CN114015722A - 一种构建重症免疫缺陷和肝损伤双重猪模型的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种构建重症免疫缺陷和肝损伤双重猪模型的方法及应用，属动物生物技术领域。该方法采用CRISPR/Cas9技术敲除猪胎儿成纤维细胞中RAG2、IL2RG和FAH基因，利用体细胞核移植技术构建RAG2‑/‑/IL2RG‑/Y/FAH‑/‑三基因编辑克隆猪，经表型分析鉴定获得重症免疫缺陷及肝损伤双重猪模型。本发明克服了现有模型构建技术中生产周期长、效率低、损伤不可逆、缺乏免疫缺陷和肝损伤同时应用人源化程度不理想等问题，可通过连续克隆技术实现批量构建重症免疫缺陷和肝损伤双重猪模型，在肿瘤生物学、细胞移植及人源化动物模型等相关领域具有巨大的优势和潜在的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于动物生物技术领域，具体的说，涉及一种构建重症免疫缺陷和肝损伤双重猪模型的方法及应用。
背景技术
免疫缺陷动物在生物医学与基础医学研究领域发挥了重要的作用。肝脏移植是治疗终末期肝衰竭的重要治疗方式，肝脏供体短缺是制约肝移植临床应用的主要瓶颈。肝细胞移植技术作为解决肝脏器官严重短缺问题的重要途径之一，通过在免疫缺陷和肝损伤双重动物模型上植入人的肝细胞生产人源化的肝脏，批量获得人源化肝细胞可解决临床上原代肝细胞来源局限的问题，在人类乙肝(HBV)、丙肝(HCV)疾病治疗及疫苗研发、药理学、毒理学等方面发挥了重要的作用。
现利用SCID(Severe Combined Immunodeficiency Disorder)和uPA(urokinasetype plasminogen activator)双重小鼠模型，植入人肝细胞在6周后已成功获得了嵌合度高达80％的人源化肝脏小鼠。基于FAH-/-/Rag-/-/IL2RG-/-三基因修饰小鼠模型，已成功实现了大量人源化肝细胞的大量扩增，肝脏再生率可达80％以上。然而，目前小鼠模型仍存在诸多问题：
(1)小鼠等啮齿类动物与人亲缘关系较远、体型大小差异较大且寿命短，利用小鼠等啮齿类动物很难高度地模拟人的生理代谢过程，使免疫缺陷小鼠在生命科学研究领域的应用受到了很大的限制。
(2)目前小鼠的双重模型的构建均用了比较传统的基因编辑方法，甚至在肝损伤的制备上选用的是化学药物，具有不可逆的损伤，造模的成功率低，不利于后续模拟人类开展外科手术和临床前评价。
(3)现常采用的杂交方式获得的FAH-/-/Rag-/-/IL2RG-/-三基因同时修饰的小鼠模型，首先是通过Rag-/-/IL2RG-/-的基础上与FAH-/-的小鼠交配产生Rag-/+/IL2RG-/+/FAH-/+个体，再通过自交获得FAH-/-/Rag-/-/IL2RG-/-三基因同时修饰的个体，有的甚至是采用受精卵注射获得的嵌合体小鼠，该方式构建的周期较长，模型生产效率较低。
(4)目前小鼠FAH-/-/Rag-/-/IL2RG-/-模型中，存在NK细胞没有办法去除、炎症反应与人不同的特点，不能很好的重塑人的模型。
猪属于大型哺乳动物，因其在基因组同源性、体型大小、生理生化指标、组织解剖及免疫代谢等方面与人极为相似，因此建立免疫缺陷和肝损伤双重猪模型能更好地应用于人类肿瘤生物学、细胞移植及免疫缺陷模型等相关领域的研究，对推进生命科学产业的快速发展具有重要的意义。
发明内容
针对以上技术问题和实际需求，本发明提供了一种构建重症免疫缺陷和肝损伤双重猪模型的方法及应用，本方法基于CRISPR/Cas9基因编辑技术同时敲除猪胎儿成纤维细胞中RAG2、IL2RG、FAH基因获得RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑猪成纤维细胞系，以此为供体细胞，进行体细胞核移植构建RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪，进一步对克隆猪病理学、免疫学、细胞学及肝功能检测和表型分析鉴定，获得重症免疫缺陷及肝损伤双重猪模型。该模型表现为免疫缺陷及肝损伤，胸腺、脾脏发育不良，成熟T细胞数量减少、B细胞及NK细胞缺失，在肿瘤生物学、细胞移植及人源化动物模型等相关领域的应用具有巨大的优势，市场前景广阔。
为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明提供了RAG2/IL2RG/FAH三基因打靶载体、用于细胞RAG2/IL2RG/FAH三基因编辑的重组质粒和RAG2/IL2RG/FAH三基因敲除的猪成纤维细胞系。
RAG2/IL2RG/FAH三基因打靶载体，打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，sgRNA包括RAG2-sgRNA、IL2RG-sgRNA和FAH-sgRNA；sgRNA作用位点位于猪RAG2基因的编码区、IL2RG基因的第5外显子、FAH基因的第2外显子。
进一步的，RAG2-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；IL2RG-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；FAH-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
进一步的，骨架载体为pGL3-U6-sgRNA(Addgene no:51133)。
用于细胞RAG2/IL2RG/FAH三基因编辑的重组质粒，其特征在于：重组质粒RAG2-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；重组质粒IL2RG-sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示；重组质粒FAH-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
进一步的，细胞为猪成纤维细胞系。
RAG2/IL2RG/FAH三基因敲除的猪成纤维细胞系，其特征在于：将权利要求1-5任一项所述的打靶载体或重组质粒转染猪成纤维细胞系，获得的中靶阳性细胞克隆，即为RAG2/IL2RG/FAH三基因敲除的猪成纤维细胞系或RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑猪成纤维细胞系。
