CN101903517A

CN101903517A - 产生由具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质催化的反应的产物的细菌和生产所述产物的方法

Info

Publication number: CN101903517A
Application number: CN2008801221358A
Authority: CN
Inventors: 瑟吉·V·斯米尔诺夫; 纳塔利娅·N·萨姆索诺娃; 韦罗妮卡·A·科特利亚罗娃; 纳塔利娅·Y·拉什凯维科; 奥尔佳·S·比兹诺申科; 塔蒂亚纳·A·巴奇纳; 今林由希; 杉山雅一; 铃木俊一
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-12-22
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2028-12-22
Also published as: JP2011507486A; WO2009082029A1; EP2240574B1; RU2007147436A; EP2240574A1; CN101903517B; JP5429170B2; US8524476B2; DK2240574T3; US20100330622A1

Abstract

一种使用下述细菌生产由具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质催化的反应产物如(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法，所述细菌用含有编码具有2-氧戊二酸依赖性酶活性如L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的基因的DNA片段转化；并且其中所述细菌具有产生所述产物如(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的能力。

Description

产生由具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质催化的反应的产物的细菌和生产所述产物的方法

技术领域

本发明涉及微生物工业，并特别涉及使用用含有编码具有2-氧戊二酸依赖性酶(如L-异亮氨酸双加氧酶)活性的蛋白质的基因转化的细菌生产由具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质催化的反应的产物如4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法。这种细菌还经修饰而具有编码L-异亮氨酸转运蛋白的基因的增强表达，并具有产生(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的能力。

背景技术

4-羟基-L-异亮氨酸是一种能够从胡卢巴种子(fenugreekseed)(Trigonellafoenum-graecum L.leguminosae)提取和纯化的氨基酸。4-羟基-L-异亮氨酸展现促胰岛素活性，非常引人关注，这是因为其明显依赖于培养基中的血浆葡萄糖浓度的刺激作用。这种作用已在分离的灌注大鼠胰脏和人胰岛二者中得到了证实(Sauvaire，Y.et al，Diabetes，47：206-210，(1998))。这种葡萄糖依赖性对于磺酰脲还未得到确认(Drucker，D.J.，Diabetes 47：159-169，(1998))，磺酰脲是目前用以治疗II型糖尿病[或称非胰岛素依赖性糖尿病(NIDD或NIDDM)]的唯一促胰岛素药物类型，因此，低血糖仍为磺酰脲治疗中常见的不理想的副作用(Jackson，J.，and Bessler，R.Drugs，22：211-245；295-320，(1981)；Jennings，A.et al.Diabetes Care，12：203-208，(1989))。还已知用于改善对葡萄糖的耐受性的方法(Am.J.Physiol.Endocrinol.，Vol.287，E463-E471，2004)。之前已报道了这种葡萄糖代谢增强活性，及其用于药物和保健食品的潜在应用(特开平6-157302，US2007-000463A1)。

4-羟基-L-异亮氨酸仅见于植物，而且由于其特别的促胰岛素作用，可视为具有用于II型糖尿病治疗的潜在应用的新型促分泌剂，这是因为所述II型糖尿病是一种以与不同程度的胰岛素抗性相关的缺陷性胰岛素分泌为特征的疾病(Broca，C.et al Am.J.Physiol.277(Endocrinol.Metab.40)：E617-E623，(1999))。

已将通过使用胡卢巴提取物中的双加氧酶活性来氧化铁、抗坏血酸、2-氧化戊二酸(2-oxyglutaric acid)和氧依赖性异亮氨酸作为用于生产4-羟基-L-异亮氨酸方法加以报道(Phytochemistry，Vol.44，No.4，pp.563-566，1997)。然而，这种方法用于生产4-羟基-L-异亮氨酸难如人意，这是因为该酶的活性在20mM或更高的异亮氨酸浓度下受到底物的抑制。此外，该酶尚未被鉴定，源自植物提取物，不方便大量获取，并且不稳定。

已披露了一种具有39％总产率的有效的光学纯(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸的八步合成。这种合成的关键步骤涉及使用白地霉(Geotrichumcandidum)2-甲基乙酰乙酸乙酯生物转化为(2S，3S)-2-甲基-3-羟基-丁酸乙酯以及不对称Strecker合成(Wang，Q.et al，Eur.J.Org.Chem.，834-839(2002))。

还披露了一种完全控制立体化学的(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸的短的六步化学酶合成，最后的步骤为通过使用商业上可以获得的固定在Eupergit C上的青霉素酰基转移酶G(E-PAC)水解N-苯乙酰内酯衍生物的酶促分解过程(Rolland-Fulcrand，V.et al，J.Org.Chem.，873-877(2004))。

