CN113564205A - 一种平衡染色体动物模型的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种近乎完整染色体倒置的平衡染色体以及具有平衡染色体动物模型的构建方法，使用位点特异性重组酶系统介导的重组技术，在染色体着丝粒侧插入片段1，包括位点特异性重组酶系统一侧识别位点，该位点的上游具有正选择标记基因表达元件片段A；在端粒侧插入片段2，包括位点特异性重组酶系统另侧识别位点，该位点的上游具有反向的正选择标记基因表达元件片段B，经相应的位点特异性重组酶诱导实现两个位点特异性重组酶系统识别位点之间的序列倒置，正选择标记基因表达元件片段A和B组合实现正选择标记基因的表达，利用正负筛选法筛选得到平衡染色体。本发明所述方法可用于建立所有染色体近乎全部倒置的平衡染色体动物品系。

Description

一种平衡染色体动物模型的构建方法
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体涉及一种平衡染色体，特别是整条染色体倒置，以获得平衡染色体小鼠模型，并通过繁育获得染色体全部倒置的小鼠模型。
背景技术
平衡染色体(Balancer Chromosome)是经特殊修饰过的染色体，最先被应用在果蝇的遗传学研究，平衡染色体通常包含倒置的染色体片段，姐妹染色单体在倒置区不会发生同源重组，因此，平衡染色体可用于保存筛选到的突变，包括隐性致死突变，维持基因杂合性(Boles,M.K.,et al.,A mouse chromosome 4balancer ENU-mutagenesis screenisolates eleven lethal lines.BMC genetics,2009.10:p.12-12.)。平衡染色体为遗传学家提供了一种可靠的方法，可以从遗传学角度筛选生物的突变并使其保持恒定，如图1(说明：[B,C,D]和[G]是倒置的染色体片段，正常的基因同源重组(大X))。在倒置片段处被抑制(小X)。
平衡染色体的工作原理是：在减数分裂期间，倒转的基因片段能够抑制姐妹染色单体重组事件时交叉互换的重组产物的恢复。染色体倒置可通过两种方式阻止交叉互换后染色体的恢复完整。首先，在倒置染色体附近很难形成染色体的交叉联会。其次，存在染色体联会时，在染色体的联会区，内翻的倒置基因出现交叉重组互换会导致产生两个无法遗传的染色体(一条具有两个着丝粒，一条无着丝粒)，由此产生的非整倍体配子不能产生正常后代。如图2所示。(Miller,D.E.,et al.,Rare recombination events generatesequence diversity among balancer chromosomes in Drosophilamelanogaster.Proceedings of the National Academy of Sciences,2016.113(10):p.E1352-E1361.)
平衡染色体倒置区越大，够保存其配对的同源染色体上的基因越多。科学家在制作倒置染色体时，面临的问题是随着倒置的目的基因区域变大，获得倒置成功的概率逐渐降低接近于0。原因在于介导倒置的Cre/loxP介导的重组效率随着遗传距离增大而降低，当loxP囊括的染色体长度大致达到60cM(～94Mb)时，获得重组的概率为8.3±0.8×10-5(Zheng,B.,et al.,Engineering mouse chromosomes with Cre-loxP:range,efficiency,and somatic applications.Molecular and cellular biology,2000.20(2):p.648-655.)。
孙磊等人设计了利用Cre/loxP系统，设计基于4个不同的插入框架，通过多次电转，先后完成3个倒位，分别培育出含有远端倒位和近端倒位的小鼠,利用体内减数分裂自然同源重组的方法使它们重组到同一条染色体上,再分离相应的ES细胞。(孙磊，复旦大学，博士学位论文，2007，《小鼠17号染色体全长有丝分裂重组系统构建以及平衡染色体初探》)。
目前已有的小鼠平衡染色体都只是覆盖了某条染色体的一部分,即便是小鼠11号染色体也是通过三条独立的平衡染色体才覆盖了86％的区域,还不能满足进行全基因组或全长染色体遗传筛选的要求。
现有技术下使用分段倒置的技术思路存在很大的缺陷。首先，在同一细胞上进行多段插入，无法有效保证插入的每个片段在同一个染色体上，增加的片段数越多，概率越低。仅当这些片段都插入在同一个染色体上，该Cre/loxP系统才能工作，获得倒置。其次，在孙磊公开的文献中，每一段序列的插入都需要使用一种抗性标记，每一段插入后，需要进行一次Cre电转将抗性删除，如此进行，ES细胞需要经历的基因打靶次数倍数增加，而ES细胞在进行连续打靶会大大影响其全能性和遗传能力，造成无法获得小鼠。同时，采用多段插入，还面临双交换的风险，插入的片段越多，风险越大。此外，由于分段倒置每段来源不同的细胞产生的小鼠，分段片段不在同一个染色体上，利用小鼠配繁的过程中自然产生跨越整个染色体的同源重组概率在理论上极低。
目前尚无理想、有效的，进行完整染色体倒置的平衡染色体构建方法。
发明内容
本发明针对现有技术不足，提供了一种完整染色体倒置的平衡染色体以及具有平衡染色体动物模型的构建方法，可用于建立全部染色体倒置的平衡染色体动物品系。
本发明具体技术方案如下：
一种平衡染色体的构建方法，使用位点特异性重组酶系统介导的位点特异性重组技术，在染色体着丝粒侧插入片段1，包括位点特异性重组酶系统一侧识别位点，该位点的上游具有正选择标记基因表达元件片段A，在端粒侧引入片段2，包括位点特异性重组酶系统另侧识别位点，该位点的上游具有反向的正选择标记基因表达元件片段B，经位点特异性重组酶诱导实现两个位点之间的序列倒置，正选择标记基因表达元件片段A和B组合实现正选择标记基因的表达，利用正负筛选法筛选得到平衡染色体。
本发明所述的构建方法适用于各种长度的染色区域倒置，特别适用于整条染色体(超过190Mb染色体区域)的倒置。
为了实现近整条染色体的倒置，片段1插入位置在着丝粒一端，优选位于着丝粒序列下游0～50Mbp处，片段2插入位置在端粒一端，位于端粒序列上游0～50M bp处。