本发明还提供了利用CRISPR/Cas9技术构建重症免疫缺陷和肝损伤双重猪模型的方法，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除猪胎儿成纤维细胞中的RAG2、IL2RG、FAH基因，并利用体细胞核移植技术构建RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪；具体步骤为：
1)基于CRISPR/Cas9系统构建RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因突变表达载体
针对猪RAG2(Gene ID:100151744)基因的编码区，IL2RG(Gene ID:397156)基因的第5外显子，FAH(Gene ID:100623036)基因的第2外显子，设计相应的sgRNA打靶载体并将其连接至骨架载体上，获得pGL3-U6-sgRNA重组质粒；
2)RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑猪成纤维细胞系的筛选
将pGL3-U6-sgRNA重组质粒与pST1374-NLS-flag-linker-Cas9(Addgene no:44758)共同转染至猪胎儿成纤维细胞中，经单细胞克隆基因型鉴定筛选，获得RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑猪成纤维细胞系；
3)体细胞核移植及胚胎移植
以RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑猪成纤维细胞为供体细胞进行体细胞核移植，构建RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑猪克隆胚，进一步将克隆胚移植至代孕母猪输卵管内，妊娠114天后分娩获得RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪；
4)克隆仔猪基因型鉴定及表型分析
提取克隆仔猪基因组DNA，利用分子生物学方法对克隆仔猪的RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-基因型进行鉴定，进一步对克隆猪的胸腺、脾脏、肝脏等器官进行组织学及免疫组织化学分析，对成熟T细胞、B细胞、NK细胞及肝细胞等进行免疫学及细胞学分析和鉴定，获得RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑重症免疫缺陷及肝损伤双重猪模型。
进一步的，步骤1)中，sgRNA包括RAG2-sgRNA、IL2RG-sgRNA和FAH-sgRNA；其中，RAG2-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；IL2RG-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；FAH-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；载体为pGL3-U6-sgRNA骨架载体(Addgene no:51133)。
进一步的，步骤2)所述转染的方法包括脂质体转染和/或核转染；优选为核转染；
进一步的，步骤3)中，供体细胞可为RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑单细胞克隆或克隆胎儿成纤维细胞及克隆猪成纤维细胞；
进一步的，步骤3)中，转染量pST1374-NLS-flag-linker-Cas9质粒：RAG2/IL2RG/FAH-sgRNA＝2：1。
进一步的，步骤3)中，若需批量生产RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪，可通过连续克隆技术获得。
上述打靶载体、重组质粒、细胞或方法在构建重症免疫缺陷和肝损伤双重猪模型及在肿瘤生物学、细胞移植及人源化动物模型研究等领域中的应用。
本发明的有益效果：
1.本发明基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-重症免疫缺陷和肝损伤双重猪模型，与小鼠等啮齿类及非人灵长类动物模型相比，除基因组同源性、体型大小、生理生化、组织解剖及免疫代谢等方面与人更为相似外，无伦理限制，将在人类生命科学研究领域发挥重要的作用，具有巨大的生物医学研究应用前景和市场价值。
2.本发明首次通过CRISPR/Cas9技术获得了免疫缺陷和肝损伤的双重猪模型，模型生产周期短、生产效率高，且通过敲除FAH基因后利用NTBC药物可实现可逆性，解决了现有模型构建技术不可逆的应用问题。
3.现有技术构建RAG2-/-/IL2RG-/Y免疫缺陷小鼠过程中，由于小鼠的免疫调节系统与人的不同，导致RAG2-/-/IL2RG-/Y敲除后不能将NK细胞去除。此外，去除NK细胞的需要同时编辑RAG和IL2RG基因，常规通过锌指核酸酶和TALENs技术对多个基因敲除，效率较低；本发明通过CRISPR/Cas9技术克服了多基因编辑的效率问题。本发明中RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-模型猪实现了有效去除了外周血中的NK细胞的问题，在一定程度上降低了炎症反应的发生，人源化程度更高，在一定程度上有效降低了免疫排斥反应。
4.本发明是通过不同sgRNA活性的筛选和脱靶检测，提供了适用于猪FAH、Rag2和IL2RG三个基因编辑的sgRNA，且对其编辑区域敲除后的功能性进行验证，克服了CRISPR/Cas9基因编辑技术存在脱靶、多基因修饰后克隆动物出生效率低的问题。
5.本发明所获得RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪表现为免疫缺陷及肝损伤严重，胸腺、脾脏发育不良，成熟T细胞减少、B细胞及NK细胞缺失，肝细胞凋亡率高，免疫缺陷程度高，可通过连续克隆技术实现重症免疫缺陷和肝损伤双重猪模型的批量生产。构建RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑重症免疫缺陷和肝损伤双重猪模型在肝细胞移植技术、肿瘤生物学、细胞移植及人源化动物模型等多领域具有巨大的优势和潜在的市场应用前景。
附图说明
图1为RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因敲除克隆猪构建示意图；
