KR20020015708A - 탄소 동화의 조절 - Google Patents

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아처 다니엘 미드랜드 캄파니
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Abstract

본 발명은 이산화탄소의 동화를 향상시킴으로써 미생물의 생산성을 증가시키는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 활성화를 위해 아세틸 조효소 A를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작된 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 암호화하는 유전자들을 제공한다. 아세틸-CoA 또는 아스파르트산에 의해 조절되지 않는 PEP 카복실라아제를 암호화하는 유전자는 3 탄소 중간산물 PEP에서 4 탄소 중간산물 OAA로의 탄소 흐름을 향상시킬 수 있고, OAA로부터 유도되는 화합물의 생산에 기여할 수 있으며, 아미노산 생합성을 증가시킬 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자, 이러한 유전자로 형질전환시킨 박테리아 및 이 형질전환 박테리아를 이용한 아미노산의 생산 방법을 제공한다.

Description

탄소 동화의 조절{REGULATION OF CARBON ASSIMILATION}
포스포에놀피루베이트(PEP) 카복실라아제(EC 4.1.1.31)는 거의 모든 박테리아와 식물에서 발견되는 효소이다. PEP 카복실라아제는 트리카복실산(TCA) 사이클과 L-아스파르트산 생합성에 공통으로 사용되는 대사 중간산물인 4 탄소 옥살아세테이트(OAA)를 형성하는 3 탄소 당분해 중간산물 PEP와 이산화탄소 사이의 축합 반응을 촉매한다. TCA 사이클은 아미노산 생합성에 소모된 중간산물을 대체하기 위해서 계속적인 C4분자의 재충전을 필요로 하며, 비오틴 비의존성 PEP 카복실라아제는 TCA 사이클에 OAA를 공급하는 데 있어서 보충대사 역할을 함으로써, 이러한 기능을 수행하는 것을 보조한다.
OAA는 아미노산, 특히 글루타메이트 계통, 즉 글루타메이트, 아르기닌 및 프롤린, 그리고 아스파르테이트 계통, 즉 아스파르테이트, 리신, 메티오닌, 트레오닌 및 이소루신과 같은 세포 대사산물의 생산을 위한 매우 중요한 기질이다. PEP 카복실라아제는 OAA를 형성하는 반응을 촉매함으로써 대사 과정에 의해 유기산을 공급하는 데 있어서 중요한 역할을 한다. 예를 들면, 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli)에 의한 포도당으로부터의 숙신산의 발효 생산은 PEP 카복실라아제의 과다 발현에 의해 상당히 증가되었다. 이에 대해서는 Millard, C. 등의 문헌[Appl. Environ. Microbiol.62:1808-1810(1996)]을 참조할 수 있다. 따라서, PEP 카복실라아제는 또한 글루타메이트와 아스파르테이트로부터 형성되는 아미노산의 생산에 중요한 역할을 한다.
아미노산은 단백질의 구성성분으로서 세포 내에 일반적으로 존재하는 화합물이다. 그러나, 경제적인 에너지 대사 및 물질 대사를 위해, 아미노산의 생산은 엄격히 제어된다. 이러한 제어는 주로 피드백 제어이며, 피드백 제어에서는 대사 경로의 최종 생성물이 대사 경로의 초기 단계를 촉매하는 효소의 활성을 억제한다. PEP 카복실라아제의 발현 역시 다양하게 조절된다.
예를 들면, 브레비박테리아(Brevibacterium) 속, 코리네박테리아(Corynebacterium) 속 또는 에쉐리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물의 PEP 카복실라아제의 경우, PEP 카복실라아제 활성은 아스파르트산에 의해 억제된다. 이에 대한 참고 문헌으로는 Mori, M. 등의 문헌[J. Biochem.98:1621-1630(1985)], O'Regan, M. 등의 문헌[Gene77:237-251(1989)])이 있다. 그러므로,PEP 카복실라아제가 관여하는 전술한 아미노산 생합성 역시 아스파르트산에 의해 억제된다. 그러나, 아스파르트산에 대해 감소된 민감성을 갖는 코리네박테리아 미생물 유래의 PEP 카복실라아제 활성에 대해서도 설명된 바 있다. 이에 대해서는 Eikmanns, B.J. 등의 문헌[Mol. Gen. Genet.218:330-339(1989)]을 참조할 수 있다.
아세틸 조효소 A(아세틸-CoA)는 아스파르트산에 의해 알로스테릭하게 억제되는 것 외에도, 예컨대 브레비박테리아 플라범(Brevibacterium flavum) 및 에쉐리키아 콜리 유래의 PEP 카복실라아제의 알로스테릭 활성제이다. 이에 대해서는 Mori, M. 등의 문헌[J. Biochem.98:1621-1630(1985)], Morikawa, M. 등의 문헌[J. Biochem.81:1473-1485(1977)]을 참조할 수 있다. 아스파르트산 또는 아세틸-CoA에 의해 조절되지 않는 다른 유기체 유래의 PEP 카복실라아제도 보고되어 있다. 이에 대해서는 Valle, F. 등의 문헌[J. Indus. Microbiol.17:458-462(1996)], O'Regan, M. 등의 문헌[Gene77:237-251(1989)], Vance, C. 등의 문헌[Plant Physiol.75:261-264(1984)]을 참조할 수 있다.
보충대사 효소 PEP 카복실라아제는 OAA의 최적 풀의 유지에 중요하고, 그 결과 OAA 유래의 아미노산의 생합성 레벨을 결정하기 때문에, 발효에 의한 아미노산 생산을 향상시키는 한가지 방법은 해당ppc유전자를 조작하는 것이 될 것이다. 예를 들면, 브레비박테리아 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum) 유래의ppc유전자의 증폭은 프롤린과 트레오닌의 생산을 향상시키는 것으로 나타났다. 이에 대해서는 Sano, K. 등의 문헌[Agric. Biol. Chem.51:597-599(1987)]을 참조할 수있다.
피드백 제어에 둔감성으로 전환된 돌연변이 균주를 이용함으로써 아미노산 발효에 있어서의 효율적인 생산을 위한 다양한 기법들이 개발되었다. 그러나, 아스파르트산 또는 글루타민산 계통의 아미노산의 발효 생산을 위해 식물로부터 유래되는 PEP 카복실라아제를 이용하거나, 동일한 계통의 아미노산의 발효 생산을 위해 PEP 카복실라아제가 아세틸-CoA 또는 아스파르트산에 의해 실질적으로 조절되지 않는 미생물 염색체 DNA로 삽입된 코리네폼 박테리아(Coryneform bacterium) 유래의ppc유전자를 이용하는 것에 대한 보고는 없다.
미국 특허 제4,757,009호(Sano 등; Ajinomoto Company)는 PEP 카복실라아제를 암호화하는 유전자가 작용가능하게 삽입된 플라스미드를 포함하는 재조합 DNA 분자를 보유하는 코리네박테리아 종 또는 브레비박테리아 종을 배양 배지에서 배양하는 단계 및 이 배양 배지로부터 아미노산을 분리하는 단계를 포함하는 발효에 의해 아미노산을 생산하는 방법에 대해 개시하는데, 상기 유전자는 PEP 카복실라아제 유전자를 보유하는 코리네박테리아 종 또는 브레비박테리아 종으로부터 분리된 염색체 유전자이며, 아미노산을 암호화하는 염색체 유전자를 보유한다. PEP 카복실라아제를 암호화하는 유전자가 분리된 코리네박테리아 종 또는 브레비박테리아 종은 아스파르트산에 의한 피드백 억제가 약화된 종이다.
유럽 특허 제358,940호(Bachman 등; Degussa Aktiengesellschaft)는 코리네박테리아 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) DM58-1에 도입된 플라스미드 pDM6에 대해 개시하고 있으며, 이는 독일 미생물 수집소(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen; DSM)에 DSM 4697로 기탁된 것이고, 상기 플라스미드는 PEP 카복실라아제 활성을 갖는 단백질의 생산을 위한 암호화 정보를 포함하는 유전적 서열을 포함한다.ppc유전자는 코리네박테리아 글루타미컴(Corynebacteruim glutamicum) ATCC 13032의 게놈 은행에서 분리한 것이고, PEP 카복실라아제는 아세틸-CoA에 의해 자극되지 않는다. 플라스미드 pDM6를 포함하는 코리네박테리아 속 또는 브레비박테리아 속에 속하는 숙주 박테리아를 적절한 배지에서 배양하는 단계 및 이 배지로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, 발효에 의해 L-리신, L-트레오닌 및 L-이소루신을 생산하는 방법에 대해서도 개시하고 있다.
