CN110993030B - 一种单个活细胞内rna出核流量的监测方法和系统 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体为一种单个活细胞内RNA出核流量的监测方法及系统。本发明方法包括基因标记、RNA出核流量模型的构建和计算；所述的基因标记，包括在目标基因上进行基因编辑，用于标定目标检测基因，还包括构建合成示踪基因片段，用于表达示踪蛋白特异性结合目标基因及荧光显微监测；构建荧光显微监测过程中示踪蛋白在单个真核生物活细胞核内外的动态平衡模型；根据该动态平衡模型，即可计算监测期内单个或细胞中RNA出核流量。本发明系统包括用户自定义监测变量输入的功能模块，荧光显微图像读取功能模块，荧光图像中真核生物受体细胞的分选、统计功能模块，图像数据处理功能模块。

Description

一种单个活细胞内RNA出核流量的监测方法和系统

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种单个活细胞内RNA出核流量的监测方法及系统。

背景技术

RNA是生物体内一种重要的遗传物质，它与基因的转录、翻译过程息息相关，它多由DNA转录而来，又作为模板指导合成氨基酸，从而指导细胞、组织乃至生物体的生长情况、分化方向和表达形状。在现代分子生物学领域研究中，检测不同条件下细胞内的RNA水平极为重要，该水平的变化反映了细胞周期、培养环境、分化方向等条件变化下，细胞遗传物质水平的对应调控机理。

目前，RNA的检测方法多为体外扩增测量和原位荧光杂交技术。体外扩增测量以从大量细胞群体中提取得到的目标RNA为样本，进行扩增后检测得到细胞群体的RNA水平。测量样本来自于大量细胞群体，不能排除必然的个体差异；测量过程包含提取和扩增，不能排除各项体外实验带来的误差，并且势必破坏原测量细胞对象；测量结果反映的也是细胞群体的RNA水平，无法精确到单个细胞。

原位荧光杂交技术是在单个固定细胞内，使用荧光素标记的特异核酸探针计数得到该细胞内的RNA水平。该方法避免了体外提取和扩增，能把RNA的测量水平精确到单细胞层面；但随之而来的是大量繁琐的计数工作，并且该方法要求的固定操作也势必会破坏原测量细胞对象。

另外，对于生物体内存在的micro RNA、lncRNA等多种RNA水平的测量研究，体外扩增测量技术和原位荧光杂交技术存在体外分离提取困难、杂交成功率低等困难。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供一种监测单个活细胞内RNA出核流量的方法及系统，可以在不破坏原测量细胞对象的情况下，监测单细胞水平上目标RNA的出核流量，从而提高RNA检测方法的精细度和时效性，减小检测对原细胞造成的破坏性。

本发明提供的单个真核生物活细胞内RNA出核流量的监测方法，具体包括基因标记、RNA出核流量模型的构建和计算；其中：

所述的基因标记，包括在目标基因上进行基因编辑，用于标定目标检测基因，还包括构建合成示踪基因片段，用于表达示踪蛋白特异性结合目标基因及荧光显微监测；

所述构建RNA出核流量模型，即构建荧光显微监测过程中示踪蛋白在单个真核生物活细胞核内外的动态平衡模型；

所述计算RNA出核流量，根据建立的RNA出核流量模型，计算监测期内单个或细胞中RNA出核流量。

本发明中，所述在目标基因上进行基因编辑，就是采用包括但不限于锌指核酸酶技术、转录激活子样效应物核酸酶技术、规律间隔成簇短回文重复序列核酸酶技术，特异性地识别目标基因上选定的标记靶位点，对其单链或双链进行精准切割后，由细胞内源性的修复机制完成基因标记系统适配子的替换或添加；该适配子具有识别并招募属特定外壳蛋白到基因组位点的特性。所述构建合成示踪基因片段，该片段编码目标真核生物受体细胞核定位序列、能与适配子特异性结合壳蛋白以及各类荧光标记物；具体采用转染、感染或注射等方式，在真核生物受体细胞内表达前述编辑的目标基因以及示踪基因。成功表达示踪基因的真核生物细胞，能在荧光显微镜下被观测并采集，得到荧光显微强度图像。所述目标真核生物受体细胞包括但不限于哺乳动物细胞和各类真菌。基因标记系统包括但不限于MS2基因标记系统、pp7基因标记系统。

本发明中，所述RNA出核流量模型和计算方法，包括模型概念和原理表达式。其中模型概念具体为真核生物受体细胞内，示踪基因表达的示踪蛋白在荧光显微镜下被观察拍摄期间的动态分布平衡模型，示踪蛋白在细胞各处的分布浓度由前述荧光显微强度图像记录，该动态平衡模型的原理表达式如下：