图2为RAG2-/-基因编辑猪胎儿成纤维细胞系打靶示意图及鉴定结果；
图3为IL2RG基因和FAH基因打靶sgRNA活性筛选结果；
图4为RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑猪胎儿成纤维细胞系打靶示意图及鉴定结果；
图5为RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪；
图6为RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪基因型鉴定结果图；
图7为RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪免疫功能缺失鉴定结果。
(A)RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪生存曲线；(B)RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪胸腺解剖图；(C)RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪脾脏解剖图；(D)RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪脾脏HE染色结果图；(E-G)RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪外周血或脾脏中成熟T细胞(CD3抗体标记)、B细胞(CD45RA抗体标记)和NK细胞(CD3和CD16抗体标记)检测结果图；(H)RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆脾脏中CD4、CD8、IL2Rγ、CD19基因mRNA表达水平；(I)RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪IL2Rγ基因的蛋白表达水平；(J)RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪V(D)J重排结果。
图8为RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪肝损伤表型检测结果。
(A)RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪NTBC给药方案示意图；(B)RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪肝FAH免疫组化检测结果；(C)RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪肝中FAH基因的蛋白表达水平；(D)RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪睾丸中FAH基因的蛋白表达水平；(E)RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪肝脏HE染色结果；(F)RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪肝细胞凋亡检测结果；(G)RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪肝脏细胞凋亡量化结果；(H)RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪肝脏凋亡相关基因BID、BAX、PUMA、BCL2L1 mRNA的表达水平。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
实施例1：猪RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因打靶载体的构建
在NCBI数据库中查找得到猪的RAG2(Gene ID:100151744)、IL2RG(Gene ID:397156)和FAH(Gene ID:100623036)基因的核苷酸序列，针对猪RAG2基因的编码区，IL2RG基因的第5外显子序列，FAH基因的第2外显子序列，利用在线软件(http://crispor.tefor.net/)设计和筛选打靶gRNA位点并将sgRNA连接至骨架载体，获得RAG2-gRNA(SEQ ID NO:1)打靶载体(图2)，进一步筛选获得最优猪IL2RG/FAH基因重组打靶载体，分别为IL2RG-gRNA(SEQ ID NO:2)、FAH-gRNA(SEQ ID NO:3)(图3)。将上述打靶载体共同转染至猪胎儿成纤维中，筛选获得RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因突变猪胎儿成纤维细胞系，以此为供体细胞进行体细胞核移植，构建RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪(图1)。
实施例2：RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪的构建
1.针对猪RAG2(Gene ID:100151744)基因的编码区，IL2RG(Gene ID:397156)基因的第5外显子，FAH(Gene ID:100623036)基因的第2外显子，设计和筛选打靶gRNA位点，分别为RAG2-gRNA(SEQ ID NO:1)、IL2RG-gRNA(SEQ ID NO:2)、FAH-gRNA(SEQ ID NO:3)。
2.将RAG2基因的gRNA序列SEQ ID NO:1连接至GL3-U6-sgRNA骨架载体上，经测序验证后序列正确的重组质粒RAG2-GL3-U6-sgRNA与pST1374-NLS-flag-linker-Cas9质粒经核转仪共同转染至猪胎儿成纤维细胞中(pST1374-NLS-flag-linker-Cas9：RAG2-GL3-U6-sgRNA＝2：1)，经筛选共获得9单细胞克隆，其中9号单细胞克隆为RAG2双等位基因敲除，进一步以RAG2KO-09单细胞克隆为供体细胞进行体细胞核移植，克隆胚移植至代孕母猪中，35天后获得6个RAG2KO胎儿并分离RAG2KO猪胎儿成纤维细胞系(图2)。