미국 특허 제5,876,983호(Sugimoto 등; Ajinomoto Company)는 3-브로모피루베이트, 아스파르트산-β-하이드라지드 및 DL-트레오-β-히드록시아스파르트산으로 구성된 군에서 선택되는 야생형 PEP 카복실라아제 억제제의 존재하에 에쉐리키아 미생물을 배양하여, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작된 돌연변이 PEP 카복실라아제를 암호화하는 DNA 서열을 보유하는 에쉐리키아 속의 미생물을 선별하는 단계; 돌연변이 PEP 카복실라아제를 암호화하는 DNA 서열로 형질전환시킨 에쉐리키아 속 또는 코리네폼 박테리아 속의 미생물을 적절한 배지에서 배양하는 단계; 및 L-리신, L-트레오닌, L-메티오닌, L-이소루신, L-글루타민산, L-아르기닌 및 L-프롤린으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산을 상기 배지로부터 분리하는 단계를 포함하는 아미노산의 생산 방법에 대해 개시하고 있다.
재조합 DNA 기법을 이용하여 아미노산 생산 박테리아를 배양하는 방법의 많은 예들이 있지만, 항상 높은 레벨의 아미노산 생산성이 얻어지는 것은 아니다. 그러므로, 높은 역가와 수율로 발효에 의해 아미노산을 생산하는 방법이 여전히 요구되고 있다. 아세틸-CoA 또는 아스파르트산에 의해 실질적으로 조절되지 않는 PEP 카복실라아제는 3 탄소 중간산물 PEP로부터 4 탄소 중간산물 OAA로의 탄소 흐름을 향상시킬 수 있었다. 이러한 향상된 흐름은 OAA 유래의 화합물 생산에 기여하고 아미노산 생합성을 증가시켰다.
본 발명은 활성화를 위해 아세틸 조효소 A를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작된(desensitized) 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 암호화하는 유전자들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 유전자들을 포함하는 재조합 DNA 분자, 상기 유전자들로 형질전환시킨 박테리아 및 이 형질전환 박테리아를 이용하여 아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 유전자 치환법의 모식도이다.
발명의 상세한 설명
본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용되는 몇가지 용어를 정의한다.
본원에서 사용되는 "활성제"란 폴리펩티드를 우선 활성화되도록 하는 데 필요한 물질 및 단지 활성을 증가시키는 물질 모두를 포함한다.
본원에서 사용되는 "아미노산"이란 자연 발생적 L 아미노산을 말한다(알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 시스틴, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린).
"키메라 유전자"는 이종성의 조절 서열 및 암호화 서열을 포함하는 유전자를 말한다. 이것은 재조합 DNA 기법에 의해 생산된 하이브리드 유전자이다.
"DNA 단편"이란 디옥시리보핵산 분자의 일부를 말한다.
본원에서 사용되는 "발현"이란 유전자에 의해 암호화된 단백질 생성물의 생산을 의미하는 것이다.
"유전자"란 암호화 영역에 선행하는 조절 서열(5' 비암호화 영역) 및 후행하는 조절 서열(3' 비암호화 영역)을 포함하는, 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미한다. 유전자는 발현의 조절, 즉 전사 및 번역의 조절에 관여하는 조절 DNA 서열 및 특징적인 폴리펩티드를 제공하도록 전사 및 번역되는 암호화 서열을 포함하는 분리된 염색체 영역이다.
"숙주 미생물"이란 도입된 유전 물질로 형질전환되는 미생물을 말한다.
"억제"란 폴리펩티드의 활성 감소 및 완전한 활성 결여 둘다를 의미한다.
"분리된"이란 물질이 원래의 환경(예, 자연 발생적이라면 자연 환경)으로부터 제거되는 것을 의미한다.
"폴리펩티드" 또는 "단백질"이란 아미드 결합(펩티드 결합이라고도 알려짐)에 의해 직선형으로 결합된 단량체(아미노산)들로 구성된 분자를 의미한다. 폴리펩티드 또는 단백질은 아미노산의 분자적 연쇄를 나타내며, 생성물의 구체적인 길이를 나타내지는 않는다. 따라서, 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질은 폴리펩티드의 정의에 속하는 것들이다. 이 용어는 폴리펩티드의 발현 후 변형, 예컨대 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등이 일어난 것을 의미하기도 한다. 재조합 또는 유도체 폴리펩티드는 반드시 정해진 핵산 서열로부터 번역될 필요는 없다. 이것은 화학 합성 또는 재조합 발현 시스템의 발현을 비롯하여 어떤 방법으로도 생성될 수 있다.
"조절 서열"이란 암호화 서열의 상류(5'), 내부 및/또는 하류(3')에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 의미하며, 잠재적으로 세포의 단백질 생합성 기관과 연계하여 암호화 서열의 전사 및/또는 발현을 제어한다.
"합성 DNA"란 화학 합성법에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 제조된 핵산 분자를 의미한다.
"형질전환"이란 숙주 세포 게놈 DNA의 일부로서 또는 독립적인 분자로서 외부 유전자가 숙주 세포로 전달된 후 이것이 유전적으로 안정하게 유전되는 현상을 의미한다.
본 발명의 일 측면은 PEP 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 제공하는 것으로, 상기 유전자는 숙주 미생물에서 발현될 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸-CoA를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작되어 있다.
효소 PEP 카복실라아제를 암호화하는ppc유전자는, 이것이 외떡잎 식물류 또는 쌍떡잎 식물류에 속하는 식물이나, 또는 브레비박테리아 속 또는 코리네박테리아 속에 속하는 미생물의 PEP 카복실라아제를 암호화하는 유전자이고, 발현된 폴리펩티드가 활성화를 위해 아세틸-CoA를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 거의 탈감작되어 있다면 어떠한 것도 가능하다.ppc유전자는 이것의 염기 서열을 결정하고 클로닝하는 것이 바람직하다. 클로닝되지 않은 경우, 상기 유전자를 포함하는 DNA 단편을 PCR법 등을 이용하여 증폭하여 분리한 다음, 적절한 벡터를 이용하여 클로닝할 수 있다.ppc유전자의 바람직한 공여체는 아스파르트산에 의한 피드백 억제가 약화된 종이다. 이러한 종은 아스파르트산-길항작용(antagonistic) 억제제에 대해 내성인 것으로 간주한다.
PEP 카복실라아제는 C4식물에서의 광합성에 중요한 효소이다. 이는 엽육 세포의 시토졸에 특이적으로 위치하며, 인산화/탈인산화 과정에 의해 조절된다. 이에 대해서는 Giglioni-Guivarc'h, N. 등의 문헌[Cytometry23:241-249(1996)]을 참조할 수 있다. 또한, PEP 카복실라아제는 콩과식물 뿌리혹에서의 공생적 N2고정 중의 CO2동화에 있어서 중요한 역할을 한다. 이에 대해서는 Pathirana, S. 등의문헌[Plant J.12:293-304(1997)]을 참조할 수 있다.
일 구체예에서, PEP 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편은 외떡잎 식물류 또는 쌍떡잎 식물류에 속하는 식물에서 유래된다. 바람직한 구체예의 DNA 단편은 자주개자리(alfalfa) 식물에서 유래된 것이다. 메디카고 사티바(Medicago sativa) 종에서 유래된 DNA 단편이 가장 바람직하다.
메디카고 사티바 종 유래의 PEP 카복실라아제 활성은 L-아스파르트산에 의해 거의 억제되지 않는다고 알려져 있다. 이에 대해서는 Vance, C.P. 등의 문헌[Plant Physiol.75:261-264(1984)]을 참조할 수 있다. 메디카고 사티바 종 유래의 천연ppc뉴클레오티드 서열 역시 알려져 있으며(Pathirana, S. 등의 문헌[Plant Molecular Biology20:437-450(1992)]), 이는 서열 번호 1에 제시하였고, 이에 의해 암호화된 천연 PEP 카복실라아제의 아미노산 서열은 서열 번호 2에 제시하였다. 이러한 서열들은 공지되어 있으므로, 이 뉴클레오티드 서열을 기초로 하여 프라이머를 디자인하고 합성한 다음, 메신저 RNA를 주형으로 사용하여 PCR을 통해 유전자를 얻을 수 있다.
