CN105671006A - 高效表达海肾荧光素酶基因的重组HCoV-OC43病毒及其应用 - Google Patents

高效表达海肾荧光素酶基因的重组HCoV-OC43病毒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高效表达海肾荧光素酶基因的人冠状病毒OC43重组病毒及其在抗病毒药物筛选中的应用。本发明首先通过重叠PCR方法将海肾荧光素酶基因以替换或者插入到附属基因(ns2和ns12.9)中的方式克隆到人冠状病毒OC43全长感染性克隆pBAC-OC43FL中，分别拯救出四株表达海肾荧光素酶基因的重组病毒：rOC43-ns2DelRluc、rOC43-ns2FusionRluc、rOC43-ns12.9StopRluc和rOC43-ns12.9FusionRluc。其中rOC43-ns2DelRluc病毒能够高效表达海肾荧光素酶基因，病毒生长曲线与亲本病毒HCoV-OC43-WT相似，插入的报告基因在连续传代过程中较为稳定，并且能够成功应用于抗病毒药物筛选实验，在高通量筛选抗冠状病毒药物和宿主抗病毒基因等方面有广泛的应用前景。

Description

高效表达海肾荧光素酶基因的重组HCoV-OC43病毒及其应用
技术领域本发明涉及人冠状病毒OC43重组病毒，尤其涉及一株高效表达海肾荧光素酶基因的人冠状病毒OC43重组病毒，本发明还涉及该OC43重组病毒在抗冠状病毒药物筛选实验中的应用，属于表达海肾荧光素酶基因的人冠状病毒OC43重组病毒的拯救和应用领域。
背景技术人冠状病毒OC43(HumancoronavirusOC43，HCoV-OC43)是目前已知的6种人冠状病毒中的一种，该病毒最早发现于1967年美国马里兰州贝塞斯达市，从一名上呼吸道感染患者中分离获得。据报道约有5％～20％的人呼吸道感染是由HCoV-OC43引起的，人感染HCoV-OC43后一般会出现上呼吸道感染的临床特征，如鼻炎、咽炎和喉痛等，但是越来越多的实验证明，HCoV-OC43会使免疫功能低下的人群，如婴幼儿和老年人表现出支气管炎、肺炎等严重的下呼吸道症状。最近，随着研究的深入，病毒学者们还发现HCoV-OC43具有嗜神经性，在患有急性弛缓性麻痹病例患者的鼻咽拭子中检测到了HCoV-OC43和HCoV-229E病毒的共感染。HCoV-OC43属于β群，同属于该群人冠状病毒的还有HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV，其中2003年爆发的SARS-CoV和2012年9月在沙特地区爆发的MERS-CoV都能够引起严重的呼吸道疾病。针对这6种人冠状病毒，特别是2种新型冠状病毒，目前尚无特效药和疫苗，因此构建一株能够用于高通量筛选抗人冠状病毒药物的重组病毒迫在眉睫。
HCoV-OC43与其它冠状病毒相似，是一种有包膜的单股正链RNA病毒，基因组大小约31kb。冠状病毒基因组RNA具有和真核生物mRNA一样的5′端甲基化帽子结构和3′端的多聚赖氨酸尾巴。基因组RNA的5′端是一段由65至98个碱基组成的“前导序列”，紧接着“前导序列”的是一段由200-400个碱基组成的“非翻译区”(untranslatedregion，UTR)，在基因组的3′端也有一段由300至500碱基组成的“非翻译区”，这两个“非翻译区”的功能目前还不是很清楚，可能与冠状病毒基因组包装信号有关。冠状病毒基因组5′端到2/3处的两个开放阅读框ORF1a和ORF1b负责编码16个非结构蛋白，这些非结构蛋白在病毒复制和转录过程中发挥了重要作用。其中nsp5是主要的蛋白酶，在众多冠状病毒中nsp5蛋白的单体结构均显示出较高程度的结构保守性，这也使得设计或筛选光谱抗冠状病毒药物成为可能，该蛋白也是第一个用于设计针对冠状病毒广谱抑制剂的蛋白。此外，HCoV-OC43基因组与同属于β群的SARS-CoV和MERS-CoV具有极高的基因组相似性，特别是在ORF1b的复制酶(nsp12)和解旋酶(nsp13)区域，这两个蛋白同样也成为了研究抗冠状病毒药物的靶点。因此，以HCoV-OC43作为冠状病毒模型可以不依赖于BSL3实验室，并用来研究冠状病毒复制，病毒编码蛋白的功能和筛选新型抗冠状病毒药物等。
