CN115948397A - 一种靶向敲除鸡TET2基因的sgRNA及CRISPR/Cas9系统与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向敲除鸡TET2基因的sgRNA及CRISPR/Cas9系统与应用，所述sgRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑4任一所示，本发明还公开了靶向敲除鸡TET2基因的CRISPR‑Cas9系统，以及该系统在敲除鸡TET2基因的细胞株中的应用。本发明通过CRISPR‑Cas9技术首次靶向敲除鸡巨噬细胞系(HD11)的TET2基因，适用于较难转染和抗生素筛选敏感的免疫细胞，且确保了细胞中不含有转基因片段，同时发现敲除TET2基因的HD11细胞具有免疫抑制特征，为鸡免疫抑制机制的研究提供了理想模型。

Description

一种靶向敲除鸡TET2基因的sgRNA及CRISPR/Cas9系统与应用

技术领域

本发明为细胞生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种靶向敲除鸡TET2基因的sgRNA及CRISPR/Cas9系统与应用。

背景技术

TET2是一个表观遗传调控因子，主要催化DNA发生羟甲基化反应，被认为是细胞内源性的DNA去甲基化酶。研究表明，TET2基因在造血系统中发挥重要的生物学作用，还参与调控免疫细胞成熟和活化等过程。巨噬细胞作为免疫系统的一部分，是参加炎症反应的中心细胞，具有吞噬，分泌和抗原呈递等作用。而鸡TET2基因在调节巨噬细胞生物学功能的作用还未被阐明。

CRISPR，全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats(规律成簇的间隔短回文重复由众多短而保守的重复序列)，与CRISPR-associatedprotein(Cas)，共同组成了细菌抵抗噬菌体侵染的特异性免疫系统。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身DNA里。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存贮的DNA片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。CRISPR/Cas9作为Ⅱ型CRISPR/Cas系统，通过人工设计的sgRNA(single-guide RNA)来识别目的基因组序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割DNA双链，形成双链断裂，从而启动细胞内的DNA损伤修复机制，造成基因敲除或敲入，最终达到对基因组DNA进行编辑的目的。

目前，CRISPR/Cas9基因敲除技术已被用于多种模式动物的基因敲除，但该技术在禽类免疫细胞中的基因敲除的应用仍鲜有报道。鸡巨噬细胞系HD11是难转染细胞系，且对抗性筛选较为敏感，采用CRISPR/Cas9技术加抗性筛选的方法难以获得基因编辑细胞，主要原因在于抗性筛选敏感，加入抗生素时会导致细胞活力变差，细胞很容易死，也是当前在巨噬细胞系敲除基因报道较少的原因之一。目前，用HD11细胞系进行相关基因研究时，普遍采用RNA干扰技术，其主要缺点是只能敲低基因表达且效率低下，不适于长期基因抑制研究。因此，有必要针对HD11细胞的特点，探究一种适合在HD11细胞上进行基因敲除的方法，以解决上述传统方法带来的缺陷，为在HD11细胞上研究鸡免疫学相关机制奠定基础。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种靶向敲除鸡TET2基因的sgRNA，利用该sgRNA获得的鸡TET2基因敲除的巨噬细胞系，有利于TET2基因在调节巨噬细胞生物学功能的研究。

本发明还提供一种靶向敲除鸡TET2基因的CRISPR-Cas9系统。

技术方案：为了实现上述目的，本发明提供了一种靶向敲除鸡TET2基因的sgRNA，所述sgRNA在CRISPR-Cas9系统中能够以鸡TET2基因组的特定位点为靶序列进行DNA序列的编辑，所述sgRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4任一所示。

作为优选，所述sgRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述sgRNA表达载体，所述sgRNA表达载体构建方法包括如下步骤：

(1)使用BbsI酶切pEX-A-U6-sgRNA载体，得到酶切后的表达载体；

(2)将权利要求1所述的sgRNA，经退火行程短双链DNA与酶切后的质粒连接，得到靶向敲除鸡TET2基因的sgRNA表达载体pEX-A-U6-TET2-sgRNA。

