CN113930437A - 一种病毒报告基因及其在抗SARS-CoV-2药物筛选中的用途 - Google Patents
一种病毒报告基因及其在抗SARS-CoV-2药物筛选中的用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113930437A CN113930437A CN202010606598.4A CN202010606598A CN113930437A CN 113930437 A CN113930437 A CN 113930437A CN 202010606598 A CN202010606598 A CN 202010606598A CN 113930437 A CN113930437 A CN 113930437A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- reporter gene
- gene
- virus
- viral
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 title claims abstract description 125
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 68
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title claims description 19
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 22
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 36
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 13
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 10
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 9
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 claims description 8
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 claims description 6
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 6
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 claims description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 4
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 14
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 abstract description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 8
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 abstract description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 7
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 abstract description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 13
- PURKAOJPTOLRMP-UHFFFAOYSA-N ivacaftor Chemical compound C1=C(O)C(C(C)(C)C)=CC(C(C)(C)C)=C1NC(=O)C1=CNC2=CC=CC=C2C1=O PURKAOJPTOLRMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229960004508 ivacaftor Drugs 0.000 description 11
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 8
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 4
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Natural products O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 4
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 3
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N cyclandelate Chemical compound C1C(C)(C)CC(C)CC1OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000729 cyclandelate Drugs 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 3
- JFOZKMSJYSPYLN-QHCPKHFHSA-N lifitegrast Chemical compound CS(=O)(=O)C1=CC=CC(C[C@H](NC(=O)C=2C(=C3CCN(CC3=CC=2Cl)C(=O)C=2C=C3OC=CC3=CC=2)Cl)C(O)=O)=C1 JFOZKMSJYSPYLN-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 3
- 229960005381 lifitegrast Drugs 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- ZRJBHWIHUMBLCN-MEBBXXQBSA-N (-)-Huperzine A Chemical compound N1C(=O)C=CC2=C1C[C@@H]1C(=CC)[C@]2(N)CC(C)=C1 ZRJBHWIHUMBLCN-MEBBXXQBSA-N 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 241000242739 Renilla Species 0.000 description 2
- ZRJBHWIHUMBLCN-UHFFFAOYSA-N Shuangyiping Natural products N1C(=O)C=CC2=C1CC1C(=CC)C2(N)CC(C)=C1 ZRJBHWIHUMBLCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- FEZBIKUBAYAZIU-UHFFFAOYSA-N trimethobenzamide Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(C(=O)NCC=2C=CC(OCCN(C)C)=CC=2)=C1 FEZBIKUBAYAZIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004161 trimethobenzamide Drugs 0.000 description 2