然而时下，并无报道称通过使用用含有编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的基因的DNA片段转化的细菌来产生(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸；其中所述细菌也经修饰而具有编码L-异亮氨酸转运蛋白的基因的增强表达；并且具有产生(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的能力。

除(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸外，还已知由具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质所催化的反应产生的，并在工业上具有重要性的产物。然而，并未报道通过使用具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质有效产生所述产物的系统。

发明内容

本发明的一个方面为增强与由具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质从2-氧戊二酸形成琥珀酸的反应偶联的反应的产物的产生。所述产物包括以其游离形式和盐形式存在的化合物。本发明的另一个方面为提供使用具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的细菌通过与从2-氧戊二酸形成琥珀酸偶联的反应制备所述产物的方法。这种细菌经修饰而减弱了编码氧戊二酸脱氢酶的基因的表达，优选经修饰而减弱了编码氧戊二酸脱氢酶和异柠檬酸裂合酶的基因的表达，更优选经修饰而减弱了编码氧戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂合酶和异柠檬酸脱氢酶磷酸酶的基因的表达。

本发明的一个方面为增强(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸，包括其游离形式和盐形式的产生。这种化合物亦可称作“(2S，3R，4S)-4IL”。本发明的另一个方面为提供使用具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的细菌通过L-异亮氨酸的直接酶羟化制备(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法。这种细菌优选过表达编码L-异亮氨酸转运蛋白的基因，并且具有产生(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的能力。

之前从自然界分离了具有高水平L-异亮氨酸双加氧酶活性的细菌，并且克隆了编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因。发现了L-异亮氨酸双加氧酶可用于(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的合成。

本发明的另一个方面包括提供使用具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的细菌用于增强的(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸产生的方法。上述目的通过发现若具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的细菌经修饰而过表达编码L-异亮氨酸转运蛋白的基因，则所述细菌产生了更多(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸而达成。

本发明的一个方面为提供用含有编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的基因的DNA片段转化的细菌，并且其中所述细菌具有产生(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的能力。

本发明的进一步的方面为提供如上所述的(2S，3R，4S)-4-HIL生产细菌，其中所述编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的基因选自下组：

(a)包含SEQ ID No：1的核苷酸序列的DNA；

(b)在严格条件下与包含与SEQ ID No：1的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交的DNA，并且其中所述DNA编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质；

(c)包含编码包含SEQ ID No：2的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的DNA；

(d)包含编码包含SEQ ID No：2的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的DNA，但所述氨基酸序列含有一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位，并且其中所述蛋白质具有L-异亮氨酸双加氧酶活性；和

(e)包含编码包含与SEQ ID No：2的氨基酸序列至少98％同源的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的DNA，并且其中所述蛋白质具有L-异亮氨酸双加氧酶活性。

本发明的进一步方面为提供如上所述的(2S，3R，4S)-4-HIL生产细菌，其中所述细菌经修饰而增强了L-异亮氨酸双加氧酶活性。

本发明的进一步的方面为提供如上所述的(2S，3R，4S)-4-HIL生产细菌，其中所述L-异亮氨酸双加氧酶活性是通过增加编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因的表达而增强的。

本发明的进一步的方面为提供如上所述的(2S，3R，4S)-4-HIL生产细菌，其中所述L-异亮氨酸双加氧酶的表达是通过修饰编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因的表达控制序列或通过增加编码L-异亮氨酸双加氧酶编码的基因的拷贝数而增加的。

本发明的进一步的方面为提供如上所述的(2S，3R，4S)-4-HIL生产细菌，其中所述编码L-异亮氨酸转运蛋白的基因为来自大肠杆菌的brnQ基因。

本发明的进一步的方面为提供如上所述的细菌，其中所述细菌经额外修饰而减弱了编码氧戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂合酶和异柠檬酸脱氢酶磷酸酶的基因的表达。

本发明的进一步的方面为提供如上所述的细菌，其中所述表达是通过使所述基因失活而减弱的。

本发明的进一步的方面为提供如上所述的细菌，其中所述细菌经额外修饰而减弱了编码支链氨基酸氨基转移酶的基因的表达。

本发明的进一步的方面为提供如上所述细菌，其中所述表达是通过使所述基因失活而减弱的。

本发明的进一步的方面为提供如上所述的细菌，其中所述细菌属于选自下组的属：埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、棒杆菌属(Corynebacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、曲霉属(Aspergillus)和芽孢杆菌属(Bacillus)。

本发明的进一步的方面为提供如上所述细菌，其中所述细菌选自下组：大肠杆菌(Escherichia coli)、简单节杆菌(Arthrobacter simplex)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)、硫磺节杆菌(Arthrobacter sulfureus)、粘节杆菌(Arthrobacter viscosus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