反向遗传操作技术的建立为研究冠状病毒基因功能和抗病毒药物筛选开辟了新的途径。利用反向遗传操作技术将外源报告基因插入病毒基因组中可以用来研究病毒的复制、病毒编码蛋白的功能及抗病毒药物的筛选等。例如，携带绿色荧光蛋白的SARS-CoV可用于影响病毒复制的宿主的筛选(deWildeAH.etal.AKinome-WideSmallInterferingRNAScreenIdentifiesProviralandAntiviralHostFactorsinSevereAcuteRespiratorySyndromeCoronavirusReplication，IncludingDouble-StrandedRNA-ActivatedProteinKinaseandEarlySecretoryPathwayProteins.JVirol.2015，89，8318-8333.)。但是，利用绿色荧光蛋白标记的SARS-CoV筛选抗冠状病毒因子需要在生物安全防护三级实验室(BSL3)中进行，而且绿色荧光蛋白的检测需要通过借助荧光显微镜进行判断，而且误差相对较大，因此在高通量筛选方面受到了限制。
发明内容
利用反向遗传学技术拯救出4株表达海肾荧光素酶(Renillaluciferase，Rluc)基因的HCoVs-OC43重组病毒，其中一株重组病毒rOC43-ns2DelRluc能够稳定和高效表达Rluc基因，并且该重组病毒能够快速检测冠状病毒的复制并且适用于高通量筛选抗冠状病毒药物，解决了现有荧光定量技术测定病毒拷贝数操作繁琐以至在高通量筛选方面受到限制等问题。
附图说明
图1为pBAC-OC43FL(A)、pBAC-OC43-ns2DelRluc(B)、pBAC-OC43-ns2FusionRluc(C)、pBAC-OC43-ns12.9StopRluc(D)和pBAC-OC43-ns12.9FusionRluc(E)的构建示意图；
图2为4株重组病毒rOC43-ns2DelRluc、rOC43-ns2FusionRluc、rOC43-ns12.9StopRluc和rOC43-ns12.9FusionRluc与亲本病毒HCoV-OC43-WT免疫荧光鉴定结果，可见4株重组病毒均拯救成功；
图3为4株重组病毒与亲本病毒HCoV-OC43-WT的生长曲线，可见rOC43-ns2DelRluc与亲本病毒生长动力学较为相似，在不同时间点病毒滴度约降低了3倍；
图4为4株重组病毒Rluc基因表达的动力学，可见rOC43-ns2DelRluc表达海肾荧光素酶活性最强，峰值为108(144h)；
图5为Westernblot检测重组病毒rOC43-ns2DelRluc和rOC43-ns2FusionRluc(A)rOC43-ns12.9StopRluc和rOC43-ns12.9FusionRluc(B)的N蛋白和Rluc蛋白的表达；
图6为IFA测定4株重组病毒在连续传代过程中的病毒滴度，可见4株重组病毒滴度在传代过程中略有升高并最终趋于稳定；
图7为测定4株重组病毒在连续传代过程中表达的Rluc活性，可见在传代过程中，rOC43-ns2DelRluc和rOC43-ns12.9StopRluc的Rluc基因表达活性基本没变，而rOC43-ns2FusionRluc和rOC43-ns12.9FusionRluc的Rluc基因表达活性在传代过程中均有所下降。
图8为4株重组病毒在传代过程中插入Rluc基因稳定性测序实验，可见重组病毒rOC43-ns12.9StopRluc稳定性最强，其次是rOC43-ns2DelRluc，而rOC43-ns2FusionRluc和rOC43-ns12.9FusionRluc插入外源基因稳定性最差，分别在P4代和P6代即可检测到碱基突变；
