CN113943748A - 一种丁香假单胞菌中的重组系统及应用 - Google Patents

一种丁香假单胞菌中的重组系统及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种丁香假单胞菌中的重组系统及应用，涉及基因工程技术领域；该重组系统的核苷酸序列为如SEQ ID No.37所示序列，其中该重组系统携带庆大霉素基因、阿拉伯糖调控基因和重组酶基因amp‑araC‑red、广宿主复制子pBBR1和蔗糖敏感负筛选基因sacB。该重组系统可以应用于丁香假单胞菌的基因重组中，能介导Psyr_1621的全基因敲除和Psyr_3467的5’端部分敲除，该重组系统不仅携带由阿拉伯糖诱导的λRed的重组酶蛋白，并且可以在蔗糖的筛选压力下将质粒丢失。

Description

一种丁香假单胞菌中的重组系统及应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种丁香假单胞菌中的重组系统及应用。
背景技术
细菌基因组定点突变通常使用同源重组技术实现。该技术通过导入含有与基因组同源的外源DNA的自杀性质粒，与染色体上的目的基因进行交叉互换，进而在细菌自身DNA修复系统作用下实现外源DNA片段替代染色体上目的基因。该方法虽然可完成大多数细菌的基因编辑，但存在操作技术繁琐、耗时长、效率低等缺点。噬菌体编码的同源重组系统同样可以促进线性DNA分子与目标基因组的整合，基于噬菌体编码的重组系统对基因组DNA进行设计和改造，在大肠杆菌中已有应用。在携带Rac原噬菌体的大肠杆菌中，RecTE系统能促使短同源臂DNA分子进行同源重组；而λ噬菌体Red操纵子编码的Red系统在大肠杆菌中能够介导高效的同源重组。其中，Red操纵子编码的Exo、Beta、Gam蛋白分别是具有DNA单链5’端向3’端的切割活性的核酸外切酶、促进由Exo蛋白切割后裸露的3’末端互补退火的单链结合蛋白和能与RecBCD核酸外切酶结合并抑制体内的外源DNA降解的辅助蛋白。
丁香假单胞菌丁香致病变种B728a(Pseudomonas syringaepv.syringae B728a，Pss B728a)致病型多，病害范围广，引起植物病害的发生概率较高，能造成毁灭性植物灾害，给农业经济造成了巨大损失。为研发防治丁香假单胞菌的方法，有必要深入研究丁香假单胞菌及其基因功能。对基因功能研究的最重要方法之一是将被研究的基因敲除，构建相应的突变体；同源重组技术是丁香假单胞菌基因操作的传统技术，但该技术操作繁琐、耗时长、效率低。利用源于噬菌体的同源重组系统，在许多细菌中可以介导高效率重组。λRed和RecET重组系统可显著提高大肠杆菌和其他肠道菌群的短同源臂DNA重组效率；有文献报道在铜绿假单胞菌中，利用RecTE系统也可以促进重组发生。
除了同源重组酶，特异性重组酶也作为遗传操作的工具。由于位点特异性重组系统能有效克服常用的重组技术在基因重组方面难以避免的随机整合等不足之处，并且具有较高的重组效率，因此已广泛用于各种生物的基因操作。根据特异性重组酶的催化残基和序列同源性的不同，其主要分为酪氨酸家族和丝氨酸家族。其中，来源于酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)的FLP/FRT系统属于酪氨酸家族。FLP重组酶能特异性识别FRT位点，当两个FRT位点反向重复时，FLP能识别产生外源基因的倒置和插入作用；同向重复时，FLP能识别位点间的序列产生删除效应。利用这个特性，FLP/FRT系统可用于外源基因和选择标记基因的去除，并且能在基因组中融入短肽，使重组系统与特异性重组酶系统得以在丁香假单胞菌中结合运用。
发明内容
本发明的目的是提供一种丁香假单胞菌中的重组系统及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该重组系统可以应用于丁香假单胞菌的基因重组中，能介导Psyr_1621的全基因敲除和Psyr_3467的5’端部分敲除，该重组系统不仅携带由阿拉伯糖诱导的λRed的重组酶蛋白，并且可以在蔗糖的筛选压力下将质粒丢失。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种丁香假单胞菌中的重组系统，核苷酸序列为如SEQ ID No.37所示序列，其中所述重组系统携带庆大霉素基因、阿拉伯糖调控基因和重组酶基因amp-araC-red、广宿主复制子pBBR1和蔗糖敏感负筛选基因sacB。
本发明还提供上述丁香假单胞菌中的重组系统的构建方法，包括以下步骤：
(1)将氨苄青霉素抗性基因、阿拉伯糖调控基因和重组酶基因amp-araC-red和广宿主复制子pBBR1酶切连接，得到pBBR1-Ampr-AraC-Red；
(2)将蔗糖敏感负筛选基因sacB连接至线性化质粒pBBR1-Ampr-AraC-Red上，得到pRed01-Ampr；
(3)将pRed01-Ampr的氨苄青霉素抗性基因替换成庆大霉素基因，得到所述丁香假单胞菌中的重组系统pRed02-Gmr。
本发明还提供上述丁香假单胞菌中的重组系统在丁香假单胞菌基因重组中的应用，所述基因重组为基因敲除，具体为敲除Psyr_1621的全部基因或Psyr_3467的部分基因。
进一步地，所述丁香假单胞菌为丁香假单胞菌丁香致病变种B728a。