3.进一步分别将IL2RG、FAH基因对应的gRNA序列SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3连接至GL3-U6-sgRNA骨架载体上，经测序序列正确重组质粒与pST1374-NLS-flag-linker-Cas9质粒经核转仪共同转染至RAG2KO猪胎儿成纤维细胞中，共获得39个单细胞克隆，经筛选鉴定25号单克隆基因型为RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因突变克隆(图4)。
4.以步骤(3)筛选获得25号RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑单细胞克隆为供体细胞进行体细胞核移植，克隆胚移植至发情的代孕母猪子宫内，妊娠114天后获得了2头成活的克隆仔猪(图5)。
实施例3：RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪的基因型鉴定及表型分析
基因型鉴定。提取2头成活克隆仔猪(RGFP19、RGFP20)基因组DNA，利用PCR、T7ENI、Sanger测序等方法对其克隆猪RAG2/IL2RG/FAH基因突变情况进行鉴定，结果显示均为RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因敲除型(图6)，进一步检测了RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪的脱靶情况，均未发现脱靶(表1)。
表1.RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪脱靶检测结果
表型分析。2头RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因敲除猪分别存活了14天和29天(图7A)，病理解剖后可见RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑敲除猪的胸腺发育缺陷(图7B)、脾脏发育异常(图7C&D)，提取1头RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因突变克隆猪外周血和脾脏PBMC细胞，通过免疫学及细胞学方法检测其成熟T细胞、B细胞和NK细胞的数量(CD3抗体标记T细胞，CD45RA抗体标记B细胞，CD3和CD16抗体标记NK细胞)，结果显示，外周血和脾脏中成熟T淋巴细胞均显著减少、B淋巴细胞缺失(图7F&G),外周血中NK细胞缺失(图7E)，脾脏中CD8、CD19、IL2RG、CD19基因mRNA表达水平显著降低(图7H)，脾脏中IL2Rγ基因蛋白表达降低(图7I)，免疫功能丧失(图7J)，肝脏、睾丸中FAH蛋白表达缺失(图8B、C&D)，肝组织损伤严重(图8E)，肝细胞凋亡显著增加(图8F、G)，肝脏中BID、BAX、PUMA基因mRNA表达水平显著升高(图8H)。本发明中RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因敲除重症免疫缺陷和肝损伤双重猪模型有效去除了外周血中的NK细胞，在一定程度上降低了炎症反应的发生、人源化程度更高、有效降低了免疫排斥反应。
可逆性分析：
猪属于大型哺乳动物，在制备肝损伤模型的过程中，能通过NTBC药物实现在猪上维持酪氨酸代谢的使用是一个全新的摸索过程。本发明首次通过CRISPR/Cas9技术获得了免疫缺陷和肝损伤的双重猪模型，且敲除FAH基因后可通过饲喂NTBC药物实现可逆性，且若需批量生产本发明所述的重症免疫缺陷和肝损伤双重猪模型，则可进一步通过连续克隆技术获得，成功解决了现有模型构建技术不可逆的应用问题。
本发明通过大量的预实验，确定了NTBC药物使用最适浓度的给药方案(图8A)，在一定程度上克服了NTBC药物在RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因突变猪上使用量不足或过量产生的负面影响(用量过少猪成活率低、用量过大对代孕母猪和仔猪均可产生不利的影响)。
综上所述，本发明提供了一种构建重症免疫缺陷和肝损伤双重猪模型的方法，克服了现有模型构建技术中生产周期长、效率低、损伤不可逆、人源化程度不理想等问题，所获得RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪表现为免疫缺陷及肝损伤严重，胸腺、脾脏发育不良，成熟T细胞减少、B细胞及NK细胞数量缺失，肝细胞凋亡升高，免疫缺陷程度高，若通过连续克隆技术可实现该重症免疫缺陷和肝损伤猪模型的批量生产，将在肿瘤生物学、细胞移植及人源化动物模型等相关领域发挥重要的作用，具有潜在的市场应用前景。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南农业大学
<120> 一种构建重症免疫缺陷和肝损伤双重猪模型的方法及应用
<130> 2021.08
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
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<212> DNA
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ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 2640
tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 2700
gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 2760
ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 2820
ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 2880
gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 2940
aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 3000
tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 3060
ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 3120