식물 PEP 카복실라아제의 번역 후 조절은, 예컨대 단백질의 인산화를 통해 이루어진다. 이에 대해서는 Jiao, J.A. 등의 문헌[Arch. Biochem. Biophys.269:526-535(1989)], Duff, S.M. 등의 문헌[Eur. J. Biochem.228:92-95(1995)]을 참조할 수 있다. 자주개자리 PEP 카복실라아제는 여러개의 보존된 서열을 보유하며, 이 중 하나는 인산화와 관련이 있다고 제시되었다(MASIDAQLR, 잔기 8∼16). 이에 대해서는 Pathirana, S.M. 등의 문헌[Plant Molecular Biology20:437-450(1992)]을 참조할 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예를 들면, 외떡잎 식물류 또는 쌍떡잎 식물류에 속하는 식물 유래의 PEP 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편은 1 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 변형된다. 변형은 아미노산 서열 Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg을 암호화하는 뉴클레오티드를 결실시키는 것을 포함하는 것이 가장 바람직하다.
또 다른 구체예를 들면, PEP 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편은 브레비박테리아 속 또는 코리네박테리아 속에 속하는 미생물에서 유래된다. 바람직한 구체예는 DNA 단편이 코리네박테리아 글루타미컴 종에서 유래된 것이다. 코리네박테리아 글루타미컴의 천연ppc뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3에 제시하였다.
본 발명의 활성 PEP 카복실라아제 분자의 아미노산의 수는 다양할 수 있으며, PEP 카복실라아제 활성 및 원하는 탈조절 특성을 갖는 자주개자리 식물 또는 코리네박테리아 종에서 유래되는 모든 아미노산 서열은 모두 본 발명에 속하는 것으로 간주된다. 보존적 치환에 의해서만 서로 다른 폴리펩티드 서열 역시 본 발명에 속하는 것이다. 이러한 보존적 치환은 동일한 부류의 또 다른 아미노산의 서열 내의 일정한 위치에서 한개의 아미노산이 치환된 것으로 이루어진다. 서열 내에 위치된 1 이상의 비보존적 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입이, 폴리펩티드의 생물학적 활성이 파괴되는 정도까지 폴리펩티드를 변화시키지 않는다면, 이 역시 본 발명에 속하는 것이다.
최종적인 PEP 카복실라아제 단백질 분자의 기능적 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 침묵 변화를 일으키는, 결실, 삽입 및/또는 치환과 같은 서열에 가해진 변형 역시 본 발명에 속하는 것으로 간주된다. 예를 들면, 유전 암호의 축퇴성을 반영하는 유전자 서열의 변화 또는 일정한 위치에서 일어난 화학적으로 동등한 아미노산을 생성하게 하는 유전자 서열의 변화는 본 발명에 속하는 것으로 간주된다.
따라서, 본 발명은 특정한 예시 서열보다 많은 것을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 제시된 변형 각각은 당업자들이 잘 알고 있는 것이며, 암호화된 생성물의 생물학적 활성 보유 여부 결정 역시 당업자라면 잘 아는 것이다.
또 다른 구체예에서, PEP 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편은 브레비박테리아 속 또는 코리네박테리아 속에 속하는 미생물 유래의 불완전 PEP 카복실라아제 뉴클레오티드 서열 및 외떡잎 식물 류 또는 쌍떡잎 식물류에 속하는 식물 유래의 불완전 PEP 카복실라아제 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메라 유전자이다. 2개의 불완전 서열은 함께 PEP 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 완전 키메라ppc유전자를 형성하며, 이때 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸-CoA를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작되어 있다.
바람직한 구체예를 들면, 불완전 PEP 카복실라아제 뉴클레오티드 서열 중 하나는 코리네박테리아 속에 속하는 미생물에서 유래되는 것이고, 다른 하나는 자주개자리 식물에서 유래되는 것이다. 하나는 코리네박테리아 글루타미컴 종에서 유래되는 불완전 PEP 카복실라아제 뉴클레오티드 서열이고, 다른 하나는 메디카고 사티바 종에서 유래되는 불완전 PEP 카복실라아제 뉴클레오티드 서열인 것이 가장 바람직하다.
또 다른 구체예에서, DNA 단편은 상보성 DNA(cDNA), 게놈 DNA 또는 합성 DNA이다. PEP 카복실라아제를 암호화하는 본 발명의 DNA 단편은 화학적 합성, cDNA 또는 게놈 라이브러리 스크리닝, 발현 라이브러리 스크리닝 및/또는 cDNA의 PCR 증폭을 비롯한 다양한 방법을 통해 쉽게 얻을 수 있지만, 이러한 방법에 국한되는 것은 아니다. 이러한 DNA를 분리하는 데 유용한 방법들은, 예컨대 Sambrook 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor(1989)], Ausubel 등의 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press(1994)], 그리고 Berger 및 Kimmel의 문헌[Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, Vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego(1987)]에 설명되어 있다.
ppc유전자의 분리는, 예컨대 다음 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 아래의 예는 간단히 코리네박테리아에 대해서만 설명하고 있지만, 브레비박테리아 속에 속하는 박테리아 역시 사용할 수 있다. 먼저,ppc유전자를 보유하는 코리네박테리아 종으로부터 염색체 유전자를 추출한다(예컨대, H. Saito 및 K. Miura의 문헌[Biochem. Biophys. Acta72:619(1963)]의 방법 이용). 이 유전자를 적절한 제한 효소로 절단한 다음, 코리네폼 박테리아 또는 E. 콜리에서 증폭될 수 있는 플라스미드 셔틀 벡터로 서브클로닝한다. 염색체 유전자를 절단하기 위해서는 다양한제한 효소를 이용할 수 있으며, 예컨대 절단 반응 시간, 온도 등을 조절함으로써 절단 정도를 조절할 수 있다. 당업자라면 제한 효소에 의한 DNA의 절단에 대해서 잘 알고 있으므로, 여기서 상세히 설명할 필요는 없다.
코리네폼 박테리아 또는 E. 콜리의 PEP 카복실라아제 결핍 돌연변이를 이렇게 얻은 재조합 DNA로 형질전환시킨다. 이렇게 얻은 형질전환체를 벡터 DNA 및/또는 수용체가 보유하는 특성을 기초로 하여 통상적인 방법으로 선별 및 분리할 수 있다. 예를 들면, PEP 카복실라아제 활성을 보유하게 된 박테리아 종을 분리하여, 그로부터ppc유전자를 분리할 수 있다.
전술한 바와 같이 본 발명의 DNA 단편으로 형질전환시킨 미생물을 배양하여, 이 DNA 서열을 발현시킬 경우, 활성화를 위해 아세틸-CoA를 필요로 하지 않고, 아스파르트산 억제에 대해 거의 탈감작된 효소를 얻을 수 있다. 아세틸-CoA의 부재 및/또는 존재하에 PEP 카복실라아제 활성을 측정함으로써, 예컨대 효소가 활성제로 아세틸-CoA를 필요로 하는 지를 명백히 알 수 있다. 효소 반응 시스템에서 아스파르트산의 존재 및/또는 부재하에 PEP 카복실라아제 활성을 측정함으로써 이렇게 얻은 효소가 아스파르트산에 의해 실질적으로 억제되는 지 역시 명백하게 알 수 있다.
효소 활성은 분광법(Yoshinage, T. 등의 문헌[J. Biochem.68:747-750(1970)]) 등을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 반응이 일어나는 동안 효소 분석을 연속적 또는 역학적 모드로 측정할 경우, 흡광도(통상 340 nm에서) 감소를 추적함으로써 반응을 분광법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 PEP 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 선별하는 방법을 제공하는 것으로, 이때 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸-CoA를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작되어 있다. 이 방법은ppc유전자를 보유하는 코리네박테리아 종으로부터 염색체 유전자를 추출하는 단계, 적절한 제한 효소로 이 염색체 유전자를 절단하는 단계,ppc유전자를 코리네박테리아에서 증폭할 수 있는 플라스미드 벡터로 결찰하는 단계,ppc및pyc유전자가 비기능성인 코리네박테리아 종을 형질전환시키는 단계, 유일한 탄소원으로 포도당을 함유하는 최소 배지에서 우세한 성장을 나타내는 종을 분리하는 단계 및 이 종으로부터 DNA 단편을 분리하는 단계를 포함한다.
