CN103497972B

CN103497972B - 一种带有荧光素酶基因的jev感染性克隆及构建方法和应用

Info

Publication number: CN103497972B
Application number: CN201310441707.1A
Authority: CN
Inventors: 张波; 李晓丹; 秦成峰; 李晓峰; 袁志明; 邓成林; 单超; 叶寒青
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2013-09-25
Filing date: 2013-09-25
Publication date: 2015-09-30
Anticipated expiration: 2033-09-25
Also published as: CN103497972A

Abstract

本发明公开了一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆及构建方法和应用。一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆，其制备步骤是：（1）JEV病毒SA14株基因序列的分段合成；（2）JEV病毒感染性克隆的组装与构建；（3）带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆的构建。本发明通过免疫荧光、Rluc活性的检测、病毒噬斑、药物抑制、活体动物成像及疫苗评价等实验证明：本发明所构建的带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆可以拯救出具有与JEV病毒生长趋势相同的Rluc-JEV报告病毒，并且在动物模型、病毒复制与致病机理、药物筛选和药物作用机制、活体动物成像及疫苗评价等方面具有广泛的应用价值。

Description

一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆及构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆，还涉及一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆的制备方法，以及该克隆拯救出的Rluc-JEV报告病毒在抗病毒药物筛选、动物活体成像以及乙型脑炎疫苗评价中的应用。

背景技术

日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）是流行性乙型脑炎（简称乙脑）的病原体，病毒通过蚊虫叮咬传播，病毒随着蚊虫唾液进入人体，引发中枢神经系统损伤，病死率和致残率高，作为一种以儿童为高发人群的传染病，乙脑严重危害儿童的身心健康。乙脑主要流行于亚洲地区，1995年开始传播至澳大利亚，近年来流行区覆盖至亚洲和太平洋地区的24个国家，已成为严重的公共卫生问题。我国是乙脑流行最严重的国家之一，乙脑疫苗的大规模使用明显降低了我国乙脑发病率。尽管如此，2012年WHO统计结果显示，全球每年约有20,000例流行性乙脑病例发生，其中60000人死亡，约有30%-50%的患者存有终生神经系统后遗症，我国大陆的发病人数仍占全球病例的50%左右。目前为止，尚无特效抗病毒药物治疗JEV感染引发的乙型脑炎，主要采用对症及支持疗法。为了降低乙型脑炎的病死率和后遗症的发生，科学工作者针对JEV展开了深入研究，包括病毒复制机制和致病机理等，以期为研制针对乙脑的抗病毒药物，研发新型疫苗和改良治疗方法提供理论依据。

JEV病毒属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus）成员，同属的其它病毒包括登革病毒（DENV）、蜱传脑炎病毒（TBEV）、黄热病毒（YFV）和西尼罗河病毒（WNV）等，均是引起人类致病的重要病原体。黄病毒属病毒为包膜病毒，基因组为单正链RNA，大约长10～11kb,5’端具有有细胞mRNA类似的7-甲基鸟苷帽(Cap)结构，但3’端缺少多聚腺苷尾Poly A.病毒基因组含有一个大的阅读框，在进入细胞后即可以自身为信使RNA，翻译出一条多聚蛋白，在细胞和病毒蛋白酶的作用下切割成三个结构蛋白和七个非结构蛋白。非结构蛋白有多种酶活性，主要参与病毒的复制，包括NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5.结构蛋白主要与病毒的包装有关，分别是衣壳蛋白（Capsid,C）、prM蛋白和包膜E蛋白。

RNA病毒的反向遗传学技术，也称为“病毒拯救”技术，一般是在质粒中构建含有整个病毒基因组的cDNA拷贝，通过体外转录过程再次得到病毒基因组RNA，将此RNA转染病毒敏感细胞中可以拯救出活病毒，这种cDNA质粒称为感染性克隆。通过感染性cDNA克隆，科学工作者可以在DNA水平上对病毒基因组进行各种修饰和改造，通过病毒的表型来判断这些操作对病毒的影响，从而研究病毒复制机制和致病机理，甚至得到减毒株，研发新型疫苗。因此，感染性克隆的构建解决了RNA病毒基因组难以操作的困扰，为RNA病毒的研究提供有效的工具。目前已有许多RNA病毒的全长感染性克隆构建成功，如肠道病毒属的EV71病毒、脊髓灰质炎病毒，黄病毒属的登革病毒、黄热病毒等，在RNA病毒研究领域有广泛的应用。报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因，如荧光蛋白或荧光素酶等。在感染性克隆的基础上，将报告基因与病毒基因组融合，构建含有报告基因的病毒cDNA感染性克隆,拯救出具有感染性的稳定表达报告基因的病毒，通过测定报告基因所表达蛋白的活性即可直观判断病毒生长情况。与传统的病毒滴度检测方法相比，报告基因的表达检测灵敏度更高、检测时间极大缩短，可以大大提高病毒检测的效率和灵敏度。这种含有含有报告基因和病毒基因组的克隆称为报告病毒感染性克隆，其拯救出的病毒称为报告病毒。与感染性克隆相比，报告病毒感染性克隆显然有着更加便捷的优势。

活体动物体内成像是近年来新兴的检测活体动物体内基因表达及细胞活动的光学成像技术，具有操作简便，直观性强的特点。活体动物体内光学成像主要采用生物发光技术和荧光技术。其中生物发光是用荧光素酶基因标记细胞或DNA，利用报告基因产生的生物发光就可以形成体内的生物光源。虽然哺乳动物组织是不透光的，但是利用灵敏的光子成像技术可以从动物体表检测到组织内部的生物光源，使研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为，操作简单、结果直观、灵敏度高，是一种十分有效的研究实验动物生理过程的技术，广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。因此，将荧光素酶与病毒基因组进行融合而构建的报告病毒感染性克隆，是将反向遗传学技术与活体动物成像技术结合起来，对病毒在体内进行追踪，观察病毒在体内的发展过程，可为研究者提供广阔的应用空间。

本发明提供一种带有海肾荧光素酶（Renilla luciferase,Rluc）基因的JEV病毒的感染性克隆的构建方法，以及该感染性克隆所拯救出的报告病毒Rluc-JEV在药物筛选和动物活体成像、疫苗评价等方面的应用。本发明所构建的带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆将为深入展开JEV病毒的复制、包装机制等基础理论研究以及药物研发、疫苗评价等应用研究提供有效的技术平台，可有效地服务于人类的医疗卫生事业。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆pACYC-Rluc-JEV-FL，其序列为SEQ ID NO.1所示，其中，1～95：JEV-5’UTR序列；96～197：JEV-Capsid蛋白N端34位氨基酸序列；198～1130：海肾荧光素酶序列；1131～1190：口蹄疫病毒FMDV2A自切割肽序列；1191～12071：JEV病毒结构蛋白、非结构蛋白以及3’UTR序列；12071～12268：丁型肝炎病毒核酶（HDVR）序列；12269～14692：pACYC177序列；14693～14710：T7启动子序列。

本发明还有一个目的在于提供了一种带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆的构建方法，根据本发明提供的方法，构建带有海肾荧光素酶Rluc报告基因的JEV SA14病毒株感染性克隆，并将体外转录获得的RNA转染BHK-21细胞，通过定点收集细胞和上清，可获得带有荧光素酶的JEV病毒。

本发明还有一个目的在于提供了一种带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆在活体动物成像中的应用。利用带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆所拯救出的Rluc-JEV报告病毒对小鼠进行Rluc-JEV报告病毒感染实验，通过动物活体成像系统检测小鼠体内Rluc信号，实现了对病毒在小鼠体内的动态观察。

本发明还有一个目的在于提供了一种带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆在抗病毒药物筛选的应用。利用该克隆所拯救出的Rluc-JEV报告病毒，通过检测荧光素酶活性，可知道药物对病毒的抑制情况，可以作为有效的抗病毒药物筛选平台。

本发明最后一个目的在于提供了一种带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆在乙型脑炎疫苗评价中的应用。通过比较新型疫苗株病毒免疫的小鼠与未免疫对照小鼠在感染Rluc-JEV报告病毒后的动物成像结果，对新型疫苗研制进行效果评价。

为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：

本发明的设计思路为：

以低拷贝的载体pACYC177为对象，将JEV的基因组插入到pACYC177中，同时在与病毒5’端非编码区上游的连接区域引入T7RNA聚合酶的启动子序列，病毒3’末端引入HDVR(hepatitis delta virus ribozyme，HDVR)序列，并将Rluc基因插入病毒衣壳蛋白capsid的N端，Rluc基因插入的同时，将capsid的N端34个氨基酸进行重复拷贝，因此带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆基因组的顺序为：T7-5’UTR-Capsid34-Rluc-2A-Capsid-PrM-E-NS1～5-3’UTR.其中5’UTR后面重复的capsid-34可以提供病毒复制必须的顺式作用元件，保证病毒5’末端和3’末端的正常环化，从而不影响Rluc插入后的基因组的正常复制。此外，T7启动子可以线性化的DNA为模板，在体外高效的转录获得病毒RNA，HDVR序列可将转录后的RNA从3’UTR末端与pACYC载体序列切割开来，从而保证体外转录的RNA具有正确的病毒3’UTR序列。以上处理可以高效获得正确的病毒RNA，并解决了外源基因插入病毒基因组造成基因组不复制的现象，转录出的RNA转染细胞后，RNA可正常复制，并产生具有感染性的病毒粒子。