作为优选，在sgRNA序列5’端前部添加caccg，同时合成sgRNA互补的寡核苷酸，并在5’端添加aaac，3’端添加c，形成带有粘性末端的短双链DNA；将所述短双链DNA与酶切后的质粒连接，转入感受态细胞，克隆后测序，得到靶向敲除鸡TET2基因的sgRNA表达载体。

本发明所述靶向敲除鸡TET2基因的CRISPR-Cas9系统，其含有所述的靶向敲除鸡TET2基因的sgRNA的DNA序列。

进一步地，所述CRISPR-Cas9系统包括靶向敲除鸡TET2基因的sgRNA表达载体pEX-A-U6-TET2-sgRNA和Cas9-T2A-GFP质粒。

本发明所述的sgRNA或者所述的sgRNA表达载体或者所述的CRISPR-Cas9系统在制备敲除TET2基因的细胞系中的应用。

本发明所述靶向敲除鸡TET2基因的细胞系，将所述的靶向敲除鸡TET2基因的CRISPR/Cas9系统转染目的细胞得到的。

进一步地，将高切割活性的靶向敲除鸡TET2基因的sgRNA表达载体pEX-A-U6-TET2-sgRNA和Cas9-T2A-GFP质粒共转染鸡巨噬细胞系HD11，转染后经流式细胞分选，获得GFP表达阳性细胞系，稀释细胞以获取单克隆细胞株进行培养得到靶向敲除鸡TET2基因的巨噬细胞系。

作为优选，本发明用于靶向敲除鸡TET2基因的CRISPR/Cas9系统在构建靶向敲除TET2基因的鸡巨噬细胞系HD11中的应用。

进一步地，所述应用的过程包括如下步骤：

(1)sgRNA表达载体的构建、转化、筛选、PCR鉴定及测序验证；

(2)将(1)中构建的sgRNA表达载体pEX-A-U6-TET2-sgRNA与Cas9-T2A-GFP共转染DF-1细胞；

(3)转染48h后，提取基因组DNA，用PCR鉴定引物扩增序列，退火后用T7E1酶切，进行琼脂糖电泳检测sgRNA切割效率；

(4)将高切割活性的表达载体pEX-A-U6-TET2-sgRNA和Cas9-T2A-GFP质粒共转染HD11细胞，48h后进行流式细胞分选，获得GFP表达阳性细胞，并通过有限稀释法获取单克隆细胞进行培养。

作为优选，本发明中分别设计了4组sgRNA，进行筛选较高切割效率的sgRNA，包括TET2-sgRNA1、TET2-sgRNA2、TET2-sgRNA3、TET2-sgRNA4，所述sgRNA核苷酸序列分别如SEQID NO.1-4所述；

进一步地，本发明获取的高切割效率的sgRNA为TET2-sgRNA2，其序列如AAAGGTCAGGGCTAATGCGG。

进一步地，上述步骤(4)中，将GFP阳性细胞进行稀释并进行单克隆筛选；取少量筛选的单克隆细胞提取DNA，通过步骤(1)中PCR鉴定引物扩增后，进行DNA测序鉴定。将测序鉴定发生基因编辑的细胞，进行扩大培养传代保存，从而获得敲除TET2基因的稳定传代的鸡巨噬细胞系。

本发明中采用的转染目的细胞株为鸡巨噬细胞系HD11。

本发明所述的靶向敲除鸡TET2基因的巨噬细胞系在制备TET2基因参与鸡巨噬细胞功能作用研究的细胞模型上的应用。

本发明所述的靶向敲除鸡TET2基因的巨噬细胞系在制备TET2介导的鸡免疫抑制机制研究的细胞模型上的应用。

本发明设计的靶向敲除鸡TET2基因的sgRNA及CRISPR/Cas9系统可以进一步制备成试剂盒，并运用在制备家禽的免疫抑制模型中，制备得到的免疫抑制细胞模型，可以用于病毒的传代培养，特别在免疫、药品与生物制品的安全性评价及有效药物的临床筛选方法具有重要的应用价值。