由于位点特异性重组酶系统(如Cre/loxP)介导的重组效率随着遗传距离增大而降低，为了提高筛选的精准性，本发明基于正选择标记基因的筛选思路，敲除原表达系统中正选择标记基因，将正选择标记基因表达元件分割为两段独立的含有编码区的片段，并将下游部分的编码区片段序列反向，分别放置于片段1和2的位点特异性重组酶系统识别位点的上游。经位点特异性重组酶系统工具酶诱导实现两个位点特异性重组酶系统识别位点之间的序列倒置后，原正选择标记基因反向的下游部分的编码区片段经倒置转为正向序列，连接在片段1的位点特异性重组酶系统识别位点之后，与正选择标记基因的上游部分的编码区实现正选择标记基因的表达，利用正选择标记基因抗性的药物(如HAT(胸苷激酶基因选择法)筛选或抗生素药物压力筛选)，筛选得到平衡染色体阳性克隆。
基于上述构思，将所述正选择标记基因表达元件分割成两段编码区，片段A和B，可以分割为正选择标记基因表达启动子和正选择标记基因，或者在正选择标记基因的内含子部分进行分割，得到的片段A为正选择标记基因表达启动子+正选择标记基因编码区(部分)，片段B为正选择标记基因编码区(部分)。两个位点特异性重组酶系统识别位点之间的序列倒置后，片段1的位点特异性重组酶系统识别位点位于正选择标记基因表达元件两个片段之间，但不影响正选择标记基因的表达。
优选的，所述正选择标记基因选自新霉素磷酸转移酶(neo)、潮霉素B磷酸转移酶(hph)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶(gpt)、次黄嘌呤磷酸转移酶(Hprt)、胸腺嘧啶激酶(tk)或嘌呤霉素乙酰转移酶(puro)。
考虑到采用上述方法构建得到的平衡染色体除了原序列外，还引入了外源性序列，如位点特异性重组酶系统识别位点，正选择标记基因，启动子等，本发明进一步设计了删除外源序列的技术方案，向片段1和2中引入可以被可诱导重组系统的工具酶识别、切割的位点，使两个位点特异性重组酶系统识别位点之间的序列倒置后，酶可以识别并切割外源性片段，并连接原染色体序列部分，获得无任何外源序列的平衡染色体。
一个具体的方案，所述片段1的5’端和3’端分别具有正向和反向的被可诱导重组系统工具酶识别的单侧序列，所述片段2的5’端和3’端分别具有反向和正向的被可诱导重组系统工具酶识别的另一侧序列。
两个被可诱导重组系统工具酶识别位点之间的序列倒置后，原片段2的5’端和片段1的3’端的被可诱导重组系统工具酶识别的序列随着染色体倒置，分别与所述片段1的5’端和片段2的3’端的序列形成两组酶切位点，被可诱导重组系统工具酶识别、切割，并使染色体剩余序列拼接成整体。
优选的，所述可诱导重组系统选自Cre/loxP重组系统、转座子重组系统、Gateway重组系统、FLP/FRT重组系统、Dre/Rox重组系统。
本发明一个具体的方案，所述可诱导重组系统选自转座子重组系统，被可诱导重组系统识别的序列为piggyBac转座子的转座酶识别序列。
本发明可以采用打靶载体、ZFNs、TALENs或CRISPER/Cas9等转基因手段，向染色体中插入片段1和2，以及电转、转染、注射等方式向细胞中转入位点特异性重组酶系统工具酶、DNA或RNA载体。优选采用DNA质粒载体电转的方法。
优选的，所述的构建方法，还包括对片段1和2的插入结果进行验证和筛选阳性克隆。例如，在于所述片段1的位点特异性重组酶系统一侧位点和片段2的位点特异性重组酶系统另侧位点的下游还包括与正选择标记基因表达元件不同的抗性筛选标记，选自Neo、Hph、Gpt、Hprt、Tk或Puro，以及所述不同的抗性筛选标记相应的启动子。
本发明一个优选的方案，采用使用Cre/LoxP系统介导的位点特异性重组技术，在染色体着丝粒侧插入片段1，包括loxP位点，loxP位点的上游具有正选择标记基因表达元件片段A，在端粒侧引入片段2，包括反向的loxP位点，反向的loxP位点的上游具有反向的正选择标记基因表达元件片段B，经Cre工具酶诱导实现两个loxP位点之间的序列倒置，正选择标记基因表达元件片段A和B组合实现正选择标记基因的表达，利用正负筛选法筛选得到平衡染色体。
优选的，本发明所述构建方法使用的Cre/loxP系统，使用的Cre酶为iCre，基因序列如SEQ ID No.11所示(Shimshek,D.R.et al."Codon-Improved Cre Recombinase(Icre)Expression in the Mouse."genesis,vol.32,no.1,2002,pp.19-26,)。
本发明一个具体的技术方案，选择piggyBac转座子的转座酶识别序列PB3’和PB5’作为删除外源序列的可诱导删除识别位点。选择在Hprt序列的内含子区域将其分为两段包含编码区的片段，作为正选择标记基因表达元件片段A和B。并选择neo及其启动子和puro及其启动子作为抗性筛选标记。设计片段1依次包括依次包括piggyBac转座子的转座酶识别序列PB3’/PB5’、Hprt启动子、5’Hprt编码区、loxP、neo-PGK、反向piggyBac转座子的转座酶识别序列PB3’/PB5’，片段2依次包括反向piggyBac转座子的转座酶识别序列PB5’/PB3’、反向3’Hprt编码区、反向loxP、puro-PGK、piggyBac转座子的转座酶识别序列PB 5’/PB3’，采用HAT筛选得到平衡染色体。
所述片段1的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，所述片段2的核苷酸序列如SEQ IDNo：2所示。
本发明另一目的在于公开一种具有平衡染色体细胞的构建方法，首先构建正选择标记基因敲除的细胞，通过基因打靶技术，采用本发明所述的方法获得具有平衡染色体的细胞。进一步的，还包括向细胞给予被可诱导重组系统的工具酶或其表达载体。所述细胞为干细胞，包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、成体干细胞，成体干细胞选自造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肝干细胞、肌肉卫星细胞、皮肤表皮干细胞、肠上皮干细胞、视网膜干细胞、胰腺干细胞等。
本发明所述的方法可以应用于遗传育种技术领域。