一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆，其构建方法如下：

1）JEV-SA14病毒株基因组序列分段合成：

构建带有JEV全长基因组的cDNA感染性克隆：选择JEV-SA14病毒株序列，GenBank No.U14163.1；分成四个片段进行基因合成，这四个片段分别命名为片段A,片段B,片段C,和片段D，其中片段A为T7+基因组1～3450nt序列,片段B为基因组3446-5581nt序列，片段C为基因组5576-9136nt序列，片段D为基因组9121-10976nt+HDVR序列；T7启动子序列如SEQ ID NO.2所示，HDVR序列为SEQ ID NO.3所示，四个片段分别用PsiⅠ和BamHⅠ插入低拷贝质粒pACYC177载体，转化至大肠杆菌感受态HB10；质粒均经过DNA测序鉴定为正确序列，分别命名为pACYC-A,pACYC-B,pACYC-C和pACYC-D。

2）含有病毒基因组的JEV cDNA感染性克隆的构建：

（1）JEV基因组片段A+B的拼接：用BspEⅠ和BamHⅠ酶切上述步骤1）中所得的pACYC-A和pACYC-B，回收pACYC-A的大片段与pACYC-B的大片段；将pACYC-A的大片段作为载体，pACYC-B的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HB101，挑取菌落并进行PCR鉴定；将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，将测序正确的质粒命名为pACYC-A+B；

（2）JEV基因组片段C+D的拼接：用XbaⅠ和XhoⅠ酶切上述步骤1）中所得的pACYC-C和pACYC-D，回收pACYC-C的大片段与pACYC-D的大片段；将pACYC-C的大片段作为载体，pACYC-D的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HB101，挑取菌落并进行PCR鉴定；将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒命名为pACYC-C+D；

（3）JEV基因组全长pACYC-A+B+C+D的拼接：用BamHⅠ和XhoⅠ酶切上述步骤中所得的pACYC-A+B和上述步骤所得pACYC-C+D，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pACYC-A+B的大片段与pACYC-C+D的大片段；将pACYC-A+B的大片段作为载体，pACYC-C+D的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HB101，挑取菌落并进行PCR鉴定，将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒即为拼接完成的含有JEV全长基因组的cDNA质粒，命名为pACYC-JEV-FL。

3）带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆的构建：

（1）待融合的三个目的基因的特异性扩增：

①片段T7-5’UTR-Capsid-34的扩增：以pACYC-JEV-FL为模板，使用PrimeSTARHS酶扩增含有T7-5’UTR-Capsid-34的序列，引物为SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6所示，回收DNA片段。

②片段Rluc-2A的特异性扩增：以含有Rluc基因的WNV-Rluc-replicon质粒为模板，使用PrimeSTAR HS酶扩增含有Rluc-2A的序列，引物为SEQ ID NO.7,SEQ ID NO.8，回收DNA片段；

③片段Capsid-prM-E的特异性扩增：以pACYC-JEV-FL为模板，使用PrimeSTARHS酶扩增含有Capsid-prM-E的序列，引物为SEQ ID NO.9,SEQ ID NO.10，回收DNA片段；

（2）两步融合PCR法扩增T7-5’UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Capsid-prM-E片段：

第一步融合PCR：片段T7-5’UTR-Capsid-34-Rluc-2A的融合PCR特异性扩增：以上述所得片段T7-5’UTR-Capsid-34和Rluc-2A为模板，使用PrimeSTAR HS酶扩增含有T7-5’UTR-Capsid-34-Rluc-2A的序列，引物为SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.8，回收DNA片段；

第二步融合PCR：片段T7-5’UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Capsid-prM-E的融合PCR特异性扩增：以上述所得片段Capsid-prM-E和T7-5’UTR-Capsid-34-Rluc-2A为模板，使用PrimeSTAR HS酶扩增含有T7-5’UTR-Capsid34-Rluc-2A-Capsid-prM-E的序列，引物为SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.10，回收DNA片段；

（3）将荧光素酶基因Rluc插入JEV全长感染性克隆：将T7-5’UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Capsid-prM-E和JEV全长感染性克隆pACYC-JEV-FL分别用KpnⅠ和BsrGⅠ双酶切。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切产物，经过T4DNA连接酶将回收的酶切产物按照片段:载体摩尔比为6:1进行连接，并将连接产物转化HB101感受态，将PCR鉴定阳性的克隆进行培养并抽提质粒，测序正确，获得的质粒即为带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆，命名为pACYC-Rluc-JEV-FL。

带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆成功拯救出与野生型病毒生长趋势相同的Rluc-JEV报告病毒，其步骤是：

1、用XhoⅠ酶切pACYC-JEV-FL及pACYC-Rluc-JEV-FL进行线性化处理，线性化产物经酚氯仿抽提后，分别以线性化的pACYC-JEV-FL和pACYC-Rluc-JEV-FL为模板，使用体外转录试剂盒T7mMESSAGE mMACHINE kit（购自美国Ambion公司），按照试剂盒说明分别得到带JEV的RNA及Rluc-JEV的RNA。

2、体外转录得到的Rluc-JEV及JEV RNA分别使用电转的方法转染BHK-21细胞，接种2×10⁵转染了各RNA的BHK细胞于12孔细胞培养板中，并在转染后2、12、24、48、72和96h后收取培养基上清作为不同时间点的Rluc-JEV及JEV P0代病毒，并于-80℃保存。

3、接种2×10⁵转染了Rluc-JEV的BHK细胞于12孔细胞培养板中，在转染后2、12、24、48、72和96h后，收集上清完毕后分别向孔中加入1ml PBS洗一遍后，吸弃孔中PBS，并分别加入200μl细胞裂解液处理细胞，分别混匀孔中的细胞裂解物，取20μl于白色96孔板中，并加入50μl的底物腔肠素（coelenterazine），按照Luciferase Assay System（购于Promega公司）说明书的要求使用多功能酶标仪（购于德国Thermo公司）检测Rluc的活性。

4、接种4×10⁵转染了Rluc-JEV及JEV RNA的BHK细胞于每孔放置了三个10mm×10mm盖玻片的6孔板中，分别于转染后24、48、72h后用丙酮固定液（购于国药集团化学试剂公司）对细胞进行固定，使用针对黄病毒E蛋白的抗体进行免疫荧光检测，检测RNA转染至细胞后的病毒E蛋白表达情况；

5、双层噬斑检测不同时间点的Rluc-JEV及JEV P0代病毒的噬斑形态及生长曲线：在6孔细胞培养板的各孔中分别接种4×10⁵个Vero细胞，24h后待细胞覆盖孔底80-90%时，吸弃孔中的培养基，加入DMEM培养基10倍比稀释的转染后不同时间点的Rluc-JEV及JEV的病毒100μl，37℃吸附1h。吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，加入第一层由含有2%FBS培养基的琼脂糖覆盖物，于37℃、5%CO₂的培养箱中培养3天后，加入第二层含有中性红的琼脂糖覆盖物，于37℃、5%CO₂的培养箱中培养12h后观察噬斑形态和数量。

一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆在抗病毒药物筛选中的应用，其步骤是：

本发明选择两种已知的对黄病毒属病毒有抑制作用的药物：利巴韦林及NITD008来检测这两种药物对Rluc-JEV的抑制作用：

1、利巴韦林对Rluc-JEV的抑制作用：在12孔细胞培养板每孔中接种1×10⁵BHK-21细胞，在37℃，5%CO₂培养条件下，待汇合度达到60%时，分别向每孔加入Rluc-JEV病毒液，感染复数MOI为0.01，37℃，5%CO₂培养箱中吸附1h后，将各个孔的病毒液用枪头吸弃，分别加入用含2％胎牛血清的DMEM培养基2倍系列稀释的利巴韦林（浓度分别为0、0.25、0.5、0.25、1和2mg/ml），于37℃，5%CO₂的培养箱中培养48h后分别丢弃孔中的上清，并向孔中加入1ml PBS后吸弃孔中PBS，并分别加入200μl细胞裂解液处理细胞并混匀孔中的细胞裂解物，取20μl于白色96孔板中，并加入50μl的底物，按照Luciferase Assay System（前面已述）说明书的要求使用多功能酶标仪（前面已述）检测Rluc的活性。

2、NITD008对Rluc-JEV的抑制作用：在12孔细胞培养板每孔中接种1×10⁵BHK-21细胞，在37℃，5%CO₂培养条件下，待汇合度达到60%时，分别向每孔加入Rluc-JEV病毒液，感染复数MOI为0.01，37℃、5%CO₂培养箱中吸附1h后，将各个孔的病毒液用枪头吸弃，分别加入用含2％胎牛血清的DMEM培养基系列稀释的NITD008（浓度分别为0、0.11、1、3、9和27μM），于37℃、5%CO₂的培养箱中培养48h后分别丢弃孔中的上清，并向孔中加入1ml PBS后吸弃孔中PBS，并分别加入200μl细胞裂解液处理细胞并混匀孔中的细胞裂解物，取20μl于白色96孔板中，并加入50μl的底物，按照Luciferase Assay System（前面已述）说明书的要求使用多功能酶标仪（前面已述）检测Rluc的活性。

