CN115896314A - 一种基于lf-rpa的猕猴桃细菌性溃疡病菌的无设备、可视化检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于LF‑RPA的猕猴桃细菌性溃疡病菌的无设备、可视化检测方法，涉及植物病原细菌检测技术领域，其技术方案要点为：检测试剂盒包含检测Psa的引物、探针和侧向流动试纸条，该方法具体步骤如下：S1：提取病组织中的DNA；S2：配置上述试剂盒中引物和探针的RPA反应体系，并向反应体系中加入提取的DNA，在恒温条件下进行RPA扩增反应；S3：分析扩增产物。该方法可以在猕猴桃的引种、育种、繁殖、生长及休园等环节快速检测和鉴定苗木是否含有Psa，进而达到预防以及采取针对性措施的目的，减少病害带来的损失。本发明不需要检测设备，成本低，操作便捷；检测时间短，灵敏度高，检测结果可视化，可应用于猕猴桃产业的生产实践中。
Description
技术领域
本发明涉及植物病原细菌检测技术领域，更具体地说，它涉及一种基于LF-RPA的猕猴桃细菌性溃疡病菌的无设备、可视化检测方法。
背景技术
由Psa(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa,丁香假单胞菌猕猴桃变种)侵染导致的猕猴桃溃疡病是世界范围内猕猴桃产业的毁灭性病害，业已成为限制猕猴桃生产最重要的因素之一，直接威胁猕猴桃产业的健康、可持续发展。该病发生迅速，防治难度大。由于目前尚未有较好的防治措施，迫使果农们只能尽早发现感病植株并将其砍伐后焚烧来控制病情发展。研发适用于田间快速检测溃疡病致病菌的方法、建立溃疡病发生的有效监测体系对溃疡病的防控具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于LF-RPA的猕猴桃细菌性溃疡病菌的无设备、可视化检测方法，该检测方法检测猕猴桃细菌性溃疡病菌不仅检测速度快，且灵敏度高，可用于田间猕猴桃溃疡病菌Psa的检测。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：第一方面，本发明提供丁香假单胞菌猕猴桃变种LF-RPA检测引物和探针，上、下游引物和探针序列分别如下：
上游引物：5′-GAAATCGAAACCGTTAAGGATAGTGTCG-3′；
下游引物：5′-[Biotin]-AAGTGTTGATATGGCGTTGA-3′；
探针：
5′-[FAM]-TTTAAAAATCGCACTCAATTCATCGACGA[THF]TATTTTTTACTCGC-[C3spacer]-3′。
本发明基于Psa的avrD1基因的保守序列设计了上述RPA引物和探针。
第二方面，本发明提供丁香假单胞菌猕猴桃变种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述的引物和探针，还包括侧向流动试纸条。
第三方面，本发明提供一种基于LF-RPA的猕猴桃细菌性溃疡病菌的无设备、可视化检测方法，具体包括以下步骤：
S1：提取病组织中的DNA；
S2：配置含有上述的引物和探针的RPA反应体系，并向反应体系中加入提取的DNA，在恒温条件下进行RPA扩增反应；
S3：分析扩增产物。
进一步的，所述S1中提取DNA的具体方法是：
取病组织于离心管中，向离心管中加入PEG-NaOH溶液，研磨棒研磨充分后静置2分钟，直接取研磨液用于下游LF-RPA检测。
进一步的，所述S2的RPA反应体系中探针浓度为0.1μM，引物浓度为0.42μM，反应温度为27℃，反应时间为30min。
进一步的，所述S3的具体方法为：将侧向流动试纸条加入混合物中，孵育5min，然后观察结果。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、采用RPA扩增技术建立快速检测Psa的方法，该方法能检测出最低76.1×10-7μg/μL的Psa，灵敏度是常规PCR的103倍，实现了无设备、可视化、灵敏快捷检测Psa；
2、该方法检测速度快，与常规PCR相比，30min内即可完成反应，尤其适用于田间快速检测；
3、利用这一方法可以在猕猴桃的引种、育种、繁殖、生长及休园等环节快速检测和鉴定苗木是否含有Psa，进而达到预防以及采取针对性措施的目的，减少病害带来的损失。
附图说明
图1是本发明实施例中LF-RPA的检测流程图；
图2是本发明实施例中Psa的RPA引物凝胶电泳筛选图；