其中，算式左侧为所述方法的监测量，即单个活细胞内目标基因RNA出核流量。算式右侧， n _C 为细胞核内示踪蛋白浓度，由细胞质内示踪蛋白荧光强度标定； k _B 为玻尔兹曼常量，由国际计量大会确立； T为真核生物受体细胞的监测温度条件，在监测过程中测量得到； N为整合在目标基因上的标记系统适配子循环数，由使用者在编辑目标基因时自主选择并记录，可采用基因测序方法二次确认；为监测条件下真核生物受体细胞核附近的胞浆黏度，可由真核生物受体活细胞的单分子实验证实；为示踪蛋白分子的颗粒半径，由使用者在编辑示踪蛋白基因时自主选择并记录； S为真核生物受体细胞核孔复合物细胞质侧的中央孔径面积，采用电子显微镜测量得到； I%为示踪蛋白在真核生物受体细胞质内经过主动运输成功进入细胞核的概率，可由光漂白后荧光恢复实验在真核生物受体活细胞中测量得到； k _D 为基因标记系统中适配子与壳蛋白在监测条件下的结合常数，由使用者在选择基因标记系统时自主选择并测量记录； n _N 为细胞质内示踪蛋白浓度，由细胞质内示踪蛋白荧光强度标定。

本发明提供的单个活细胞内RNA出核流量的监测数据处理系统，是一种基于荧光图像的RNA出核流量计算机处理分析系统。包括：

用户自定义监测变量输入的功能模块，用于明确监测的对象类型和环境条件，包括前述标记蛋白强度与富集浓度转换比值、整合在目标基因上的标记系统适配子循环数、监控温度条件；

荧光显微图像读取功能模块；

荧光图像中真核生物受体细胞的分选、统计功能模块，按标记蛋白在真核生物受体细胞核内外的发光强度不同，基于大津算法分选并记录核、质内的荧光强度信息；

图像数据处理功能模块，将采集得到的真核生物受体细胞核内外标记蛋白荧光强度信息经由用户输入的前述标记蛋白强度与富集浓度转换比值，换算得到核内外标记蛋白的富集浓度，结合用户输入监控温度条件，用户自定义整合在目标基因上的标记系统适配子循环数和前述RNA出核流量模型和计算方法，得到监测数据。

本发明可克服了现有RNA水平检测技术的缺点和不足，提供一种监测单个活细胞内RNA出核流量的方法及系统，可以在不破坏原测量细胞对象的情况下，监测单细胞水平上目标RNA的出核流量。从而提高RNA检测方法的精细度和时效性，减小检测对原细胞造成的破坏性，为细胞生物学的基因水平测量、分析生物个体的生长分化方向提供了有力快捷的技术手段。

附图说明

图1为本发明的方法流程示意图。

图2为采用Python语言编写的基于荧光图像的RNA出核流量计算机处理分析系统示例，包含用户自定义监测变量输入界面，荧光图像的自动分选示例，图像数据处理结果展示。

图3为监测在HeLa细胞中瞬时转染标记MS2基因标记系统的外源青色荧光蛋白（cyan fluorescence protein，CFP）基因的mRNA出核流量统计柱状图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

本发明提供的一种监测单个活细胞内RNA出核流量方法的监控实现流程如图1所示。

本实例中，监测了人类海拉宫颈癌细胞系中，外源基因青色荧光蛋白（cyanfluorescence protein, CFP）转录的相应信使RNA（messenger RNA, mRNA）的出核流量。采用MS2基因标记系统对目标外源基因进行标记，适配子循环数为9；构建合成编码哺乳动物细胞核定位序列、MS2基因标记系统壳蛋白（MS2 coat protein，MCP）和红色mCherry荧光蛋白融合示踪蛋白的基因片段。采用脂质体转染的方法将上述目标外源基因和编码示踪蛋白的基因片段转入人类海拉宫颈癌细胞中。采用激光扫描共聚焦显微镜对细胞进行荧光成像。

基于前述RNA出核流量模型和计算方法，运用Python语言编写基于荧光图像的RNA出核流量计算机处理分析系统，其运行界面如图2所示。在该计算机处理分析系统中，按本实例输入监控条件及监控对象参数，读取实例采集得到的人类海拉宫颈癌细胞荧光图像，系统即分选统计荧光图像中的荧光强度信息，显示相应统计区域范围，并计算得到监测期内单个活海拉宫颈癌细胞内mRNA的出核流量值。对瞬时转染后同一时间内的大量单个海拉宫颈癌细胞内mRNA的出核流量进行计算统计，结果如图3所示。

本发明在实际使用时，可将监测对象扩大至任意种类真核细胞内的出核RNA，采用其他种类含能招募特定壳蛋白适配子的基因标记系统，采用其他荧光标记物示踪，采用其他目标细胞的荧光标记表达方法，采用其他荧光显微成像手段。对于不同种类的真核细胞来说，编码示踪蛋白的基因片段需做相应改变，以确保示踪蛋白能被该细胞核孔复合物主动运输在细胞核内富集。对目标基因上的基因编辑方法，采用其他基因标记系统，如pp7基因标记系统等。在构建合成示踪蛋白基因片段时选择其他荧光标记，如绿色荧光蛋白等。采用不同的基因编辑技术将标记系统嵌入目标基因。采用不同方式将标记系统转录整合入目标真核生物受体细胞。获得荧光图像的手段包括但不限于激光共聚焦显微术、宽场荧光显微术、超分辨显微术等，如对于细胞周期内RNA出核流量的变化监测，可采用带稳定焦距系统的活细胞工作站。对于不同基因标记方法和目标监测对象，在RNA出核流量模型和计算方法、基于荧光图像的RNA出核流量计算软件中，需要更改相应模型参数和统计方法，如对不同培养条件下RNA出核流量监测中，培养温度、细胞质黏度等皆需做相应更改。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种单个真核生物活细胞内RNA出核流量的监测方法，其特征在于，具体包括基因标记、RNA出核流量模型的构建和计算；其中：