进一步地，本发明的试剂盒适用于较难转染和抗生素筛选敏感的免疫细胞，同时本发明靶向敲除鸡TET2基因使鸡巨噬细胞HD11免疫相关基因全面下调。

本发明基于CRISPR/Cas9技术，针对鸡TET2基因的两种剪切形式的共有外显子设计sgRNA并连接至pEX-A-U6-sgRNA载体；首先在鸡胚成纤维细胞DF-1中筛选出高切割效率的sgRNA，然后在鸡巨噬细胞(HD11)中利用这个sgRNA介导的CRISPR/Cas9系统，通过流式细胞仪筛选，经有限稀释法获得敲除TET2基因的单克隆细胞。该系统操作简单，适用于较难转染和抗生素筛选敏感的免疫细胞。本发明首次发现所构建的TET2基因敲除的HD11细胞株具有免疫抑制特征，可用于研究鸡TET2在免疫细胞中的生物学功能。同时本发明所构建的敲除细胞系使鸡巨噬细胞免疫相关基因全面下调，导致明显的免疫抑制，可用作鸡免疫抑制的细胞模型。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

(1)本发明通过CRISPR-Cas9技术首次靶向敲除鸡巨噬细胞系(HD11)的TET2基因，适用于较难转染和抗生素筛选敏感的免疫细胞，且确保了细胞中不含有转基因片段，属于无痕基因编辑。

(2)本发明sgRNA靶点设计在TET2不同剪接变体的共有序列，可以更好的完全敲除鸡TET2基因。

(3)本发明提供了一个鸡TET2基因敲除的免疫细胞模型，为TET2介导的免疫损伤机制的研究提供理想的细胞模型。

(4)本发明鸡巨噬细胞HD11敲除TET2后，细胞中ALV-J复制显著增加，可以推测敲除鸡TET2基因将有利于病毒繁殖。

附图说明

图1为本发明鸡TET2基因所设计的sgRNA序列示意图；

图2为本发明sgRNA表达质粒图谱；

图3为T7E1酶切PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析结果；泳道M：DNA marker，泳道1-5分别代表TET2-sgRNA1、TET2-sgRNA2、TET2-sgRNA3、TET2-sgRNA4和对照组；

图4为本发明所述的鸡TET2基因敲除HD11单克隆细胞株测序鉴定结果；

图5为Western blot评价鸡TET2基因敲除HD11细胞株；

图6为KEGG信号通路富集分析鸡TET2基因敲除对基因表达的影响；

图7为火山图分析鸡TET2基因敲除对基因表达的影响；

图8为免疫荧光分析鸡TET2基因敲除HD11细胞系中ALV-J病毒增殖。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实验中PCR引物合成、sgRNA oligo DNA合成和Sanger测序均由苏州金唯智生物有限公司完成。pEX-A-U6-sgRNA购自Addgene(编号#65626)。鸡胚成纤维细胞系DF-1源于美国ATCC，由申请人传代保存。HD11细胞系由扬州大学兽医学院提供。非病毒载体Cas9-T2A-GFP由申请人通过MLM3613Cas9质粒(Addgene，#42251)改造而来，携带GFP标签(Targeting the histonemethyltransferase disruptor of telomeric silencing 1-like restricts avianleukosis virus subgroup J replication by restoring the innate immune responsein chicken macrophages.Frontiers in Microbiology 2020,11:603131.)。

实施例1

靶向鸡TET2基因的sgRNA合成及载体构建

(1)靶向鸡TET2基因的sgRNA的选择和设计

通过NCBI在线数据库查找鸡TET2的基因组序列，NCBI登录号为：NM_001277794.3，考虑其还有一个剪切变体登录号为XM_015276223.3，因此在两个mRNA的共有序列设计sgRNA，即在NM_001277794.3序列的第二个外显子，XM_015276223.3序列的第三个外显子作为靶标设计区域，该外显子序列如SEQ ID NO.5所示。基于CRISPR/Cas9的针对鸡TET2基因所设计的sgRNA序列示意图如图1所示，进行sgRNA的设计，设计4条sgRNA，具体核苷酸序列如SEQ ID NO.2-5所示：