图9为已报道HCoVs-OC43抗病毒药物氯喹(Chloroquine)对重组病毒rOC43-ns2DelRluc和其亲本病毒HCoV-OC43-WT复制的影响，可见随着氯喹浓度的增加，能显著抑制两种病毒的复制；
图10为Westernblot检测不同浓度氯喹对亲本病毒HCoV-OC43-WT蛋白表达量的影响，可见随着氯喹浓度的增加，亲本病毒N蛋白合成量显著下降；
图11为氯喹对重组病毒rOC43-ns2DelRluc报告基因表达量的影响，可见随着氯喹浓度的增加，rOC43-ns2DelRluc报告基因的表达量显著下降。
图12为抗病毒药物病毒唑(Ribavirin)对重组病毒rOC43-ns2DelRluc和其亲本病毒HCoV-OC43-WT复制的影响；可见随着病毒唑浓度的增加，虽然能抑制两种病毒的复制，但是需要较高的药物浓度；
图13为Westernblot检测不同浓度病毒唑对亲本病毒HCoV-OC43-WT蛋白表达量的影响，可见随着病毒唑浓度的增加(＞10μM)，亲本病毒N蛋白合成量随之下降；
图14为病毒唑对重组病毒rOC43-ns2DelRluc报告基因表达量的影响，可见随着病毒唑浓度的增加，rOC43-ns2DelRluc报告基因的表达量随之下降。
具体实施方式：
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件，或按试剂生产厂家所建议的条件进行。
实施例1：携带Rluc基因的HCoVs-OC43重组病毒的拯救
1.1携带Rluc基因的全长感染性克隆的构建
根据亲本病毒HCoVs-OC43全长序列分析，选择了4个外源基因插入位点，分别是取代ns2和ns12.9基因以及将Rluc基因插入ns2和ns12.9基因中融合表达。然后根据插入位点，在其两端分别选择了两个特异性的酶切位点用于Rluc外源基因的引入。其中将Rluc基因取代ns2基因和插入ns2基因融合表达利用NarI和PmeI酶切位点，取代ns12.9和插入ns12.9基因融合表达利用SacII和SanDI酶切位点。根据选定的外源基因插入位点和酶切位点，分别设计引物通过融合PCR的方法获得携带Rluc基因的重组片段，最后通过酶切连接的方法与pBAC-OC43FL质粒连接获得目的质粒，分别命名为pBAC-OC43-ns2DelRluc、pBAC-OC43-ns2FusionRluc、pBAC-OC43-ns12.9StopRluc和pBAC-OC43-ns12.9FusionRluc。具体构建策略见图1。
1.2重组病毒的拯救
用大提试剂盒提取pBAC-OC43FL、pBAC-OC43-ns2DelRluc、pBAC-OC43-ns2FusionRluc、pBAC-OC43-ns12.9StopRluc和pBAC-OC43-ns12.9FusionRluc质粒，按照X-tremeGENEHPDNA转染试剂说明书将大提的质粒转染至生长为70％的BHK-21细胞培养板中(6孔板)，转染剂量为4μg，6h后换为含有4％胎牛血清的DMEM维持液，并将转染的六孔板置于37℃、5％CO2孵箱中培养72h，使质粒能够在细胞内更有效的转录病毒基因组RNA。72h后换为2％的DMEM维持液，并将细胞转移到33℃、5％CO2孵箱中培养72h。为了获得更多的病毒，在33℃、5％CO2培养3天后的细胞，以1∶3的比例传代到细胞培养瓶中，37℃、5％CO2培养48h。待细胞融合达到80％左右时，换为2％的DMEM维持液，转入33℃、5％CO2孵箱中进行培养，3天后收取细胞和上清，经37℃/-80℃反复冻融3次，混合后于3000r/min离心5min，0.45μm的滤膜过滤，将收获的病毒并分别命名为HCoV-OC43-WT、rOC43-ns2DelRluc、rOC43-ns2FusionRluc、rOC43-ns12.9StopRluc和rOC43-ns12.9FusionRluc。
实施例2：HCoVs-OC43重组病毒的筛选
2.1间接免疫荧光试验(IFA)鉴定重组病毒