- -1 -1PRF element Proteins 0.000 description 1
- 206010003757 Atypical pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 1
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 1
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710114810 Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101000802734 Homo sapiens eIF5-mimic protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000711513 Mononegavirales Species 0.000 description 1
- 101100284369 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) has-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229920002352 Peptidyl-tRNA Polymers 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 229940079156 Proteasome inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 1
- 101710167605 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000000266 alpha-aminoacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 102100035859 eIF5-mimic protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N hypochlorous acid Chemical compound ClO QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000003207 proteasome inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000001521 two-tailed test Methods 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种病毒报告基因，属于抗病毒效果检测领域。本发明的病毒报告基因，包括依次连接的报告基因A、‑1 PRF元件、报告基因B，‑1 PRF元件、报告基因B之间存在终止密码子序列。将该病毒报告基因用于体外抗SARS‑CoV‑2药物筛选时，若病毒被药物抑制时，其‑1 Frameshift效率会受到影响，进而报告基因B相对于报告基因A的表达会受到影响，进而可以根据两报告基因的信号相对强弱来反映病毒受抑制的情况，完成药物筛选。本发明的病毒报告基因是全新的病毒报告基因，相比观察细胞病变更为省时，对于推进新型冠状病毒新药开发进程具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于抗病毒效果检测领域。
背景技术
SARS-CoV-2是一种含有帽状结构的正链单股病毒，其基因组长度约为29875nt。从亲缘关系角度分析，SARS-CoV-2与引起非典型肺炎的SARS-CoV及引起中东呼吸综合征的MERS-CoV同属于冠状病毒β属。β属冠状病毒的基因结构包含5′非翻译区(5′-UTR)、开放阅读框1区(ORF1)、结构基因区(S基因、E基因、M基因、N基因)、3′UTR及一些非结构蛋白ORF区。冠状病毒颗粒外观呈不规则形状，直径约100-160nm。冠状病毒颗粒被一个脂肪膜包裹，其表面有3种糖蛋白，分别为刺突糖蛋白(S)、小包膜糖蛋白(E)及膜糖蛋白(M)。
SARS-CoV-2传播能力强，致死率较高，其引起的新冠肺炎(COVID-19)已经在全世界范围内流行，截至北京时间2020年6月11日，全球已经累计确诊新冠肺炎病例7313661例，累计死亡高达413854例，给人类生命和健康造成了极大的威胁，给经济发展和社会稳定带来了极大的压力。目前，各国正积极研发治疗新冠肺炎的药物。抗SARS-CoV-2药物体外筛选是研发药物的重要步骤，主要依靠观察病毒导致细胞的病变情况来判断药物是否有效，但这种方法耗时较长。
核糖体延伸过程中的“-1programed Frameshifting”(-1PRF)现象在RNA病毒中非常常见，IBV、HIV-1及SARS病毒均有这种现象。其具体过程为：(1)mRNA假结结构迫使延伸阶段的核糖体停滞，而此时A位点氨酰tRNA及P位点肽酰tRNA的反密码环刚好与mRNA的滑动序列结合；(2)滑动序列引起tRNAs发生-1位的移位；(3)下游mRNA假结被打开，核糖体继续向前移动，但读码框发生了移动。之前的研究证实，SARS病毒滑动序列为“UUUAAAC”，在该序列之后还应该有一个介导核糖体后退的三颈状“假结”结构序列。当处于翻译延伸步骤的核糖体移动至滑动序列时，tRNA从核糖体脱落，核糖体以滑动方式倒退一步后，引起读码框的-1PRF，之后tRNA重新入位，此时肽酰转移中心未受影响，不发生新生肽链的脱落，核糖体进入ORF1b的翻译过程。
发明内容
发明人通过研究发现，SARS-CoV-2具备-1PRF现象。本发明主要解决的问题是：基于SARS-CoV-2的-1PRF现象，构建一种可用于体外筛选抗SARS-CoV-2药物的病毒报告基因。
本发明的技术方案如下：
一种病毒报告基因，所述病毒报告基因是一段核酸，它包括：
依次连接的报告基因A、-1PRF元件、报告基因B；
所述报告基因A和报告基因B同为荧光素酶基因或同为荧光蛋白基因，因报告基因A和报告基因B而产生的光信号颜色不同；
所述-1PRF元件序列如SEQ ID NO.1所示；
-1PRF元件、报告基因B之间存在终止密码子序列；终止密码子序列与基因翻译的起始密码子之间的碱基数为3的整数倍。
如前述的病毒报告基因，所述报告基因A和报告基因B同为荧光素酶基因；
优选的，所述报告基因A是海肾荧光素酶基因，报告基因B是萤火虫荧光素酶基因；或，所述报告基因A是萤火虫荧光素酶基因，报告基因B是海肾荧光素酶基因；
进一步优选的，所述病毒报告基因的序列包括SEQ ID NO.2所述序列。
如前述的病毒报告基因，所述报告基因A和报告基因B同为荧光蛋白基因；
优选的，所述所述报告基因A是绿色荧光蛋白基因，报告基因B是红色荧光蛋白基因；或，所述报告基因A是红色荧光蛋白基因，报告基因B是绿色荧光蛋白基因。
如前述的病毒报告基因，所述报告基因A的上游还包括泛素基因；
进一步优选的，所述病毒报告基因的序列包括SEQ ID NO.3所述序列。
本发明还提供了序列与前述病毒报告基因反向互补的核酸。注：与前述病毒报告基因反向互补的核酸，可以通过逆转录等本领域常规方法获得前述病毒报告基因，其最终功能与前述病毒报告基因等同。
本发明还提供了前述病毒报告基因或前述核酸的重组核酸载体。
如前述的重组核酸载体，所述重组核酸载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或质粒载体。
本发明还提供了携带前述病毒报告基因或前述核酸的重组病毒。
本发明还提供了携带权利前述病毒报告基因的动物细胞。
本发明还提供了前述病毒报告基因、核酸、重组核酸载体、重组病毒、动物细胞在体外筛选抗病毒药物中的用途。
如前述的用途，所述抗病毒药物是抗SARS-CoV-2的药物。
本发明相比现有技术的优势在于：