피루베이트 카복실라아제(EC 6.4.1.1.)는 성장 중의 생합성을 위해 소모되는 OAA를 피루베이트로부터 보충하는 중요한 보충대사 효소이며, 산업적 발효에서 리신과 글루타민산 생산에 사용된다. PEP 카복실라아제 외에도,pyc유전자에 의해 암호화되는 비오틴 의존적 피루베이트 카복실라아제가 코리네박테리아 글루타미컴에서 보충대사 효소인 것으로 최근에 밝혀졌다. 코리네박테리아 글루타미컴에서ppc및pyc유전자 둘다를 불활성화시키자 포도당에서의 미생물 생육이 불가능해졌다. 이에 대해서는 Peters-Wendisch, P. 등의 문헌[Microbiology144:915-27(1998)]을 참조할 수 있다.ppc및pyc유전자 모두를 불활성화시킴으로써, 유일한 탄소원으로 포도당을 함유하는 최소 배지에서 성장할 수 있는 균주의 능력을 통해 복제 플라스미드로 클로닝한 본 발명의ppc유전자를 보유하는 DNA 단편을 확인할 수 있다.
또 다른 구체예로, PEP 카복실라아제 활성 억제제를 배지에 첨가한다. 예를 들면, 아스파르트산의 유사체를 첨가할 수 있다. 유사체 화합물은 야생형 PEP 카복실라아제를 생산하는 코리네박테리아 속에 속하는 미생물에 대항하는 성장 억제 작용을 나타내는 것이 바람직하고, 상기 성장 억제 작용은 L-글루타민산 또는 L-아스파르트산의 존재에 의해 회복되며, 상기 유사체 화합물은 야생형 PEP 카복실라아제 활성을 억제한다. 코리네박테리아 속에 속하는 미생물로부터 유사체 화합물에 내성을 나타내는 종을 선별한다면, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작된 PEP 카복실라아제를 생산하는 숙주 미생물을 얻을 확률이 훨씬 크다.
또 다른 구체예는 OAA 유래의 아미노산의 생산 증가를 나타내는 종을 분리하는 것이다. 이러한 아미노산으로는 아스파르테이트, 리신, 메티오닌, 트레오닌 및 이소루신을 들 수 있다. 또한, 이 종들은 아세틸-CoA 부재하에 최소 배지에서 성장할 수 있으며, PEP 카복실라아제 활성을 측정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 플라스미드 및 이 플라스미드에 작용가능하게 삽입된 PEP 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 DNA를 제공하는 것으로, 이 재조합 DNA 분자는 증폭될 수 있고, 상기 유전자는 에쉐리키아 속, 코리네박테리아 속 및 브레비박테리아 속을 포함하는 숙주 미생물에서 발현될 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸-CoA를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작되어 있다.
본 발명에 사용된 플라스미드 벡터는 이것이 에쉐리키아, 코리네박테리아 또는 브레비박테리아 유래의 박테리아 세포에서 증폭될 수 있는 한 어떤 벡터도 가능하다. 벡터 DNA는 염색체 유전자의 절단에 사용되는 제한 효소와 동일한 효소를 이용하여 절단하거나, 또는 염색체 DNA 절단 단편 및 절단된 벡터 DNA 개개의 말단에 상보적인 염기 서열을 보유하는 올리고뉴클레오티드에 연결한다. 그 다음, 플라스미드 벡터 및 염색체 유전자 보유 단편으로 결찰 반응을 수행한다. 유전자를 상기 방법 또는 임의의 다른 방법으로 센스 방향으로, 적절한 리딩 프레임으로 삽입시켜서, 이 플라스미드가 이것이 삽입된 세포 내 유전 기관에 의해 전사 및 번역되었을 때 PEP 카복실라아제 효소가 발현되면, 상기 유전자는 이 플라스미드 벡터에 "작용가능하게 삽입"되어 있다고 한다.
바람직한 구체예의 PEP 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 자주개자리 식물에서 유래된 것이다. 메디카고 사티바 종에서 유래된 유전자가 가장 바람직하다. 또 다른 바람직한 구체예에서는 유전자가 1 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 변형된다. 변형은 아미노산 서열 Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg을 암호화하는 뉴클레오티드를 결실시키는 것을 포함하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 또 다른 측면은 PEP 카복시라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 본 발명의 DNA 단편으로 형질전환시킨 숙주 미생물을 제공하는 것이다. 숙주로서, L-아미노산의 생산에 이용되는 미생물을 이용할 수 있으며, 그 예로는 브레비박테리아(Brevibacterium) 속, 코리네박테리아(Corynebacterium) 속, 바실러스(Bacillus) 속,에쉐리키아(Escherichia) 속, 세라티아(Seratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속 및 아트로박터(Arthrobacter) 속에 속하는 것들을 들 수 있다.
바람직한 구체예에서,ppc유전자를 포함하는 DNA 단편은 에쉐리키아 속, 코리네박테리아 속 또는 브레비박테리아 속에 속하는 숙주 미생물에서 발현된다. 숙주의 예로는 에쉐리키아 속에 속하는 미생물, 예컨대 에쉐리키아 콜리, 바람직하게는 L-리신 생산 에쉐리키아 콜리; 코리네폼 박테리아에 속하는 미생물, 바람직하게는 L-리신 생산 종 등이 있다. 본 발명에서 언급되는 코리네폼 박테리아는 호기성 그램 양성 비-산 내성(non-acid-fast) 간균으로 포자 형성 능력이 없는 미생물 군이며, 이것에는 코리네박테리아 속에 속하는 박테리아, 브레비박테리아 속에 속하는 박테리아가 있고, 브레비박테리아는 지금까지는 브레비박테리아 속으로 분류되었지만 현재는 코리네박테리아 속에 속하는 박테리아로 통합되었으며, 브레비박테리아 속에 속하는 박테리아는 코리네박테리아 속에 속하는 박테리아와 밀접한 연관성이 있다.
일 구체예에서, DNA 단편이 외떡잎 식물류 또는 쌍떡잎 식물류의 식물에서 유래될 경우, 숙주 미생물을 플라스미드와 이 플라스미드에 작용가능하게 삽입된 DNA 단편을 포함하는 DNA 분자로 형질전환시킬 수 있다. 대안으로, 본 발명의 DNA 단편을 숙주 염색체 DNA에 삽입시켜서 형질전환시킬 수 있다.
DNA 단편은 자주개자리 식물에서 유래되는 것이 바람직하며, 메디카고 사티바 종에서 유래되는 것이 가장 바람직하다. 또 다른 바람직한 구체예는, 식물 유래의 DNA 단편을 1 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 변형시키는것이다. 변형은 아미노산 서열 Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg을 암호화하는 뉴클레오티드를 결실시키는 것을 포함하는 것이 가장 바람직하다.
또한, 전술한 바와 같이, 본 발명의 DNA 서열을 자가 복제할 수 있는 벡터 DNA에 삽입하여 숙주로 도입하는 것도 가능하다. 벡터 DNA로서는 플라스미드 벡터가 바람직하며, 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있는 것이 가장 바람직하다. 대안으로, 파아지 DNA 벡터 역시 이용할 수 있다.
유전자를 포함하는 DNA 단편이 외떡잎 식물류 또는 쌍떡잎 식물류에 속하는 식물이나, 또는 코리네박테리아 또는 브레비박테리아 속에 속하는 미생물에서 유래되는 경우, DNA 단편을, 예컨대 트랜스포존(Berg, D.E. 및 Berg, C.M. 등의 문헌[Bio/Technol.1:417(1983)], Mu 파아지(일본 특허 공개 공보 제2-109985호) 또는 상동성 재조합(Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972))을 이용하는 방법을 통해 숙주 미생물의 염색체 DNA로 삽입시키는 것도 가능하다. 또한, 본 발명의 DNA를 코리네폼 박테리아에 삽입시키기 위해, 일본 특허 공개 공보 제5-7491호에 개시된 대로 온도 민감성 플라스미드를 이용하는 것도 가능하다.
바람직한 구체예의 DNA 단편은 코리네박테리아 글루타미컴 종에서 유래된 것이며, 이를 숙주 미생물의 염색체 DNA로 삽입시킨다. 코리네박테리아 글루타미컴 염색체의ppc유전자와 측면에 접한 영역의 서열은 분석되었다(서열 번호 3). 본 발명의 유전자 치환법에 따르면,ppc유전자의 염색체 카피를 제거하고, 항생제 내성 유전자 마커로 치환한다(도 1). 이 마커를 다시 본 발명의 변형된ppc유전자로치환한다.