本发明的进一步的方面为提供用于制备(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法，其包括：

-在含有L-异亮氨酸的培养基中培养如上所述的(2S，3R，4S)-4HIL生产细菌；并

-分离(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸。

本发明的进一步的方面为提供如上所述的方法，其中所述培养基包含选自糖和醇的碳源。

本发明的进一步的方面为提供如上所述的方法，其中所述糖为葡萄糖并且所述醇为甘油。

本发明的一个方面为增强4-羟基-L-脯氨酸(包括其游离形式和盐形式二者)的产生。本发明的另一个方面为提供使用具有L-脯氨酸羟化酶活性的细菌通过L-脯氨酸的直接酶羟化而制备4-羟基-L-脯氨酸或其盐的方法。

本发明在下文中详细描述。

附图简述

图1显示在菌株MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)_[pELAC-IDO(Lys，23)]中由于异亮氨酸与α-酮戊二酸(2-氧戊二酸)的同时氧化造成的TCA循环的“分流”。

图2显示重组质粒pET-IlvA的结构。

图3显示重组质粒pELAC-IDO(Lys，23)的结构。

图4显示大肠杆菌MG1655(P_L-brnQ)菌株的构建。

图5显示菌株MG1655与MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)在含葡萄糖或甘油的、添加或未添加赖氨酸、甲硫氨酸和二氨基庚二酸(DAP)的M9-盐培养基上的生长。将菌株在补充了葡萄糖或甘油，以及，任选地，赖氨酸、甲硫氨酸和二氨基庚二酸(DAP)的M9-盐培养基中培养。缩写：菌株WT＝MG1655；2d＝MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)；培养基：A＝M9盐+葡萄糖；B＝M9盐+葡萄糖+(Lys，Met，DAP)；C＝M9盐+甘油；D＝M9盐+甘油+(Lys，Met，DAP)。

图6显示菌株MG1655[pELAC-IDO(Lys，23)]和MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)[pELAC-IDO(Lys，23)]在添加或未添加L-异亮氨酸的M9-盐培养基上的生长。缩写：菌株1＝MG1655[pELAC-IDO(Lys，23)]；2＝MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)[pELAC-IDO(Lys，23)]；培养基：G＝M9盐+葡萄糖(137mM)；GI＝M9盐+葡萄糖(137mM)+L-异亮氨酸(137mM)；Y＝M9盐+甘油(136mM)；YI＝M9盐+甘油(136mM)+L-异亮氨酸(137mM)。

实施本发明的最佳方式

1.本发明的细菌

如本说明书中所用的术语“细菌”包括产生酶的细菌，其中存在目标酶活性或目标酶活性得到增强的这些细菌的突变体和遗传重组体等。

如本说明书中所用的术语“2-氧戊二酸依赖性酶活性”指催化与从2-氧戊二酸形成琥珀酸偶联的反应的酶活性。

已报道了许多具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质，如2-氧戊二酸依赖性双加氧酶。其实例包括可用于产生有用产物的双加氧酶，如将L-Pro转换为羟基Pro的Pro羟化酶(APPLIED AND ENVIRONMENTALMICROBIOLOGY，Sept.1999，p.4028-4031)，将γ-丁基甜菜碱转换为L-肉毒碱的γ-丁基甜菜碱羟化酶(WO2005/083089)。除了这些双加氧酶外，还报道了许多双加氧酶。例如，参照：Critical Reviews in Biochemistry and MolecularBiology，39：21-68，2004和NATURE CHEMICAL BIOLOGY，4 NUMBER 3MARCH：152-156，2008。对于这些综述中描述的2-氧戊二酸依赖性双加氧酶，所述细菌经修饰而减弱了编码氧戊二酸脱氢酶的基因(如ΔsucAB、ΔsucA、ΔsucB)的表达，优选经修饰而减弱了编码氧戊二酸脱氢酶和异柠檬酸裂合酶的基因(如(ΔsucAB、ΔsucA或ΔsucB)加ΔaceA)的表达，更优选经修饰而减弱了编码氧戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂合酶和异柠檬酸脱氢酶磷酸酶(如(ΔsucAB、ΔsucA或ΔsucB)加ΔaceAK)的基因的表达，其由下文提及的实施例中描述的大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK)所代表，将其视为供有效使用在2-氧戊二酸依赖性酶反应中自碳源(如D-葡萄糖)产生的2-氧戊二酸用的一般性宿主。

本发明将通过提及下述实施方式作为实例来加以描述，在所述实施方式中具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质为具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质，并且由该蛋白质催化的反应的产物为(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸。然而，本发明并不限定于这种实施方式。