本发明另一目的在于公开一种平衡染色体动物模型的构建方法，本发明采用权利述方法获得具有平衡染色体ES细胞，将ES细胞注射到动物囊胚，获得染色体倒置成功的动物模型。
所述动物模型的构建方法，可以将具有平衡染色体但不含有可诱导重组系统的工具酶或其表达载体的ES细胞注射到动物囊胚，将繁育得到的动物与具有被可诱导重组系统的工具酶基因的转基因同种类动物配繁，获得外源性标签删除的平衡染色体动物模型。
所述动物可以为非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、犬、猴等。
本发明以小鼠17号染色体为例在染色体上靠近着丝粒及端粒的位置分别插入位点特异性重组酶系统识别位点，再经位点特异性重组酶诱导实现两位点特异性重组酶系统识别位点之间片段倒置，通过抗生素药物压力筛选方式获得倒置成功的胚胎干细胞株，进而通过遗传育种获得完整染色体倒置的平衡染色体小鼠品系。通过上述方案分别获得其他染色体倒置的小鼠，将这些小鼠Line通过配繁遗传育种的方式获得全部染色体倒置的小鼠品系Autosome Balancer mouse strain。
本发明的有益效果
本发明扩大了倒置染色体区域，可获得超过190Mb染色体区域的倒置。
本发明在染色体上靠近着丝粒及端粒的位置分别引入位点特异性重组酶系统识别位点，可获得整条染色体接近全部区域倒置。获得的平衡染色体小鼠品系，基本覆盖了小鼠多达99％的基因编码及非编码区域，可广泛用于几乎所有小鼠遗传突变的保护需求，具有广谱性。
本发明采取基因操作方案中，在倒置基因抗性标签外侧引入了转座子原件，在获得的平衡染色体小鼠后，可通过受精卵转座酶RNA显微注射、转座酶转基因小鼠配繁等方式去除平衡染色体两侧的抗性基因，获得无外源抗性标记的平衡染色体小鼠，避免抗性标记基因的同源性，影响平衡染色体保持恒定性的性能。
本发明获得的平衡染色体动物模型是遗传学角度筛选动物基因的突变并使其保持恒定的有力工具，可以在基因工程动物的培育过程中，帮助研究人员在动物种群中维持隐性致死、致病或不育突变。
附图说明
图1 平衡染色体(Balancer Chromosome)示意图。
图2 倒置的染色体交叉互换后产生的无着丝粒染色体和双着丝粒染色体。
图3 本发明制备平衡染色体小鼠技术原理图。
图4 本发明实施例平衡染色体F1代小鼠鉴定电泳图(Centromere端)。
图5 本发明实施例平衡染色体F1代小鼠鉴定电泳图(Telomere端)。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1：Chr.17染色体倒置小鼠建系
基于本申请人拥有的小鼠ES Cell line(来源于129S1/SvImJGpt)，首先进行Hprt基因敲除，获得Hprtnull ES细胞系，作为后续基因打靶操作的基础材料。然后，再次通过ES打靶方法，使用携带5’Hprt-loxP和3’Hprt-loxP的两个打靶载体同时打靶，分别插入17号染色体的端粒端和着丝粒端，筛选出双中靶的ES克隆。挑选双中靶ES克隆后电转Cre表达质粒诱导染色体倒置，(5’Hprt和3’Hprt能够组成完整的Hprt基因)，使用HAT培养基筛选出倒置成功的ES克隆，如图3。通过PCR、Southern blot后，将最终验证正确的ES克隆注射到C57BL/6JGpt小鼠囊胚，获得染色体倒置成功的小鼠。同时在抗性筛选标记外侧预留了PB转座子原件，后续获得的小鼠可以PB转座子转基因小鼠配繁，获得抗性基因删除的染色体倒置成功小鼠。
(1)采用Cas9介导的Hprt基因敲除ES cell line获取
设计针对小鼠X染色体Hprt基因序列的sgRNA。合成识别5’端靶位点和3’端靶位点的sgRNA序列，并构建sgRNA表达载体。两端sgRNA识别位点分别位于小鼠Hprt基因的Intron1的3’端和Intron2的5’端上。各sgRNA序列如下表所示：
表1 sgRNA信息
sgRNA名称 sgRNA序列(5’→3’)
Hprt-5S1 GCGUUUGUAACCCCAGCAUGG(SEQ ID No.5)
Hprt-3S1 AGAGCACUUGGGCACGCAUCAGG(SEQ ID No.6)
sgRNA转录制备方法：以PrimerStar Max体系(表4)，sgRNA-F、sgRNA-R为引物，测序正确的puc57-sgRNA质粒(1：30稀释)为模板进行PCR，PCR产物进行纯化，制备sgRNA转录制备模板。使用T7-ShortScript体外转录试剂盒(AM1354)进行sgRNA的转录。
电转染获取Hprt基因敲除ES cell line：将5’端靶位点和3’端靶位点sgRNA进行配对，组合成1对sgRNA(5S1/3S1)。将配对的sgRNA与Cas9蛋白进行孵育后，电转化入小鼠ES细胞内，进行低密度铺板培养后获取Hprt敲除的单克隆ES细胞：Hprtnull ES细胞系。
(2)近着丝粒(Centromere)区域loxP的插入及近端粒(Telomere)区域loxP的插入
选择piggyBac转座子的转座酶识别序列PB3’和PB5’作为删除外源序列的酶切识别位点。选择在Hprt序列的内含子区域将其分为两段包含编码区的片段作为正选择标记基因表达元件片段A和B。并选择neo-PGK和puro-PGK作为抗性筛选标记。设计片段1依次包括转座子PB识别序列3’、Hprt启动子、5’Hprt编码区、loxP、neo-PGK、反向PB3’，片段2依次包括反向转座子PB识别序列5’、反向3’Hprt编码区、反向loxP、puro-PGK、PB 5’。
Hprtnull ES细胞系的基础上，采用电转染的方式，在距离Chr.17着丝粒下游162kb位置插入片段1，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示(1-242bp为PB’3，243-2107bp为CAGpromoter序列，2108-2992bp为5’Hprt序列，2993-3026为loxP序列，3027-4729bp为PGK-Neo抗性标记，4752-4993bp为反向的PB3’)。在距离Chr.17端粒上游1.97Mb位置插入片段2，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示(1-314bp为反向PB转座子转座酶识别序列PB5’，405-2570bp为反向3’Hprt序列，2571-2604为反向loxP序列，3707-6218bp为PGK-Puro抗性标记，6219-6532bp为PB转座子转座酶识别序列PB5’)。获得中靶后的Centro-telo-double-loxP KI ES细胞系。