本发明还提供一种对丁香假单胞菌进行基因重组的方法，具体为利用上述重组系统对丁香假单胞菌进行基因敲除。
进一步地，所述基因重组为对丁香假单胞菌进行Psyr_1621全基因敲除，包括以下步骤：
(1)所述重组系统通过电击转化导入丁香假单胞菌中，得到所述重组系统的重组子Pss B728a/pRed02-Gmr；
(2)以Pss B728a总DNA为模板，PCR扩增Psyr_1621基因的上游和下游片段；以pKD4质粒为模板，扩增FRT-Kanr-FRT片段；将PCR扩增获得的Psyr_1621基因的上游和下游片段以及FRT-Kanr-FRT片段共同作为模板，通过重叠PCR方法，使Psyr_1621基因的上游片段、FRT-Kanr-FRT片段和Psyr_1621基因的下游片段搭桥成一个大片段；用Ω-PCR的方法将所述大片段和pSRK-Gmr质粒反应，转化后通过筛选和测序鉴定，获得用于Psyr_1621基因敲除的敲除盒片段克隆载体pSRK-1621-Kanr；
(3)以步骤(2)得到的pSRK-1621-Kanr作为模板，分别PCR扩增带有500bp和250bp同源臂的卡那霉素抗性基因，将PCR扩增产物电击转化至步骤(1)得到的Pss B728a/pRed02-Gmr中，经过验证后得到Psyr_1621全基因敲除的丁香假单胞菌。
进一步地，所述基因重组为对丁香假单胞菌进行Psyr_3467基因的N端600bp敲除，保留330bp，同时设计不破坏阅读框的FRT cassette，包括以下步骤：
(1)所述的Red重组系统通过电击转化导入至丁香假单胞菌中，得到所述的Red重组系统的重组子Pss B728a/pRed02-Gmr；
(2)以Pss B728a总DNA为模板，PCR扩增Psyr_3467基因的上游和下游片段；将Psyr_3467基因的上游和下游片段进行酶切连接至pMD19-T载体，经转化及菌落PCR筛选，得到转化子pMD19-T-3467-up-dn；以pHSG399-FRT-Kanr-FRT质粒为模板，PCR扩增FRT-Kanr-FRT片段，再将所述FRT-Kanr-FRT片段与所述pMD19-T-3467-up-dn酶切连接，再经转化及菌落PCR筛选，获得用于Psyr_3467基因敲除的敲除盒片段克隆载体pMD19-3467-Kanr；
(3)以步骤(2)得到的pMD19-3467-Kanr作为模板，PCR扩增带有750bp同源臂的卡那霉素抗性基因，将PCR扩增产物电击转化至步骤(1)得到的Pss B728a/pRed02-Gmr中，经过验证后得到Psyr_3467部分基因敲除的丁香假单胞菌。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供的运用在丁香假单胞菌中的重组系统，是由λ噬菌体的三个基因exo、beta和gam基因发挥重组功能。基于实验室植物病原菌研究基础及分子工具使用需要，利用pKD46、pSRK、pK18mobsacB质粒中的Red重组基因、广宿主复制子、蔗糖敏感的sacB负筛选基因元件，进行新载体工具构建。该载体工具不仅携带由阿拉伯糖诱导的λRed的重组酶蛋白，并且可以在蔗糖的筛选压力下将质粒丢失。
本发明对酰化高丝氨酸内脂合成酶基因Psyr_1621进行全基因敲除。酰化高丝氨酸内酯类(Acyl-homoserine lactones，AHLs)化合物是革兰氏阴性菌群体感应系统中最重要的一类信号分子，通过DNA分子测序与检测信号分子合成，证明本发明重组质粒pRed02-Gmr能介导Psyr_1621的全基因敲除，且突变显著抑制AHL信号分子的产生。
本发明对酰化高丝氨酸内脂的合成必需基因Psyr_3467进行5’端部分敲除。在同一个操纵子中，一个结构基因发生突变不仅会影响该基因本身产物的表达，还可能影响其下游结构基因的表达(在转录或翻译水平)，该现象被称作极性效应。而对目的基因进行5’端部分敲除，破坏其基因结构的同时保证其阅读框架不被破坏，可有效避免极性效应的发生。本发明利用有痕敲除的特点，在与敲除基因Psyr_3467发生同源重组的PCR片段中设计FRT cassette，通过FLP介导抗性消除后，确保遗留的FRT识别位点与被保留的Psyr_3467部分基因融合，能继续转录和翻译，不产生移码突变。通过DNA分子测序和检测信号分子合成，证明本发明重组质粒pRed02-Gmr能介导的Psyr_3467基因5’端部分敲除，且突变显著影响了AHL信号分子的产生。功能验证结果表明，该系统能在丁香假单胞菌中工作，能对丁香假单胞菌进行插入、删除等基因组的修饰，具有一定应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为pRed质粒构建示意图；
图2为pSRK-1621-Kanr质粒的PCR鉴定，其中泳道1为1621-up-Kanr-dn基因片段，M为DL2000标准分子量DNAMarker；
图3为pMD19-3467-Kanr质粒的PCR鉴定，其中泳道1是3467-up-Kanr-dn基因片段，M为DL2000标准分子量DNAMarker；
图4为Psyr_1621(a)、Psyr_3467(b)基因敲除盒片段构建示意图；
图5为pRed02-Gmr质粒在Pss B728a中的转化；
图6为Pss B728a/pRed02-Gmr的PCR鉴定，其中泳道1、2、3、4是引物Exo F、Gam R扩增的重组酶基因片段，M为DL2000标准分子量DNAMarker；