一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆在活体动物成像中的应用，其步骤是：

取两只三周龄BALB/c小鼠，每只均经腹腔注射1×10⁷PFU Rluc-JEV病毒，分别在接种病毒后的24h、48h和72h以后，每只小鼠腹腔注射1.5mg Rluc的底物腔肠素（Coelenterazine）（购于Promega公司），注射腔肠素10分钟后，将小鼠经小动物麻醉机（购于美国Matrx公司）麻醉后放入成像暗箱，使用50成像系统（购于美国精诺真公司Xenogen Corp）进行检测成像并摄取影像，应用系统配套分析软件ROI对小鼠体内细胞或组织发出的荧光进行定量分析。

一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆在乙型脑炎疫苗评价中的应用，其步骤是：

取两只三周龄BALB/c小鼠，分别为实验组和对照组。实验组小鼠经腹腔注射0.03ml乙型脑炎减毒疫苗JEV-SA14-14-2（购于北京生物制品研究所），对照组腹腔注射0.03mlPBS。三周后，实验组和对照组小鼠均经腹腔注射1×10⁷PFU Rluc-JEV病毒，分别于注射Rluc-JEV病毒后第3天和第5天，实验组小鼠和对照组小鼠分别经腹腔注射1.5mgRluc的底物腔肠素，注射腔肠素10分钟后，将小鼠经小动物麻醉机（前面已述）麻醉后放入成像暗箱，使用50成像系统（前面已述）进行检测成像并摄取影像，应用系统分析软件ROI进行分析，比较实验组和对照组小鼠体内细胞或组织发出的荧光量。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、本发明制备的带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆可以高效获得正确的病毒RNA，并解决了外源基因插入病毒基因组造成基因组不复制的现象，转录出的RNA转染细胞后，RNA可正常复制，并产生具有感染性的病毒粒子。

2、本发明中的Rluc-JEV报告病毒感染性克隆拯救出的Rluc-JEV与野生型JEV病毒有着相同的生长趋势，Rluc-JEV病毒滴度又与Rluc信号值直线相关，因此，可通过直接检测Rluc信号值，即可判断Rluc-JEV的病毒生长情况，继而反映JEV的病毒生长情况。因此，可通过检测Rluc信号来替换传统的病毒滴度测定方法，与传统的通过病毒噬斑检测病毒生长情况相比，通过检测Rluc-JEV的荧光素酶活性来反映病毒生长趋势更加快捷、更加灵敏。不仅具有极高的检测灵敏度，而且可以用低廉的实验费用在极短的时间获得预期的实验或检测结果。

3、通过药物抑制实验，证明本发明中的带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆所拯救出的Rluc-JEV病毒是有效的药物筛选平台。与传统的药物筛选方法相比，Rluc-JEV病毒不仅有着明显的灵敏度和高效率，还可以用于高通量筛选抗病毒药物，可同时对多种药物抗病毒效果进行快速检测，缩短药物研发周期，是研发出特异性抗JEV病毒药物的有效工具。与目前应用广泛的带有报告基因的复制子系统筛选体系相比，Rluc-JEV报告病毒与带有报告基因的复制子系统一样，具有易操作、高灵敏度以及高准确性的优点，都可应用于抗病毒药物的高通量筛选。同时，Rluc-JEV报告病毒克服了复制子系统不能筛选作用靶点为病毒结构蛋白的药物的缺点：复制子系统由于缺失病毒结构蛋白基因，仅能检测作用靶点为非结构蛋白的药物；然而本发明所拯救出的Rluc-JEV病毒含有病毒全长基因组，可形成具有感染性的病毒粒子，不仅可以筛选作用靶点为非结构蛋白的药物，还能筛选出作用靶点为结构蛋白的药物，并可区分出所筛选药物的作用机制是基于病毒的复制过程还是包装过程。

4、本发明中的带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆所拯救出的Rluc-JEV病毒可有效在动物体内进行活体成像。这项技术可以实现无损伤的在动物体内进行病毒的动态示踪，因此可以利用同一组动物进行长时间的研究，从而大大减少了实验动物的使用数量。更为有力的是，由于一系列的数据来源于同一只或同一组动物，以自身作为内对照，大大增加了数据的可靠性。通过活体动物体内成像系统，可观测到病毒在动物体内的发展进程以及药物治疗或疫苗免疫所产生的反应，可广泛应用于动物水平的药物测试和疫苗评价。通过活体动物成像系统，可以观察Rluc-JEV病毒在动物体内的繁殖部位、数量变化及对外界因素的反映；并且是同一批老鼠持续观察，可排除个体间的差异；具有更高的灵敏度，在整体上观察活体动物的感染途径；可定量比较各个器官的感染程度。

5.本发明所构建的带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆，是以JEV病毒强毒株SA14株为模板所构建的，SA14病毒为强毒株，其弱毒株SA14-14-2为目前广泛使用的乙型脑炎疫苗株。通过比较JEV-SA14-14-2疫苗株病毒免疫的小鼠与未免疫对照小鼠在感染Rluc-JEV报告病毒后的动物成像结果发现，疫苗株免疫的小鼠可以抵抗Rluc-JEV病毒感染，成像结果为阴性，而未免疫对照小鼠则可以检测到明显的Rluc信号，证明本发明所构建的Rluc-JEV报告病毒系统可用于疫苗评价，未来可对新型疫苗研制进行效果评价。

因此，以本发明为基础，将为深入开展JEV的动物模型、病毒的复制机制与致病机理，抗病毒药物筛选和药物的作用机制、疫苗和诊断试剂等方面具有广泛的应用价值，因此具有十分重要的理论意义和现实意义。

附图说明：

图1为一种含有JEV病毒SA14株基因组cDNA的JEV全长感染性克隆的构建示意图。

图2为一种带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆的构建示意图。

图3为一种由感染性克隆拯救出的JEV及Rluc-JEV病毒免疫荧光及噬斑形态示意图。

图4为JEV及Rluc-JEV RNA转染BHK-21细胞的病毒生长曲线，及Rluc-JEV不同时间点的Rluc信号与病毒滴度的线性关系示意图。

A：Rluc-JEV不同时间点的Rluc信号，以及JEV和Rluc-JEV转染后不同时间点的病毒生长曲线；

B：Rluc-JEV不同时间点的Rluc信号与病毒滴度的线性关系，其中R²=0.986，y=0.6881x+5.0966.

图5为抗病毒药物NITD008及利巴韦林对Rluc-JEV病毒的抑制作用示意图。

A：不同浓度NITD008作用下Rluc-JEV病毒的Rluc信号；

B：不同浓度利巴韦林作用下Rluc-JEV病毒的Rluc信号。

图6为Rluc-JEV感染小鼠后第1,3,5天动物活体成像示意图。

图7为JEV-SA14-14-2疫苗株免疫的实验组小鼠及未免疫对照组小鼠在感染Rluc-JEV后的体内成像示意图。

A为JEV-SA14-14-2疫苗株免疫的实验组小鼠及未免疫对照组小鼠在感染Rluc-JEV后的体内成像图；

B为ROI软件分析免疫组与对照组小鼠腹腔内的Rluc信号值对比；

C为ROI软件分析免疫组与对照组小鼠脑内的Rluc信号值对比。

具体实施方式

本实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法以下列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以下实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

实施例1：

一种带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆的构建方法，其步骤是：

1、JEV-SA14病毒株基因组序列分段合成：

构建带有JEV全长基因组的cDNA感染性克隆：选择JEV-SA14(GenBank No.U14163.1)病毒株序列，分成四个片段进行基因合成（金唯智生物科技有限公司），这四个片段分别命名为片段A,片段B,片段C,和片段D。其中片段A包括”T7+基因组1～3450nt”的序列,片段B包括”基因组3446-5581nt”的序列，片段C包括“基因组5576-9136nt“的序列，片段D包括“基因组9121-10976nt+HDVR”的序列。片段A中的”T7”为启动子，序列如SEQ ID NO.2所示，位于病毒基因组5’UTR之前，是为了保证构建的cDNA在体外转录得到基因组RNA。片段D中的”HDVR”为序列为丁型肝炎病毒核酶(hepatitis deltavirus ribozyme，HDVR)序列，序列如SEQ ID NO.3所示，位于病毒基因组3’UTR之后，可将体外转录出的RNA自3’UTR处切断，与cDNA克隆3’UTR后面的载体序列分开，形成正确的基因组3’UTR末端，如此在体外转录出的RNA序列，即为完整的JEV基因组RNA，不含有其他非特异序列。四个片段分别用PsiⅠ（购于美国NEB公司）和BamHⅠ（购于美国NEB公司）插入低拷贝质粒pACYC177载体（购于美国Promega公司），转化至大肠杆菌感受态HB101（购于美国Promega公司）。含有所合成基因片段的质粒均经过DNA测序鉴定为正确序列，分别命名为pACYC-A,pACYC-B,pACYC-C和pACYC-D。

2、含有病毒基因组的JEV cDNA感染性克隆的构建：

（1）JEV基因组片段A+B的拼接：用BspEⅠ（购于美国NEB公司）和BamHⅠ（前面已述）酶切上述步骤1中所得的pACYC-A和pACYC-B，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒（购自天根生化科技有限公司）回收pACYC-A的大片段与pACYC-B的大片段，使用Thermo Scientific NanoDrop2000(购于Thermo公司)测定DNA的浓度，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。将pACYC-A的大片段作为载体，pACYC-B的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶(购于美国NEB公司)将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HB101(前面已述)，挑取菌落并进行PCR鉴定。PCR的鉴定反应体系为：10×buffer:2μl,dNTP:0.4μl,引物(5’-GAATGCCCTGATGAGCACAGA-3’):0.2μl,引物(5’-ATGGCAAACATCAATCCA-3’):0.2μl,Taq酶：0.2μl，水：16.8μl，总体系20μl.扩增条件为：94℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃3min，72℃10min，16℃10min，28个循环。将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，将测序正确的质粒命名为pACYC-A+B。