TET2-sgRNA1：TTGCCGTTGACTTCGACCTC       SEQ ID NO.1；

TET2-sgRNA2：AAAGGTCAGGGCTAATGCGG       SEQ ID NO.2；

TET2-sgRNA3：CTGCATGCGTGCGGAAGCGA       SEQ ID NO.3；

TET2-sgRNA4：TGATGCATTAAAGGGGCCGT       SEQ ID NO.4。

(2)靶向鸡TET2基因的sgRNA载体构建

根据步骤(1)中设计的TET2-sgRNA1、TET2-sgRNA2、TET2-sgRNA3和TET2-sgRNA4，分别在其5’端前部添加caccg，同时合成TET2-sgRNA1、TET2-sgRNA2、TET2-sgRNA3和TET2-sgRNA4互补的寡核苷酸，并在5’端添加aaac，3’端添加c。将合成的4对反向互补的sgRNAoligo DNA单链退火，形成带有粘性末端的短双链DNA。退火步骤如下：将正反向sgRNA序列以100mmol·L^-1浓度溶于ddH₂O；配置以下体系：1μL Forward oligo，1μL Reverse oligo，2μL 10×NEB buffer 2，16μL ddH₂O，置于100℃水，自然降温至25℃左右即可。将短双链DNA与经BbsI酶切后的质粒pEX-A-U6-sgRNA(如图2所示)连接，并将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂菌板后置于37℃过夜培养。挑取单克隆菌落，送苏州金唯智生物科技公司测序鉴定，4对sgRNA序列均正确插入sgRNA表达质粒，提示载体构建成功。

(3)pEX-A-U6-TET2-sgRNA无内毒素质粒的制备

根据步骤(2)中经测序鉴定无误的质粒，提取四种pEX-A-U6-TET2-sgRNA表达质粒(TET2-sgRNA1、TET2-sgRNA2、TET2-sgRNA3和TET2-sgRNA4)，用E.Z.N.A.Endo-freePlasmid Mini Kit试剂盒制备无内毒素质粒，质粒提取步骤具体按照试剂盒说明书进行。

(4)鸡DF-1细胞进行sgRNA切割效率的测定

鸡DF-1细胞转染效率很高，而鸡巨噬细胞HD11较难转染，因此选择先在鸡DF-1细胞进行TET2-sgRNA1、TET2-sgRNA2、TET2-sgRNA3和TET2-sgRNA4切割效率的测定，筛选较高切割效率的sgRNA用于鸡巨噬细胞HD11的筛选。

将DF-1细胞铺于6孔板进行培养，待6孔板中的细胞生长至80％密度时开始转染，每个孔分别加入4μg的表达质粒pEX-A-U6-TET2-sgRNA(TET2-sgRNA1、TET2-sgRNA2、TET2-sgRNA3和TET2-sgRNA4)和2μg的Cas9-T2A-GFP进行转染，不转染的细胞作为对照，转染6h后换成含10％FBS的完全培养基，48h后收集转染后的细胞，提取DNA，通过PCR扩增靶点序列。

PCR鉴定的上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO.6-9：

TET2-ck1-F:CAATCTGCTATCCTGAGTGA    SEQ ID NO.6；

TET2-ck1-R:ATTGGAGATGCTTGGTGTT     SEQ ID NO.7；

TET2-ck2-F:GCAGCACCCAGAAGAAAT      SEQ ID NO.8；

TET2-ck2-R:AGCAGGGAATCCATCTTTG     SEQ ID NO.9。

分别以TET2-ck1和TET2-ck2上、下游引物，PCR扩增sgRNA-1和sgRNA-2，sgRNA-3和sgRNA-4靶位点附近的DNA片段。PCR反应体系为50μL，含5×SF Buffer 10μL，PhantaSuper-Fidelity DNA Polymerase 1μL，dNTP Mix(10mmol·L^-1each)1μL，上游、下游引物各2μL，模板DNA2μL，无酶水32μL。PCR扩增条件为95℃预变性30s；95℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸15s，30个循环；72℃充分延伸5min后，进行退火。退火条件是95℃变性5min，以0.1℃/s的速率降温至25℃。将退火后的PCR产物进行纯化，用T7E1酶(NEB)在37℃酶切2h，其产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，观察目的基因片段被T7E1酶切割情况。