所述的基因标记，包括在目标基因上进行基因编辑，用于标定目标检测基因，还包括构建合成示踪基因片段，用于表达示踪蛋白特异性结合目标基因及荧光显微监测；

所述构建RNA出核流量模型，即构建荧光显微监测过程中示踪蛋白在单个真核生物活细胞核内外的动态平衡模型；

所述计算RNA出核流量，根据建立的RNA出核流量模型，计算监测期内单个或细胞中RNA出核流量。

2.根据权利要求1所述的单个真核生物活细胞内RNA出核流量的监测方法，其特征在于：

所述在目标基因上进行基因编辑，就是采用锌指核酸酶技术、转录激活子样效应物核酸酶技术或CRISPR-Cas核酸酶技术，特异性地识别目标基因上选定的标记靶位点，对其单链或双链进行精准切割后，由细胞内源性的修复机制完成基因标记系统适配子的替换或添加；该适配子具有识别并招募属特定外壳蛋白到基因组位点的特性；

所述构建合成示踪基因片段，该片段编码目标真核生物受体细胞核定位序列、能与适配子特异性结合壳蛋白以及各类荧光标记物，并采用转染、感染或注射方式在真核生物受体细胞内表达前述编辑的目标基因以及示踪基因，成功表达示踪基因的真核生物细胞，能在荧光显微镜下被观测并采集，得到荧光显微强度图像；

所述目标真核生物受体细胞包括哺乳动物细胞和各类真菌；

基因标记系统包括但MS2基因标记系统、pp7基因标记系统。

3.根据权利要求2所述的单个真核生物活细胞内RNA出核流量的监测方法，其特征在于，所述RNA出核流量模型和计算方法，包括模型概念和计算公式；其中模型概念具体为：真核生物受体细胞内，示踪基因表达的示踪蛋白在荧光显微镜下被观察拍摄期间的动态分布平衡模型；示踪蛋白在细胞各处的分布浓度由前述荧光显微强度图像记录，其动态平衡模型的计算公式如下：

其中，算式左侧为所述方法的监测量，即单个活细胞内目标基因RNA出核流量；算式右侧，n_c为细胞核内示踪蛋白浓度，由细胞质内示踪蛋白荧光强度标定；k_B为玻尔兹曼常量，由国际计量大会确立；T为真核生物受体细胞的监测温度条件，在监测过程中测量得到；N为整合在目标基因上的标记系统适配子循环数，由使用者在编辑目标基因时自主选择并记录，采用基因测序方法二次确认；η为监测条件下真核生物受体细胞核附近的胞浆黏度，由真核生物受体活细胞的单分子实验确认；a为示踪蛋白分子的颗粒半径，由使用者在编辑示踪蛋白基因时自主选择并记录；S为真核生物受体细胞核孔复合物细胞质侧的中央孔径面积，采用电子显微镜测量得到；I％为示踪蛋白在真核生物受体细胞质内经过主动运输成功进入细胞核的概率，由光漂白后荧光恢复实验在真核生物受体活细胞中测量得到；k_D为基因标记系统中适配子与壳蛋白在监测条件下的结合常数，由使用者在选择基因标记系统时自主选择并测量记录；n_N为细胞质内示踪蛋白浓度，由细胞质内示踪蛋白荧光强度标定。

4.一种基于权利要求1-3之一所述监测方法的单个活细胞内RNA出核流量的监测数据处理系统，是一种基于荧光图像的RNA出核流量计算机处理分析系统，包括：

用户自定义监测变量输入的功能模块，用于明确监测的对象类型和环境条件，包括标记蛋白强度与富集浓度转换比值、整合在目标基因上的标记系统适配子循环数、监控温度条件；

荧光显微图像读取功能模块；

荧光图像中真核生物受体细胞的分选、统计功能模块，按标记蛋白在真核生物受体细胞核内外的发光强度不同，基于大津算法分选并记录核、质内的荧光强度信息；

图像数据处理功能模块，将采集得到的真核生物受体细胞核内外标记蛋白荧光强度信息经由用户输入的前述标记蛋白强度与富集浓度转换比值，换算得到核内外标记蛋白的富集浓度，结合用户输入监控温度条件，用户自定义整合在目标基因上的标记系统适配子循环数和前述RNA出核流量模型和计算方法，得到监测数据。

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