이러한 독특한 디자인의 유전자 치환법은 숙주 미생물의 염색체ppcDNA 서열을 완전히 제거시키고, 2개의 이웃 유전자인tpi유전자와secG유전자의 발현을 변화시키지 않으면서 새로운ppc유전자의 치환을 용이하게 한다.tpi유전자는 당분해 효소 트리오세포스페이트 이소머라아제를 암호화하고,secG유전자는 단백질 방출에 관여하는 내부 막 단백질인 secG를 암호화한다.
이러한 디자인의 유전자 치환법은ppc유전자 측면에 접해 있는 무손상tpi및secG유전자의 재구성에 의존한다. 4개의 올리고뉴클레오티드를ppc의 측면에 접해 있는 DNA 영역을 클로닝하는 데 이용할 수 있다:
(1) 5' GTTGG TGAGC CACTG GAAAT CCGTG 3'(서열 번호 4)
(2) 5' GATGT CATCG CGTAA AAAAT CAGTC 3'(서열 번호 5)
(3) 5' CACTG CGCTG CGCAA CTCTA GATAG 3'(서열 번호 6)
(4) 5' GACCA CCACC TTGCC GAAAT CTTGG 3'(서열 번호 7).
본 발명의 또 다른 측면은 발효에 의한 아미노산 생산 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 에쉐리키아 속, 코리네박테리아 속 또는 브레비박테리아 속에 속하는 숙주 미생물을 적절한 배지에서 배양하는 단계 및 이 배양 배지로부터 아미노산을 분리하는 단계를 포함하며, 이 경우 숙주 미생물을 PEP 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편으로부터 형질전환시키고, 상기 숙주 미생물은 상기 유전자를 발현하며, 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸-CoA를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백에 대해 탈감작되어 있다.
전술한 숙주 배양 방법은 선행 기술에서의 아미노산 생산 미생물 배양 방법과 특별히 다르지 않다. 즉, 탄소원, 질소원, 무기 이온, 보조영양요구성을 충족시키는 물질, 그리고 아미노산, 비타민 등과 같은 선택적인 유기 미량 영양물질을 함유하는 통상의 배지를 사용한다.
탄소원으로는 포도당, 자당, 유당 등과 같은 탄수화물은 물론, 아세트산과 같은 유기산을 사용할 수 있다. 질소원으로는 암모니아 기체, 수성 암모늄, 암모늄염 등을 사용할 수 있다. 무기 이온으로는 칼륨 이온, 나트륨 이온, 마그네슘 이온, 포스페이트 이온 등을 필요에 따라 배지에 적절히 첨가할 수 있다.
배양은 호기성 조건에서 배지의 pH와 온도를 적절히 조절하면서 아미노산의 생성 및 축적이 거의 종료될 때까지 수행한다. 이렇게 배양 배지에 축적된 아미노산을 회수하기 위해서는 통상의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 여과, 한외여과, 원심분리 또는 기타 공지된 방법을 이용하여 세포로부터 아미노산을 제거한 다음, 예컨대 세포가 없는 용액의 농축 및 아미노산(또는 이의 염)의 결정화를 통해 아미노산을 회수한다. 대안으로, 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 화합물을 회수할 수 있다.
바람직한 구체예에서 아미노산은 OAA에서 유래되는 아미노산이며, 이것의 예로는 L-아스파르테이트, L-리신, L-메티오닌, L-트레오닌 및 L-이소루신 등이 있다. 아미노산은 L-리신인 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 또 다른 측면은, PEP의 OAA로의 전환율을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 본 발명의 DNA 단편으로 숙주 미생물을 형질전환시키는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서 숙주 미생물은 에쉐리키아, 코리네박테리아 또는 브레비박테리아 속에서 선택된다.
PEP 카복실라아제는 OAA를 형성하는 PEP와 이산화탄소 사이의 축합 반응을 촉매한다. 따라서, 아세틸-CoA 또는 아스파르트산에 의해 실질적으로 조절되지 않는 본 발명의 PEP 카복실라아제는 PEP의 OAA로의 전환율을 증가시킨다.
DNA 단편이 외떡잎 식물류 또는 쌍떡잎 식물류에 속하는 식물에서 유래되는 경우, 예컨대 재조합 DNA 분자의 이용, 또는 삽입에 의해 숙주 미생물을 형질전환시킬 수 있다. DNA 단편이 코리네박테리아 속 또는 브레비박테리아 속에 속하는 미생물에서 유래되는 경우, 숙주 미생물은 본 발명의 DNA 단편을 숙주 미생물의 염색체 DNA에 삽입시켜서 형질전환시킨다.
본 발명의 또 다른 측면은 발효 과정에서 탄소를 재순환시키는 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 숙주 미생물을 본 발명의 DNA 단편으로 형질전환시키는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서 숙주 미생물은 에쉐리키아 코리네박테리아 또는 브레비박테리아 속에서 선택된다.
TCA 사이클은 아미노산 생합성에서 소모되는 중간산물을 대체하기 위해 C4분자를 연속적으로 보충할 것을 요구한다. PEP 카복실라아제는 4 탄소 OAA를 TCA 사이클에 공급하는 보충대사 역할을 수행함으로써 이 기능을 수행하는 것을 보조한다. 숙주 미생물을 PEP 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 본 발명의 DNA 단편으로 형질전환시킴으로써 탄소 재순환 방법을 제공한다.
DNA 단편이 외떡잎 식물류 또는 쌍떡잎 식물류에 속하는 식물에서 유래되는 경우, 예컨대 재조합 DNA 분자의 이용, 또는 삽입에 의해 숙주 미생물을 형질전환시킬 수 있다. DNA 단편이 코리네박테리아 속 또는 브레비박테리아 속에 속하는 미생물에서 유래되는 경우, 숙주 미생물은 본 발명의 DNA 단편을 숙주 미생물의 염색체 DNA에 삽입시켜서 형질전환시킨다.
지금까지는 L-리신 및 L-글루타민산을 이러한 아미노산을 생산하는 능력을 지닌 브레비박테리아 속 또는 코리네박테리아 속에 속하는 코리네폼 박테리아를 이용하여 발효법으로 공업적으로 생산하여 왔다. 이 방법에서는, 코리네폼 박테리아가 이들의 성장을 위해 비오틴을 필요로 한다고 알려져 있다. 효소 PEP 카복실라아제는 생물학적 활성화를 위해 비오틴을 필요로 하지 않는다. 또한, PEP 카복실라아제의 주요 생리적 역할 중 하나는 탄소의 동화에 의해 TCA 사이클을 재충전하는 것이다. 본 발명의 탈조절된 PEP 카복실라아제는 이산화탄소의 동화를 향상시킨다.
따라서, 본 발명의 일 측면은 비오틴을 필요로 하지 않는 발효 과정에서 탄소를 동화시키는 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 본 발명의 DNA 단편으로 숙주 미생물을 형질전환시키는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서 숙주 미생물은 에쉐리키아, 코리네박테리아 또는 브레비박테리아 속에서 선택된다.
DNA 단편이 외떡잎 식물류 또는 쌍떡잎 식물류에 속하는 식물에서 유래되는 경우, 예컨대 재조합 DNA 분자의 이용, 또는 삽입에 의해 숙주 미생물을 형질전환시킬 수 있다. DNA 단편이 코리네박테리아 속 또는 브레비박테리아 속에 속하는 미생물에서 유래되는 경우, 숙주 미생물은 본 발명의 DNA 단편을 숙주 미생물의 염색체 DNA에 삽입시켜서 형질전환시킨다.
보충대사 효소 PEP 카복실라아제는 OAA의 최적 풀의 유지에 중요하며, 그 결과 이로부터 유래되는 유기산의 생합성 레벨을 결정한다. 본 발명의 DNA 단편으로 숙주 미생물을 형질전환시키면 OAA의 생산율이 증가된다. 이로써, OAA 유래의 유기산의 생산 역시 증가된다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 발효 과정에서 유기산의 생산을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다. 바람직한 구체예에서 숙주 미생물은 에쉐리키아 속, 코리네박테리아 속 또는 브레비박테리아 속에서 선택된다.