（2）JEV基因组片段C+D的拼接：用XbaⅠ（购于美国NEB公司）和XhoⅠ（购于美国NEB公司）酶切上述步骤1中所得的pACYC-C和pACYC-D，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒（前面已述）回收pACYC-C的大片段与pACYC-D的大片段，使用Thermo Scientific NanoDrop2000(前面已述)测定DNA的浓度，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。将pACYC-C的大片段作为载体，pACYC-D的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶(前面已述)将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HB101(前面已述)，挑取菌落并进行PCR鉴定。PCR鉴定的反应体系为：10×buffer:2μl,dNTP:0.4μl,引物(5’-GGAAGGCCTGGGGGCAGGACG-3’):0.2μl,引物(5’-AGATCCTGTGTTCTTCCTCACTA-3’):0.2μl,Taq酶：0.2μl，水：16.8μl，总体系20μl.扩增条件为：94℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃3min，72℃10min，16℃10min，28个循环。将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒命名为pACYC-C+D。

（3）JEV基因组全长pACYC-A+B+C+D的拼接：用BamHⅠ（前面已述）和XhoⅠ（前面已述）酶切上述步骤中所得的pACYC-A+B和上述步骤所得pACYC-C+D，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒（前面已述）回收pACYC-A+B的大片段与pACYC-C+D的大片段，使用Thermo Scientific NanoDrop2000(购自Thermo公司)测定DNA的浓度，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。将pACYC-A+B的大片段作为载体，pACYC-C+D的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶(前面已述)将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HB101(前面已述)，挑取菌落并进行PCR鉴定。PCR鉴定的反应体系为：10×buffer:2μl,dNTP:0.4μl,引物(5’-GTGTTTTGGGACACGCCATCC-3’):0.2μl,引物(5’-ACTAGAGCACCAAGACCCATC-3’):0.2μl,Taq酶：0.2μl，水：16.8μl，总体系20μl.扩增条件为：94℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃3min，72℃10min，16℃10min，28个循环。将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒即为拼接完成的包含有JEV全长基因组的cDNA质粒（图1），命名为pACYC-JEV-FL.

3、带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆的构建：

（1）待融合的三个目的基因的特异性扩增：

①片段“T7-5’UTR-Capsid-34”的扩增：以pACYC-JEV-FL为模板，使用PrimeSTAR HS酶（购自Takara公司）扩增含有“T7-5’UTR-Capsid-34”的序列，引物为SEQ IDNO.5,SEQ ID NO.6所示。使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒（购自天根生化科技有限公司）分别回收DNA片段，使用Thermo Scientific NanoDrop2000（前面已述）测定DNA的浓度，使用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于-20℃保存备用。

②片段”Rluc-2A”的特异性扩增：以含有Rluc基因的”WNV-Rluc-replicon”(来自LoMK,Tilgner M,Shi PY.Potential high-throughput assay for screening inhibitors of West Nile virus replication J Virol.2003Dec;77(23):12901-6.)质粒为模板，使用PrimeSTAR HS酶（前面已述）扩增含有“Rluc-2A”的序列，引物为SEQ ID NO.7,SEQ ID NO.8；其中Rluc为海肾荧光素酶序列，序列为GenBank：HV535459.1所示,2A为口蹄疫病毒FMDV的2A自切割肽序列，序列为SEQ ID NO.4所示。使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒（前面已述）分别回收DNA片段，使用Thermo Scientific NanoDrop2000（前面已述）测定DNA的浓度，使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于-20℃保存备用。

③片段”Capsid-prM-E”的特异性扩增：以pACYC-JEV-FL为模板，使用PrimeSTARHS酶（前面已述）扩增含有”Capsid-prM-E”的序列，引物为SEQ ID NO.9,SEQ ID NO.10。使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒（前面已述）分别回收DNA片段，使用Thermo Scientific NanoDrop2000（前面已述）测定DNA的浓度，使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于-20℃保存备用。

（2）两步融合PCR法扩增”T7-5’UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Capsid-prM-E”片段：

第一步融合PCR：片段“T7-5’UTR-Capsid-34-Rluc-2A”的融合PCR特异性扩增：以上述所得片段“T7-5’UTR-Capsid-34”和”Rluc-2A”为模板，使用PrimeSTAR HS酶（前面已述）扩增含有“T7-5’UTR-Capsid-34-Rluc-2A”的序列，引物为SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.8.使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒（前面已述）分别回收DNA片段，使用Thermo Scientific NanoDrop2000（前面已述）测定DNA的浓度，使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于-20℃保存备用。

第二步融合PCR：片段“T7-5’UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Capsid-prM-E”的融合PCR特异性扩增：以上述所得片段”Capsid-prM-E”和“T7-5’UTR-Capsid-34-Rluc-2A”为模板，使用PrimeSTAR HS酶（前面已述）扩增含有“T7-5’UTR-Capsid34-Rluc-2A-Capsid-prM-E”的序列，引物为SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.10.使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒（前面已述）分别回收DNA片段，使用ThermoScientific NanoDrop2000（前面已述）测定DNA的浓度，使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于-20℃保存备用。

上述PCR扩增所用PCR仪为Biorad公司的MyCycler Thermal cycler，所用引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR的反应体系均为5×PS buffer：10μl，dNTP：4μl，引物：0.5μl，引物：0.5μl，模板：0.5μl，PrimeSTAR HS酶：0.5μl，水：34μl。扩增条件为：98℃30s,98℃10s,55℃10s,68℃3min,68℃10min,16℃10min,30个循环。

（3）将荧光素酶基因Rluc插入JEV全长感染性克隆：将“T7-5’UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Capsid-prM-E”和JEV全长感染性克隆pACYC-JEV-FL.分别用KpnⅠ和BsrGⅠ双酶切。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切产物，经过T4DNA连接酶（购自美国NEB公司）将回收的酶切产物按照片段：载体摩尔比为6:1进行连接，并将连接产物转化HB101感受态，将PCR鉴定阳性的克隆进行培养并抽提质粒，测序正确。至此获得的质粒即为带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆（图2），命名为pACYC-Rluc-JEV-FL.

实施例2：

带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆成功拯救出与野生型病毒生长趋势相同的病毒

1、质粒的线性化和酚氯仿抽提：各取10μg质粒pACYC-JEV-FL和质粒pACYC-Rluc-JEV-FL，用XhoI(前面已述)酶切，37℃酶切两小时，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切完全后，向酶切产物中加入100μl饱和酚（购自国药集团化学试剂公司），振荡混匀，17000g离心5min，吸取上层液体于新的离心管中，并向原离心管中加入100μl无菌水振荡混匀，17000g离心5min；吸取上层液体与上一步所得液体合并（总体积约200μl），加入200μl氯仿（购自国药集团化学试剂公司）混匀，17000g离心5min；吸取上层液体于无菌进口离心管管中（约150～200μl），加入十分之一体积的pH5.2，3mol/l醋酸钠（购自国药集团化学试剂公司）和2.5倍体积无水乙醇（购自国药集团化学试剂公司）混匀，-20℃放置30min，17000g离心5min；吸弃上清，加入1ml70%乙醇洗涤，17000g离心5min，吸弃上清；室温放置15min，最后加入11μl无RNAase的水溶解，使用Thermo Scientific NanoDrop2000(前面已述)测定DNA的浓度，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，于-20℃保存备用。

2、RNA的体外转录：各取2.5μg酚氯仿抽提的pACYC-JEV-FL和pACYC-Rluc-JEV线性化产物为模板，按照T7mMESSAGE mMACHINE kit（购自美国Ambion公司）说明书的要求将其体外转录为RNA，使用Thermo Scientific NanoDrop2000(前面已述)测定RNA的浓度，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，检测体外所得RNA均有明显主带后，于-80℃保存备用。