(3)获得Chr17正确倒置的小鼠
Cre表达介导loxP之间染色体区域倒置：参考文献(Shimshek,D.R.et al."Codon-Improved Cre Recombinase(Icre)Expression in the Mouse."genesis,vol.32,no.1,2002,pp.19-26)构建iCre表达质粒，在Centro-telo-double-loxP KI ES细胞系基础上，采用电转染的方式将iCre表达质粒转化入细胞，并且表达iCre蛋白，促使Centromere端的loxP与Telomere端的loxP重组，使用HAT药物筛选杀死未正确重组的细胞，获得正确倒置的Chr17-inverted ES细胞系。
倒置后的Centromere端DNA序列为SEQ ID No.3所示，序列如下：1-242bp为PB3’，243-2107bp为CAG promoter序列，2108-2992bp为5’Hprt序列，2993-3026为loxP序列，3027-5192bp为3’Hprt序列，和5283-5596bp为PB转座子序列5’，可在Transposase转座酶作用下可删除中间的Hprt抗性基因及loxP位点。
倒置后的Telomere端DNA序列为SEQ ID No.4，序列如下：1-242bp为PB3’，265-1967bp为PGK-Neo抗性片段，1968-2001为反向loxP序列，3104-5615bp为PGK-Puro抗性片段，5616-5929bp为PB5’。可在Transposase转座酶作用下删除中间的Neo抗性、Puro抗性及loxP位点。
将Chr17-inverted ES细胞注射到C57BL6/JGpt小鼠囊胚中，移植至2.5天假孕雌鼠体内，待小鼠出生后，观察毛色呈灰色为嵌合小鼠(F0)。F0小鼠与129S1/SvImJGpt小鼠配繁，获得子代小鼠(F1)进行鼠尾DNA鉴定，确认获得带有两端抗性标签的Chr.17染色体倒置成功的小鼠。
Chr.17染色体倒置成功F1基因型鉴定。对获得的F1鼠的鼠尾基因组DNA分别使用两对引物进行倒置后的Centromere端与Telomere端PCR鉴定，引物Chr17-inverted-centro-tF3/Chr17-inverted-centro-tR1分别位于5’Hprt和3’Hprt片段上，如该对引物扩增产生PCR产物，说明Centromere端正确倒置，5’Hprt和3’Hprt在倒置后正确连接成完整Hprt基因；Chr17-inverted-telo-tF1/Chr17-inverted-telo-tR1分别位于Neo和Puro片段上，如该对引物扩增产生PCR产物，说明Telomere端正确倒置，Neo片段由倒置前在Centromere端变为倒置后在Telomere端。
表2 F1鉴定引物
Figure BDA0002474349560000081
PCR反应体系以及反应条件如下表所示：
表3 PCR反应体系
试剂(Takara R045) 体积(μl) 规格
PrimeSTAR Max Premix(2×) 12.5 \
ddH2O 9.5 \
Primer 1 10μM
Primer 1 10μM
Template 1
表4 PCR反应条件
Figure BDA0002474349560000091
结果：获得4只阳性F0小鼠。如图4和图5所示。图4为17号染色体倒置F1代小鼠鉴定(Centromere端)结果。图中11-60为此编号F1小鼠鼠尾DNA为模板进行PCR；B6为阴性对照，是以129Sv小鼠鼠尾DNA为模板进行PCR；N为空白对照，无模板的对照；P为阳性质粒对照；TRANS2K PLUS II条带：8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。图5为17号染色体倒置F1代小鼠鉴定(Telomere端)结果。图中，11-60为此编号F1小鼠鼠尾DNA为模板进行PCR；B6为阴性对照，是以129Sv小鼠鼠尾DNA为模板进行PCR；N为空白对照，无模板的对照；P为阳性质粒对照；TRANS2K PLUS II条带：8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。
Chr.17inverted F1代鼠尾DNA鉴定电泳图结果表明10-14#、16#、18-20#、23#、24#、27#、30#、32#、33#、35#、36#、38#、40#、42#、44#、45#、50#、51#、53#、60#小鼠的Centromere端与Telomere端鉴定均为阳性，表明小鼠的17号染色体存在正确倒置。
在两端抗性标签的Chr.17染色体倒置成功的小鼠性成熟后，将其与转座子Transposase转基因小鼠进行配繁，子代小鼠在转座酶的作用下，倒置的17号染色体两端PB5’和PB3’元件之间的抗性标记将会删除。该子代小鼠大量互配，将获得外源抗性标签完成删除的Chr.17倒置纯合子小鼠。
实施例2：Chr.17染色体倒置小鼠维持小鼠基因突变并使其保持恒定
本实施例用于验证染色体倒置的小鼠是否能够有效减少同源重组带来的突变交换，维持突变基因的稳定。在获得Chr17染色体倒置纯合子小鼠(为129S1/SvImJGpt背景)基础上，将该小鼠与其他已知SNP位点突变的近交系小鼠(如DBA/1，Balb/C等)配繁，获得F1杂合子后，将F1杂合子回交到原背景，检测F2代杂合小鼠的SNP位点，可获得突变交换的数据。
分析Chr17染色体倒置小鼠于DBA/1和Balb/C两个背景的配繁数据，其交换概率分别为0.137与0.124，远低于Jax Lab报道的正常小鼠基因重组率(17号染色体重组率根据位点差异性在0.5-1.5之间(Cox,A.,et al.,A new standard genetic map for thelaboratory mouse.