在本发明中，术语“(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸”或“(2S，3R，4S)-4-HIL”或“4HIL”指单一的化学化合物或含有(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的化合物的混合物。

如本说明书中所用的术语“细菌”包括产生酶的细菌，其中存在目标酶活性或增强了目标酶活性的这样的细菌的突变体和遗传重组体等。

来自微生物细胞的L-异亮氨酸双加氧酶可缩写为IDO。

筛选环境微生物揭示了独特的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株2-e-2，其具有催化从L-异亮氨酸(其游离形式和盐形式二者)直接形成(2S，3R，4S)-4HIL的反应的活性。从所述培养的微生物细胞中纯化了新型L-异亮氨酸双加氧酶，并且可以缩写为IDO(Lys，23)。

此外，通过纯化源自苏云金芽孢杆菌菌株2-e-2的双加氧酶而确定了

编码IDO(Lys，23)的DNA示于SEQ ID No：1。此外，SEQ ID No：1的核苷酸序列编码的IDO(Lys，23)氨基酸序列示于SEQ ID No：2。SEQ ID No：2为SEQ ID No：1的核苷酸序列编码的IDO(Lys，23)氨基酸序列。SEQ ID No：2的IDO(Lys，23)拥有L-异亮氨酸双加氧酶活性，并催化从一分子的L-异亮氨酸直接合成下文式(I)中所示的(2S，3R，4S)-4HIL的反应。

编码催化自L-异亮氨酸形成(2S，3R，4S)-4HIL的反应的IDO的DNA并不仅仅为示于SEQ ID No：1的DNA。这是因为在来自形成催化从L-异亮氨酸产生(2S，3R，4S)-4HIL的反应的IDO的芽孢杆菌中的各个菌株和菌种的核苷酸序列中可能存在差异。

本发明的DNA不仅包括分离的编码IDO的DNA，还包括其中突变经人工添加到编码IDO的DNA的DNA。这种DNA可从产生IDO的微生物的染色体分离。本发明的DNA必需编码能够催化上述反应的IDO。人工添加突变的方法包括描述于Method.in Enzymol.，154(1987)的通常使用的导入位点特异性突变的方法。

在严格条件下与具有与SEQ ID No：1的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交，并且编码具有IDO活性的蛋白质的DNA也包括在本发明的DNA中。如本文所使用的，“严格条件”指在该条件下形成特异性杂交体而不性成非特异性杂交体的那些条件。尽管难以用数字来明确表示这些条件，但是通过举例，在那些条件下具有较高同源性(例如优选70％或更高，更优选80％或更高，还更优选90％或更高，并且特别优选95％或更高的同源性)的DNA分子互相杂交，而具有较低同源性的DNA分子不互相杂交，或者在那些条件下，在Southern杂交中的典型洗涤条件(即，在37℃下盐浓度对应于0.1xSSC和0.1％SDS，优选在60℃下0.1xSSC和0.1％SDS，并且更优选在65℃下0.1xSSC和0.1％SDS)下发生杂交。探针的长度可适当选择，取决于杂交的条件，并通常在100bp到1kbp之间浮动。此外，“L-异亮氨酸双加氧酶活性”可描述为自L-异亮氨酸合成(2S，3R，4S)-4HIL的活性。然而，当核苷酸序列在严格条件下与互补于SEQ ID No：1的核苷酸序列的核苷酸序列杂交时，其优选在37℃和pH 8保留具有SEQ ID No：2的氨基酸序列的蛋白质的10％或更多，优选30％或更多，更优选50％或更多，并且更优选70％或更多的L-异亮氨酸双加氧酶活性。

此外，编码与SEQ ID No：1的DNA编码的IDO基本上相同的蛋白质的DNA也包括在本发明的DNA中。即，下述DNA也包含在本发明的DNA中：

(a)SEQ ID No：1核苷酸序列的DNA；

(b)在严格条件下与具有与SEQ ID No：1的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交，并且编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的DNA；

(c)编码SEQ ID No：2的氨基酸序列的蛋白质的DNA；

(d)编码具有在SEQ ID No：2的氨基酸序列中含有一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的DNA；和

(e)编码具有与SEQ ID No：2的氨基酸序列至少70％同源，优选至少80％同源，更优选至少90％同源并且还更优选至少95％同源并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的氨基酸序列的蛋白质的DNA。

在此，“一个或数个”指不导致所述蛋白质的3D结构显著变化或L-异亮氨酸双加氧酶活性显著降低的变化数，并且更具体地，为1～78的范围，优选1～52，更优选1～26，并且还更优选1～13。