3、转染BHK-21细胞：将5μg体外转录的JEV和Rluc-JEV RNA采用电转的方法分别转入8×10⁶BHK-21细胞，分别接种4×10⁵转染了Rluc-JEV及JEV RNA的BHK细胞于每孔放置了三个10mm×10mm盖玻片的6孔板中进行免疫荧光实验，于转染后24、48、72h分别用5%丙酮固定液（购于国药集团化学试剂公司）室温固定细胞15分钟，PBS洗三遍后，于室温环境孵育一抗，抗体为1:250倍稀释的针对黄病毒属E蛋白小鼠单克隆抗体（购于美国Millipore公司），一抗孵育1～2h，PBS冲洗10遍后，于室温避光孵育二抗，抗体为1:125倍稀释的偶联德克萨斯红（Texs-Red）羊抗鼠抗体。孵育二抗1h后，PBS冲洗10遍，于荧光显微镜下使用200×放大倍数进行观察（图3A）。于此同时，电转后的细胞分别接种于12孔细胞培养板中，每孔接种2×10⁵的细胞，并在转染后2、12、24、48、72h和96h收集孔中培养基（即JEV和Rluc-JEV P0代不同时间点的病毒液），并于-80℃保存。其中转染Rluc-JEV RNA的细胞，每次收集病毒完毕后分别向孔中加入1ml PBS后吸弃孔中PBS，并分别加入200μl细胞裂解液处理细胞并混匀孔中的细胞裂解物，取20μl于白色96孔板中，并加入50μl的底物，按照试剂盒说明书的要求使用多功能酶标仪（购自德国Thermo）检测Rluc的活性（图4A）。将冻存的不同时间点Rluc-JEV和JEV病毒取出，室温冻融，使用双层噬斑检测Rluc-JEV及JEV的滴度和噬斑形态，方法是：在6孔细胞培养板的各孔中分别接种4×10⁵个Vero细胞，24h后待细胞覆盖孔底80-90%时，吸弃孔中的培养基，接入DMEM培养基10倍比稀释的转染后不同时间点的Rluc-JEV及JEV的病毒100μl，37℃吸附1h。吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，加入由含有2%FBS培养基的琼脂糖上层覆盖物，于37℃、5%CO₂的培养箱中培养3天后，加入含有中性红的琼脂糖覆盖物，于37℃、5%CO₂的培养箱中培养12h后观察噬斑形态（图3B）和数量（图4A）。从图4A中可以看到，Rluc-JEV病毒生长曲线与JEV病毒生长曲线趋势相同，同时，Rluc信号值与病毒滴度也呈相同增长趋势，表明Rluc信号可以反映Rluc-JEV病毒生长情况，进而反映出JEV病毒的生长趋势。将Rluc-JEV Rluc信号值和滴度分别取对数值后，使用SPSS统计软件进行二者线性回归分析，得出Rluc-JEV病毒滴度与Rluc信号值呈线性相关，回归方程为y=0.6881x+5.0966,R²=0.986（图4B）。

以下应用实施例中使用的均为pACYC-Rluc-JEV-FL拯救出的完整病毒粒子Rluc-JEV，方法参见实施例2。

实施例3：

1、NITD008对Rluc-JEV的抑制作用：在12孔细胞培养板每孔中接种1×10⁵BHK-21细胞，在37℃，5%CO₂培养条件下，待汇合度达到60%时，分别向每孔加入Rluc-JEV病毒液，感染复数MOI为0.01，37℃、5%CO₂培养箱中吸附1h后，将各个孔的病毒液用枪头吸弃，分别加入用含2％胎牛血清的DMEM培养基系列稀释的NITD008（浓度分别为0、0.11、1、3、9和27μM），于37℃、5%CO₂的培养箱中培养48h后分别丢弃孔中的上清，并向孔中加入1ml PBS后吸弃孔中PBS，并分别加入200μl细胞裂解液处理细胞并混匀孔中的细胞裂解物，取20μl于白色96孔板中，并加入50μl的底物，按照Luciferase Assay System说明书的要求使用多功能酶标仪检测Rluc的活性（图5A）。通过对Rluc的活性检测发现，随着NITD008浓度的增加，Rluc信号值逐渐减弱，表明NITD008抑制JEV病毒生长呈现浓度依赖性。

2、利巴韦林对Rluc-JEV的抑制作用：在12孔细胞培养板每孔中接种1×10⁵BHK-21细胞，在37℃，5%CO₂培养条件下，待汇合度达到60%时，分别向每孔加入Rluc-JEV病毒液，感染复数MOI为0.01，37℃，℃，5%CO₂培养箱中吸附1h后，将各个孔的病毒液用枪头吸弃，分别加入用含2％胎牛血清的DMEM培养基2倍系列稀释的利巴韦林（浓度分别为0、0.25、0.5、0.25、1和2mg/ml），于37℃，5%CO₂的培养箱中培养48h后分别丢弃孔中的上清，并向孔中加入1ml PBS后吸弃孔中PBS，并分别加入200μl细胞裂解液处理细胞并混匀孔中的细胞裂解物，取20μl于白色96孔板中，并加入50μl的底物，按照Luciferase Assay System说明书的要求使用多功能酶标仪检测Rluc的活性（图5B）。图中结果显示，随着利巴韦林浓度的增加，Rluc信号值逐渐减弱，表明利巴韦林抑制JEV病毒生长也呈现浓度依赖性。

以上两种药物均是已报道的对黄病毒生长有抑制作用的药物，通过检测不同浓度作用下Rluc-JEV病毒的Rluc信号值，发现随着药物浓度增加，Rluc信号值均呈下降趋势，说明Rluc-JEV病毒的生长受到了抑制，这与已报道的药物抑制野生型JEV病毒的结果相同。因此，实验表明：本发明所构建的带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆所拯救出的Rluc-JEV报告病毒能够用于抗JEV的药物筛选，且灵敏度更强，检测效率更高。

实施例4：

一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆在动物体内成像中的应用，其步骤是：

取两只三周龄BALB/c小鼠，每只均经腹腔注射1×10⁷PFU Rluc-JEV病毒，分别在接种病毒后的24h、48h和72h以后，每只小鼠腹腔注射1.5mg Rluc的底物腔肠素（Coelenterazine）（购于Promega公司），注射腔肠素10分钟后，将小鼠经小动物麻醉机（购于美国Matrx公司）麻醉后放入成像暗箱，使用50成像系统（购于美国精诺真公司Xenogen Corp）进行检测成像并摄取影像（图6）。从成像图像中显示，病毒感染后第一天，即可在小鼠的脑部和腹腔检测到Rluc阳性信号，说明病毒在小鼠体内正常扩增；到病毒感染后第三天，小鼠体内呈现强阳性Rluc信号，说明病毒在小鼠体内大量扩增并持续感染周围组织和细胞；到病毒感染后第五天，小鼠体内仍可观察到阳性Rluc信号，与第三天相比，信号强度及范围有所下降，提示随着时间延长，小鼠体内产生免疫应答，产生特异性抗体，将病毒中和。因此，根据实验结果可以看出，本发明所构建的Rluc-JEV感染性克隆所拯救出的Rluc-JEV病毒可实现病毒在小鼠活体内进行动态观察，可观测到病毒在动物体内的发展进程，具有广泛的应用价值。

实施例5：

取两只三周龄BALB/c小鼠，分别为实验组和对照组。实验组小鼠经腹腔注射0.03ml乙型脑炎减毒疫苗JEV-SA14-14-2（购于武汉生物制品研究所），对照组腹腔注射0.03mlPBS。三周后，实验组和对照组小鼠均经腹腔注射1×10⁷PFU Rluc-JEV病毒，分别于注射Rluc-JEV病毒后3天和5天，每只小鼠腹腔注射1.5mg Rluc的底物腔肠素（前面已述），注射腔肠素10分钟后，将小鼠经小动物麻醉机麻醉后放入成像暗箱放入成像暗箱，使用50成像系统进行检测成像并摄取影像（图7A），应用系统分析软件ROI进行分析，对实验组小鼠和对照组小鼠体内腹腔（图7B）及脑部（图7C）的荧光进行定量。结果显示，经过JEV-SA14-14-2疫苗株免疫的实验组小鼠可以抵抗Rluc-JEV病毒的感染，活体成像结果为阴性背景，而在对照组小鼠体内，Rluc-JEV则可正常扩增，呈现出强阳性信号。ROI软件分析显示，在脑内和腹腔，对照组小鼠体内Rluc信号值可达到10⁷至10⁸，而经过疫苗株免疫的实验组小鼠，脑内和腹腔的Rluc信号则为阴性。证明JEV-SA14-14-2疫苗株的免疫，使小鼠获得了抵抗JEV病毒感染的能力。因此，实验表明：本发明所构建的带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆所拯救出的Rluc-JEV报告病毒可观测到病毒在动物体内的发展进程，实现直观观察病毒在小鼠体内经过疫苗免疫所产生的反应，可广泛应用于动物水平的乙型脑炎疫苗评价。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院武汉病毒研究所

<120> 一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆及构建方法和应用

<130> 一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆及构建方法和应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 14710