1)省时。通过细胞病变观察评估药效通常需要数天，而使用携带本发明的病毒报告基因只需数小时就能完成药效评估。
2)易于分辨。细胞病变观察时容易出现模棱两可的情形，而荧光信号则容易量化，辨识度高，本发明可用于高通量筛选。
3)安全。本发明的病毒报告基因使用稳定表达细胞系，不涉及有感染能力的活体病毒，因此不存在感染或传播SARS-CoV-2病毒的风险。
4)可高通量筛选。双荧光蛋白病毒报告基因可用于高内涵显微镜进行高通量筛选，双荧光素酶报告基因病毒报告基因可用于酶标仪筛选。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：双荧光素酶病毒报告基因原理示意图。
图2：双荧光素酶病毒报告基因检测流程。
图3：双荧光素酶病毒报告基因检测Cyclandelate、Lifitegrast、Ivacaftor三种药物的相对-1Frameshift(-1FR)。
图4：双荧光素酶病毒报告基因检测(-)-Huperzine A、Erythromycin、Trimethobenzamide三种药物的相对-1Frameshift(-1FR)。
图5：双荧光蛋白病毒报告基因原理示意图。
图6：双荧光蛋白病毒报告基因检测流程。
图7：荧光蛋白病毒报告基因检测结果；a.流式分析结果中的红色荧光蛋白阳性细胞比例；b.流式分析结果中的绿色荧光蛋白阳性细胞比例(mean±s.d.,n＝5tests；*P<0.05；**P<0.01；by two-tailed Student’s t test)。
图8：Cyclandelate、Lifitegrast、Ivacaftor对活体病毒的抑制后的荧光定量PCR结果。
具体实施方式
实施例1:双荧光素酶病毒报告基因
1.双荧光素酶病毒报告基因的构成及其工作原理
为确定是否有药物可以抑制SARS-CoV-2的-1Frameshift过程，发明人构建了病毒报告基因。该病毒报告基因由三部分组成：海肾(Renilla)荧光素酶基因、-1PRF元件、萤火虫(Firefly)荧光素酶基因，三部分的组成顺序为Renilla-“-1PRF元件”-Firefly，-1PRF元件和Firefly之间有终止密码子(STOP)序列，终止密码子序列与基因翻译的起始密码子之间的碱基数为3的整数倍。
其中，-1PRF元件序列(SEQ ID NO.1)为：
CCGCGAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCAGCCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCACTAGTACTGATGTCGTATACAGG
双荧光素酶病毒报告基因核心序列(SEQ ID NO.2)如下：
GAATTCACCGAGCTCGCCACCATGGCTTCCAAGGTGTACGACCCCGAGCAACGCAAACGCATGATCACTGGGCCTCAGTGGTGGGCTCGCTGCAAGCAAATGAACGTGCTGGACTCCTTCATCAACTACTATGATTCCGAGAAGCACGCCGAGAACGCCGTGATTTTTCTGCATGGTAACGCTGCCTCCAGCTACCTGTGGAGGCACGTCGTGCCTCACATCGAGCCCGTGGCTAGATGCATCATCCCTGATCTGATCGGAATGGGTAAGTCCGGCAAGAGCGGGAATGGCTCATATCGCCTCCTGGATCACTACAAGTACCTCACCGCTTGGTTCGAGCTGCTGAACCTTCCAAAGAAAATCATCTTTGTGGGCCACGACTGGGGGGCTTGTCTGGCCTTTCACTACTCCTACGAGCACCAAGACAAGATCAAGGCCATCGTCCATGCTGAGAGTGTCGTGGACGTGATCGAGTCCTGGGACGAGTGGCCTGACATCGAGGAGGATATCGCCCTGATCAAGAGCGAAGAGGGCGAGAAAATGGTGCTTGAGAATAACTTCTTCGTCGAGACCATGCTCCCAAGCAAGATCATGCGGAAACTGGAGCCTGAGGAGTTCGCTGCCTACCTGGAGCCATTCAAGGAGAAGGGCGAGGTTAGACGGCCTACCCTCTCCTGGCCTCGCGAGATCCCTCTCGTTAAGGGAGGCAAGCCCGACGTCGTCCAGATTGTCCGCAACTACAACGCCTACCTTCGGGCCAGCGACGATCTGCCTAAGATGTTCATCGAGTCCGACCCTGGGTTCTTTTCCAACGCTATTGTCGAGGGAGCTAAGAAGTTCCCTAACACCGAGTTCGTGAAGGTGAAGGGCCTCCACTTCAGCCAGGAGGACGCTCCAGATGAAATGGGTAAGTACATCAAGAGCTTCGTGGAGCGCGTGCTGAAGAACGAGCAGACGCGTCACACTGGTACTGGTCAGGCAATAACAGTTACACCGGAAGCCAATATGGATCAAGAATCCTTTGGTGGTGCATCGTGTTGTCTGTACTGCCGTTGCCACATAGATCATCCAAATCCTAAAGGATTTTGTGACTTAAAAGGTAAGTATGTACAAATACCTACAACTTGTGCTAATGACCCTGTGGGTTTTACACTTAAAAACACAGTCTGTACCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCAGCCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCACTAGTACTGATGTCGTATACAGGGCTTTTGACATCTACAATGATAAAGTAGCTGGTTTTGCTAAATTCCTAAAAACTAATTGTTGTCGCTTCCAAGAAAAGGACGAAGATGACAATTTAATTGATTCTTACTTTGTAGTTAAGAGACACACTTTCTCTAACTACCAACATGAAGAAACAATTTATAATTTACTTAAGGATTGTCCAGCTGTTGCTAAACATGACTTCTTTAAGTTTAGAATAGACTCTAGAATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCGCTGGAAGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGAACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGGACATCACTTACGCTGAGTACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGCAGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTCAACAGTATGGGCATTTCGCAGCCTACCGTGGTGTTCGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAGCTCCCAATCATCCAAAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTGCCAGAGTCCTTCGATAGGGACAAGACAATTGCACTGATCATGAACTCCTCTGGATCTACTGGTCTGCCTAAAGGTGTCGCTCTGCCTCATAGAACTGCCTGCGTGAGATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCCATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAAGAAGAGCTGTTTCTGAGGAGCCTTCAGGATTACAAGATTCAAAGTGCGCTGCTGGTGCCAACCCTATTCTCCTTCTTCGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGTGGCGCTCCCCTCTCTAAGGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCCAAGAGGTTCCATCTGCCAGGTATCAGGCAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACATCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAAAGAGGCGAACTGTGTGTGAGAGGTCCTATGATTATGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATAGCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATCGTTGACCGCCTGAAGTCTCTGATTAAGTACAAAGGCTATCAGGTGGCTCCCGCTGAATTGGAATCCATCTTGCTCCAACACCCCAACATCTTCGACGCAGGTGTCGCAGGTCTTCCCGACGATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGATTACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCTTACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGATCGCCGTGTAAGCTAGCACAGGATCC
细胞内存在-1PRF现象时，核糖体在移动到-1PRF元件的slippery site时会后移一个碱基(即发生-1PRF现象)，再继续前行，进行翻译，按照3个碱基编码1个氨基酸的规则，刚好错过终止密码子，顺利使下游Firefly荧光素酶基因得以表达。
当细胞内不存在-1PRF现象时，核糖体在移动到-1PRF元件的slippery site时不会后移一个碱基(即不发生-1PRF现象)，正常前行，按照3个碱基编码1个氨基酸的规则，刚好会读取终止密码子的终止信号，下游的Firefly荧光素酶基因得不到表达(原理如图1所示)。
细胞环境中人工添加荧光素酶底物，就能观察荧光素酶信号。
2.病毒报告基因的使用
本发明的病毒报告基因可以被构建到真核表达载体(可选用慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、质粒载体等)内，本实施例将本发明的病毒报告基因构建到慢病毒载体。
2.1方法
(1)重组病毒构建
将本发明的病毒报告基因构建到慢病毒载体，经293T细胞包装出大量带有本发明病毒报告基因的重组慢病毒。
(2)获得重组细胞系
将重组慢病毒感染呼吸道上皮细胞16HBE，经嘌呤霉素筛选后获得稳定表达本发明的病毒报告基因的阳性细胞系，用于药物筛选。
(3)药物筛选
将阳性细胞单克隆培养至96孔板，24小时后，向孔板中分别加入不同抗病毒药物，培养8小时，裂解细胞，先后加入萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶底物，萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶的比值为-1Frameshift效率。
前述流程的总结如图2所示。
2.2结果
-1Frameshift效率低，表明病毒表达受到抑制。随着Cyclandelate、Lifitegrast、Ivacaftor的用药浓度升高，-1Frameshift效率降低，这3种药物均有很好的的抑制SARS-CoV-2的效果，其中Lifitegrast与Ivacaftor效果相对更优(图3)。
-1Frameshift效率显著增高(20％以上)同样也会抑制病毒的复制。发明人总结了对SARS-CoV-2的-1Frameshift效率升高的药物信息，发现(-)-Huperzine A、Erythromycin、Trimethobenzamide三种药具有很好的促进SARS-CoV-2的-1Frameshift效果(图4)。
3.结论
本发明的双荧光素酶病毒报告基因可以用于筛选抗SARS-CoV-2的药物。
实施例2：双荧光蛋白病毒报告基因
1.双荧光蛋白病毒报告基因的构成及工作原理
双荧光素酶病毒报告基因是基于荧光素酶的蛋白酶降解，如果药物对蛋白酶降解病毒报告基因造成影响，则会干扰实验结果，因此，发明人构建了非蛋白酶依赖的病毒报告基因，该病毒报告基因由四部分组成：泛素(ubiquitin)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因、-1PRF元件、红色荧光蛋白(RFP)基因。四部分的组成顺序为ubiquitin-GFP-“-1PRF元件”-RFP，-1PRF元件和RFP之间有终止密码子(STOP)序列，终止密码子序列与基因翻译的起始密码子之间的碱基数为3的整数倍。(图5)。其中，-1PRF元件与实施例1的-1PRF元件相同。比实施例1多出泛素基因，其目的是在不需要检测时，双荧光蛋白病毒报告基因表达的蛋白能因泛素化标记而被蛋白酶体降解，以减少检测前产生的背景荧光。
双荧光蛋白报告基因病毒报告基因核心序列(SEQ ID NO.3)如下：
GAATTCACCGCCACCATGGAGATCTTCGTGAAGACTCTGACTGGTAAGACCATCACCCTCGAGGTTGAGCCCAGTGACACCATTGAGAATGTCAAGGCAAAGATCCAAGATAAGGAAGGCATCCCTCCTGACCAGCAGAGGCTGATCTTTGCTGGAAAACAGCTGGAAGATGGGCGCACCCTGTCTGACTACAACATCCAGAAAGAGTCCACCCTGCACCTGGTACTCCGTCTCAGAGGTGGGCGCGGGAAGCTTGGTCGACAACCGGTCGAGCTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGACGCGTGAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCAGCCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCACTAGTACTGATGTCGTATACAGGGCTTTTGACATTCTAGACATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGCTAGCGGATCC
当环境中存在蛋白酶体抑制剂(如MG-132)时，病毒报告基因表达的泛素蛋白不能介导蛋白降解，荧光蛋白基因表达后才能稳定存在。其中位于-1PRF元件上游的GFP首先表达，而下游的RFP表达则依赖于-1PRF现象，其原理与实施例1本质相同，只是报告基因换成了荧光蛋白，示意图见图5。
2.病毒报告基因的使用
本发明的病毒报告基因可以被构建到真核表达载体(可选用慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、质粒载体等)内，本实施例将本发明的病毒报告基因构建到慢病毒载体。
2.1方法
(1)重组病毒构建
将本发明的病毒报告基因构建到慢病毒载体，经293T细胞包装出大量带有本发明病毒报告基因的重组慢病毒。
(2)获得重组细胞系
将重组慢病毒感染呼吸道上皮细胞16HBE，经嘌呤霉素筛选后获得稳定表达本发明的病毒报告基因的阳性细胞系，用于药物筛选。
(3)药物筛选
a.细胞铺板：提前24h于六孔板中传代稳定表达本发明的病毒报告基因的阳性细胞，使其在加药时细胞融合度至80％-90％为宜。
b.细胞加药处理：每个药设置3个复孔，加20uM的药物终浓度处理1后，加5μM MG-132后继续处理2-3h.