图7为cDNA稀释梯度模板的qPCR扩增曲线；
图8为Pss B728a/pRed02-Gmr重组酶的转录；
图9为突变株的的PCR鉴定，其中泳道1、2、3、4是同源臂为500bp的B728aΔ1621::Kmr/pRed02-Gmr突变体、泳道5为同源臂为250bp的B728aΔ1621::Kmr/pRed02-Gmr突变体，泳道6为同源臂为750bp的B728aΔ3467::Kmr/pRed02-Gmr基因片段，M为DL2000标准分子量DNAMarker；
图10为突变株的信号分子合成分析，其中a为突变株信号分子AHL的产量，b为突变株AHL信号分子产量柱状图，纵坐标为蓝色晕圈直径；
图11为SacB介导pRed02-Gmr重组质粒的丢失；
图12为FLP介导Kan抗性的消除；
图13为Pss B728aΔPsyr_3467FRT重组后的短肽链。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
在以下实施例中所用到的材料(如实例中无特殊说明，则按常规试剂使用)：丁香假单胞菌丁香致病变种B728a、大肠杆菌DH5α、农杆菌Agrobacterium tumefaciens NT1购自美国爱荷华州立大学GwynA.Beattie教授课题组；
质粒pK18mobsacB、pSRK-Gmr、pKD46、pKD4、pHSG399购自美国伊利诺伊大学香槟分校John E.Cronan教授课题组；质粒pUC18-Mini-Tn7T-Gm购自Addgene公司；质粒pHSG399-FRT-Kanr-FRT为本实验室前期构建，构建方法为：以Mini-Tn7T-Gm质粒为模板，FRT GmEcoRI F和FRT Gm HindIII R为引物，引物上设计EcoRI和HindIII酶切位点，并与pHSG399有18bp同源序列，扩增FRT-Gmr-FRT cassette；用EcoRI和HindIII酶切pHG399，利用无缝克隆的方法连接，构建pHSG399-FRT-Gmr-FRT载体。以pHSG399-FRT-Gmr-FRT为模板，用FRT-P1、FRT-P2为引物扩增载体骨架；以pKD4为模板，用Kan-P1、Kan-P2为引物扩增Kan片段；引物上设计SacI酶切位点，并且载体骨架与Kan片段的引物之间含有18bp的同源序列，利用无缝克隆的方法连接，构建pHSG399-FRT-Kanr-FRT载体；质粒pRed02-Gmr为本发明构建；
质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；T4连接酶与连接酶Buffer均购于宝生物工程(大连)有限公司(Takara)；Golden Star T6Supper PCR Mix、2×T5 Super PCR Mix(Colony)均购于北京擎科生物科技有限公司(Tsingke Biotechnology Co.,Ltd.)；限制性核酸内切酶均购于NEB有限公司；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司广州分公司合成；RNA提取试剂盒为Omega Biotek(美国)公司生产；反转录反应试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)购于宝日医生物工程(大连)有限公司(Takara Bio)；2×RealStarGreen Fast Mixture(with ROX II)购于北京康润诚业生物科技有限公司(GenStar)。
在以下实例中所用到的常规方法包括(如实例中无特殊说明，则按常规方法操作)：大肠杆菌感受态的制备方法为接种5mL种子液摇菌过夜，转接按1％的接种量转接到100mL新鲜培养基中；震荡培养到OD600到0.35-0.4时，4℃4100rpm离心10min收集菌体；去上清，加入0.1倍体积预冷的0.1M MgCl2悬浮，冰浴10min，4℃，4100rpm离心10min；去上清，加入0.04倍体积预冷0.1M CaCl2悬浮，冰浴30min，4℃，4100rpm离心10min；去上清，加入1/25体积预冷的0.1M甘油CaCl2，悬浮沉淀；以100μL/管分装至1.5ml离心管，零下80摄氏度保存备用。试剂均用高温湿热灭菌。热激转化方法为将连接体系(10-20μL)或质粒(1-3μL)加入100μL感受态细胞，轻柔混匀；混匀，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴5min；加入800-1000μL新鲜的培养基，37℃温和震荡培养45min；取约100μL培养菌液，均匀涂布平板，晾干水份后倒置培养过夜。丁香假单胞菌Pss B728a制备电击感受态按照以下步骤进行：用5mL新鲜的King’s B液体培养基接种Pss B728a，30℃，180rpm震荡培养；待生长至OD600为0.6～0.8时，菌液冰浴10min，4℃，4000rpm离心10min，收集菌体；分别用预冷的5mL 10％甘油洗3次菌体，最后一次离心后倒掉剩余90μL左右上清液，重悬菌体即为电击感受态细胞。电击转化的步骤为：取90μL感受态细胞，加入10μL的片段或者3-5μL的质粒，冰浴10min；将混合液转移到电击杯，放入电击仪，设定电压为2100V，进行电击；在电击杯中加入890μL新鲜的King’sB液体培养基，吹打混匀，转移到新的2ml EP管中，30℃，180rpm震荡复苏2-3h；取100μL菌液涂布在添加了载体抗性抗生素的平板上，30℃培养箱静置培养过夜。