结果如图3所示，TET2-sgRNA1、TET2-sgRNA2、TET2-sgRNA3出现被T7E1酶切割的小片段，说明转染这些sgRNA后细胞基因组DNA发生了编辑事件。其中设计的TET2-sgRNA2引导Cas9蛋白对靶标序列表现出较高切割活性，经T7E1酶切后的全长扩增片段(520bp)产生大小为329bp和191bp的片段，大小符合预期。故选取TET2-sgRNA2用于在鸡巨噬细胞HD11中TET2基因敲除细胞株的筛选，其按上述方法构建的表达质粒命名为pEX-A-U6-TET2-sgRNA2。

(5)制备TET2敲除的鸡巨噬细胞系HD11(TET2-KO)

根据步骤(4)设计sgRNA靶点活性筛选结果，选用活性较高的靶点基因TET2-sgRNA2，用于制备敲除TET2基因的鸡巨噬细胞系HD11。将HD11细胞铺于6孔板进行培养增殖，待6孔板中的HD11细胞生长至50％密度时开始转染，选取1孔细胞加入4μg pEX-A-U6-TET2-sgRNA2无内毒素质粒和2μgCas9-T2A-GFP共转染，只转染2μg Cas9-T2A-GFP的细胞作为对照,转染6h后换成含10％FBS完全培养基。在37℃培养48h后用胰酶消化细胞，制备细胞悬液进行流式细胞仪的筛选，将获得的GFP阳性细胞通过有限稀释法，在96孔板中培养单细胞克隆，待亚克隆的细胞生长至80％密度时，选用其中一半细胞用于提取DNA，另一半细胞继续扩大培养得到TET2敲除HD11细胞株。通过步骤(4)PCR扩增条件扩增靶位点序列，进行DNA测序鉴定，以正常HD11细胞为对照。

所用PCR扩增特异性引物序列为：

TET2-ck1-F:CAATCTGCTATCCTGAGTGA   SEQ ID NO.6；

TET2-ck1-R:ATTGGAGATGCTTGGTGTT    SEQ ID NO.7；

上述96孔板筛选的细胞选取10孔单克隆细胞进行DNA测序分析，得到测序结果后，进行序列比对。将测序结果与基因组序列比对，确定具体突变位置及其突变序列。序列比对鉴定结果如图4所示，经比对发现存在1孔细胞(将该细胞编号为HT-2)发生了DNA编辑事件，突变类型为一个等位基因缺失1个碱基，另一个等位基因插入62个碱基，导致鸡TET2基因移码突变，转录提前终止。待该孔细胞生长至足够数量时进行传代和细胞冻存，说明TET2基因已确认敲除。

实施例2

Western blot分析鸡敲除细胞TET2蛋白表达

为了更进一步确认鸡TET2基因的敲除，通过Western blot来检测HD11细胞系中TET2的蛋白表达。将实施例1制备的TET2敲除HD11细胞系与野生型HD11细胞系分别铺至6孔细胞板，待细胞密度长至90％左右时，收获细胞，获得蛋白，进行Western blot分析。简要步骤如下：用预冷PBS洗涤细胞沉淀，加入RIPA裂解液进行细胞裂解，冰上孵育30min；4℃，12000×g离心15min。吸上清，通过BCA法进行蛋白浓度测定。然后加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，99℃金属浴加热5min，充分变性蛋白后，进行SDS-PAGE电泳。230mA恒流条件下转膜2.5h。将膜用5％脱脂牛奶封闭缓冲液室温封闭30min。稀释TET2(1:1000)和GAPDH(1：1000)抗体，4℃孵育过夜。第二天，洗膜三次后，用HRP标记亲和纯化羊抗兔IgG(1:10000)室温孵育1h后，用TBST缓冲液洗涤3次，每次5min。最后置于蛋白印迹成像系统下观察条带。图5为Western blot实验结果，由图5可知，相对于野生型HD11细胞，敲除细胞系中TET2蛋白基本不表达，说明敲除TET2的HD11细胞系构建成功。