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 3180
aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 3240
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ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgggacccac 3360
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gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 3480
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tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 3600
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tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 3720
ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 3780
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tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 4140
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gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag cccaagctac 4740
catgataagt aagtaatatt aaggtacggg aggtacttgg agcggccgca ataaaatatc 4800
tttattttca ttacatctgt gtgttggttt tttgtgtgaa tcgatagtac taacatacgc 4860
tctccatcaa aacaaaacga aacaaaacaa actagcaaaa taggctgtcc ccagtgcaag 4920
tgcaggtgcc agaacatttc tctatcgata 4950
<210> 5
<211> 4950
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ggtaccgatt agtgaacgga tctcgacggt atcgatcacg agactagcct cgagcggccg 60
cccccttcac cgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 120
ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 180
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tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 300
tgtggaaagg acgaaacacc gcagctggag caaccgatac tgttttagag ctagaaatag 360
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acaaactaaa gaattacaaa aacaaattac aaaaattcaa aattttcggg tttattacag 600
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ccgctaccct tgtgggcccc ccggcgacgc ttcctgctcc gcccctaagt cgggaaggtt 840
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tcgcagacgg acagcgccag ggagcaatgg cagcgcgccg accgcgatgg gctgtggcca 960
atagcggctg ctcagcaggg cgcgccgaga gcagcggccg ggaaggggcg gtgcgggagg 1020
cggggtgtgg ggcggtagtg tgggccctgt tcctgcccgc gcggtgttcc gcattctgca 1080
agcctccgga gcgcacgtcg gcagtcggct ccctcgttga ccgaatcacc gacctctctc 1140
cccaggggga tccaccggag cttaccatga ccgagtacaa gcccacggtg cgcctcgcca 1200
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tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt 4560
ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt 4620
taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttcc cattcgccat tcaggctgcg 4680
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc ccaagctacc 4740
atgataagta agtaatatta aggtacggga ggtacttgga gcggccgcaa taaaatatct 4800
ttattttcat tacatctgtg tgttggtttt ttgtgtgaat cgatagtact aacatacgct 4860
ctccatcaaa acaaaacgaa acaaaacaaa ctagcaaaat aggctgtccc cagtgcaagt 4920
gcaggtgcca gaacatttct ctatcgata 4949