将实施例1拯救的4株重组病毒rOC43-ns2DelRluc、rOC43-ns2FusionRluc、rOC43-ns12.9StopRluc、rOC43-ns12.9FusionRluc及其亲本病毒HCoV-OC43-WT接种于生长至70％的BHK-21细胞中，2h后用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗1遍并换为新鲜的含4％胎牛血清的DMEM，在5％CO2、37℃环境中继续培养，72h后用抗N蛋白血清进行IFA试验。
具体操作如下：弃掉培养液，用PBS清洗细胞2遍，然后用冷无水乙醇固定细胞，30min后加入抗N蛋白的血清，在室温下作用2h后用PBS洗涤细胞3次，并加入1∶200稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，于室温中避光作用1h，用PBS洗涤细胞3次，5min/次，在倒置荧光显微镜下观察并拍照。
如图2所示间接免疫荧光试验证实，4株重组病毒均拯救成功，其中rOC43-ns12.9StopRluc荧光灶数目和其它4株重组病毒相比明显减少，病毒滴度较低。
2.2HCoVs-OC43重组病毒生长曲线的测定
将实施例1拯救的4株重组病毒和亲本病毒HCoV-OC43-WT分别按每孔MOI＝0.01的感染量接种于生长至单层的BHK-21细胞中，并在感染后24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h收获病毒。将不同时间点收获的病毒分别用IFA测定病毒滴度，并绘制出病毒的生长曲线。
比较4株重组病毒与亲本病毒HCoV-OC43-WT的生长动力学，结果显示，rOC43-ns2FusionRluc和rOC43-ns12.9FusionRluc滴度的峰值为106.23TCID50/mL，与亲本病毒HCoV-OC43-WT滴度的峰值相同，而rOC43-ns2DelRluc病毒滴度的峰值比HCoV-OC43-WT低3倍，rOC43-ns12.9StopRluc病毒滴度最低，仅为104.83TCID50/mL(图3)。
2.3HCoVs-OC43重组病毒报告基因表达动力学测定
为了确定实施例1拯救的4株重组病毒表达Rluc基因的能力，将重组病毒按MOI＝0.01剂量感染24孔板中BHK-21细胞，并在感染后24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h测定Rluc活性，以3次重复试验结果的算术平均值作为该孔病毒的海肾荧光素酶活性。并绘制出病毒表达Rluc基因活性值曲线。
比较4株重组病毒表达Rluc报告基因的能力，结果显示，rOC43-ns2DelRluc表达Rluc报告基因的能力最强，Rluc活性值在144h能达到108.2，是rOC43-ns12.9StopRluc的13倍(图4)。其余两株重组病毒rOC43-ns2FusionRluc和rOC43-ns12.9FusionRluc虽然病毒生长动力学与HCoV-OC43-WT最为相近，但是表达Rluc报告基因的能力最差，分别为106.5和105.7(图4)，表明在4株重组病毒中，rOC43-ns2DelRluc更适合作为后续筛选所需的报告病毒。
2.4HCoVs-OC43重组病毒蛋白质免疫印迹分析
为了进一步验证重组病毒表达Rluc基因的能力，将感染实施例1拯救的4株重组病毒及其亲本病毒HCoV-OC43-WT的BHK-21细胞在72h和96h后裂解并用Westernblot检测Rluc蛋白和N蛋白的表达情况，以亲本病毒HCoV-OC43-WT作为对照。
Westernblot检测结果与Rluc基因表达动力学结果一致，在rOC43-ns2DelRluc和rOC43-ns12.9StopRluc感染BHK-21细胞后，可以检测到大量Rluc基因的表达(图5)；而在rOC43-ns2FusionRluc感染BHK-21细胞中，仅可以检测到较少量ns2-Rluc融合蛋白的表达；在rOC43-ns12.9FusionRluc感染BHK-21细胞中，由于ns12.9-Rluc蛋白表达量太低，未能检测到。