实施例3

转录组测序分析鸡TET2基因缺失影响鸡巨噬细胞免疫基因的表达

将实施例1所构建的鸡TET2基因敲除的HD11细胞系与野生型HD11细胞分别提取RNA，反转录获得cDNA后，送北京百迈客生物科技有限公司进行RNA-seq建库和测序分析。图6为TET2敲除前后差异表达基因KEGG通路富集分析，图7为差异表达基因的火山图。由图6可知，鸡巨噬细胞HD11敲除TET2基因后，天然免疫相关的信号通路如NOD-like和Toll-like等被显著富集；由图7可知，鸡巨噬细胞敲除TET2后，天然免疫相关基因的表达水平显著下调，两个结果表明TET2在维持免疫基因表达方面起重要作用；鸡巨噬细胞中敲除TET2会造成细胞免疫抑制而增加病毒的复制水平。本发明所构建的敲除细胞系使鸡巨噬细胞免疫相关基因全面下调，导致明显的免疫抑制，可用作鸡免疫抑制的细胞模型，尤其是基因参与鸡巨噬细胞功能作用研究的细胞模型和TET2介导的鸡免疫抑制机制研究的细胞模型。

实施例4

免疫荧光实验分析鸡TET2基因缺失对ALV-J病毒扩增的影响。

将实施例1所构建的鸡TET2敲除的HD11细胞系与野生型HD11细胞分别铺至12孔细胞板。当细胞密度达60％时，分别感染MOI＝1、2、5的ALV-J病毒。感染方法如下：首先弃去12孔板中细胞培养基，用PBS洗涤两次以去除残留培养基，将MOI＝1、2、5的病毒用无血清DMEM稀释至500μL后，逐滴加至12孔细胞板进行感染，然后置于37℃培养箱进行培养。2h后弃去培养基，并用PBS洗涤1次后，添加1mL含1％FBS的DMEM培养基继续置于37℃培养箱进行培养。48h后弃去培养基进行免疫荧光实验。图8为免疫荧光实验检测ALV-J Env(绿色)表达水平，由图8可知，鸡巨噬细胞HD11敲除TET2后，细胞中ALV-J复制显著增加，故由此可推测敲除鸡TET2基因将有利于病毒繁殖。

Claims (10)

1.一种靶向敲除鸡TET2基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA核苷酸序列如SEQ IDNO.1-4任一所示。

2.根据权利要求1所述的靶向敲除鸡TET2基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种sgRNA表达载体，其特征在于，所述sgRNA表达载体构建方法包括如下步骤：

(1)使用BbsI酶切pEX-A-U6-sgRNA载体，得到酶切后的表达载体；

(2)将权利要求1所述的sgRNA，经退火形成短双链DNA与酶切后的质粒连接，得到靶向敲除鸡TET2基因的sgRNA表达载体pEX-A-U6-TET2-sgRNA。

4.一种靶向敲除鸡TET2基因的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，其含有权利要求1所述的靶向敲除鸡TET2基因的sgRNA的DNA序列。

5.根据权利要求4所述的靶向敲除鸡TET2基因的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，所述CRISPR-Cas9系统包括靶向敲除鸡TET2基因的sgRNA表达载体pEX-A-U6-TET2-sgRNA和Cas9-T2A-GFP质粒。

6.一种权利要求1所述的sgRNA或者权利要求3所述的sgRNA表达载体或者权利要求5所述的CRISPR-Cas9系统在制备敲除TET2基因的细胞系中的应用。

7.一种靶向敲除鸡TET2基因的细胞系，其特征在于，将权利要求5所述的靶向敲除鸡TET2基因的CRISPR/Cas9系统转染目的细胞得到的。

8.根据权利要求7所述的靶向敲除鸡TET2基因的细胞系，其特征在于，将高切割活性的靶向敲除鸡TET2基因的sgRNA表达载体pEX-A-U6-TET2-sgRNA和Cas9-T2A-GFP质粒共转染鸡巨噬细胞系HD11，转染后经流式细胞分选，获得GFP表达阳性细胞系，稀释细胞以获取单克隆细胞株进行培养得到靶向敲除鸡TET2基因的巨噬细胞系。

9.一种权利要求1所述的sgRNA或者权利要求3所述的sgRNA表达载体或者权利要求5所述的CRISPR-Cas9系统在制备TET2基因参与鸡巨噬细胞功能作用研究的细胞模型上的应用。

10.一种权利要求1所述的sgRNA或者权利要求3所述的sgRNA表达载体或者权利要求5所述的CRISPR-Cas9系统在制备TET2介导的鸡免疫抑制机制研究的细胞模型上的应用。

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