以下实施例中所用引物序列见表1。
表1
Figure BDA0003340371380000071
Figure BDA0003340371380000081
注：下划线为酶切位点。
实施例1Red重组质粒载体构建
本发明首先构建了Red重组质粒载体。本发明以pKD46、pSRK-Gmr、pK18mobsacB质粒为基础，分别以pKD46 Nco I F/pKD46 Not I R，pSRKNot I F/pSRKNco I R，pK18Not IF/pK18 Not I R引物扩增获得氨苄青霉素抗性基因、阿拉伯糖调控基因和重组酶基因(amp-araC-red)，广宿主复制子pBBR1(ori)，蔗糖敏感负筛选基因(sacB)(50μL扩增体系：质粒DNA 1μL，引物各2μL，Golden Star T6 Supper PCR Mix 45μL。扩增条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，Tm±5℃退火15s，72℃延伸5～15s/kb，72℃延伸5min。程序循环数：30个循环)。本发明在引物设计时，预先在引物中设计了酶切位点，分别用限制性核酸内切酶Nco I和Not I消化amp-araC-red、ori后(酶切条件为：片段60μL，10×酶切buffer 10μL，Nco I 2μL，Not I 2μL，双蒸水补至100μL，37℃反应4h)，用T4连接酶连接(连接条件为：酶切后片段各7.5μL，10×连接酶buffer 2μL，T4 DNA连接酶1μL，双蒸水补至20μL。16℃连接4h)，随后进行热激转化，对平板上的菌落进行PCR筛选(20μL扩增体系：阳性重组子菌液1μL，特殊引物各1μL，2×T5 Super PCRMix(Colony)10μL，双蒸水补至20μL。扩增条件：98℃预变性3min，98℃变性10s，Tm±5℃退火10s，72℃延伸5～15s/kb，72℃延伸2min。程序循环数：30个循环)。
筛选获得阳性重组子并测序无误后，命名为pBBR1-Ampr-AraC-Red，根据质粒提取试剂盒的说明书，提取重组质粒，限制性核酸内切酶Not I消化后纯化回收备用，同样消化sacB片段后，同上述的酶切连接方法，将sacB连接至线性化质粒pBBR1-Ampr-AraC-Red上，获得的阳性转化子测序无误后命名为pRed01-Ampr。
以pSRK-Gmr为模板，用Gm F1/Gm R1引物扩增获得庆大霉素抗性基因(50μL扩增体系：质粒DNA 1μL，引物各2μL，Golden Star T6 Supper PCR Mix 45μL。扩增条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，Tm±5℃退火15s，72℃延伸5～15s/kb，72℃延伸5min。程序循环数：30个循环)。以纯化回收后的庆大霉素基因作为引物，用Ω-PCR的方法将pRed01-Ampr的氨苄青霉素抗性基因替换为庆大霉素基因，所得的阳性转化子测序无误后命名为pRed02-Gmr。
质粒构建示意图参见图1。
实施例2敲除载体的构建
以Pss B728a总DNA为模板，引物F1和R1、F2和R2分别进行PCR扩增目的基因Psyr_1621的上、下游片段(同源臂各约500bp，不包含目的基因序列)；目的基因全长681bp，为敲除Psyr_1621的整个开放阅读框，以pKD4质粒为模板，引物F3和R3进行PCR扩增FRT-Kanr-FRT片段；由于引物F3和R1有同源序列、F2和R3有同源序列，三个片段回收后，共同作为模板，通过重叠PCR方法，用引物F1和R2进行扩增，使目的基因上游、Kanr、下游三个片段“搭桥”成一个大片段敲除盒(1621-up-Kanr-dn)。由于F1、R2引物与pSRK-Gmr载体骨架有同源序列，因此用Ω-PCR的方法将大片段和pSRK-Gmr质粒反应，转化后通过菌落PCR筛选阳性重组子并测序鉴定，获得用于Psyr_1621基因敲除的敲除盒片段克隆载体pSRK-1621-Kanr(图2)。
以Pss B728a总DNA为模板，引物F4和R4和F5和R5分别进行PCR扩增目的基因Psyr_3467的上、下游片段(同源臂各约1000bp，不包含目的基因序列)；目的基因全长930bp，由于敲除Psyr_3467的N端600bp，保留330bp，同时设计不破坏阅读框的FRT cassette，因此F4引入EcoRI(GAATTC)酶切位点，R4引入Kpn I(GGTACC)，F5引入Pst I(CTGCAG)，R5引入HindIII(AAGCTT)；由于引物R4和F5完全互补，重叠PCR后将上下游片段(3467-up-dn)进行酶切连接至pMD19-T载体、转化及菌落PCR筛选，得到的转化子为pMD19-T-3467-up-dn，提取质粒备用。同时以pHSG399-FRT-Kanr-FRT质粒为模板，引物F6和R6进行PCR扩增FRT-Kanr-FRT片段，由于pMD19-T-3467-up-dn质粒和引物F6、R6中有Kpn I和Pst I酶切位点，通过酶切连接、转化及菌落PCR筛选后，最终获得用于Psyr_3467基因敲除的敲除盒片段克隆载体pMD19-3467-Kanr(图3)。具体原理如图4所示。