Claims (10)
1.RAG2/IL2RG/FAH三基因打靶载体，其特征在于：打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，sgRNA包括RAG2-sgRNA、IL2RG-sgRNA和FAH-sgRNA；sgRNA作用位点位于猪RAG2基因的编码区、IL2RG基因的第5外显子、FAH基因的第2外显子。
2.根据权利要求1所述的RAG2/IL2RG/FAH三基因打靶载体，其特征在于：RAG2-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；IL2RG-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；FAH-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.根据权利要求1或2所述的RAG2/IL2RG/FAH三基因打靶载体，其特征在于：骨架载体为pGL3-U6-sgRNA（Addgene no:51133）。
4.用于细胞RAG2/IL2RG/FAH三基因编辑的重组质粒，其特征在于：重组质粒RAG2-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；重组质粒IL2RG-sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示；重组质粒FAH-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
5.权利要求4所述的重组质粒，其特征在于：所述细胞为猪胎儿成纤维细胞系。
6.RAG2/IL2RG/FAH三基因敲除的猪成纤维细胞系，其特征在于：将权利要求1-5任一项所述的打靶载体或重组质粒转染至猪胎儿成纤维细胞系，获得的中靶阳性细胞克隆，即为RAG2/IL2RG/FAH三基因敲除的猪成纤维细胞系或RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑猪成纤维细胞系。
7.利用CRISPR/Cas9技术构建重症免疫缺陷和肝损伤双重猪模型的方法，其特征在于：具体步骤为：
（1）基于CRISPR/Cas9系统构建RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因突变表达载体
针对猪RAG2基因的编码区，IL2RG基因的第5外显子，FAH基因的第2外显子，设计打靶sgRNA并将其连接至骨架载体上，获得pGL3-U6-sgRNA重组质粒；
（2）RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑猪成纤维细胞系的筛选
将pGL3-U6-sgRNA重组质粒与pST1374-NLS-flag-linker-Cas9共同转染至猪胎儿成纤维细胞中，经单细胞克隆基因型鉴定筛选，获得RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑猪成纤维细胞系；
（3）体细胞核移植及胚胎移植
以RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑猪胎儿成纤维细胞为供体细胞进行体细胞核移植，构建RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑猪克隆胚，进一步将克隆胚移植至代孕母猪输卵管内，妊娠114天后分娩获得RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪；
（4）克隆仔猪基因型鉴定及表型分析
提取克隆仔猪基因组DNA，利用分子生物学方法对克隆仔猪的RAG2/IL2RG/FAH基因型进行鉴定，进一步对克隆猪的胸腺、脾脏、肝脏等器官进行组织学和免疫组织化学分析，对成熟T细胞、B细胞、NK细胞及肝细胞等进行免疫学及细胞学分析和鉴定，获得RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑重症免疫缺陷及肝损伤双重猪模型。
8.根据权利要求7所述的利用CRISPR/Cas9技术构建重症免疫缺陷和肝损伤双重猪模型的方法，其特征在于：步骤1）中，sgRNA包括RAG2-sgRNA、IL2RG-sgRNA和FAH-sgRNA；其中，RAG2-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，IL2RG-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，FAH-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；载体为pGL3-U6-sgRNA骨架载体（Addgene no:51133）。
9.根据权利要求7所述的利用CRISPR/Cas9技术构建重症免疫缺陷和肝损伤双重猪模型的方法，其特征在于：步骤2）所述转染的方法包括脂质体转染和/或核转染；优选为核转染；步骤3）中，供体细胞可为RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑单细胞克隆或克隆胎儿成纤维细胞及克隆猪成纤维细胞；若需批量生产RAG2-/-/IL2RG-/Y/FAH-/-三基因编辑克隆猪，可通过连续克隆技术获得。
10.权利要求1-3中任一项权利要求项所述的打靶载体、权利要求4-5任一项所述的重组质粒、权利要求6所述的细胞或权利要求7-9任一项所述方法在构建重症免疫缺陷和肝损伤双重猪模型及在肿瘤生物学、细胞移植及人源化动物模型研究等领域中的应用。
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2021
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| ZHANG，L.D.等: "Survival-Assured Liver Injury Preconditioning (SALIC) Enables Robust Expansion of Human Hepatocytes in Fah–/–Rag2–/–IL2rg–/– Rats", ADV. SCI. * |
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