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgttg agaagaatcg agagattagt 60

gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgac taaaaaacca ggagggcccg 120

gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccgcgtattc ccactagtgg 180

gagtgaagag ggtagtaatg gcttccaagg tgtacgaccc cgagcaacgc aaacgcatga 240

tcactgggcc tcagtggtgg gctcgctgca agcaaatgaa cgtgctggac tccttcatca 300

actactatga ttccgagaag cacgccgaga acgccgtgat ttttctgcat ggtaacgctg 360

cctccagcta cctgtggagg cacgtcgtgc ctcacatcga gcccgtggct agatgcatca 420

tccctgatct gatcggaatg ggtaagtccg gcaagagcgg gaatggctca tatcgcctcc 480

tggatcacta caagtacctc accgcttggt tcgagctgct gaaccttcca aagaaaatca 540

tctttgtggg ccacgactgg ggggcttgtc tggcctttca ctactcctac gagcaccaag 600

acaagatcaa ggccatcgtc catgctgaga gtgtcgtgga cgtgatcgag tcctgggacg 660

agtggcctga catcgaggag gatatcgccc tgatcaagag cgaagagggc gagaaaatgg 720

tgcttgagaa taacttcttc gtcgagacca tgctcccaag caagatcatg cggaaactgg 780

agcctgagga gttcgctgcc tacctggagc cattcaagga gaagggcgag gttagacggc 840

ctaccctctc ctggcctcgc gagatccctc tcgttaaggg aggcaagccc gacgtcgtcc 900

agattgtccg caactacaac gcctaccttc gggccagcga cgatctgcct aagatgttca 960

tcgagtccga ccctgggttc ttttccaacg ctattgtcga gggagctaag aagttcccta 1020

acaccgagtt cgtgaaggtg aagggcctcc acttcagcca ggaggacgct ccagatgaaa 1080

tgggtaagta catcaagagc ttcgtggagc gcgtgctgaa gaacgagcag cagctgttga 1140

attttgacct tctcaagctg gcgggagacg tcgagtccaa ccctgggcca atgactaaaa 1200

aaccaggagg gcccggtaaa aaccgggcta tcaatatgct gaaacgcggc ctaccccgcg 1260

tattcccact agtgggagtg aagagggtag taatgagctt gttggacggc agagggccag 1320

tacgtttcgt gctggctctt atcacgttct tcaagtttac agcattagcc ccgaccaagg 1380

cgcttttagg ccgatggaaa gcagtggaaa agagtgtggc aatgaaacat cttactagtt 1440

tcaaacgaga acttggaaca ctcattgacg ccgtgaacaa gcggggcaga aagcaaaaca 1500

aaagaggagg aaatgaaggc tcaatcatgt ggctcgcgag cttggcagtt gtcatagctt 1560

gtgcaggagc catgaagttg tcgaatttcc aggggaagct tttgatgacc atcaacaaca 1620

cggacattgc agacgttatc gtgattccca cctcaaaagg agagaacaga tgctgggtcc 1680

gggcaatcga cgtcggctac atgtgtgagg acactatcac gtacgaatgt cctaagctta 1740

ccatgggcaa tgatccagag gatgtggatt gctggtgtga caaccaagaa gtctacgtcc 1800

aatatggacg gtgcacgcgg accaggcatt ccaagcgaag caggagatcc gtgtcggtcc 1860

aaacacatgg ggagagttca ctagtgaata aaaaagaggc ttggctggat tcaacgaaag 1920

ccacacgata tctcatgaaa actgagaact ggatcataag gaatcctggc tatgctttcc 1980

tggcggcggt acttggctgg atgcttggca gtaacaacgg tcaacgcgtg gtatttacca 2040

tcctcctgct gttggtcgct ccggcttaca gttttaattg tctgggaatg ggcaatcgcg 2100

acttcataga aggagccagt ggagccactt gggtggactt ggtgctggaa ggagatagct 2160

gcttgacaat catggcaaac gacaaaccaa cattggacgt ccgcatgatt aacatcgaag 2220

ctagccaact tgctgaggtc agaagttact gctatcatgc ttcagtcact gacatctcga 2280

cggtggctcg gtgccccacg actggagaag cccacaacga gaagcgagct gatagtagct 2340

atgtgtgcaa acaaggcttc actgaccgtg ggtggggcaa cggatgtgga cttttcggga 2400

agggaagcat tgacacatgt gcaaaattct cctgcaccag taaagcgatt gggagaacaa 2460

tccagccaga aaacatcaaa tacgaagttg gcatttttgt gcatggaacc accacttcgg 2520

aaaaccatgg gaattattca gcgcaagttg gggcgtccca ggcggcaaag tttacagtaa 2580

cacccaatgc tccttcgata accctcaaac ttggtgacta cggagaagtc acactggact 2640

gtgagccaag gagtggactg aacactgaag cgttttacgt catgaccgtg gggtcaaagt 2700

catttctggt ccatagggag tggtttcatg acctcgctct cccctggacg tccccttcga 2760

gcacagcgtg gagaaacaga gaactcctca tggaatttga agaggcgcac gccacaaaac 2820

agtccgttgt tgctcttggg tcacaggaag gaggcctcca tcaggcgttg gcaggagcca 2880

tcgtggtgga gtactcaagc tcagtgaagt taacatcagg ccacctgaaa tgtaggctga 2940

aaatggacaa actggctcta aaaggcacaa cctatggcat gtgtacagaa aaattctcgt 3000

tcgcgaaaaa tccggcggac actggtcacg gaacagttgt cattgaactc tcctactctg 3060

ggagtgatgg cccctgcaaa attccgattg tttccgttgc gagcctcaat gacatgaccc 3120

ccgttgggcg gctggtgaca gtgaacccct tcgtcgcgac ttccagtgcc aactcaaagg 3180

tgctggtcga gatggaaccc cccttcggag actcctacat cgtagttgga aggggagaca 3240

agcagatcaa ccaccattgg cacaaagctg gaagcacgct gggcaaggcc ttttcaacaa 3300

ctttgaaggg agctcaaaga ctggcagcgt tgggcgacac agcctgggac tttggctcta 3360

ttggaggggt cttcaactcc ataggaaaag ccgttcacca agtgtttggt ggtgccttca 3420

gaacactctt tgggggaatg tcttggatca cacaagggct aatgggtgcc ctactgctct 3480

ggatgggcgt caacgcacga gaccgatcaa ttgctttggc cttcttagcc acagggggtg 3540

tgctcgtgtt cttagcgacc aatgtgcatg ctgacactgg atgtgccatt gacatcacaa 3600

gaaaagagat gagatgtgga agtggcatct tcgtgcacaa cgacgtggaa gcctgggtgg 3660

ataggtataa atatttgcca gaaacgccca gatccctagc gaagatcgtc cacaaagcgc 3720

acaaggaagg cgtgtgcgga gtcagatctg tcactagact ggagcaccaa atgtgggaag 3780

ccgtaaggga cgaattgaac gtcctgctca aagagaatgc agtggacctc agtgtggttg 3840

tgaacaagcc cgtgggaaga tatcgctcag cccctaaacg cctatccatg acgcaagaga 3900

agtttgaaat gggctggaaa gcatggggaa aaagcatcct ctttgccccg gaattggcta 3960

actccacatt tgtcgtagat ggacctgaga caaaggaatg ccctgatgag cacagagctt 4020

ggaacagcat gcaaatcgaa gacttcggct ttggcatcac atcaacccgt gtgtggctga 4080

aaattagaga ggagagcact gacgagtgtg atggagcgat cataggcacg gctgtcaaag 4140

gacatgtggc agtccatagt gacttgtcgt actggattga gagtcgctac aacgacacat 4200

ggaaacttga gagggcagtc tttggagagg tcaaatcttg cacttggcca gagacacaca 4260

ccctttgggg agatgatgtt gaggaaagtg aactcatcat tccgcacacc atagccggac 4320

caaaaagcaa gcacaatcgg agggaagggt ataagacaca aaaccaggga ccttgggatg 4380

agaatggcat agtcttggac tttgattatt gcccagggac aaaagtcacc attacagagg 4440

attgtagcaa gagaggccct tcggtcagaa ccactactga cagtggaaag ttgatcactg 4500

actggtgctg tcgcagttgc tcccttccgc ccctacgatt ccggacagaa aatggctgct 4560

ggtacggaat ggaaatcaga cctgttaggc atgatgaaac aacactcgtc agatcacagg 4620

ttgatgcttt caatggtgaa atggttgacc cttttcagct gggccttctg gtgatgtttc 4680

tggccaccca ggaggtcctt cgcaagaggt ggacggccag attgaccatt cctgcggttt 4740

tgggggccct acttgtgctg atgcttgggg gcatcactta cactgatttg gcgaggtatg 4800

tggtgctagt cgctgctgct ttcgcagagg ccaacagtgg aggagacgtc ctgcaccttg 4860

ctttgattgc cgtttttaag atccaaccag catttctagt gatgaacatg cttagcacga 4920

gatggacgaa ccaagaaaac gtggttctgg tcctaggggc tgcctttttc caattggcct 4980

cagtagatct gcaaatagga gtccacggaa tcctgaatgc cgccgctata gcatggatga 5040

ttgtccgagc gatcaccttc cccacaacct cctccgtcac catgccagtc ttagcgcttc 5100

taactccggg gatgagggct ctatacctag acacttacag aatcatcctc ctcgtcatag 5160

ggatttgctc cctgctgcac gagaggaaaa agaccatggc aaaaaagaaa ggagctgtac 5220

tcttgggctt agcgctcaca tccactggat ggttctcgcc caccactata gctgccggac 5280

taatggtctg caacccaaac aagaagagag ggtggccagc tactgagttt ttgtcggcag 5340

ttggattgat gtttgccatc gtaggtggtt tggccgagtt ggatattgaa tccatgtcaa 5400

tacccttcat gctggcaggt ctcatggcag tgtcctacgt ggtgtcagga aaagcaacag 5460

atatgtggct tgaacgggcc gccgacatca gctgggagat ggatgctgca atcacaggaa 5520

gcagtcggag gctggatgtg aaactggatg atgacggaga ttttcacttg attgatgatc 5580

ccggtgttcc atggaaggtc tgggtcctgc gcatgtcttg cattggctta gccgccctca 5640

cgccttgggc catcgttccc gccgctttcg gttattggct cactttaaaa acaacaaaaa 5700

gagggggcgt gttttgggac acgccatccc caaaaccttg ctcaaaagga gacaccacta 5760