实施例3丁香假单胞菌中qRT-PCR检测重组酶表达
根据上文所述的电击感受态的制备与电击方法，将测序无误后的pRed02-Gmr质粒通过电击转化导入至B728a中，涂布于含有Gm(30μg/ml)的平板上筛选(图5)；经过菌落PCR鉴定之后(图6)，确认pRed02-Gmr质粒能转移进入Pss B728a，并稳定复制传代。培养得到的单菌落为含有pRed02-Gmr质粒的重组子，命名为Pss B728a/pRed02-Gmr。
为了检测重组质粒中重组酶在Pss B728a中的表达情况，在转接种子液时，一管菌液加入过量的阿拉伯糖诱导剂，另一管菌液则不添加阿拉伯糖诱导剂，根据RNA提取试剂盒、反转录反应试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect RealTime)以及荧光定量PCR 2×RealStar Green Fast Mixture(with ROX II)试剂盒的说明书，分别提取了有/无阿拉伯糖诱导的Pss B728a/pRed02-Gmr的总RNA，按照反转录试剂盒说明书合成cDNA，并于–80℃保存备用。将cDNA模板分别用去离子水作10倍浓度梯度稀释，选取10-1～10-4为模板，每个梯度标准品设立3个重复，以16s rRNA基因为内参基因，以16sF、16sR作为引物，用伯乐CFX96荧光定量PCR仪进行荧光定量扩增。在模板浓度为10-3时(如图7)，CT值为17，故选用稀释浓度为10-3的cDNA作为模板，16s F/R，Gam F/R，Bete F/R，ExoF/R，Gm F/R作为引物，分别检测了exo、gam、bet、Gmr基因的转录水平(图8)。qRT-PCR的结果中可以得到在Pss B728a中，添加了阿拉伯糖诱导重组质粒的重组酶表达之后，Gm抗性基因的表达水平不受诱导剂的影响，而重组酶基因exo、gam和bet在阿拉伯糖诱导之后比诱导前的表达水平有明显的提高，分别为15、25、35倍的提高，初步判定pRed02-Gmr能发挥重组酶的功能。
实施例4PssB728a/pRed02-Gmr功能验证
本发明构建了含同源臂的敲除质粒，用以扩增同源重组的PCR片段。本发明拟敲除酰基高丝氨酸内脂合成酶基因Psyr_1621、Psyr_3467，验证Red重组酶基因是否能够在PssB728a中发挥重组功能。Psyr_1621是酰基高丝氨酸内脂的合成酶，Psyr_3467对酰基高丝氨酸内脂的合成是必需的，而酰化高丝氨酸内酯类(Acyl-homoserine lactones，AHLs)化合物是革兰氏阴性菌群体感应系统中最重要的一类信号分子，因此基因敲除后通过检验信号分子的合成来判断基因敲除的正确性。
以质粒pSRK-1621-Kanr作为模板，1621-500F/R、1621-250F/R作为引物，分别PCR扩增带有500bp和250bp同源臂的卡那霉素抗性基因，用以敲除Psyr_1621；将PCR产物电击转化至阿拉伯糖诱导后的Pss B728a/pRed02-Gmr中，分别得4个和1个重组子。对重组子进行PCR验证(图9)，全为正确的卡那霉素的抗性克隆。同样地，以质粒pMD19-3467-Kanr作为模板，3467-750F/R作为引物，PCR扩增带有750bp同源臂的卡那霉素抗性基因，电击转化和菌落PCR验证后得到1个正确的重组子(图9)。本发明采用报告菌株为农杆菌NT1(pJM 749(Ptra::lacZ),pSVB 33(pTIC58 traR))检测信号分子合成情况。用LB液体培养基接种报告菌株NT1，King’s B液体培养基接种待测菌株Pss B728aΔPsyr_1621::Kmr/pRed02-Gmr、PssB728aΔPsyr_3467::Kmr/pRed02-Gmr，30℃，180rpm摇菌过夜；将待测菌的OD600值调成1.0，报告菌的OD600值先调成1.0，再稀释100倍使用；将2mL报告菌菌液充分平铺于含有40μg/mLX-gal的无抗的MinA培养基平板表面，随后将多余的菌液吸净，晾干平板，各取2μL的待测菌菌液点在晾干的平板上，30℃静置培养2d，观察各菌产生的蓝色晕圈。图10中，与野生型相比，Pss B728a/pRed02-Gmr菌圈周围报告菌株产生的蓝色晕圈无明显变化，说明重组质粒不影响Pss B728a中AHL信号分子的产生；PssΔPsyr_1621菌圈周围报告菌株不产生蓝色晕圈，说明由pRed02-Gmr介导的基因敲除Psyr_1621的突变显著抑制AHL信号分子的产生；PssΔPsyr_3467菌圈周围报告菌株产生的颜色淡、蓝色晕圈极小，表明由pRed02-Gmr介导的基因敲除Psyr_3467的突变显著影响了AHL信号分子的产生。本发明的重组质粒pRed02-Gmr能在Pss B728a中发挥重组功能，成功敲除了Psyr_1621、Psyr_3467基因，检测信号分子AHL的合成验证了方法的正确性。
实施例5SacB介导的重组质粒丢失和FLP介导的抗性消除