DNA 단편이 외떡잎 식물류 또는 쌍떡잎 식물류에 속하는 식물에서 유래되는 경우, 예컨대 재조합 DNA 분자의 이용, 또는 삽입에 의해 숙주 미생물을 형질전환시킬 수 있다. DNA 단편이 코리네박테리아 속 또는 브레비박테리아 속에 속하는 미생물에서 유래되는 경우, 숙주 미생물은 본 발명의 DNA 단편을 숙주 미생물의 염색체 DNA에 삽입시켜서 형질전환시킨다.
OAA는 아미노산과 같은 세포 대사산물의 생산을 위한 중요한 기질이다. PEP에서 OAA로의 전환율을 증가시킴으로써, 본 발명의ppc유전자는 아미노산의 생산을 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 발효 과정에서 아미노산의 생산을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 본 발명의 DNA 단편으로 숙주 미생물을 형질전환시키는 것을 포함한다.
바람직한 구체예에서 숙주 미생물은 에쉐리키아, 코리네박테리아 또는 브레비박테리아 속에서 선택된다. 또 다른 바람직한 구체예에서 아미노산은 L-아스파르테이트, L-리신, L-메티오닌, L-트레오닌 및 L-이소루신을 포함한다. 아미노산은 L-리신인 것이 가장 바람직하다.
DNA 단편이 외떡잎 식물류 또는 쌍떡잎 식물류에 속하는 식물에서 유래되는 경우, 예컨대 재조합 DNA 분자의 이용, 또는 삽입에 의해 숙주 미생물을 형질전환시킬 수 있다. DNA 단편이 코리네박테리아 속 또는 브레비박테리아 속에 속하는 미생물에서 유래되는 경우, 숙주 미생물은 본 발명의 DNA 단편을 숙주 미생물의 염색체 DNA에 삽입시켜서 형질전환시킨다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허 및 공보는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자의 기술 수준을 나타내는 것이며, 이는 모두 본 명세서에서 참고 인용한다.
지금까지는 본 발명을 개괄적으로 설명하였으며, 예로써 제공된 후술하는 실시예를 참조로 하면 더욱 쉽게 이해될 것이다. 그러나, 이 실시예는 구체적 언급이 없는 한 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
발명의 개요
따라서, 본 발명은 PEP 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편에 관한 것으로, 상기 유전자는 숙주 미생물에서 발현될 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸-CoA를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작되어 있다.
본 발명은 또한 플라스미드 및 이 플라스미드에 작용가능하게 삽입된 PEP 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것으로, 이 재조합 DNA 분자는 증폭될 수 있고, 상기 유전자는 에쉐리키아 속, 코리네박테리아 속 및 브레비박테리아 속을 포함하는 숙주 미생물에서 발현될 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸-CoA를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작되어 있다.
본 발명은 또한 PEP 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편으로 형질전환시킨 에쉐리키아 속, 코리네박테리아 속 또는 브레비박테리아 속에 속하는 숙주 미생물에 관한 것으로, 상기 유전자는 외떡잎식물류 또는 쌍떡잎 식물류에 속하는 식물이나, 또는 코리네박테리아 속 또는 브레비박테리아 속에 속하는 미생물에서 유래되는 것이며, 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸-CoA를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작되어 있으며, 상기 DNA 단편으로 형질전환시킨 숙주 미생물은 상기 유전자를 발현한다.
본 발명의 또 다른 측면은 발효에 의해 아미노산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 에쉐리키아 속, 코리네박테리아 속 또는 브레비박테리아 속에 속하는 숙주 미생물을 적절한 배지에서 배양하는 단계 및 이 배양 배지로부터 아미노산을 분리하는 단계를 포함하며, 상기 숙주 미생물은 PEP 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편으로 형질전환시킨 것으로, 상기 유전자를 발현하며, 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸-CoA를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작되어 있다.
또한, 본 발명은 활성화를 위해 아세틸-CoA를 필요로 하지 않으며, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작된 PEP 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 선별하는 방법, PEP에서 OAA로의 전환율을 증가시키는 방법, 발효 과정에서 탄소를 재순환시키는 방법, 비오틴을 필요로 하지 않는 발효 과정에서 탄소를 동화시키는 방법, 발효 과정에서 유기산의 생산을 증가시키는 방법 및 발효 과정에서 아미노산 생산을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
실시예 1
식물 ppc 유전자는 에쉐리키아 콜리에서 기능을 수행한다
자주개자리(메디카고 사티바) 유래의ppc유전자의 cDNA 클론(APPC)은 기능적 PEP 카복실라아제가 결여되어 단일 탄소원으로서 포도당만을 함유하는 M9 배지에서 성장할 수 없는 에쉐리키아 콜리 돌연변이 CGSC3594에서 기능을 나타내었다. APPC 플라스미드(pMS2)로 형질전환시킬 경우, E. 콜리 돌연변이 CGSC3594는 단일탄소원으로 포도당을 함유하는 M9 배지에서 성장할 수 있었다. 자주개자리 PEP 카복실라아제의 DNA 및 아미노산 서열은 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 제시하였다.
실시예 2
자주개자리 유래의 ppc 유전자는 진탕 플라스크에서 코리네박테리아의 성장 촉진을 나타낸다
자주개자리(메디카고 사티바) 유래의ppc유전자가 리신 생산 코리네박테리아 균주 BF100에서의 성장 촉진에 미치는 영향을 측정하였다. 성장율은 660 nm에서의 흡광도로서 측정하였고, 역가는 리신(g)/배지(ℓ)로서 측정하였으며, 수율은 [리신(g)/소모된 포도당(g)] x 100으로서 측정하였다. 유도인자인 이소프로필-베타-D-갈락토시드(IPTG) 30 ㎎/ℓ을 첨가하였다. 이 결과는 하기 표 1에 제시한다.
균주 성장율 역가 수율
BF100 25 25 42
BF100/pMS2 34 23 40
BF100/pMS2/IPTG 40 25 43
실시예 3
야생형 코리네박테리아 종 유래의 ppc 유전자는 리신 생산 코리네박테리아 종의 생산성을 향상시킨다
코리네박테리아 글루타미컴 ATCC 13032 유래의ppc유전자의 cDNA 클론(CPPC)을 pCPPC 플라스미드로 삽입하였다. 리신 생산 코리네박테리아 글루타미컴 균주 BF100을 진탕 플라스크에서 pCPPC 플라스미드로 형질전환시키자 생산성이 향상되었다.
성장율은 660 nm에서 흡광도로서 측정하였고, 역가는 리신(g)/배지(ℓ)로서 측정하였으며, 수율은 [리신(g)/소모된 포도당(g)] x 100으로서 측정하였다. 이 결과는 하기 표 2에 제시한다.
균주 성장율 역가 수율
BF100 39 27 44
BF100/pCPPC 32 29 48
실시예 4
야생형 코리네박테리아 종 및 리신 생산 코리네박테리아 종으로부터의 아세틸-CoA 및 L-아스파르트산에 대한 민감성
야생형 코리네박테리아 글루타미컴 균주(ATCC 13032) 및 리신 생산 코리네박테리아 글루타미컴 균주(BF100)로부터의 추출물의 아세틸-CoA 및 L-아스파르트산에 대한 민감성은 PEP 카복실라아제 활성으로 측정하였을 때 서로 다른 것으로 나타났다. 활성 단위는 미정제 추출물을 이용하여 흡광도(340 nm/분)의 변화로서 분광법으로 측정하였다. 이 결과는 하기 표 3에 제시한다.
균주 PEP 카복실라아제 활성
완전 - 아세틸-CoA + 아스파르테이트(5 mM)
ATCC 13032 100% 56% 100%
BF100 100% 15% 17%
실시예 5
염색체 ppc 유전자의 변형된 ppc 유전자로의 치환
코리네박테리아 글루타미컴 염색체의ppc유전자의 측면에 접해 있는 영역의 서열은 분석되어 있다(서열 번호 3).ppc유전자의 염색체 카피를 제거하고, 항생제 내성 유전자 마커로 치환한다(도 1). 이 마커를 다시 본 발명의 변형된ppc유전자로 치환한다. 이러한 독특한 디자인의 유전자 치환법은 숙주 미생물의 염색체ppcDNA 서열을 완전히 제거시키고, 2개의 이웃 유전자의 발현에 변화를 주지 않으면서 새로운 유전자의 치환을 용이하게 한다. 이러한 디자인의 유전자 치환법은ppc유전자의 측면에 접해 있는 무손상tpi및secG유전자의 재구성에 의존한다. 4개의 올리고뉴클레오티드를ppc의 측면에 접해 있는 DNA 영역을 클로닝하는 데 이용할 수 있다:
(1) 5' GTTGG TGAGC CACTG GAAAT CCGTG 3'(서열 번호 4)
(2) 5' GATGT CATCG CGTAA AAAAT CAGTC 3'(서열 번호 5)
(3) 5' CACTG CGCTG CGCAA CTCTA GATAG 3'(서열 번호 6)
(4) 5' GACCA CCACC TTGCC GAAAT CTTGG 3'(서열 번호 7).