Genetics,2009.182(4):p.1335-1344.))。
(1)基于DBA/1背景小鼠的验证
将Chr17染色体倒置纯合子小鼠与DBA/1背景近交系小鼠配繁，获得倒置F1杂合子后，将F1杂合子回交到原背景，获得F2代杂合小鼠。选择了25个在DBA/1背景和129S1/SvImJGpt背景上碱基不相同的SNP位点，在F2杂合子上检测该25个SNP位点：若F2代SNP位点为杂合，认定为突变未发生同源重组交换；若F2代SNP位点为纯合子，无论是DBA/1纯合SNP还是129S1/SvImJGpt纯合SNP，均认定为突变发生了同源重组交换。共检测了59只F2杂合子，获得的数据如下表5。结果表明倒置后的17号染色体与DBA/1来源的正向17号染色体发生重组的概率降低，检测平均重组率为0.1374。
(2)基于Balb/C背景小鼠的验证
将Chr17染色体倒置纯合子小鼠与Balb/C背景近交系小鼠配繁，获得倒置F1杂合子后，将F1杂合子回交到原背景，获得F2代杂合小鼠。选择了17个在Balb/C背景和129S1/SvImJGpt背景上碱基不相同的SNP位点，在F2杂合子上检测该17个SNP位点：若F2代SNP位点为杂合，认定为突变未发生同源重组交换；若F2代SNP位点为纯合子，无论是Balb/C纯合SNP还是129S1/SvImJGpt纯合SNP，均认定为突变发生了同源重组交换。共检测了30只F2杂合子，获得的数据如下表5。结果表明倒置后的17号染色体与Balb/C来源的正向17号染色体发生重组的概率降低，检测平均重组率为0.124。
表5 重组效率统计
Figure BDA0002474349560000101
序列表
<110> 江苏集萃药康生物科技有限公司
<120> 一种平衡染色体动物模型的构建方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4993
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg cgtaaaattg 60
acgcatgtgt tttatcggtc tgtatatcga ggtttattta ttaatttgaa tagatattaa 120
gttttattat atttacactt acatactaat aataaattca acaaacaatt tatttatgtt 180
tatttattta ttaaaaaaaa acaaaaactc aaaatttctt ctataaagta acaaaacttt 240
tacgccggct agcatctgta gggcgcagta gtccagggtt tccttgatga tgtcatactt 300
atcctgtccc ttttttttcc acagctcgcg gttgaggaca aactcttcgc ggtctttcca 360
gtggttaatt aagtcgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt 420
cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc 480
ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag 540
taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc 600
acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg 660
gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc 720
agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct 780
tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt attttttaat 840
tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg 900
cgaggggcgg ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct 960
ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc 1020
gcggcgggcg ggagtcgctg cgcgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc 1080
gcgccgcccg ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg 1140
cccttctcct ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg 1200
gctgcgtgaa agccttgagg ggctccggga gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg 1260
gggtgcgtgc gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc ggctccgcgc tgcccggcgg 1320
ctgtgagcgc tgcgggcgcg gcgcggggct ttgtgcgctc cgcagtgtgc gcgaggggag 1380
cgcggccggg ggcggtgccc cgcggtgcgg ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt 1440
gcggggtgtg tgcgtggggg ggtgagcagg gggtgtgggc gcgtcggtcg ggctgcaacc 1500
ccccctgcac ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg 1560
tacggggcgt ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc 1620
gggcggggcg gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg 1680
gagcgccggc ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg 1740
cgagagggcg cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat ctgggaggcg 1800
ccgccgcacc ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat 1860
gggcggggag ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg 1920
gggctgtccg cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt 1980
ctggcgtgtg accggcggct ctagagcctc tgctaaccat gttcatgcct tcttcttttt 2040
cctacagctc ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct catcattttg gcaaagaatt 2100
cctcgagggg ggtcttgctg cgcctccgcc tcctcctctg ctccgccacc ggcttcctcc 2160
tcctgagcag tcagcccgcg cgccggccgg ctccgttatg gcgacccgca gccctggcgt 2220
cgtgattagt gatgatgaac caggttatga ccttgattta ttttgcatac ctaatcatta 2280
tgctgaggat ttggaaaggg tgtttattcc ccatggacta attatggaca ggtaagtaag 2340
atcttaaaat gaggtttttt actttttctt gtgttaattt caaacatcag cagctgttct 2400
gagtacttgc tatttgaaca taaactaggc caacttatta aataactgat gctttctaaa 2460
atcttcttta ttaaaaataa aagaggaggg ccttactaat tacttagtat cagttgtggt 2520
atagtgggac tctgtaggga ccagaacaaa gtaaacattg aagggagatg gaagaaggaa 2580
ctctagccag agtcttgcat ttctcagtcc taaacagggt aatggactgg ggctgaatca 2640
catgaaggca aggtcagatt tttattatta tgcacatcta gcttgaaaat tttctgttaa 2700
gtcaattaca gtgaaaaacc ttacctggta ttgaatgctt gcattgtatg tctggctatt 2760
ctgtgttttt attttaaaat tataatatca aaatatttgt gttataaaat attctaacta 2820
tggaggccat aaacaagaag actaaagttc tctcctttca gccttctgta cacatttctt 2880
ctcaagcact ggctatgcat gtatactata tgcaaaagta catatataca tttatatttt 2940
aacgtatgag tatagtttta aatgttattg gacactttta atattagtgt gttaccgttc 3000