本发明中重组质粒的丢失采用负筛选标记sacB。在遗传学中，sacB基因为最常用的负筛选标记，编码分泌型蔗糖果聚糖酶，该酶能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并且将果糖聚合成对菌株有潜在的毒性的高分子量的果聚糖，故当蔗糖存在时，可造成细胞死亡，含有sacB基因的菌株不能生存。由于pRed02-Gmr质粒携带负筛选标记基因sacB，使细菌不能在添加了蔗糖的平板上生长。因此，先接种PssB728aΔPsyr_1621::Kmr/pRed02-Gmr、PssB728aΔPsyr_3467::Kmr/pRed02-Gmr至新鲜的King’s B液体培养基，在不加抗性的培养基中30℃，180rmp传代培养。传至第四代后，稀释10-4～10-6倍后涂布于添加了10％的蔗糖的KBS培养基。此时生长的单菌落为pRed02-Gmr质粒从突变菌株中丢失的Pss B728aΔpsyr_1621::Kmr、Pss 728aΔpsyr_3467::Kmr。为了进一步验证，用牙签挑取KBS平板中的单菌落，分别点板于KB+Rif+Kan和KB+Rif+Kan+Gm平板上，如图11所示，含有Gm抗性平板中的突变菌株不生长，说明重组质粒丢失。
本发明利用FLP/FRT系统介导Kan抗性的丢失。由于其较高的重组效率，来源于酵母的FLP/FRT系统是目前研究和运用最多的位点特异性重组系统之一，被广泛应用于基因重组研究中的基因敲除、点突变、染色体组的大片段删除等操作。重组位点还具有方向性，当两个FRT位点同向且位于一条链上时，在FLP重组酶的存在下，两个FRT位点间的序列能够被删除，并且只留下一个FRT基因。利用有痕敲除的特点，在验证了本发明构建的重组质粒能对Psyr_1621进行全基因敲除的基础上，对Psyr_3467进行N端的部分敲除，FLP介导抗性丢失后，残留的FRT能与保留的目的基因形成不移码突变的肽链(图13)，避免了极性效应的发生。具体做法为，本发明将pFLP2-Ω通过电击转化导入到Pss B728aΔPsyr_1621::Kmr、Pss B728aΔPsyr_3467::Kmr菌株中，涂布在添加了Sp抗生素的KB平板上，同时用牙签挑取平板上的单菌落点在添加了Sp、Rif的KB平板和添加了Kan、Rif的KB平板上，选择不能在Kan平板上生长(图12)，但能在Sp平板上生长的菌进行菌落PCR筛选，获得无Kan抗性标记的突变株Pss B728aΔPsyr_1621/pFLP2-Ω、PssB728aΔPsyr_3467/pFLP2-Ω。由于pFLP2-Ω质粒携带负筛选标记基因sacB，因此同样可通过在培养基中添加10％的蔗糖将pFLP2-Ω质粒从突变菌株中去除，最终获得Pss B728aΔPsyr_1621、Pss B728aΔPsyr_3467。
pRed02-Gmr重组质粒序列为SEQ ID No.37所示序列，pSRK-1621-Kanr敲除盒质粒序列为SEQ ID No.38所示序列；pMD19-3467-Kanr敲除盒质粒序列为SEQ ID No.39所示序列；Pss B728aΔPsyr_1621突变体有痕敲除部分序列为SEQ ID No.40所示序列；Pss B728aΔPsyr_3467突变体有痕敲除部分序列为SEQ ID No.41所示序列。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种丁香假单胞菌中的重组系统及应用
<160> 47
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agacatgcgg ccgcaatcgg gcaaat 26
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agacatccat ggattcttcg tctgtt 26
<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcgaaccat ggcagtgtga ccgtgt 26
<210> 4
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<212> DNA
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agacatgcgg ccgccttgcc agcccg 26
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgattgcgg ccgccgtcgc ttggtc 26
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<212> DNA
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agacatgcgg ccgctcacat atacct 26
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tcgacggagt tccactgagc ggctcgacat tctaaaaccc ac 42
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ccgctctaga actagtggat cgacacgcac tgtcaaaccg gt 42