c.处理完后，吸除培养基，用PBS洗一次，加0.25％胰酶消化细胞，加有血清培养基终止消化，收集细胞于EP管中，500g离心3min。
d.丢弃上清，加300μl-500μl PBS重悬细胞，并用70um滤网过滤细胞后转移至流式管中，用于流式细胞仪检测分析。
e.流式检测：开机流式检测仪器FACSAria SORP，打开液流调节至稳定，用次氯酸冲洗管路，上样前轻轻涡旋上样管，防止细胞沉底，上样检测PE和FITC双通道荧光。
前述流程的总结如图6所示。
2.2结果
利用流式细胞仪对Cyclandelate、Lifitegrast、Ivacaftor三种药物的作用效果进行进一步检测，结果显示，与荧光素酶实验结果(实施例1)类似，Cyclandelate、Lifitegrast、Ivacaftor在荧光蛋白检测病毒报告基因中，同样具有抑制SARS-CoV-2的-1Frameshift的作用(图7)。
3.结论
本发明的双荧光蛋白病毒报告基因可以用于筛选抗SARS-CoV-2的药物。
实施例3：Cyclandelate、Lifitegrast、Ivacaftor对活体病毒的抑制效果
通过对离体培养的SARS-CoV-2活体病毒进行药物处理，进一步验证Cyclandelate、Lifitegrast、Ivacaftor对活体病毒的抑制效果。
一、具体实施步骤
1.培养人呼吸道上皮细胞16HBE，感染SARS-CoV-2活体病毒48小时后，分别向培养皿中加入DMSO及10uM Cyclandelate、Lifitegrast、Ivacaftor，继续培养24小时并收集细胞，裂解后经离心法获得病毒颗粒。
2.利用Oligo dT引物进行逆转录。
3.对逆转录产物进行PCR，引物如下：
Target：ORF1ab
正向引物(F)：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA(SEQ ID NO.4)
反向引物(R)：ACGATTGTGCATCAGCTGA(SEQ ID NO.5)
二、结果
利用病毒核酸进行RT-PCR，并对病毒数量进行分析，结果显示，10uMCyclandelate、Lifitegrast、Ivacaftor处理后，病毒数量明显下降。该结果说明，Cyclandelate、Lifitegrast、Ivacaftor对活体病毒具有明显的抑制效果(图8)。
三、结论
通过本发明病毒报告基因筛选得到的药物，经SARS-CoV-2活体病毒验证，能够起到明显抑制作用，表明本发明的病毒报告基因具有可靠的筛选能力。
综上，利用SARS-CoV-2的-1PRF现象，本发明构建了病毒报告基因，按其中信号分子类型，可分为双荧光素酶病毒报告基因和双荧光蛋白病毒报告基因。通过两种颜色的荧光信号相对强弱来反映病毒受抑制的情况，可完成药物体外快速筛选工作，对于推进新型冠状病毒新药开发进程具有重要意义。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种病毒报告基因及其在抗SARS-CoV-2药物筛选中的用途
<130> GYKH1669-2020P0110384CC
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ccgcgaaccc atgcttcagt cagctgatgc acaatcgttt ttaaacgggt ttgcggtgta 60
agtgcagccc gtcttacacc gtgcggcaca ggcactagta ctgatgtcgt atacagg 117
<210> 2
<211> 3230
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gaattcaccg agctcgccac catggcttcc aaggtgtacg accccgagca acgcaaacgc 60
atgatcactg ggcctcagtg gtgggctcgc tgcaagcaaa tgaacgtgct ggactccttc 120
atcaactact atgattccga gaagcacgcc gagaacgccg tgatttttct gcatggtaac 180
gctgcctcca gctacctgtg gaggcacgtc gtgcctcaca tcgagcccgt ggctagatgc 240
atcatccctg atctgatcgg aatgggtaag tccggcaaga gcgggaatgg ctcatatcgc 300
ctcctggatc actacaagta cctcaccgct tggttcgagc tgctgaacct tccaaagaaa 360
atcatctttg tgggccacga ctggggggct tgtctggcct ttcactactc ctacgagcac 420
caagacaaga tcaaggccat cgtccatgct gagagtgtcg tggacgtgat cgagtcctgg 480
gacgagtggc ctgacatcga ggaggatatc gccctgatca agagcgaaga gggcgagaaa 540
atggtgcttg agaataactt cttcgtcgag accatgctcc caagcaagat catgcggaaa 600
ctggagcctg aggagttcgc tgcctacctg gagccattca aggagaaggg cgaggttaga 660
cggcctaccc tctcctggcc tcgcgagatc cctctcgtta agggaggcaa gcccgacgtc 720
gtccagattg tccgcaacta caacgcctac cttcgggcca gcgacgatct gcctaagatg 780
ttcatcgagt ccgaccctgg gttcttttcc aacgctattg tcgagggagc taagaagttc 840
cctaacaccg agttcgtgaa ggtgaagggc ctccacttca gccaggagga cgctccagat 900
gaaatgggta agtacatcaa gagcttcgtg gagcgcgtgc tgaagaacga gcagacgcgt 960
cacactggta ctggtcaggc aataacagtt acaccggaag ccaatatgga tcaagaatcc 1020
tttggtggtg catcgtgttg tctgtactgc cgttgccaca tagatcatcc aaatcctaaa 1080
ggattttgtg acttaaaagg taagtatgta caaataccta caacttgtgc taatgaccct 1140
gtgggtttta cacttaaaaa cacagtctgt accgtctgcg gtatgtggaa aggttatggc 1200
tgtagttgtg atcaactccg cgaacccatg cttcagtcag ctgatgcaca atcgttttta 1260
aacgggtttg cggtgtaagt gcagcccgtc ttacaccgtg cggcacaggc actagtactg 1320
atgtcgtata cagggctttt gacatctaca atgataaagt agctggtttt gctaaattcc 1380
taaaaactaa ttgttgtcgc ttccaagaaa aggacgaaga tgacaattta attgattctt 1440
actttgtagt taagagacac actttctcta actaccaaca tgaagaaaca atttataatt 1500
tacttaagga ttgtccagct gttgctaaac atgacttctt taagtttaga atagactcta 1560