所述一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位应为保守突变，从而保持活性。代表性的保守突变为保守取代。保守取代的实例包括用Ser或Thr取代Ala，用Gln、His或Lys取代Arg，用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，用Asn、Glu或Gln取代Asp，用Ser或Ala取代Cys，用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln，用Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu，用Pro取代Gly，用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，用Leu、Met、Val或Phe取代Ile，用Ile、Met、Val或Phe取代Leu，用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，用Ile、Leu、Val或Phe取代Met，用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，用Thr或Ala取代Ser，用Ser或Ala取代Thr，用Phe或Tyr取代Trp，用His、Phe或Trp取代Tyr，和用Met、Ile或Leu取代Val。

此外，“L-异亮氨酸双加氧酶活性”指上述的自L-异亮氨酸合成(2S，3R，4S)-4HIL。然而，当SEQ ID No：2的氨基酸序列含有一个或数个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位时，其优选在30℃和pH 6.0的条件下如与具有SEQ ID No：2的氨基酸序列的蛋白质相比，保持至少10％或更多，优选30％或更多，更优选50％或更多，并且还更优选70％或更多的L-异亮氨酸双加氧酶活性。本发明的IDO的L-异亮氨酸双加氧酶活性可通过使用高效液相层析(HPLC)分析自L-异亮氨酸的(2S，3R，4S)-4HIL形成来测量。

此外，SEQ ID NO：1的同源DNA可用作本发明的编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因。同源DNA是否编码L-异亮氨酸双加氧酶能够通过测量细胞裂解液的L-异亮氨酸双加氧酶活性，或过表达所述同源DNA的微生物的细胞裂解液的L-异亮氨酸双加氧酶活性来证实。

SEQ ID NO：1的同源DNA也可自另外的杆菌属物种，例如蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、韦氏芽孢杆菌(Bacillus weihenstephanensis)制备。

短语“属于埃希氏菌属的细菌”意指该细菌根据微生物学领域技术人员所知分类法分类至埃希氏菌属的细菌。如本发明中所使用的属于埃希氏菌属的细菌的实例包括，但不限于，大肠杆菌(E.Coli)。

可用于本发明的属于埃希氏菌属的细菌并不特别限定；然而，例如，Neidhardt，F.C.等(大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌(Escherichia coli and Salmonellatyphimurium)，American Society for Microbiology，Washington D.C.，1208，Table 1)所描述的细菌包括在本发明内。

短语“属于假单胞菌属的细菌”意为根据微生物学领域技术人员所知分类法分类至假单胞菌属的细菌。

短语“属于棒杆菌属的细菌”意为根据微生物学领域技术人员所知分类法分类至棒杆菌属的细菌。如本发明中所使用的属于棒杆菌属的细菌的实例包括，但不限于，谷氨酸棒杆菌。

短语“属于节杆菌属的细菌”意为根据微生物学领域技术人员所知分类法分类至节杆菌属的细菌。如本发明中所使用的属于节杆菌属的细菌的实例包括，但不限于，简单节杆菌、球形节杆菌、硫磺节杆菌与粘节杆菌。

短语“属于曲霉属的细菌”意为根据微生物学领域技术人员所知分类法分类至曲霉属的细菌。

短语“属于芽孢杆菌属的细菌”意为根据微生物学领域技术人员所知分类法分类至芽孢杆菌属的细菌。如本发明中所使用的属于芽孢杆菌属的细菌的实例包括，但不限于，枯草芽孢杆菌。

来自大肠杆菌的brnQ基因(同物异名-ECK0395，b0401，hrbA)编码支链氨基酸LIVCS转运蛋白BrnQ(同物异名-B0401，HrbA，LIV-II)。所述brnQ基因(核苷酸418815-420134；GenBank登录号NC_000913.2；gi：16128105)位于大肠杆菌K-12染色体上的基因phoR和基因proY之间。brnQ基因的核苷酸序列和brnQ基因编码的BrnQ蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

来自大肠杆菌的sucA基因(同物异名ECK0714，lys，b0726，lys+met)编码氧戊二酸脱氢酶复合物的E1(0)组分的亚基-SucA(同物异名B0726，Lys)。所述sucA基因(核苷酸757929-760730；GenBank登录号NC_000913.2；gi：16128105)位于大肠杆菌K-12染色体上的基因G6388和基因sucB之间，与G6388部分重叠。sucA基因的核苷酸序列和sucA基因编码的SucA蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

来自大肠杆菌的sucB基因(同物异名ECK0715，b0727)编码氧戊二酸脱氢酶复合物的E2(0)组分的亚基-SucB(同物异名B0727)。所述sucB基因(核苷酸760745-761962；GenBank登录号NC_000913.2；gi：16128105)位于大肠杆菌K-12染色体上的基因sucA和基因sucC之间。sucB基因的核苷酸序列和sucB基因编码的SucB蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：7和SEQID NO：8。