2.5重组病毒遗传稳定性分析
将实施例1拯救的4株HCoVs-OC43重组病毒在BHK-21细胞上进行13次传代，以检查插入的Rluc基因在四株重组病毒基因组中的遗传稳定性。将上述4株HCoVs-OC43重组病毒(定义为P0)以MOI＝0.01剂量感染BHK-21细胞。在感染后120h，收获病毒，并定义为P1，之后将300μlP1代病毒液加入到新鲜BHK-21细胞中培养(定义为P2)。经过13轮类似的传代，收获各代次病毒，测定上述4株HCoVs-OC43重组病毒各代次病毒滴度并将各代次病毒以MOI＝O.01剂量感染BHK-21细胞，72h后测定各代病毒感染BHK-21细胞后的Rluc活性。另外，提取P1、P3、P5、P7、P9、P10和P11病毒的RNA，并进行RT-PCR扩增包括Rluc基因和Rluc基因上下游各350bp的序列，最后将RT-PCR产物连接T载体后测序。
病毒滴度测定结果表明，4株重组病毒在BHK-21细胞上连续传代的过程中病毒滴度有所升高，并未发生病毒滴度下降或病毒传代丢失等现象(图6)。
Rluc活性测定结果表明，rOC43-ns2DelRluc和rOC43-ns12.9StopRluc各代次病毒表达Rluc活性稳定，而rOC43-ns2FusionRluc和rOC43-ns12.9FusionRluc在传代的过程中Rluc活性虽未丢失，但是随着传代次数的增加有所下降，说明以融合方式将外源Rluc基因插入冠状病毒基因组中稳定性较差，即重组病毒rOC43-ns2FusionRluc和rOC43-ns12.9FusionRluc的稳定性较差(图7)。
测序结果进一步表明，rOC43-ns12.9StopRluc稳定性最强，在连续传代的过程中插入Rluc基因未发生突变，其次是rOC43-ns2DelRluc，仅在P11代检测到碱基突变，而rOC43-ns2FusionRluc和rOC43-ns12.9FusionRluc插入外源基因稳定性最差，分别在P4代和P6代即可检测到碱基突变(图8)。以上结果表明，rOC43-ns2DelRluc以其较好的生长特性、高敏感和较高的遗传稳定性可以作为检测病毒基因表达的有用工具。
实施例3：HCoVs-OC43特异性药物氯喹对rOC43-ns2DelRluc抑制效果评价
3.1氯喹对rOC43-ns2DelRluc和HCoV-OC43-WT抑制效果测定
由于冠状病毒尚无临床批准的特效药物，根据文献报道氯喹能够在细胞水平上有效抑制HCoVs-OC43和MERS-CoV的复制，并且能够治疗HCoVs-OC43对小鼠的致死性。因此本实验首先选择氯喹来验证重组病毒rOC43-ns2DelRluc能否用于药物筛选。同时为方便今后冠状病毒通用抑制剂的高通量筛选，本实验用96孔细胞培养板进行药物抑制实验。首先将实施例1拯救的重组病毒rOC43-ns2DelRluc及其亲本病毒HCoV-OC43-WT按照MOI＝0.01剂量感染长满单层的BHK-21细胞，2h后换为含2％胎牛血清细胞DMEM，6h后用不同浓度(0.2～80μM)的氯喹处理细胞。72h后收取两种病毒感染的细胞上清，并用Real-TimePCR技术检测上清中病毒的拷贝数，同时对于rOC43-ns2DelRluc感染的BHK-21细胞，将细胞裂解后加入含有荧光素酶检测试剂的白板中，立即放入荧光检测仪中检测Rluc活性。另外，对不同浓度氯喹处理的HCoV-OC43-WT感染的BHK-21细胞进行裂解，用Westernblot其N蛋白的表达情况。
比较不同浓度氯喹处理细胞后上清中rOC43-ns2DelRluc和HCoV-OC43-WT病毒拷贝数差异，结果显示，氯喹对重组病毒rOC43-ns2DelRluc和HCoV-OC43-WT都有很强的抑制效果，并且随着药物浓度的升高，抑制动力学曲线一致，IC50≈0.3μM(图9)。
HCoV-OC43-WT病毒的Westernblot实验进一步证明了氯喹在细胞水平上对HCoVs-OC43具有较强的抑制作用。