caggagtcta ccgaattatg gctagaggga ttcttggcac ttaccaggcc ggcgtcggag 5820

tcatgtacga gaatgttttc cacacactat ggcacacaac tagaggagca gccattatga 5880

gtggagaagg aaaattgacg ccatactggg gtagtgtgag agaagaccgc atagcttacg 5940

gaggcccatg gaggtttgac cgaaaatgga atggaacaga tgacgtgcaa gtgatcgtgg 6000

tagaaccggg gaaggctgca gtaaacatcc agacaaaacc aggagtgttt cggactccct 6060

tcggggaggt tggggctgtt agtctggatt acccgcgagg aacatccggc tcacccattc 6120

tggattccaa tggagacatt ataggcctat acggcaatgg agttgagctt ggcgatggct 6180

catacgtcag cgccatcgtg cagggtgacc gtcaggagga accagtccca gaagcttaca 6240

ccccaaacat gttgagaaag agacagatga ctgtgctaga tttgcaccct ggttcaggga 6300

aaaccaggaa aattctgcca caaataatta aggacgccat ccagcagcgc ctaagaacag 6360

ctgtgttggc accgacgcgg gtggtagcag cagaaatggc agaagctttg agagggctcc 6420

cagtacgata tcaaacttca gcagtgcaga gagagcacca agggaatgaa atagtggatg 6480

tgatgtgcca cgccactctg acccatagac tgatgtcacc gaacagagtg cccaactaca 6540

acctatttgt catggatgaa gctcatttca ccgacccagc cagtatagcc gcacgaggat 6600

acattgctac caaggtggaa ttaggggagg cagcagccat ctttatgaca gcgaccccgc 6660

ctggaaccac ggatcctttt cctgactcaa atgccccaat ccatgatttg caagatgaga 6720

taccagacag ggcatggagc agtggatacg aatggatcac agaatatgcg ggtaaaaccg 6780

tgtggtttgt ggcgagcgta aaaatgggga atgagattgc aatgtgcctc caaagagcgg 6840

ggaaaaaggt catccaactc aaccgcaagt cctatgacac agaataccca aaatgtaaga 6900

atggagactg ggattttgtc attaccaccg acatctctga aatgggggcc aacttcggtg 6960

cgagcagggt catcgactgt agaaagagcg tgaaacccac catcttagaa gagggagaag 7020

gcagagtcat cctcggaaac ccatctccca taaccagtgc aagcgcagct caacggaggg 7080

gcagagtagg cagaaacccc aaccaagttg gagatgaata ccactatggg ggggctacca 7140

gtgaagatga cagtaaccta gcccattgga cagaggcaaa gatcatgtta gacaacatac 7200

acatgcccaa tggactggtg gcccagctct atggaccaga gagggaaaag gctttcacaa 7260

tggatggcga ataccgtctc agaggtgaag aaaagaaaaa cttcttagag ctgcttagga 7320

cggctgacct cccggtgtgg ctggcctaca aggtggcgtc caatggcatt cagtacaccg 7380

acagaaagtg gtgttttgat gggccgcgta cgaatgccat actggaggac aacaccgagg 7440

tagagatagt cacccggatg ggtgagagga aaatcctcaa gccgagatgg cttgatgcaa 7500

gagtttatgc agatcaccaa gccctcaagt ggttcaaaga ctttgcagca gggaagagat 7560

cagccgttag cttcatagag gtgctcggtc gcatgcctga gcatttcatg ggaaagacgc 7620

gggaagcttt agacaccatg tacttggttg caacggctga gaaaggtggg aaagcacacc 7680

gaatggctct cgaagagctg ccagatgcac tggaaaccat cacacttatt gtcgccatta 7740

ctgtgatgac aggaggattc ttcctactaa tgatgcagcg aaagggtata gggaagatgg 7800

gtcttggagc tctagtgctc acgctagcta ccttcttcct gtgggcggca gaggttcctg 7860

gaaccaaaat agcagggacc ctgctgatcg ccctgctgct gatggtggtt ctcatcccag 7920

aaccggaaaa acagaggtca cagacagata accaactggc ggtgtttctc atctgtgtct 7980

tgaccgtggt tggagtggtg gcagcaaacg agtacgggat gctagaaaaa accaaagcag 8040

atctcaagag catgtttggc ggaaagacgc aggcatcagg actgactgga ttgccaagca 8100

tggcactgga cctgcgtcca gccacagcct gggcactgta tggggggagc acagtcgtgc 8160

taacccctct tctgaagcac ctgatcacgt cggaatacgt caccacatcg ctagcctcaa 8220

ttaactcaca agctggctca ttattcgtct tgccacgagg cgtgcctttt accgacctag 8280

acttgaccgt tggcctcgtc ttccttggct gttggggtca aatcaccctc acaacgtttc 8340

tgacagccat ggttctggcg acacttcact atgggtacat gctccctgga tggcaagcag 8400

aagcactcag ggctgcccag agaaggacag cggctggaat aatgaagaat gccgttgttg 8460

acggaatggt cgccactgat gtgcctgaac tggaaaggac tactcctctg atgcaaaaga 8520

aagtcggaca ggtgctcctc ataggggtaa gcgtggcagc gttcctcgtc aaccctaatg 8580

tcaccactgt gagagaagca ggggtgttgg tgacggcggc tacgcttact ttgtgggaca 8640

atggagccag tgccgtttgg aattccacca cagccacggg actctgccat gtcatgcgag 8700

gtagctacct ggctggaggc tccattgctt ggactctcat caagaacgct gataagccct 8760

ccttgaaaag gggaaggcct gggggcagga cgctagggga gcagtggaag gaaaaactaa 8820

atgccatgag cagagaagag ttttttaaat accggagaga ggccataatc gaggtggacc 8880

gcactgaagc acgcagggcc agacgtgaaa ataacatagt gggaggacat ccggtttcgc 8940

gaggctcagc aaaactccgt tggctcgtgg agaaaggatt tgtctcgcca ataggaaaag 9000

tcattgatct agggtgtggg cgtggaggat ggagctacta cgcagcaacc ctgaagaagg 9060

tccaggaagt cagaggatac acgaaaggtg gggcgggaca tgaagaaccg atgctcatgc 9120

agagctacgg ctggaacctg gtctccctga agagtggagt ggacgtgttt tacaaacctt 9180

cagagcccag tgacaccctg ttctgtgaca taggggaatc ctccccaagt ccagaagtag 9240

aagaacaacg cacactacgc gtcctagaga tgacatctga ctggttgcac cgaggaccta 9300

gagagttctg cattaaagtt ctctgccctt acatgcccaa ggttatagaa aaaatggaag 9360

ttctgcagcg ccgcttcgga ggtgggctag tgcgtctccc cctgtcccga aactccaatc 9420

acgagatgta ttgggttagt ggagccgctg gcaatgtggt gcacgctgtg aacatgacca 9480

gccaggtact actggggcga atggatcgca cagtgtggag agggccaaag tatgaggaag 9540

atgtcaacct agggagcgga acaagagccg tgggaaaggg agaagtccat agcaatcagg 9600

agaaaatcaa gaagagaatc cagaagctta aagaagaatt cgccacaacg tggcacaaag 9660

accctgagca tccataccgc acttggacat accacggaag ctatgaagtg aaggctactg 9720

gctcagccag ctctctcgtc aacggagtgg tgaagctcat gagcaaacct tgggacgcca 9780

ttgccaacgt caccaccatg gccatgactg acaccacccc ttttggacag caaagagttt 9840

tcaaggagaa agttgacacg aaggctcctg agccaccagc tggagccaag gaagtgctca 9900

acgagaccac caactggctg tgggcccact tgtcacggga aaaaagaccc cgcttgtgca 9960

ccaaggaaga attcataaag aaagtcaaca gcaacgcggc tcttggagca gtgttcgctg 10020

aacagaatca atggagcacg gcgcgtgagg ctgtggatga cccgcggttt tgggagatgg 10080

ttgatgaaga gagggaaaac catctgcgag gagagtgtca cacatgtatc tacaacatga 10140

tgggaaaaag agagaagaag cctggagagt ttggaaaagc taaaggaagc agggccattt 10200

ggttcatgtg gcttggagca cggtatctag agtttgaagc tttggggttc ctgaatgaag 10260

accattggct gagccgagag aattcaggag gtggagtgga aggctcaggc gtccaaaagc 10320

tgggatacat cctccgtgac atagcaggaa agcaaggagg gaaaatgtac gctgatgata 10380

ccgccgggtg ggacactaga attaccagaa ctgatttaga aaatgaagct aaggtactgg 10440

agctcctaga cggtgaacac cgcatgctcg cccgagccat aattgaactg acttacaggc 10500

acaaagtggt caaggtcatg agacctgcag cagaaggaaa gaccgtgatg gacgtgatat 10560

caagagaaga tcaaaggggg agtggacagg tggtcactta tgctcttaac actttcacga 10620

acatcgctgt ccagctcgtc aggctgatgg aggctgaggg ggtcattgga ccacaacact 10680

tggaacagct acctaggaaa aacaagatag ctgtcaggac ctggctcttt gagaatggag 10740

aggagagagt gaccaggatg gcgatcagcg gagacgactg tgtcgtcaag ccgctggacg 10800

acagattcgc cacagccctc cacttcctca acgcaatgtc aaaggtcaga aaagacatcc 10860

aggaatggaa gccttcgcat ggctggcacg attggcagca agttcccttc tgctctaacc 10920

attttcagga gattgtgatg aaagatggaa ggagtatagt tgtcccgtgc agaggacagg 10980

atgagctgat aggcagggct cgcatctctc caggagctgg atggaatgtg aaggacacag 11040

cttgcctggc caaagcatat gcacagatgt ggctactcct atacttccat cgcagggact 11100

tgcgtctcat ggcaaatgcg atttgctcag cagtgccagt ggattgggtg cccacaggca 11160

ggacatcctg gtcaatacac tcgaaaggag agtggatgac cacggaagac atgctgcagg 11220

tctggaacag agtctggatt gaagaaaatg aatggatgat ggacaagact ccaatcacaa 11280

gctggacaga cgttccgtat gtgggaaagc gtgaggacat ctggtgtggc agcctcatcg 11340

gaacgcgatc cagagcaacc tgggctgaga acatctatgc ggcgataaac caggttagag 11400

ctgtcattgg gaaagaaaat tatgttgact acatgacctc actcaggaga tacgaagacg 11460

tcttgatcca ggaagacagg gtcatctagt gtgatttaag gtagaaaagt cgactatgta 11520