来自大肠杆菌的aceA基因(同物异名ECK4007，b4015，icI)编码异柠檬酸裂合酶的亚基-AceA(同物异名B4015，IcI)。所述aceA基因(核苷酸4215132-4216436；GenBank登录号NC_000913.2；gi：16128105)位于大肠杆菌K-12染色体上的基因aceB和基因aceK之间。aceA基因的核苷酸序列和aceA基因编码的AceA蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：9与SEQ IDNO：10。

来自大肠杆菌的aceK基因(同物异名ECK4008，b4016)编码异柠檬酸脱氢酶磷酸酶的亚基-AceK(同物异名B4016)。所述aceK基因(核苷酸4216619-4218355；GenBank登录号NC_000913.2；gi：16128105)位于大肠杆菌K-12染色体上的基因aceA和基因arpA之间，其与arpA为相反方向，且部分重叠。aceK基因的核苷酸序列和aceK基因编码的AceK蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。

来自大肠杆菌的ilvE基因(同物异名ECK3762，b3770)编码支链氨基酸氨基转移酶的亚基-IlvE(同物异名B3770)。所述ilvE基因(核苷酸3950507-3951436；GenBank登录号NC_000913.2；gi：16128105)位于大肠杆菌K-12染色体上的基因ilvM与基因ilvD之间。ilvE基因的核苷酸序列和ilvE基因编码的IlvE蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14。

由于在属之间或埃希氏菌属的菌株之间在DNA序列上可能有些差异，所以增强表达的brnQ基因，或者减弱表达的sucA、sucB、aceA、aceK、ilvE基因并不限于示于SEQ ID No：3、SEQ ID No：5、SEQ ID No：7、SEQ ID No：9、SEQ ID No：11和SEQ ID No：13的基因，而是可以包括与SEQ ID No：3、SEQ ID No：5、SEQ ID No：7、SEQ ID No：9、SEQ ID No：11和SEQ ID No：13同源，但分别编码所述BrnQ、SucA、SucB、AceA、AceK和IlvE蛋白的变体蛋白的基因。如本发明中所使用的短语“变体蛋白”意指序列中有变化(无论所述变化是氨基酸的缺失、插入、添加或取代)，但作为BrnQ/SucA/SucB/AceA/AceK/IlvE蛋白的活性得到保留的蛋白质。变体蛋白中的变化数取决于所述蛋白质三维结构中氨基酸残基的位置或种类。其可以是在SEQ ID No：4、SEQ ID No：6、SEQ ID No：8、SEQ ID No：10、SEQ IDNo：12和SEQ ID No：14中的1～30个，优选1～15个，并且更优选1～5个。变体中的这些变化可发生于所述蛋白质上对该蛋白质功能非至关重要的区域。这是因为一些氨基酸彼此具有高同源性，所以三维结构和活性不受这种变化影响。因此，由所述brnQ/sucA/sucB/aceA/aceK/ilvE基因编码的蛋白质变体可以是相对于示于SEQ ID No：4、SEQ ID No：6、SEQ ID No：8、SEQ IDNo：10、SEQ ID No：12和SEQ ID No：14中所示的完整氨基酸序列，具有不少于80％，优选不少于90％，并且最优选不少于95％的同源性的蛋白质变体，只要所述BrnQ、SucA、SucB、AceA、AceK和IlvE蛋白的活性分别得以保持即可(在sucA/sucB/aceA/aceK/ilvE基因的失活之前)。

两个氨基酸序列间的同源性可使用公知的方法来测定，例如，计算机程序BLAST 2.0，其计算三个参数：得分(score)、同一性(identity)和相似性(similarity)。

另外，所述brnQ/sucA/sucB/aceA/aceK/ilvE可以是在严格条件下与以下杂交的变体：示于SEQ ID No：3/SEQ ID No：5/SEQ ID No：7/SEQ ID No：9/SEQ ID No：11/SEQ ID No：13的核苷酸序列，或可在严格条件下从所述核苷酸序列制备的探针，只要所述变体在失活之前编码功能性的BrnQ/SucA/SucB/AceA/AceK/IlvE蛋白质。“严格条件”包括下述条件，即在此条件下，形成特异性的杂合体，例如，具有不低于60％，优选不低于70％，更优选不低于80％，还更优选不低于90％，并且最优选不低于95％的同源性的杂合体，而不形成非特异性的杂合体，例如，具有低于上述的同源性的杂合体。例如，严格条件的实例为在1xSSC、0.1％SDS，优选0.1xSSC、0.1％SDS的盐浓度在60℃下洗涤一次或多次，优选两次或三次。洗涤的持续时间取决于用于印迹的膜类型，以及，通常而言，应为生产商所推荐的。例如，在严格条件下对Hybond^TM N+尼龙膜(Amersham)推荐的洗涤持续时间为15分钟。洗涤优选可以进行2到3次。所述探针的长度可适当的根据杂交条件选择，且通常为100bp～1kbp。