gtataatgta tgctatacga agttattaag ggttccgcaa gctctagtcg agccccagct 3060
ggttctttcc gcctcagaag ccatagagcc caccgcatcc ccagcatgcc tgctattgtc 3120
ttcccaatcc tcccccttgc tgtcctgccc caccccaccc cccagaatag aatgacacct 3180
actcagacaa tgcgatgcaa tttcctcatt ttattaggaa aggacagtgg gagtggcacc 3240
ttccagggtc aaggaaggca cgggggaggg gcaaacaaca gatggctggc aactagaagg 3300
cacagtcgag gctgatcagc gagctctaga gaattgatcc cctcagaaga actcgtcaag 3360
aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa 3420
gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc 3480
ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt 3540
ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat catcgccgtc 3600
gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc 3660
gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg 3720
atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca gccgccgcat 3780
tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg 3840
ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagcac 3900
agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct cgtcctgcag 3960
ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc cctgcgctga 4020
cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt catagccgaa 4080
tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt caatggccga 4140
tcccatggtt tagttcctca ccttgtcgta ttatactatg ccgatatact atgccgatga 4200
ttaattgtca acaggctgca ggtcgaaagg cccggagatg aggaagagga gaacagcgcg 4260
gcagacgtgc gcttttgaag cgtgcagaat gccgggcctc cggaggacct tcgggcgccc 4320
gccccgcccc tgagcccgcc cctgagcccg cccccggacc caccccttcc cagcctctga 4380
gcccagaaag cgaaggagca aagctgctat tggccgctgc cccaaaggcc tacccgcttc 4440
cattgctcag cggtgctgtc catctgcacg agactagtga gacgtgctac ttccatttgt 4500
cacgtcctgc acgacgcgag ctgcggggcg ggggggaact tcctgactag gggaggagta 4560
gaaggtggcg cgaaggggcc accaaagaac ggagccggtt ggcgcctacc ggtggatgtg 4620
gaatgtgtgc gaggccagag gccacttgtg tagcgccaag tgcccagcgg ggctgctaaa 4680
gcgcatgctc cagactgcct tgggaaaagc gcctccccta cccggtagaa tttcgacgac 4740
ctgcagccaa gtaaaagttt tgttacttta tagaagaaat tttgagtttt tgtttttttt 4800
taataaataa ataaacataa ataaattgtt tgttgaattt attattagta tgtaagtgta 4860
aatataataa aacttaatat ctattcaaat taataaataa acctcgatat acagaccgat 4920
aaaacacatg cgtcaatttt acgcatgatt atctttaacg tacgtcacaa tatgattatc 4980
tttctagggt taa 4993
<210> 2
<211> 6532
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttaaccctag aaagatagtc tgcgtaaaat tgacgcatgc attcttgaaa tattgctctc 60
tctttctaaa tagcgcgaat ccgtcgctgt gcatttagga catctcagtc gccgcttgga 120
gctcccgtga ggcgtgcttg tcaatgcggt aagtgtcact gattttgaac tataacgacc 180
gcgtgagtca aaatgacgca tgattatctt ttacgtgact tttaagattt aactcatacg 240
ataattatat tgttatttca tgttctactt acgtgataac ttattatata tatattttct 300
tgttatagat atcaattgca gatccggctg gttctttccg cctcagaagg tacttttttt 360
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttaaattt ttgggaattt 420
attgatttgc atttaaaagg gaactgctga caaagattca ctggtaataa tttgaacaag 480
ttggaaaata cagtcaacat tactgaaaca ctactaaaat aattccagga cagaacaaaa 540
cttcttagat gctgtctttg atgtgaaaat tgactgcttc ttacttttct aacacacggt 600
ggtataatta acaatattca atcacttcta ttctttcctg catatataaa aattaaaata 660
ccaattaaaa aactaatata tcttctcttt atttcttaca gatatgagtt caatgtttca 720
ctcaatagtg ctgtggttta agagaatttt ttcatttaca agttaaacaa caatccgccc 780
aaagggaact gatagtctat aggctcatag tgcaaataaa cagtttagga atgcagcaac 840
tgacatttct aaagtacaaa acagataaaa ttcttagaag atacatgcaa aaagctctac 900
taagcagatg gccacagaac tagaacattg ataattttac tggcgatgtc aataggactc 960
cagatgtttc caaactcaac ttgaactctc atcttaggct ttgtattttg cttttccagt 1020
ttcactaatg acacaaacat gattcaaatc cctgaagtat tcattatagt caagggcata 1080
tcctacaaca aacttgtctg gaatttcaaa tccaacaaag tctggcttat atccaacact 1140
tcgtggggtc cttttcacca gcaagcttgc gaccttgacc atctttggat tatactgcct 1200
gaccaaggaa agcaaagtct gcattgtttt gccagtgtca attatatctt ccacaatcaa 1260
gacattcttt ccagttaaag ttgagagatc atctccacca attactttta tgtcccctgt 1320
tgactggtca ttacaatagc tcttcagtct gataaaatct acagtcatag gaatggatct 1380
atcactattt ctattcagtg ctttgatgta atccagcagg tcagcaaaga atttatagcc 1440
ccccttgagc acacagaggg ctacaatgtg atggcctccc atctccttca tcacatctcg 1500
agcaagacgt tcagtcctac agaaataaaa tcaggaattt aatagaaagt ttcatacatt 1560
aaactttata acaaacacct cttagtcatt aaacttccac accaacctgg gcaatatagt 1620
gagaccccat gcctgcaaaa aaaaaaaaat tagccaggca tggtagcatg tacctgtagt 1680