图3是本发明实施例中不同探针浓度下LF-RPA反应的对比图；
图4是本发明实施例中不同引物浓度下LF-RPA反应的对比图；
图5是本发明实施例中不同反应温度下LF-RPA反应的对比图；
图6是本发明实施例中不同扩增时间下LF-RPA反应的对比图；
图7是本发明实施例中LF-RPA检测Psa的特异性评价图；
图8是本发明实施例中LF-RPA和PCR检测Psa的灵敏度对比图；
图9是本发明实施例中LF-RPA和PCR检测田间猕猴桃样品的对比图。
具体实施方式
以下结合附图1-9对本发明作进一步详细说明。
以下为实施例的具体试验内容：
1、材料与方法
1.1 DNA提取方法
PEG-NaOH法：取病组织于离心管中，在常温下，加入PEG-NaOH溶液，研磨棒研磨充分后静置2分钟，直接取研磨液用于下游LF-RPA检测。
1.2 LF-RPA扩增反应条件优化
采用控制单一变量法优化RPA扩增反应条件(包括探针、引物浓度、扩增温度和扩增时间)。
1.3 LF-RPA扩增产物检测方法
LF-RPA反应完成后，将侧向流动试纸条加入混合物中，孵育5min，若试纸条的检测线(Test line)和质控线(Control line)均出现明显条带，为阳性检测，有扩增产物生成；仅在质控线上有明显条带则检测结果为阴性，没有扩增产物生成。
1.4 LF-RPA检测的特异性评价
在最佳LF-RPA反应体系下，分别以Psa和Pst(Pseudomonas syringae pv tomato,Pst,丁香假单胞菌番茄变种)的菌液或DNA为扩增模板，进行RPA扩增来评价LF-RPA的检测特异性。
1.5 LF-RPA的灵敏度评价
以PEG-NaOH法提取菌株的DNA，将DNA按10倍梯度稀释法稀释至10-9。以系列稀释的DNA为模板，进行LF-RPA扩增反应并对扩增产物进行判断，评价LF-RPA的检测灵敏度。
1.6 LF-RPA检测方法的应用
用无针头的一次性注射器接种猕猴桃叶片，在接种后大约12小时，按PEG-NaOH法提取损伤叶片的DNA。以损伤叶片的总DNA提取液为模板进行LF-RPA检测，以注射水的猕猴桃叶片重复实验作为NTC。检测流程如图1所示。
2、结果与分析
2.1、PRA引物和探针的设计
通过多个序列比对分析了来自GenBank的Psa基因，选择Psa的avrD1基因的保守序列设计RPA特异性引物，比较各组引物的Tm值、GC含量、引物末端稳定性等因素，选择合适的RPA扩增引物。以Psa为模板进行琼脂糖凝胶电泳，如图2所示，1为Marker；2-7为不同引物扩增Psa处理；8-13为不同引物扩增Pst处理；14-19为不同引物扩增大肠杆菌处理；20为阴性对照，该引物(箭头处)有条带生成而其他菌株和空白对照均没有条带生成，这表明设计的引物可用于Psa的LF-RPA检测。同时，为了实现扩增产物的可视化检测，将引物RPA R的5’末端用生物素(Biotin)进行修饰，探针的5’末端用荧光基团(FAM)、3’末端用阻断基团(C3spacer)修饰、中间用THF残基替换部分碱基，同时，使用Psa基于ITS序列的引物F1/R2用于常规PCR检测，LF-RPA引物序列信息如表1所示。
表1 Psa的RPA引物和探针序列信息
a:5′端加上[biotin]；
b:5′端加上[FAM],3′端加上[C3spacer],CGA后第一个TAT部分碱基替换为THF残基。
2.2、LF-RPA检测的探针、引物浓度优化
为得到最佳的检测效果，减低检测成本，对扩增反应的探针和引物浓度进行优化。在对探针浓度的优化中，设定5个浓度梯度进行RPA扩增反应。结果表明：所有浓度的探针都可以使试纸条测试线条带清晰，如图3所示(1～5为RPA体系中探针浓度分别为0.10，0.11，0.12，0.13和0.14μM下处理后的样品；P：阳性对照；N：阴性对照)，因此为减低检测成本，选择探针浓度为0.10μM作为LF-RPA检测Psa的最适反应浓度。
在引物浓度优化中，引物浓度在0.42～0.50μM时条带较清晰，如图4所示(1～5为RPA体系中引物浓度分别为0.34，0.38，0.42，0.46和0.50μM处理后的样品；P：阳性对照；N：阴性对照)，为降低检测成本，选择引物浓度0.42μM作为LF-RPA检测Psa的最适反应浓度。
2.3、LF-RPA检测反应温度的确定