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ccgctcagtg gaactccgtc gatacacgtc ttgagcgatt gtgtagg 47
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atcacttatt caggcgtagc aattagccat ggtccatatg aatatcct 48
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actgcagatg tctggtacca tggcttcccg atgagtaaa 39
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gaccatgatt acgccaagct tttcagcggt ctgagcaa 38
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ctcatcggga agccatggta ccgcatgatc gaatt 35
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acacctggcg accgttcata ctgcaggatc gaattgggga 40
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acaccgcccg tcacacca 18
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gttcccctac ggctacctt 19
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taggtggcta cgtctccgaa 20
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caacgatgtt acgcagcagg 20
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ttaacttccg gagccacacc 20
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caagggggca gcgccacctt gggcaaggcc gaaggccgcg cagtcgatca acaagccccg 120
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caacaactta aaaaaggggg gtacgcaaca gctcattgcg gcaccccccg caatagctca 300
ttgcgtaggt taaagaaaat ctgtaattga ctgccacttt tacgcaacgc ataattgttg 360
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cacggggaga gcctgagcaa actggcctca ggcatttgag aagcacacgg tcacactgcc 1380
atggattctt cgtctgtttc tactggtatt ggcacaaacc tgattccaat ttgagcaagg 1440
ctatgtgcca tctcgatact cgttcttaac tcaacagaag atgctttgtg catacagccc 1500
ctcgtttatt atttatctcc tcagccagcc gctgtgcttt cagtggattt cggataacag 1560
aaaggccggg aaatacccag cctcgctttg taacggagta gacgaaagtg attgcgccta 1620
cccggatatt atcgtgagga tgcgtcatcg ccattgctcc ccaaatacaa aaccaatttc 1680
agccagtgcc tcgtccattt tttcgatgaa ctccggcacg atctcgtcaa aactcgccat 1740
gtacttttca tcccgctcaa tcacgacata atgcaggcct tcacgcttca tacgcgggtc 1800
atagttggca aagtaccagg cattttttcg cgtcacccac atgctgtact gcacctgggc 1860
catgtaagct gactttatgg cctcgaaacc accgagccgg aacttcatga aatcccggga 1920
ggtaaacggg catttcagtt caaggccgtt gccgtcactg cataaaccat cgggagagca 1980
ggcggtacgc atactttcgt cgcgatagat gatcggggat tcagtaacat tcacgccgga 2040
agtgaattca aacagggttc tggcgtcgtt ctcgtactgt tttccccagg ccagtgcttt 2100
agcgttaact tccggagcca caccggtgca aacctcagca agcagggtgt ggaagtagga 2160