당업자들은 실시예를 이용한 전술한 설명을 통해, 첨부된 청구항에서 정의되는 바와 같은 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않고 다양한 수행방법 및 실시형태로 본 발명을 실시할 수 있을 것이다.

Claims (70)

  1. 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편으로서, 상기 유전자는 숙주 미생물에서 발현될 수 있고, 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸 조효소 A를 필요로 하지 않으며, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작되는 것인 DNA 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 DNA 단편은 외떡잎 식물류 또는 쌍떡잎 식물류에 속하는 식물에서 유래되는 것이 특징인 DNA 단편.
  3. 제2항에 있어서, 상기 DNA 단편은 자주개자리(alfalfa) 식물에서 유래되는 것이 특징인 DNA 단편.
  4. 제3항에 있어서, 상기 DNA 단편은 메디카고 사티바(Medicago sativa) 종에서 유래되는 것이 특징인 DNA 단편.
  5. 제2항에 있어서, 상기 DNA 단편은 1 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변형되는 것이 특징인 DNA 단편.
  6. 제5항에 있어서, 상기 변형은 아미노산 서열 Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg을 암호화하는 뉴클레오티드를 결실시키는 것을 포함하는 것이 특징인 DNA 단편.
  7. 제1항에 있어서, 상기 DNA 단편은 브레비박테리아(Brevibacterium) 속 또는 코리네박테리아(Corynebacterium) 속에 속하는 미생물에서 유래되는 것이 특징인 DNA 단편.
  8. 제7항에 있어서, 상기 DNA 단편은 코리네박테리아 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 종에서 유래되는 것이 특징인 DNA 단편.
  9. 제7항에 있어서, 상기 DNA 단편은 숙주 미생물의 염색체 DNA로 삽입되는 것이 특징인 DNA 단편.
  10. 제1항에 있어서, 상기 DNA 단편은 에쉐리키아(Escherichia) 속, 코리네박테리아 속 및 브레비박테리아 속을 포함하는 숙주 미생물에서 발현되는 것이 특징인 DNA 단편.
  11. 제1항에 있어서, 상기 DNA 단편은 브레비박테리아 속 또는 코리네박테리아 속에 속하는 미생물에서 유래되는 불완전 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 뉴클레오티드 서열 및 외떡잎 식물류 또는 쌍떡잎 식물류에 속하는 식물에서 유래되는불완전 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메라 유전자인 것이 특징인 DNA 단편.
  12. 제1항에 있어서, 상기 DNA 단편은 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA인 것이 특징인 DNA 단편.
  13. 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 외떡잎 식물류 또는 쌍떡잎 식물류에 속하는 식물에서 유래되는 DNA 단편으로서, 상기 유전자는 에쉐리키아 속, 코리네박테리아 속 및 브레비박테리아 속을 포함하는 숙주 미생물에서 발현될 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸 조효소 A를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작된 것인 DNA 단편.
  14. 제13항에 있어서, 상기 DNA 단편은 자주개자리(alfalfa) 식물에서 유래되는 것이 특징인 DNA 단편.
  15. 제14항에 있어서, 상기 DNA 단편은 메디카고 사티바 종에서 유래되는 것이 특징인 DNA 단편.
  16. 제13항에 있어서, 상기 DNA 단편은 1 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실 또는삽입에 의해 변형되는 것이 특징인 DNA 단편.
  17. 제16항에 있어서, 상기 변형은 아미노산 서열 Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg을 암호화하는 뉴클레오티드를 결실시키는 것을 포함하는 것이 특징인 DNA 단편.
  18. 제13항에 있어서, 상기 DNA 단편은 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA인 것이 특징인 DNA 단편.
  19. 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 브레비박테리아 속 또는 코리네박테리아 속에 속하는 미생물에서 유래되는 DNA 단편으로서, 상기 유전자는 에쉐리키아 속, 코리네박테리아 속 및 브레비박테리아 속을 포함하는 숙주 미생물에서 발현될 수 있고, 상기 유전자는 상기 숙주 미생물의 염색체 DNA로 삽입되며, 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸 조효소 A를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작된 것인 DNA 단편.
  20. 제19항에 있어서, 상기 DNA 단편은 코리네박테리아 글루타미컴 종에서 유래되는 것이 특징인 DNA 단편.
  21. 제19항에 있어서, 상기 유전자는 숙주 미생물의 염색체ppc유전자를 제거하고, 숙주 미생물의 염색체ppc유전자의 측면에 접해 있는 2개의 유전자의 발현을 변화시키지 않으면서 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 삽입함으로써 삽입되는 것이 특징인 DNA 단편.
  22. 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸 조효소 A를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작되어 있으며, 제1항, 13항 및 제19항 중 어느 하나의 항에 기재된 DNA 단편에 의해 암호화되는 것인 분리된 폴리펩티드.
  23. 플라스미드 및 이 플라스미드에 작용가능하게 삽입된 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자로서, 상기 재조합 DNA 분자는 증폭될 수 있고, 상기 유전자는 에쉐리키아 속, 코리네박테리아 속 및 브레비박테리아 속을 포함하는 숙주 미생물에서 발현될 수 있고, 상기 유전자는 외떡잎 식물 또는 쌍떡잎 식물에서 유래되며, 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸 조효소 A를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작된 것인 재조합 DNA 분자.
  24. 제23항에 있어서, 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 자주개자리 식물에서 유래되는 것이 특징인 재조합 DNA분자.
  25. 제24항에 있어서, 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 메디카고 사티바 종에서 유래되는 것이 특징인 재조합 DNA 분자.
  26. 제23항에 있어서, 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 1 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변형되는 것이 특징인 재조합 DNA 분자.
  27. 제26항에 있어서, 상기 변형은 아미노산 서열 Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg을 암호화하는 뉴클레오티드를 결실시키는 것을 포함하는 것이 특징인 DNA 분자.
  28. 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸 조효소 A를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작되어 있으며, 상기 폴리펩티드는 제23항에 기재된 DNA 분자에 의해 암호화되는 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
  29. 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는유전자를 포함하는 DNA 단편으로 형질전환시킨 에쉐리키아 속, 코리네박테리아 속 또는 브레비박테리아 속에 속하는 숙주 미생물로서, 상기 유전자는 외떡잎 식물류 또는 쌍떡잎 식물류에 속하는 식물에서 유래되며, 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸 조효소 A를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작되어 있으며, 상기 DNA 단편으로 형질전환시킨 숙주 미생물은 상기 유전자를 발현하는 것인 숙주 미생물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 상기 DNA 단편을 상기 숙주 미생물의 염색체 DNA로 삽입시켜서 형질전환시키거나, 플라스미드 및 이 플라스미드에 작용가능하게 삽입된 상기 DNA 단편을 포함하는 재조합 DNA 분자로 형질전환시킨 것이 특징인 숙주 미생물.
  31. 제29항에 있어서, 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 자주개자리(alfalfa) 식물에서 유래되는 것이 특징인 숙주 미생물.
  32. 제31항에 있어서, 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 메디카고 사티바에서 유래되는 것이 특징인 숙주 미생물.
  33. 제29항에 있어서, 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 1 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변형되는 것이 특징인 숙주 미생물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 변형은 아미노산 서열 Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg을 암호화하는 뉴클레오티드를 결실시키는 것을 포함하는 것이 특징인 숙주 미생물.
  35. 에쉐리키아 속, 코리네박테리아 속 또는 브레비박테리아 속에 속하는 숙주 미생물로서, 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편이 상기 숙주 미생물의 염색체 DNA로 삽입되어 있고, 상기 DNA 단편은 코리네박테리아 속 또는 브레비박테리아 속에 속하는 미생물에서 유래되며, 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸 조효소 A를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작되어 있으며, 상기 숙주 미생물은 상기 유전자를 발현하는 것인 숙주 미생물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 DNA 단편은 코리네박테리아 글루타미컴 종에서 유래되는 것이 특징인 숙주 미생물.