aataatgtaa atgagaaaat gcatgcatat ggagtcaggc cagcaaaagc tgccaccgga 11580

tactgggtag acggtgctgc ctgcgtctca gtcccaggag gactgggtta acaaatctga 11640

caacagaaag tgagaaagcc ctcagaaccg tctcggaagt aggtccctgc tcactggaag 11700

ttgaaagacc aacgtcaggc cacaaatttg tgccactccg ctagggagtg cggcctgcgc 11760

agccccagga ggactgggtt accaaagccg ttgagccccc acggcccaag cctcgtctag 11820

gatgcaatag acgaggtgta aggactagag gttagaggag accccgtgga aacaacaaca 11880

tgcggcccaa gccccctcga agctgtagag gaggtggaag gactagaggt tagaggagac 11940

cccgcatttg catcaaacag catattgaca cctgggaata gactgggaga tcttctgctc 12000

tatctcaaca tcagctacta ggcacagagc gccgaagtat gtagctggta gtgaggaaga 12060

acacaggatc tgggtcggca tggcatctcc acctcctcgc ggtccgacct gggctacttc 12120

ggtaggctaa gggagaagaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 12180

agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 12240

aaactcatca atgtatctta tcatgtctct cgagtcaaga cgtttcccgt tgaatatggc 12300

tcataacacc ccttgtatta ctgtttatgt aagcagacag ttttattgtt catgatgata 12360

tatttttatc ttgtgcaatg taacatcaga gattttgaga cacaacgtgg ctttgttgaa 12420

taaatcgaac ttttgctgag ttgaaggatc agatcacgca tcttcccgac aacgcagacc 12480

gttccgtggc aaagcaaaag ttcaaaatca ccaactggtc cacctacaac aaagctctca 12540

tcaaccgtgg ctccctcact ttctggctgg atgatggggc gattcaggcc tggtatgagt 12600

cagcaacacc ttcttcacga ggcagacctc agcgctagcg gagtgtatac tggcttacta 12660

tgttggcact gatgagggtg tcagtgaagt gcttcatgtg gcaggagaaa aaaggctgca 12720

ccggtgcgtc agcagaatat gtgatacagg atatattccg cttcctcgct cactgactcg 12780

ctacgctcgg tcgttcgact gcggcgagcg gaaatggctt acgaacgggg cggagatttc 12840

ctggaagatg ccaggaagat acttaacagg gaagtgagag ggccgcggca aagccgtttt 12900

tccataggct ccgcccccct gacaagcatc acgaaatctg acgctcaaat cagtggtggc 12960

gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggcggctcc ctcgtgcgct 13020

ctcctgttcc tgcctttcgg tttaccggtg tcattccgct gttatggccg cgtttgtctc 13080

attccacgcc tgacactcag ttccgggtag gcagttcgct ccaagctgga ctgtatgcac 13140

gaaccccccg ttcagtccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 13200

ccggaaagac atgcaaaagc accactggca gcagccactg gtaattgatt tagaggagtt 13260

agtcttgaag tcatgcgccg gttaaggcta aactgaaagg acaagttttg gtgactgcgc 13320

tcctccaagc cagttacctc ggttcaaaga gttggtagct cagagaacct tcgaaaaacc 13380

gccctgcaag gcggtttttt cgttttcaga gcaagagatt acgcgcagac caaaacgatc 13440

tcaagaagat catcttatta aggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 13500

gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 13560

aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 13620

aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 13680

ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 13740

gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 13800

aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 13860

ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 13920

tgctgcaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 13980

ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 14040

cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 14100

agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 14160

gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 14220

gtcaacacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 14280

acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 14340

acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 14400

agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 14460

aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 14520

gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 14580

tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa 14640

aaataggcgt atgcacgagg ccctttcgtc ttcaagaatt ttataaggta cctaatacga 14700

ctcactatag 14710

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> T7启动子

<400> 2

taatacgact cactatag 18

<210> 3

<211> 197

<212> DNA

<213> HDVR

<400> 3

gggtcggcat ggcatctcca cctcctcgcg gtccgacctg ggctacttcg gtaggctaag 60

ggagaagaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 120

tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 180

tgtatcttat catgtct 197

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> FMDV

<400> 4

cagctgttga attttgacct tctcaagctg gcgggacgtc gagtccaacc ctgggcca 58

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cgcttataag gtacctaata cgactcac 28

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cttggaagcc attactaccc tcttcactcc cac 33

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ggttttttag tcattggccc agggttggac tcgac 35

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ccctgggcca atgactaaaa aaccaggagg 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ccctgggcca atgactaaaa aaccaggagg 30

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

agcatgcaca ttggtcgcta ag 22

Claims

1.一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆pACYC-Rluc-JEV-FL，其序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述感染性克隆的构建方法，其步骤如下：

1)JEV-SA14病毒株基因组序列分段合成：

构建带有JEV全长基因组的cDNA感染性克隆：选择JEV-SA14病毒株序列，GenBank No.U14163.1；分成四个片段进行基因合成，这四个片段分别命名为片段A,片段B,片段C,和片段D，其中片段A为T7+基因组1～3450nt序列,片段B为基因组3446-5581nt序列，片段C为基因组5576-9136nt序列，片段D为基因组9121-10976nt+HDVR序列；T7启动子序列如SEQ ID NO.2所示，HDVR序列为SEQ ID NO.3所示，四个片段分别用PsiⅠ和BamHⅠ插入低拷贝质粒pACYC177载体，转化至大肠杆菌感受态HB101；质粒均经过DNA测序鉴定为正确序列，分别命名为pACYC-A,pACYC-B,pACYC-C和pACYC-D；

2)含有病毒基因组的JEV cDNA感染性克隆的构建：

(1)JEV基因组片段A+B的拼接：用BspEⅠ和BamHⅠ酶切上述步骤1)中所得的pACYC-A和pACYC-B，回收pACYC-A的大片段与pACYC-B的大片段；将pACYC-A的大片段作为载体，pACYC-B的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HB101，挑取菌落并进行PCR鉴定；将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，将测序正确的质粒命名为pACYC-A+B；

(2)JEV基因组片段C+D的拼接：用Xba Ⅰ和Xho Ⅰ酶切上述步骤1)中所得的pACYC-C和pACYC-D，回收pACYC-C的大片段与pACYC-D的大片段；将pACYC-C的大片段作为载体，pACYC-D的大片段作为片段，使用T4 DNA连接酶将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HB101，挑取菌落并进行PCR鉴定；将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒命名为pACYC-C+D；

(3)JEV基因组全长pACYC-A+B+C+D的拼接：用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切上述步骤中所得的pACYC-A+B和上述步骤所得pACYC-C+D，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pACYC-A+B的大片段与pACYC-C+D的大片段；将pACYC-A+B的大片段作为载体，pACYC-C+D的大片段作为片段，使用T4 DNA连接酶将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HB101，挑取菌落并进行PCR鉴定，将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒即为拼接完成的含有JEV全长基因组的cDNA质粒，命名为pACYC-JEV-FL；

3)带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆的构建：

(1)待融合的三个目的基因的特异性扩增：

①片段T7-5’UTR-Capsid-34的扩增：以pACYC-JEV-FL为模板，使用PrimeSTARHS酶扩增含有T7-5’UTR-Capsid-34的序列，引物为SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6所示，回收DNA片段；

(2)两步融合PCR法扩增T7-5’UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Capsid-prM-E片段：

(3)将荧光素酶基因Rluc插入JEV全长感染性克隆：将T7-5’UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Capsid-prM-E和JEV全长感染性克隆pACYC-JEV-FL分别用Kpn Ⅰ和BsrG Ⅰ双酶切，使回收酶切产物，经过T4 DNA连接酶将回收的酶切产物按照片段:载体摩尔比为6:1进行连接，并将连接产物转化HB101感受态，将PCR鉴定阳性的克隆进行培养并抽提质粒，测序正确，获得的质粒即为带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆。

3.权利要求1所述的感染性克隆在制备活体动物成像药物中的应用。

4.权利要求1所述的感染性克隆在制备抗病毒药物筛选药物中的应用。

5.权利要求1所述的感染性克隆在制备乙型脑炎疫苗评价药物中的应用。