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ggatcttgag ctcattcgat ctagaattgc attgag 36
<210> 45
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ttcgcccaga gctcacttgc attacagttt acgaaccg 38
<210> 46
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tgcaattcta gatcgaatga gctcaagatc c 31
<210> 47
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tcgtaaactg taatgcaagt gagctctggg cgaa 34

Claims (7)

1.一种丁香假单胞菌中的重组系统，其特征在于，核苷酸序列为如SEQ ID No.37所示序列，其中所述重组系统携带庆大霉素基因、阿拉伯糖调控基因和重组酶基因amp-araC-red、广宿主复制子pBBR1和蔗糖敏感负筛选基因sacB。
2.一种如权利要求1所述的丁香假单胞菌中的重组系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将氨苄青霉素抗性基因、阿拉伯糖调控基因和重组酶基因amp-araC-red和广宿主复制子pBBR1酶切连接，得到pBBR1-Ampr-AraC-Red；
(2)将蔗糖敏感负筛选基因sacB连接至线性化质粒pBBR1-Ampr-AraC-Red上，得到pRed01-Ampr；
(3)将pRed01-Ampr的氨苄青霉素抗性基因替换成庆大霉素基因，得到所述丁香假单胞菌中的重组系统pRed02-Gmr。
3.如权利要求1所述的丁香假单胞菌中的重组系统在丁香假单胞菌基因重组中的应用，其特征在于，
所述基因重组为基因敲除，具体为敲除Psyr_1621的全部基因或Psyr_3467的部分基因。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述丁香假单胞菌为丁香假单胞菌丁香致病变种B728a。
5.一种对丁香假单胞菌进行基因重组的方法，其特征在于，利用权利要求1中所述重组系统对丁香假单胞菌进行基因敲除。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基因重组为对丁香假单胞菌进行Psyr_1621全基因敲除，包括以下步骤：
(1)权利要求1中所述重组系统通过电击转化导入丁香假单胞菌中，得到含有权利要求1中所述重组系统的重组子Pss B728a/pRed02-Gmr；
(2)以Pss B728a总DNA为模板，PCR扩增Psyr_1621基因的上游和下游片段；以pKD4质粒为模板，扩增FRT-Kanr-FRT片段；将PCR扩增获得的Psyr_1621基因的上游和下游片段以及FRT-Kanr-FRT片段共同作为模板，通过重叠PCR方法，使Psyr_1621基因的上游片段、FRT-Kanr-FRT片段和Psyr_1621基因的下游片段搭桥成一个大片段；用Ω-PCR的方法将所述大片段和pSRK-Gmr质粒反应，转化后通过筛选和测序鉴定，获得用于Psyr_1621基因敲除的敲除盒片段克隆载体pSRK-1621-Kanr；
(3)以步骤(2)得到的pSRK-1621-Kanr作为模板，分别PCR扩增带有500bp和250bp同源臂的卡那霉素抗性基因，将PCR扩增产物电击转化至步骤(1)得到的Pss B728a/pRed02-Gmr中，经过验证后得到Psyr_1621全基因敲除的丁香假单胞菌。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基因重组为对丁香假单胞菌进行Psyr_3467基因的N端600bp敲除，保留330bp，同时设计不破坏阅读框的FRT cassette，包括以下步骤：
(1)权利要求1所述的Red重组系统通过电击转化导入至丁香假单胞菌中，得到含有权利要求1所述的Red重组系统的重组子Pss B728a/pRed02-Gmr；
(2)以Pss B728a总DNA为模板，PCR扩增Psyr_3467基因的上游和下游片段；将Psyr_3467基因的上游和下游片段进行酶切连接至pMD19-T载体，经转化及菌落PCR筛选，得到转化子pMD19-T-3467-up-dn；以pHSG399-FRT-Kanr-FRT质粒为模板，PCR扩增FRT-Kanr-FRT片段，再将所述FRT-Kanr-FRT片段与所述pMD19-T-3467-up-dn酶切连接，再经转化及菌落PCR筛选，获得用于Psyr_3467基因敲除的敲除盒片段克隆载体pMD19-3467-Kanr；
(3)以步骤(2)得到的pMD19-3467-Kanr作为模板，PCR扩增带有750bp同源臂的卡那霉素抗性基因，将PCR扩增产物电击转化至步骤(1)得到的Pss B728a/pRed02-Gmr中，经过验证后得到Psyr_3467部分基因敲除的丁香假单胞菌。
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