  37. 제35항에 있어서, 상기 유전자는 숙주 미생물의 염색체ppc유전자를 제거하고, 숙주 미생물의 염색체ppc유전자의 측면에 접해 있는 2개의 유전자의 발현을 변화시키지 않으면서 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 삽입함으로써 삽입되는 것이 특징인 숙주 미생물.
  38. (a) 에쉐리키아 속, 코리네박테리아 속 또는 브레비박테리아 속에 속하는 숙주 미생물을 적절한 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양 배지로부터 아미노산을 분리하는 단계
    를 포함하는 발효에 의해 아미노산을 생산하는 방법으로서, (a)에 기재된 숙주 미생물을 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편으로 형질전환시키고, (a)에 기재된 숙주 미생물은 상기 유전자를 발현하며, 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸 조효소 A를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작된 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 단계 (b)에서 아미노산은 L-아스파르테이트, L-리신, L-메티오닌, L-트레오닌 및 L-이소루신을 포함하는 것이 특징인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 단계 (b)에서 아미노산은 L-리신인 것이 특징인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 상기 DNA 단편은 외떡잎 식물류 또는 쌍떡잎 식물류에 속하는 식물에서 유래되는 것이 특징인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 DNA 단편은 자주개자리 식물에서 유래되는 것이 특징인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 DNA 단편은 메디카고 사티바 종에서 유래되는 것이 특징인 방법.
  44. 제38항에 있어서, 상기 DNA 단편은 1 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변형되는 것이 특징인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 변형은 아미노산 서열 Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg을 암호화하는 뉴클레오티드를 결실시키는 것을 포함하는 것이 특징인 방법.
  46. 제38항에 있어서, 상기 DNA 단편은 브레비박테리아 속 또는 코리네박테리아 속에 속하는 미생물에서 유래되는 것이 특징인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 DNA 단편은 코리네박테리아 글루타미컴 종에서 유래되는 것이 특징인 방법.
  48. 제38항에 있어서, 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 브레비박테리아 또는 코리네박테리아 속에 속하는 미생물에서 유래되는 불완전 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 뉴클레오티드 서열 및 외떡잎 식물류 또는 쌍떡잎 식물류에 속하는 식물에서 유래되는 불완전 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메라 유전자인 것이 특징인 방법.
  49. 제38항에 있어서, 상기 DNA 단편은 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA인 것이 특징인 방법.
  50. (a) 에쉐리키아 속, 코리네박테리아 속 또는 브레비박테리아 속에 속하는 숙주 미생물을 적절한 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 이 배양 배지로부터 아미노산을 분리하는 단계
    를 포함하는 발효에 의해 아미노산을 생산하는 방법으로서, (a)에 기재된 숙주 미생물은, 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 (a)에 기재된 숙주 미생물의 염색체 DNA로 삽입시켜서 형질전환시키거나, 또는 플라스미드 및 이 플라스미드에 작용가능하게 삽입된 상기 DNA 단편을 포함하는 재조합 DNA 분자로 형질전환시키고, (a)에 기재된 숙주 미생물은 상기 유전자를 발현하고, 상기 DNA 단편은 외떡잎 식물 또는 쌍떡잎 식물에서 유래되며, 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸 조효소 A를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작된 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 단계 (b)에서 아미노산은 L-아스파르테이트, L-리신, L-메티오닌, L-트레오닌 및 L-이소루신을 포함하는 것이 특징인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 단계 (b)에서 아미노산은 L-리신인 것이 특징인 방법.
  53. 제50항에 있어서, 상기 DNA 단편은 자주개자리 식물에서 유래되는 것이 특징인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 DNA 단편은 메디카고 사티바 종에서 유래되는 것이 특징인 방법.
  55. 제50항에 있어서, 상기 DNA 단편은 1 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변형되는 것이 특징인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 변형은 아미노산 서열 Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg을 암호화하는 뉴클레오티드를 결실시키는 것을 포함하는 것이 특징인 방법.
  57. (a) 에쉐리키아 속, 코리네박테리아 속 또는 브레비박테리아 속에 속하는 숙주 미생물을 적절한 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 이 배양 배지로부터 아미노산을 분리하는 단계
    를 포함하는 발효에 의해 아미노산을 생산하는 방법으로서, DNA 단편을 (a)에 기재된 숙주 미생물의 염색체 DNA로 삽입시켜서 상기 숙주 미생물을 형질전환시키고, 상기 DNA 단편은 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하고, (a)에 기재된 숙주 미생물은 상기 유전자를 발현하며, 상기 DNA 단편은 코리네박테리아 속 또는 브레비박테리아 속에 속하는 미생물에서 유래되며, 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸 조효소 A를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작된 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 삽입 방법은 숙주 미생물의 염색체ppc유전자를 제거하고, 숙주 미생물의 염색체ppc유전자의 측면에 접해 있는 2개의 유전자의 발현을 변화시키지 않으면서, 상기 DNA 단편을 삽입하는 것이 특징인 방법.
  59. 제57항에 있어서, 단계 (b)에서 아미노산은 L-아스파르테이트, L-리신, L-메티오닌, L-트레오닌 및 L-이소루신을 포함하는 것이 특징인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 단계 (b)에서 아미노산은 L-리신인 것이 특징인 방법.
  61. 제57항에 있어서, 상기 DNA 단편은 코리네박테리아 글루타미컴 종에서 유래되는 것이 특징인 방법.
  62. (a)ppc유전자를 보유하는 코리네박테리아 종 유래의 염색체 유전자를 추출하는 단계;
    (b) (a)에 기재된 염색체 유전자를 적절한 제한 효소로 절단하는 단계;
    (c) (a)에 기재된ppc유전자를 코리네박테리아에서 증폭할 수 있는 플라스미드 벡터로 결찰하는 단계;
    (d) (c)에 기재된 플라스미드 벡터로ppc및pyc유전자가 불활성화된 코리네박테리아 종을 형질전환시키는 단계;
    (e) 유일한 탄소원으로 포도당을 함유하는 최소 배지에서 우세한 성장을 나타내는 종을 분리하는 단계; 및
    (f) 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 분리하는 단계[(e)에 기재된 종으로부터의 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸 조효소 A를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 덜 민감함]
    를 포함하는 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 선별하는 방법으로서, 상기 폴리펩티드는 활성화를 위해 아세틸 조효소 A를 필요로 하지 않고, 아스파르트산에 의한 피드백 억제에 대해 탈감작된 것인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 단계 (e)에서 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 활성의 억제제를 배지에 첨가하는 것이 특징인 방법.
  64. 제62항에 있어서, 단계 (e)에서 옥살아세트산 유래의 아미노산의 생산 증가를 나타내는 종을 분리하는 것이 특징인 방법.
  65. 제62항에 있어서, 단계(e)에서 종을 아세틸 조효소 A의 부재하에 최소 배지에서 배양하는 것이 특징인 방법.
  66. 제1항, 제13항 및 제19항 중 어느 하나의 항에 기재된 DNA 단편으로 숙주 미생물을 형질전환시키는 것을 포함하는 포스포에놀피루베이트에서 옥살아세테이트로의 전환율을 증가시키는 방법.
  67. 제1항, 제13항 및 제19항 중 어느 하나의 항에 기재된 DNA 단편으로 숙주 미생물을 형질전환시키는 것을 포함하는 발효 과정에서 탄소를 재순환시키는 방법.
  68. 제1항, 제13항 및 제19항 중 어느 하나의 항에 기재된 DNA 단편으로 숙주 미생물을 형질전환시키는 것을 포함하는 비오틴을 필요로 하지 않는 발효 과정에서 탄소를 동화시키는 방법.
  69. 제1항, 제13항 및 제19항 중 어느 하나의 항에 기재된 DNA 단편으로 숙주 미생물을 형질전환시키는 것을 포함하는 발효 과정에서 유기산의 생산을 증가시키는 방법.
  70. 제1항, 제13항 및 제19항 중 어느 하나의 항에 기재된 DNA 단편으로 숙주 미생물을 형질전환시키는 것을 포함하는 발효 과정에서 아미노산의 생산을 증가시키는 방법.
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