cccagctact tgagaggtga ggtgggaaaa tcactttagt gcaggatgtt gaggctggag 1740
tgaactgtga ttgtgccact gcactccagc ctggacaata gagcaagacc ttgtctcaaa 1800
aaaatgcatt aaaaattttt tttaaatctt ccacgtaaca catcctttgc cctcatgttt 1860
cataaggtaa aaaatttgat accttcaaaa aaaccaagca taccactatc ataatttttt 1920
ttaaatgcaa ataaaaacaa gataccattt tcacctatca gactggcagg ttctgattaa 1980
atgaaatttc ttggataata tacaatatta agagagactg tagaaactgg gccagtggct 2040
catgcctgta atcccagcac tttgggaggc tgggtaacat ggcgaaccct gtttctacaa 2100
aataaaaata ttagctggga gtggtggcgc acacctatag tcccagctac tcaggaggct 2160
gaggtggaag gatcgcttga acccaggagg ttgagactgc agtgaactgt gatcattctg 2220
ctgcactgca ccccagcctg ggcaacagag accttgtctc aaaaaaaaaa aaaaaagaga 2280
caaattgtga agagaaaggt actctcatat aacatcagga gtataaaatg attcaacttc 2340
ttagaggaaa atttggcaat accaaaatat tcaataaact ctttcccctt gacccagaaa 2400
ttccacttga ataaagctga acaagtacca aacatgtaaa agaatgtttc ttctagtaca 2460
gtcggtaaga acaaaatagt gtctatcaat agtggactgg ttaaatcagt tatggtatct 2520
ccataagaca gaatgctatg caacctttaa aatatattag atagctctag taccgttcgt 2580
atagcataca ttatacgaag ttatcattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc 2640
tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga aaaagcctga actcaccgcg 2700
acgtctgtcg agaagtttct gatcgaaaag ttcgacagcg tctccgacct gatgcagctc 2760
tcggagggcg aagaatctcg tgctttcagc ttcgatgtag gagggcgtgg atatgtcctg 2820
cgggtaaata gctgcgccga tggtttctac aaagatcgtt atgtttatcg gcactttgca 2880
tcggccgcgc tcccgattcc ggaagtgctt gacattgggg aattcagcga gagcctgacc 2940
tattgcatct cccgccgtgc acagggtgtc acgttgcaag acctgcctga aaccgaactg 3000
cccgctgttc tgcagccggt cgcggaggcc atggatgcga tcgctgcggc cgatcttagc 3060
cagacgagcg ggttcggccc attcggaccg caaggaatcg gtcaatacac tacatggcgt 3120
gatttcatat gcgcgattgc tgatccccat gtgtatcact ggcaaactgt gatggacgac 3180
accgtcagtg cgtccgtcgc gcaggctctc gatgagctga tgctttgggc cgaggactgc 3240
cccgaagtcc ggcacctcgt gcacgcggat ttcggctcca acaatgtcct gacggacaat 3300
ggccgcataa cagcggtcat tgactggagc gaggcgatgt tcggggattc ccaatacgag 3360
gtcgccaaca tcttcttctg gaggccgtgg ttggcttgta tggagcagca gacgcgctac 3420
ttcgagcgga ggcatccgga gcttgcagga tcgccgcggc tccgggcgta tatgctccgc 3480
attggtcttg accaactcta tcagagcttg gttgacggca atttcgatga tgcagcttgg 3540
gcgcagggtc gatgcgacgc aatcgtccga tccggagccg ggactgtcgg gcgtacacaa 3600
atcgcccgca gaagcgcggc cgtctggacc gatggctgtg tagaagtact cgccgatagt 3660
ggaaaccgac gccccagcac tcgtccgagg gcaaaggaat agctgtaagg gttccgcaag 3720
ctctagtcga gccccagctg gttctttccg cctcagaagc catagagccc accgcatccc 3780
cagcatgcct gctattgtct tcccaatcct cccccttgct gtcctgcccc accccacccc 3840
ccagaataga atgacaccta ctcagacaat gcgatgcaat ttcctcattt tattaggaaa 3900
ggacagtggg agtggcacct tccagggtca aggaaggcac gggggagggg caaacaacag 3960
atggctggca actagaaggc acagtcgagg ctgatcagcg agctctagag ctcagttagc 4020
ctcccccatc tcccgggcaa acgtgcgcgc caggtcgcag atcgtcggta tggagccggg 4080
ggtggtgacg tgggtctgga ccatcccgga ggtaagttgc agcagggcgt cccggcagcc 4140
ggcgggcgat tggtcgtaat ccaggataaa gacgtgcatg ggacggaggc gtttggccaa 4200
gacgtccaag gcccaggcaa acacgttgta caggtcgccg ttgggggcca gcaactcggg 4260
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agagcacuug ggcacgcauc agg 23
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aattacttag tatcagttgt ggtatagt 28
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cactttggga ggctgggtaa cat 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acggcgatga tctcgtcgtg acc 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttgccagtga tacacatggg gat 23
<210> 11
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggtgccca agaagaagag gaaagtctcc aacctgctga ctgtgcacca aaacctgcct 60
gccctccctg tggatgccac ctctgatgaa gtcaggaaga acctgatgga catgttcagg 120
gacaggcagg ccttctctga acacacctgg aagatgctcc tgtctgtgtg cagatcctgg 180
gctgcctggt gcaagctgaa caacaggaaa tggttccctg ctgaacctga ggatgtgagg 240
gactacctcc tgtacctgca agccagaggc ctggctgtga agaccatcca acagcacctg 300
ggccagctca acatgctgca caggagatct ggcctgcctc gcccttctga ctccaatgct 360
gtgtccctgg tgatgaggag aatcagaaag gagaatgtgg atgctgggga gagagccaag 420
caggccctgg cctttgaacg cactgacttt gaccaagtca gatccctgat ggagaactct 480
gacagatgcc aggacatcag gaacctggcc ttcctgggca ttgcctacaa caccctgctg 540
cgcattgccg aaattgccag aatcagagtg aaggacatct cccgcaccga tggtgggaga 600
atgctgatcc acattggcag gaccaagacc ctggtgtcca cagctggtgt ggagaaggcc 660
ctgtccctgg gggttaccaa gctggtggag agatggatct ctgtgtctgg tgtggctgat 720