为获得最佳扩增效果，对LF-RPA反应的扩增温度进行优化。扩增温度为19℃～25℃时，条带较弱；温度为27℃～41℃时，试纸条条带非常清晰，但差别不大，因此，检测Psa的最佳扩增温度为27℃，如图5所示(1～8为RPA体系中反应温度分别为19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39和41℃处理后的样品；N：阴性对照)，即反应在室温下也可以进行。
2.4、LF-RPA检测反应时间的确定
为缩短检测时间，对LF-RPA反应时间进行优化。结果如图6所示(1～5为RPA体系中反应时间分别为(10，20，30，40和50min处理后的样品；P：阳性对照；N：阴性对照)，反应时间为10分钟时条带较弱，当反应时间在30～40min时，扩增得到条带的趋于稳定，因次，检测Psa的最佳反应时间为30min。
2.5、LF-RPA检测Psa的特异性
分别以Psa和Pst为模板，以优化后的LF-RPA检测体系进行特异性检测。检测结果如图7所示(1：Psa；2：Pst；P：阳性对照；N：阴性对照)，只有Psa的扩增产物在试纸条中质控线和检测线均有条带呈红色，检测结果呈阳性。这表明建的LF-RPA反应体系检测Psa具有特异性。
2.6、优化的LF-RPA灵敏度验证
将受Psa侵染的猕猴桃样品提取DNA，分光光度计测其浓度为76.1μg/μL，将DNA进行10倍梯度稀释(100～10–9)并以此为模板进行LF-RPA反应，以LFD判断扩增结果。检测结果如图8所示(稀释倍数分别为100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8和10-9的DNA浓度作为模板的反应；P：阳性对照；N：阴性对照)，随着模板浓度稀释倍数的增加，电泳生成的梯形条带逐渐消失，当稀释倍数为10–4时，无扩增条带产生。在LF-RPA扩增中，当稀释倍数为10–8及以下时，在LF-RPA检测Psa的产物中，加入试纸条后仅在质控线上生成一条红色条带，这表明在该梯度均无扩增产物生成。因此LF-RPA检测方法可以检测出76.1×10–7μg/μL的Psa灵敏度更高，比常规PCR高103倍。
2.7、LF-RPA检测方法的应用
利用建立的LF-RPA检测方法对人工接种Psa的猕猴桃样品进行检测，检测结果如图9所示(1：猕猴桃接种样品；N：阴性对照；P：阳性对照)。以上结果表明本研究建立的LF-RPA检测方法可用于田间猕猴桃溃疡病菌Psa的检测。
以下为Psa avrD1基因序列：
Psa 16S-23S部分序列：
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (6)
1.丁香假单胞菌猕猴桃变种LF-RPA检测引物和探针，其特征是：上、下游引物和探针序列分别如下：
上游引物：5′-GAAATCGAAACCGTTAAGGATAGTGTCG-3′；
下游引物：5′-[Biotin]-AAGTGTTGATATGGCGTTGA-3′；
探针：
5′-[FAM]-TTTAAAAATCGCACTCAATTCATCGACGA[THF]TATTTTTTACTCGC-[C3spacer]-3′。
2.丁香假单胞菌猕猴桃变种检测试剂盒，其特征是：所述检测试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针，还包括侧向流动试纸条。
3.一种基于LF-RPA的猕猴桃细菌性溃疡病菌的无设备、可视化检测方法，其特征是：具体包括以下步骤：
S1：提取病组织中的DNA；
S2：配置含有权利要求1所述的引物和探针的RPA反应体系，并向反应体系中加入提取的DNA，在恒温条件下进行RPA扩增反应；
S3：分析扩增产物。
4.根据权利要求3所述的一种基于LF-RPA的猕猴桃细菌性溃疡病菌的无设备、可视化检测方法，其特征是：所述S1中提取DNA的具体方法是：
取病组织于离心管中，向离心管中加入PEG-NaOH溶液，研磨棒研磨充分后静置2分钟，直接取研磨液用于下游LF-RPA检测。
5.根据权利要求3所述的一种基于LF-RPA的猕猴桃细菌性溃疡病菌的无设备、可视化检测方法，其特征是：所述S2的RPA反应体系中探针浓度为0.1μM，引物浓度0.42μM，反应温度为27℃，反应时间为30min。
6.根据权利要求4所述的一种基于LF-RPA的猕猴桃细菌性溃疡病菌的无设备、可视化检测方法，其特征是：所述S3的具体方法为：将侧向流动试纸条加入混合物中，孵育5min，然后观察结果。
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