gaatggaaga cgccaaaaac ataaagaaag gcccggcgcc attctatccg ctggaagatg 1620
gaaccgctgg agagcaactg cataaggcta tgaagagata cgccctggtt cctggaacaa 1680
ttgcttttac agatgcacat atcgaggtgg acatcactta cgctgagtac ttcgaaatgt 1740
ccgttcggtt ggcagaagct atgaaacgat atgggctgaa tacaaatcac agaatcgtcg 1800
tatgcagtga aaactctctt caattcttta tgccggtgtt gggcgcgtta tttatcggag 1860
ttgcagttgc gcccgcgaac gacatttata atgaacgtga attgctcaac agtatgggca 1920
tttcgcagcc taccgtggtg ttcgtttcca aaaaggggtt gcaaaaaatt ttgaacgtgc 1980
aaaaaaagct cccaatcatc caaaaaatta ttatcatgga ttctaaaacg gattaccagg 2040
gatttcagtc gatgtacacg ttcgtcacat ctcatctacc tcccggtttt aatgaatacg 2100
attttgtgcc agagtccttc gatagggaca agacaattgc actgatcatg aactcctctg 2160
gatctactgg tctgcctaaa ggtgtcgctc tgcctcatag aactgcctgc gtgagattct 2220
cgcatgccag agatcctatt tttggcaatc aaatcattcc ggatactgcg attttaagtg 2280
ttgttccatt ccatcacggt tttggaatgt ttactacact cggatatttg atatgtggat 2340
ttcgagtcgt cttaatgtat agatttgaag aagagctgtt tctgaggagc cttcaggatt 2400
acaagattca aagtgcgctg ctggtgccaa ccctattctc cttcttcgcc aaaagcactc 2460
tgattgacaa atacgattta tctaatttac acgaaattgc ttctggtggc gctcccctct 2520
ctaaggaagt cggggaagcg gttgccaaga ggttccatct gccaggtatc aggcaaggat 2580
atgggctcac tgagactaca tcagctattc tgattacacc cgagggggat gataaaccgg 2640
gcgcggtcgg taaagttgtt ccattttttg aagcgaaggt tgtggatctg gataccggga 2700
aaacgctggg cgttaatcaa agaggcgaac tgtgtgtgag aggtcctatg attatgtccg 2760
gttatgtaaa caatccggaa gcgaccaacg ccttgattga caaggatgga tggctacatt 2820
ctggagacat agcttactgg gacgaagacg aacacttctt catcgttgac cgcctgaagt 2880
ctctgattaa gtacaaaggc tatcaggtgg ctcccgctga attggaatcc atcttgctcc 2940
aacaccccaa catcttcgac gcaggtgtcg caggtcttcc cgacgatgac gccggtgaac 3000
ttcccgccgc cgttgttgtt ttggagcacg gaaagacgat gacggaaaaa gagatcgtgg 3060
attacgtcgc cagtcaagta acaaccgcga aaaagttgcg cggaggagtt gtgtttgtgg 3120
acgaagtacc gaaaggtctt accggaaaac tcgacgcaag aaaaatcaga gagatcctca 3180
taaaggccaa gaagggcgga aagatcgccg tgtaagctag cacaggatcc 3230
<210> 3
<211> 1853
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
gaattcaccg ccaccatgga gatcttcgtg aagactctga ctggtaagac catcaccctc 60
gaggttgagc ccagtgacac cattgagaat gtcaaggcaa agatccaaga taaggaaggc 120
atccctcctg accagcagag gctgatcttt gctggaaaac agctggaaga tgggcgcacc 180
ctgtctgact acaacatcca gaaagagtcc accctgcacc tggtactccg tctcagaggt 240
gggcgcggga agcttggtcg acaaccggtc gagctcatgg tgagcaaggg cgaggagctg 300
ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc 360
agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc 420
tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc 480
gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 540
atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag 600
acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc 660
atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc 720
cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc 780
cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc 840
atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg 900
agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc 960
gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagacgcgtg aacccatgct tcagtcagct 1020
gatgcacaat cgtttttaaa cgggtttgcg gtgtaagtgc agcccgtctt acaccgtgcg 1080
gcacaggcac tagtactgat gtcgtataca gggcttttga cattctagac atggtgagca 1140
agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag gtgcacatgg 1200
agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc cgcccctacg 1260
agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc ttcgcctggg 1320
acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac cccgccgaca 1380
tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc gtgatgaact 1440
tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac ggcgagttca 1500
tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta atgcagaaga 1560
agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc gccctgaagg 1620
gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct gaggtcaaga 1680
ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc aacatcaagt 1740
tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa cgcgccgagg 1800
gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta agctagcgga tcc 1853
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ccctgtgggt tttacactta a 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
acgattgtgc atcagctga 19
Claims (10)
1.一种病毒报告基因，其特征在于：它包括：
依次连接的报告基因A、-1PRF元件、报告基因B；
所述报告基因A和报告基因B同为荧光素酶基因或同为荧光蛋白基因，因报告基因A和报告基因B而产生的光信号颜色不同；
所述-1PRF元件序列如SEQ ID NO.1所示；
-1PRF元件和报告基因B之间存在终止密码子序列；终止密码子序列与基因翻译的起始密码子之间的碱基数为3的整数倍。
2.如权利要求1所述的病毒报告基因，其特征在于：
所述报告基因A和报告基因B同为荧光素酶基因；
优选的，所述报告基因A是海肾荧光素酶基因，报告基因B是萤火虫荧光素酶基因；或，所述报告基因A是萤火虫荧光素酶基因，报告基因B是海肾荧光素酶基因；
进一步优选的，所述病毒报告基因的序列包括SEQ ID NO.2所述序列。
3.如权利要求1所述的病毒报告基因，其特征在于：
所述报告基因A和报告基因B同为荧光蛋白基因；
优选的，所述所述报告基因A是绿色荧光蛋白基因，报告基因B是红色荧光蛋白基因；或，所述报告基因A是红色荧光蛋白基因，报告基因B是绿色荧光蛋白基因。
4.如权利要求3所述的病毒报告基因，其特征在于：所述报告基因A的上游还包括泛素基因；
进一步优选的，所述病毒报告基因的序列包括SEQ ID NO.3所述序列。
5.序列与权利要求1～4任一所述病毒报告基因反向互补的核酸。
6.携带权利要求1～4任一所述病毒报告基因或权利要求5所述核酸的重组核酸载体；优选的，所述重组核酸载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或质粒载体。
7.携带权利要求1～4任一所述病毒报告基因或权利要求5所述核酸的重组病毒。
8.携带权利要求1～4任一所述病毒报告基因的动物细胞。
9.权利要求1～4任一所述病毒报告基因、权利要求5所述的核酸、权利要求6所述的重组核酸载体、权利要求7所述重组病毒或权利要求8所述的动物细胞在体外筛选抗病毒药物中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于：所述抗病毒药物是抗SARS-CoV-2的药物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010606598.4A CN113930437A (zh) | 2020-06-29 | 2020-06-29 | 一种病毒报告基因及其在抗SARS-CoV-2药物筛选中的用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010606598.4A CN113930437A (zh) | 2020-06-29 | 2020-06-29 | 一种病毒报告基因及其在抗SARS-CoV-2药物筛选中的用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113930437A true CN113930437A (zh) | 2022-01-14 |
Family
ID=79273160
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010606598.4A Pending CN113930437A (zh) | 2020-06-29 | 2020-06-29 | 一种病毒报告基因及其在抗SARS-CoV-2药物筛选中的用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113930437A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114921484A (zh) * | 2022-06-14 | 2022-08-19 | 四川大学华西医院 | 用于体外筛选引起基因沉默药物的报告基因组、试剂盒及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050277607A1 (en) * | 2004-06-09 | 2005-12-15 | Dinman Jonathan D | Compositions and methods for regulating peptidyltransferase activity and uses thereof |
| CN102121053A (zh) * | 2010-12-09 | 2011-07-13 | 江南大学 | 一种用于抗病毒药物筛选的方法 |
| US20110183892A1 (en) * | 2007-10-11 | 2011-07-28 | Dinman Jonathan D | Methods for the treatment of viral conditions |
| CN105671006A (zh) * | 2016-03-22 | 2016-06-15 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | 高效表达海肾荧光素酶基因的重组HCoV-OC43病毒及其应用 |
| CN111593073A (zh) * | 2020-03-18 | 2020-08-28 | 苏州奥特铭医药科技有限公司 | 双报告基因骨架载体、四质粒假病毒包装系统、包装新冠肺炎假病毒 |
-
2020
- 2020-06-29 CN CN202010606598.4A patent/CN113930437A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050277607A1 (en) * | 2004-06-09 | 2005-12-15 | Dinman Jonathan D | Compositions and methods for regulating peptidyltransferase activity and uses thereof |
| US20110183892A1 (en) * | 2007-10-11 | 2011-07-28 | Dinman Jonathan D | Methods for the treatment of viral conditions |