gaccccaaca actacctgtt ctgccgggtc agaaagaatg gtgtggctgc cccttctgcc 780
acctcccaac tgtccacccg ggccctggaa gggatctttg aggccaccca ccgcctgatc 840
tatggtgcca aggatgactc tgggcagaga tacctggcct ggtctggcca ctctgccaga 900
gtgggtgctg ccagggacat ggccagggct ggtgtgtcca tccctgaaat catgcaggct 960
ggtggctgga ccaatgtgaa catagtgatg aactacatca gaaacctgga ctctgagact 1020
ggggccatgg tgaggctgct cgaggatggg gactga 1056

Claims (18)

1.一种平衡染色体的构建方法，其特征在于使用位点特异性重组酶系统介导的位点特异性重组技术，在染色体着丝粒侧插入片段1，包括位点特异性重组酶系统一侧识别位点，该位点的上游具有正选择标记基因表达元件片段A，在端粒侧引入片段2，包括位点特异性重组酶系统另侧识别位点，该位点的上游具有反向的正选择标记基因表达元件片段B，经位点特异性重组酶诱导实现两个位点之间的序列倒置，正选择标记基因表达元件片段A和B组合实现正选择标记基因的表达，利用正负筛选法筛选得到平衡染色体。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述位点特异性重组酶系统选自Cre/loxP重组系统、转座子重组系统、Gateway重组系统、FLP/FRT重组系统或Dre/Rox重组系统中的一种或几种。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于片段1插入位置位于着丝粒序列下游0-50Mbp处，片段2插入位置位于端粒序列上游0-50Mbp处。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述正选择标记基因表达元件片段A和B为正选择标记基因表达元件分割得到的两个基因片段，两个位点特异性重组酶系统识别位点之间的序列倒置后，片段1的位点特异性重组酶系统识别位点位于正选择标记基因表达元件两个片段之间，不影响正选择标记基因的表达。
5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述正选择标记基因选自Neo、Hph、Gpt、Hprt、Tk或Puro。
6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述片段1的5’端和3’端分别具有正向和反向的被可诱导重组系统工具酶识别的单侧序列，所述片段2的5’端和3’端分别具有反向和正向的被可诱导重组系统工具酶识别的另一侧序列，当两个位点特异性重组酶系统识别位点之间的序列倒置后，片段2的5’端和片段1的3’端的可诱导重组系统工具酶识别序列随着染色体倒置，分别与所述片段1的5’端和片段2的3’端的可诱导重组系统工具酶识别序列形成两组酶切位点，被可诱导重组系统工具酶识别、切割，并使染色体剩余序列拼接成整体。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于所述可诱导重组系统选自Cre/loxP重组系统、转座子重组系统、Gateway重组系统、FLP/FRT重组系统、Dre/Rox重组系统。
8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于所述可诱导重组系统选自转座子重组系统，被可诱导重组系统工具酶识别的序列为piggyBac转座子的转座酶识别序列。
9.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述片段1的位点特异性重组酶系统一侧位点和片段2的位点特异性重组酶系统另侧位点的下游还包括与正选择标记基因表达元件不同的抗性筛选标记，选自Neo、Hph、Gpt、Hprt、Tk或Puro，以及所述不同的抗性筛选标记相应的启动子。
10.如权利要求1-9任一项所述的构建方法，其特征在于使用Cre/LoxP系统介导的位点特异性重组技术，在染色体着丝粒侧插入片段1，包括loxP位点，loxP位点的上游具有正选择标记基因表达元件片段A，在端粒侧引入片段2，包括反向的loxP位点，反向的loxP位点的上游具有反向的正选择标记基因表达元件片段B，经Cre工具酶诱导实现两个loxP位点之间的序列倒置，正选择标记基因表达元件片段A和B组合实现正选择标记基因的表达，利用正负筛选法筛选得到平衡染色体。
11.如权利要求10所述的构建方法，其特征在于所述Cre工具酶为iCre，核苷酸序列如SEQ ID No：11所示。
12.如权利要求10所述的构建方法，其特征在于所述片段1依次包括piggyBac转座子的转座酶识别序列PB3’/PB5’、Hprt启动子、5’Hprt编码区、loxP、neo及其启动子、反向piggyBac转座子的转座酶识别序列PB3’/PB5’，片段2依次包括反向piggyBac转座子的转座酶识别序列PB5’/PB3’、3’Hprt编码区、反向loxP、puro及其启动子、piggyBac转座子的转座酶识别序列PB5’/PB3’，采用HAT筛选得到平衡染色体。
13.如权利要求12所述的构建方法，其特征在于所述片段1的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，所述片段2的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
14.一种具有平衡染色体细胞的构建方法，其特征在于首先构建正选择标记基因敲除的细胞，通过基因打靶技术，采用权利要求1-13任一项所述的方法获得具有平衡染色体的细胞。
15.如权利要求14所述的构建方法，其特征在于还包括向细胞给予被可诱导重组系统的工具酶或其表达载体。
16.一种平衡染色体动物模型的构建方法，其特征在于采用权利要求14或15所述方法获得具有平衡染色体ES细胞，将ES细胞注射到动物囊胚，获得染色体倒置成功的动物模型。
17.如权利要求16所述的构建方法，其特征在于采用权利要求14所述方法获得具有平衡染色体ES细胞，将ES细胞注射到动物囊胚，将繁育得到的动物与具有被可诱导重组系统的工具酶基因的转基因同种类动物配繁，获得外源性标签删除的平衡染色体动物模型。
18.如权利要求16或17所述的构建方法，其特征在于所述动物选自小鼠、大鼠、兔、犬、猴。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6077667A (en) * 1996-06-26 2000-06-20 Bradley; Allan Method for chromosomal rearrangement by consecutive gene targeting of two recombination substrates to the deletion endpoints
US20010032340A1 (en) * 1999-12-27 2001-10-18 Chengyu Liu Controlling offspring's sex ratio by targeting transgenes onto the sex chromosomes
CN104651402A (zh) * 2015-03-18 2015-05-27 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 通用型基因打靶载体
CN106755092A (zh) * 2016-11-29 2017-05-31 中南大学湘雅医院 GLCCI1基因基于Cre‑LoxP条件性基因敲除小鼠模型构建试剂盒及构建方法
CN109504708A (zh) * 2018-12-03 2019-03-22 江苏集萃药康生物科技有限公司 一种筛选标记自我删除的基因打靶载体及方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6077667A (en) * 1996-06-26 2000-06-20 Bradley; Allan Method for chromosomal rearrangement by consecutive gene targeting of two recombination substrates to the deletion endpoints
US20010032340A1 (en) * 1999-12-27 2001-10-18 Chengyu Liu Controlling offspring's sex ratio by targeting transgenes onto the sex chromosomes
CN104651402A (zh) * 2015-03-18 2015-05-27 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 通用型基因打靶载体
CN106755092A (zh) * 2016-11-29 2017-05-31 中南大学湘雅医院 GLCCI1基因基于Cre‑LoxP条件性基因敲除小鼠模型构建试剂盒及构建方法
CN109504708A (zh) * 2018-12-03 2019-03-22 江苏集萃药康生物科技有限公司 一种筛选标记自我删除的基因打靶载体及方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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张霖等: "位点特异性重组系统的机理和应用", 《中国科学:生命科学》 *

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