重组病毒rOC43-ns2DelRluc荧光素酶检测结果表明，随着氯喹浓度的增加，病毒表达Rluc活性显著下降，在1.5μM药物浓度可达到90％以上抑制率，与Real-TimePCR检测结果一致。
以上结果表明，重组病毒rOC43-ns2DelRluc以其高通量和高敏感性可以作为筛选冠状病毒药物的工具。
实施例4：广谱抗病毒药物病毒唑对rOC43-ns2DelRlue抑制效果评价
由于病毒唑是一种广谱抗病毒药物，并且临床上用重组干扰素和病毒唑联合治疗SARS-CoV和MERS-CoV感染患者。但是最近文献报道病毒唑对MERS-CoV复制抑制效果并不明显，因此本实验选择病毒唑来进一步验证重组病毒rOC43-ns2DelRluc能否试用于抗病毒药物筛选。将实施例1拯救的重组病毒rOC43-ns2DelRluc及其亲本病毒HCoV-OC43-WT按照MOI＝0.01剂量感染长满单层的BHK-21细胞，用不同浓度(0.32～320μM)的病毒唑处理细胞。72h后收取两种病毒感染的细胞上清，用Real-TimePCR技术检测上清中病毒拷贝数。对于rOC43-ns2DelRluc感染的BHK-21细胞，裂解后检测其荧光素酶活性；对于HCoV-OC43-WT感染的细胞，则在裂解细胞后用Westernblot其N蛋白的表达情况。
上清中两种病毒拷贝数检测结果表明，虽然病毒唑对冠状病毒复制具有一定的抑制效果，但是需要较高的药物浓度(IC50＞10μM)，证明了病毒唑这种广谱抗病毒药物对于冠状病毒抑制效果并不明显。
重组病毒rOC43-ns2DelRluc荧光素酶检测与Real-TimePCR检测结果一致，结果表明，病毒唑虽然能够抑制重组病毒rOC43-ns2DelRluc荧光素酶活性，但是需要较高的药物浓度。并且病毒唑的细胞毒性明显大于氯喹的细胞毒性。
同样，HCoV-OC43-WT的Westernblot进一步证明了病毒唑在较高的药物浓度下对HCoVs-OC43具有抑制作用。
以上结果表明，重组病毒rOC43-ns2DelRluc对于药物的敏感性与亲本病毒HCoV-OC43-WT一致，但是利用海肾荧光素酶检测更为方便和敏感，并且该系统能在96孔板中进行高通量筛选，进一步证实实施例1拯救的重组病毒rOC43-ns2DelRluc在高通量筛选抗冠状病毒药物中具有十分重要的应用价值。

Claims (5)

1.本发明公开了一株高效表达海肾荧光素酶基因的人冠状病毒OC43重组病毒，其特征在于：海肾荧光素酶基因(含终止密码子)替换人冠状病毒OC43附属基因ns2编码区内第19位碱基到第713位碱基，并保留717-837位的碱基序列。
2.按照权利要求1所述的人冠状病毒OC43重组病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)扩增海肾荧光素酶基因；
(2)扩增冠状病毒OC43第18566-21523位碱基和第22222-23934位碱基之间的基因片段；
(3)通过重叠PCR将步骤(1)和(2)所扩增的3个基因片段融合，获得融合片段Rluc-2；
(4)将步骤(3)获得的融合片段Rluc-2克隆至人冠状病毒OC43全长感染性克隆中构建得到携带Rluc基因的人冠状病毒OC43全长感染性克隆质粒；
(5)将重组冠状病毒OC43全长感染性克隆质粒转染BHK-21细胞，将细胞传代后，收获病毒，即得。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所用冠状病毒OC43株全长感染性克隆为pBAC-OC43FL。
4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中用NarI和PmeI双酶切融合片段Rluc-2和冠状病毒OC43全长感染性克隆pBAC-OC43FL。
5.权利要求1或2所述的OC43重组病毒在高通量筛选抗病毒药物实验中的应用。
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