| CN102121053A (zh) * | 2010-12-09 | 2011-07-13 | 江南大学 | 一种用于抗病毒药物筛选的方法 |
| CN105671006A (zh) * | 2016-03-22 | 2016-06-15 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | 高效表达海肾荧光素酶基因的重组HCoV-OC43病毒及其应用 |
| CN111593073A (zh) * | 2020-03-18 | 2020-08-28 | 苏州奥特铭医药科技有限公司 | 双报告基因骨架载体、四质粒假病毒包装系统、包装新冠肺炎假病毒 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| AHN D G 等: "Interference of ribosomal frameshifting by antisense peptide nucleic acids suppresses SARS coronavirus replication" * |
| BARANOV P V 等: "Programmed ribosomal frameshifting in decoding the SARS-CoV genome" * |
| CHEN Y 等: "A drug screening toolkit based on the–1 ribosomal frameshifting of SARS-CoV-2" * |
| KELLY J A 等: "Structural and functional conservation of the programmed -1 ribosomal frameshift signal of SARS coronavirus 2 (SARS-CoV-2)" * |
| RAKAUSKAITE R 等: "A rapid, inexpensive yeast-based dual-fluorescence assay of programmed -1 ribosomal frameshifting for high-throughput screening" * |
| 方海同 等: "一种基于绿色荧光蛋白的蛋白酶体抑制剂细胞筛选模型" * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114921484A (zh) * | 2022-06-14 | 2022-08-19 | 四川大学华西医院 | 用于体外筛选引起基因沉默药物的报告基因组、试剂盒及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ivey et al. | MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells | |
| JP5971599B2 (ja) | 制限増殖型アデノウイルス | |
| JP6893633B2 (ja) | 分化細胞の抽出方法 | |
| WO2013189521A1 (en) | Method of generating cells of hepatocyte phenotype | |
| Jin et al. | HMGA1 accelerates the malignant progression of gastric cancer through stimulating EMT | |
| Yamamoto et al. | Recapitulation of in vivo gene expression during hepatic differentiation from murine embryonic stem cells | |
| CN113930437A (zh) | 一种病毒报告基因及其在抗SARS-CoV-2药物筛选中的用途 | |
| CN113925863B (zh) | Ivacaftor在制备抑制新型冠状病毒SARS-CoV2的药物中的用途 | |
| AU2017254796A1 (en) | Cell free translation system for compound screening and related uses | |
| CN104762322B (zh) | 一种用于对虾细胞的逆转录病毒基因转移系统 | |
| TW201531562A (zh) | 含內部核醣體進入位置序列之表達載體及其多基因表現系統 | |
| CN114921484A (zh) | 用于体外筛选引起基因沉默药物的报告基因组、试剂盒及其应用 | |
| US20160186209A1 (en) | Recombinant cells and methods of using such cells to identify circadian rhythm modulators | |
| EP4227407A1 (en) | Coronavirus-infective cells and method of preparing same | |
| Chen et al. | A novel p53 paralogue mediates antioxidant defense of mosquito cells to survive dengue virus replication | |
| Seto et al. | Processing bodies accumulate in human cytomegalovirus-infected cells and do not affect viral replication at high multiplicity of infection | |
| LaFontaine et al. | Ribosomal protein RACK1 facilitates efficient translation of poliovirus and other viral IRESs | |
| Martínez-Noël et al. | Identification of microRNAs that stabilize p53 in HPV-positive cancer cells | |
| Dupont et al. | The RBPome of influenza A virus NP-mRNA reveals a role for TDP-43 in viral replication | |
| Heintz | Analysis of Marburg Virus Protein Interactions | |
| CN117106101A (zh) | 质粒及asfv蛋白酶抑制剂筛选及药效评价的方法 | |
| US20200141928A1 (en) | Method for rna tagging and analysis on single cell | |
| Lyon Jr | Multi-Color Visualization and Quantification of Single RNA Translation and HIV-1 Programmed Ribosomal Frameshifting in Living Cells | |
| CN117844767A (zh) | 神经坏死病毒蛋白b2在促进病毒在细胞内增殖中的应用 | |
| CN117645975A (zh) | 一种用于高通量筛选trpv1受体抑制剂的细胞系及其构建方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220114 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |