acgacctagt agataaaatt 660

attgcagatc gcaaagcaag cggtgaacaa agcgatgatt tattaacgca tatgctaaac 720

ggaaaagatc cagaaacggg tgagccgctt gatgacgaga acattcgcta tcaaattatt 780

acattcttaa ttgcgggaca cgaaacaaca agtggtcttt tatcatttgc gctgtatttc 840

ttagtgaaaa atccacatgt attacaaaaa gcagcagaag aagcagcacg agttctagta 900

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tgtatcggtc agcagttcgc tcttcatgaa gcaacgctgg tacttggtat gatgctaaaa 1260

cactttgact ttgaagatca tacaaactac gagctggata ttaaagaaac tttaacgtta 1320

aaacctgaag gctttgtggt aaaagcaaaa tcgaaaaaaa ttccgcttgg cggtattcct 1380

tcacctagca ctgaacagtc tgctaaaaaa gtacgcaaaa aggcagaaaa cgctcataat 1440

acgccgctgc ttgtgctata cggttcaaat atgggaacag ctgaaggaac ggcgcgtgat 1500

ttagcagata ttgcaatgag caaaggattt gcaccgcagg tcgcaacgct tgattcacac 1560

gccggaaatc ttccgcgcga aggagctgta ttaattgtaa cggcgtctta taacggtcat 1620

ccgcctgata acgcaaagca atttgtcgac tggttagacc aagcgtctgc tgatgaagta 1680

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aaagtgcctg cttttatcga tgaaacgctt gccgctaaag gggcagaaaa catcgctgac 1800

cgcggtgaag cagatgcaag cgacgacttt gaaggcacat atgaagaatg gcgtgaacat 1860

atgtggagtg acgtagcagc ctactttaac ctcgacattg aaaacagtga agataataaa 1920

tctactcttt cacttcaatt tgtcgacagc gccgcggata tgccgcttgc gaaaatgcac 1980

ggtgcgtttt caacgaacgt cgtagcaagc aaagaacttc aacagccagg cagtgcacga 2040

agcacgcgac atcttgaaat tgaacttcca aaagaagctt cttatcaaga aggagatcat 2100

ttaggtgtta ttcctcgcaa ctatgaagga atagtaaacc gtgtaacagc aaggttcggc 2160

ctagatgcat cacagcaaat ccgtctggaa gcagaagaag aaaaattagc tcatttgcca 2220

ctcgctaaaa cagtatccgt agaagagctt ctgcaatacg tggagcttca agatcctgtt 2280

acgcgcacgc agcttcgcgc aatggctgct aaaacggtct gcccgccgca taaagtagag 2340

cttgaagcct tgcttgaaaa gcaagcctac aaagaacaag tgctggcaaa acgtttaaca 2400

atgcttgaac tgcttgaaaa atacccggcg tgtgaaatga aattcagcga atttatcgcc 2460

cttctgccaa gcatacgccc gcgctattac tcgatttctt catcacctcg tgtcgatgaa 2520

aaacaagcaa gcatcacggt cagcgttgtc tcaggagaag cgtggagcgg atatggagaa 2580

tataaaggaa ttgcgtcgaa ctatcttgcc gagctgcaag aaggagatac gattacgtgc 2640

tttatttcca caccgcagtc agaatttacg ctgccaaaag accctgaaac gccgcttatc 2700

atggtcggac cgggaacagg cgtcgcgccg tttagaggct ttgtgcaggc gcgcaaacag 2760

ctaaaagaac aaggacagtc acttggagaa gcacatttat acttcggctg ccgttcacct 2820

catgaagact atctgtatca agaagagctt gaaaacgccc aaagcgaagg catcattacg 2880

cttcataccg ctttttctcg catgccaaat cagccgaaaa catacgttca gcacgtaatg 2940

gaacaagacg gcaagaaatt gattgaactt cttgatcaag gagcgcactt ctatatttgc 3000

ggagacggaa gccaaatggc acctgccgtt gaagcaacgc ttatgaaaag ctatgctgac 3060

gttcaccaag tgagtgaagc agacgctcgc ttatggctgc agcagctaga agaaaaaggc 3120

cgatacgcaa aagacgtgtg ggctgggtaa 3150

Claims

1.一种细胞色素P450 BM-3 D168W变体酶，其特征在于，其基因序列为SEQ IDNo.1的序列。

2.一种应用权利要求1所述的细胞色素P450 BM-3 D168W变体酶制备靛玉红的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)设计细胞色素P450 BM-3单加氧酶第168位密码子的随机引物，以携带P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/E435T)变体酶基因的质粒pET28α(+)-P450 BM-3(F87V/A74G/L188Q/E435T)为模板，进行PCR扩增；

(2)构建突变文库；

(3)筛选催化吲哚的产物中以靛玉红为主的突变体，获得基因序列为SEQ IDNO.1的P450 BM-3 D168W变体酶；

(4)构建表达细胞色素P450 BM-3 D168W变体酶的基因工程菌；

(5)基因工程菌表达细胞色素P450 BM-3 D168W变体酶；

(6)用表达细胞色素P450 BM-3 D168W变体酶的基因工程菌全细胞催化吲哚；

(7)分离催化产物，获得靛玉红粗品；

(8)精制靛玉红。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述随机引物包括上游引物5’-CAGCTTTTACCGANNNCAGCCTCATCC-3’和下游引物5’-GGATGAGGCTGNNNTTGGTAAAAGCTG-3’。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将所述步骤(1)的PCR产物用DpnI酶解2-5小时后，转化到大肠杆菌，转化液再涂布到含有30μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养得到突变文库。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)具体为：称取表达后的基因工程菌，将其悬浮于Tris-HCl缓冲液中，缓冲液pH值为7.0～9.5，加入吲哚的二甲基亚砜溶液，吲哚终浓度范围为0.5～2mmol/L，在180r/min、30℃摇床进行反应；反应过程中监测吲哚浓度变化，当吲哚浓度低于0.5mmol/L时，补加吲哚，直至吲哚浓度不再减少。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述缓冲液pH值为8.5，吲哚终浓度为1.5mmol/L。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，采用固定化细胞方法进行催化。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，采用微胶囊包埋方法进行催化。