短语“基因的增强表达”或“基因的过表达”意指所述基因的表达高于未修饰的菌株，例如，野生型菌株。这种修饰的实例包括增加表达基因每细胞的拷贝数，增加所述基因的表达水平，等等。表达基因拷贝数的量通过，例如，限制切割染色体DNA继之以使用基于所述基因序列的探针的Southern印迹、荧光原位杂交(FISH)等来测定。基因表达的水平可通过多种已知方法测量，包括Northern印迹、定量RT-PCR等。所述基因编码的蛋白质的量可通过已知方法测量，包括SDS-PAGE继之以免疫印迹测定法(Western印迹分析)等。此外，起对照作用的野生型菌株包括，例如，大肠杆菌K-12。

“用编码蛋白质的DNA转化细菌”意指将所述DNA通过，例如，常规方法导入细菌。这种DNA的转化会导致编码本发明蛋白质的基因的表达增加，并且会增强所述蛋白质在所述细菌细胞中的活性。转化方法包括任何迄今为止报道的已知方法。例如，经报道用于大肠杆菌K-12的使用氯化钙处理受体细胞从而增加该细胞对DNA的渗透性的方法(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))。

过表达基因或增强基因表达的方法包括增加所述基因拷贝数。将基因导入能够在埃希氏菌属细菌中发挥功能的载体增加所述基因的拷贝数。优选使用低拷贝载体。低拷贝载体的实例包括但不限于pSC101、pMW118、pMW119等。术语“低拷贝载体”用于其拷贝数为至多每细胞5拷贝的载体。

基因表达的增强也可通过将所述基因的多个拷贝通过，例如同源重组、Mu整合等导入细菌染色体来达成。例如，一次Mu整合允许将多至3个拷贝的基因导入细菌染色体。

增加基因的拷贝数也可通过将所述基因的多个拷贝导入所述细菌的染色体DNA来达成。为了将所述基因的多个拷贝导入细菌染色体，使用以多个拷贝作为靶存在于染色体DNA中的序列进行同源重组。在所述染色体DNA中具有多个拷贝的序列包括但不限于，重复DNA，或在转座元件末端存在的反向重复。

增强基因表达也可通过将本发明的DNA置于强力启动子的控制之下来达成。例如，P_tac启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、lambda噬菌体的P_R或P_L启动子均已知为强力启动子。强力启动子的使用也可与基因拷贝数的增加组合。

或者，启动子的作用可通过，例如，将突变导入所述启动子以增加位于该启动子下游的基因的转录水平而增强。此外，已知在核糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间隔区中数个核苷酸的取代，特别是紧接着所述起始密码子上游的序列，深刻地影响mRNA的可翻译性。

另外，也有可能将核苷酸取代导入细菌染色体上基因的启动子区，其结果为更强的启动子功能。例如，可以以与基因取代相同的方式使用温度敏感的质粒，如公开于国际专利公开WO 00/18935和日本专利申请公开No.1-215280中的，实施对所述表达控制序列的改变。

本发明的发明人提出，减弱基因sucA、sucB、aceA和aceK的表达应在突变体细胞中导致TCA循环的“分流”，这是由于异亮氨酸和α-酮戊二酸(2-氧戊二酸)的同时氧化。这可导致4HIL的增强产生。与此同时，用IDO活性同时氧化异亮氨酸和α-酮戊二酸会是细菌生长与携带编码IDO的基因的质粒的稳定化二者所必需的因素。换言之，异亮氨酸羟化的过程对细胞生长会是必需的。在此情况下，从异亮氨酸到4-HIL的生物转化可在细菌细胞生长期间不补充任何抗生素的条件下达成。该策略通过构建因为缺失sucAB和aceAK基因而缺乏琥珀酰CoA的菌株来实现(图1，实施例3-5)。显而易见该原理可应用于任何与从2-氧戊二酸形成琥珀酸偶联的反应。也显而易见最低要求为减弱编码氧戊二酸脱氢酶的基因的表达(如ΔsucAB、ΔsucA、ΔsucB)。所述细菌优选经进一步修饰而减弱了编码异柠檬酸裂合酶的基因的表达(例如ΔaceA)。所述细菌更优选经进一步修饰而减弱了编码异柠檬酸裂合酶和异柠檬酸脱氢酶磷酸酶的基因的表达(如ΔaceAK)。

通过减弱编码氧戊二酸脱氢酶的基因的表达，细胞中2-氧戊二酸的代谢受到阻抑，而对2-氧戊二酸依赖性酶的2-氧戊二酸供应增强。由此工程改造的细菌为适于进行2-氧戊二酸依赖性酶反应的宿主。编码氧戊二酸脱氢酶的基因的减弱增加细胞中的2-氧戊二酸的水平，并且使其对2-氧戊二酸依赖性酶的供应为有效的。所述氧戊二酸脱氢酶为将2-氧戊二酸转换为TCA循环中的琥珀酰CoA的酶。优选进一步与编码异柠檬酸裂合酶的基因的减弱组合，所述异柠檬酸裂合酶在乙醛酸循环中催化异柠檬酸到琥珀酸的转化，从而进一步增加2-氧戊二酸的供应。通过这种组合，阻断了TCA和乙醛酸循环中从2-氧戊二酸到琥珀酸的途径，从而进一步增加对2-氧戊二酸依赖性酶的2-氧戊二酸供应。更优选进一步与编码异柠檬酸脱氢酶磷酸酶的基因的减弱组合，从而阻抑从异柠檬酸产生2-氧戊二酸的异柠檬酸脱氢酶的失活。由于支链氨基酸氨基转移酶使4HIL脱氨基(Smirnov S.V.et al，FEMS MicrobiolLett.；273(1)：70-7(2007))，本发明的发明人提出，ilvE基因的减弱表达应由于阻止了4HIL的脱氨基而导致更高的4HIL产率。

短语“细菌经修饰而减弱了基因表达”意指所述细菌经这样一种方法修饰，从而使得所述经修饰的细菌如与未修饰的细菌相比包含减少量的由所述基因编码的蛋白质，或者所述经修饰的细菌无法合成该蛋白质。短语“细菌经修饰而减弱了基因表达”也可意指所述细菌经这样一种方法修饰，从而使得所述修饰的基因编码具有降低活性的突变蛋白。

在细菌染色体中基因的存在或缺失可通过公知的方法检测，包括PCR、Southern印迹等。

短语“基因的失活”意指所述经修饰的基因编码完全无活性的蛋白质。也可能所述经修饰的DNA区域由于部分或全部基因的缺失、所述基因阅读框的移位、错义/无义突变的导入或所述基因邻近区域(包括控制基因表达的序列，例如启动子、增强子、弱化子、核糖体结合位点等)的修饰，而无法天然地表达所述基因。

所述基因的表达可通过将突变导入染色体上的基因中，从而使得所述基因编码的蛋白质的胞内活性如较之未修饰的菌株减少来减弱。这样的基因上的突变可为取代一个或多个碱基以造成所述基因编码的蛋白质中的氨基酸取代(错义突变)、导入终止密码子(无义突变)、缺失一个或两个碱基以造成移码、插入药物抗性基因、或者部分或全部基因的缺失(Qiu，Z.and Goodman，M.F.，J.Biol.Chem.，272，8611-8617(1997)；Kwon，D.H.et al，J.Antimicrob.Chemother.，46，793-796(2000))。所述基因的表达也可通过修饰表达调节序列如启动子、Shine-Dalgarno(SD)序列等来减弱(WO95/34672，Carrier，T.A.andKeasling，J.D.，Biotechnol Prog 15，58-64(1999))。

例如，下述方法可用于通过基因重组导入突变。制备编码具有减少的活性的突变蛋白的突变基因，且用含有该突变基因的DNA片段转化细菌。然后，将染色体上的天然基因通过同源重组用所述突变基因取代，并选择所得的菌株。这种使用同源重组的基因取代可通过使用线性DNA的方法(其称为“Red-驱动整合(Red-driven integration)”(Datsenko，K.A.and Wanner，B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，12，p 6640-6645(2000)))，或通过使用含有温度敏感性复制的质粒(美国专利6,303,383或JP 05-007491A)的方法来进行。此外，通过使用同源重组(例如如上所述)的基因取代进行的位点特异性突变的掺入也可使用无法在所述宿主中复制的质粒来进行。

所述基因的表达也可通过将转座子或IS因子插入所述基因的编码区(美国专利No.5,175,107)，或通过常规方法，如通过UV照射或亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)进行的诱变处理来减弱。

所述基因的失活也可通过常规方法实施，如使用UV照射或亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)的诱变处理、定点诱变、使用同源重组的基因破坏或/和插入-缺失诱变(Yu，D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97：12：5978-83和Datsenko，K.A.and Wanner，B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97：12：6640-45)，也称“Red驱动整合”。

制备质粒DNA、消化和连接DNA、转化、选择作为引物的寡核苷酸的方法等可为本领域技术人员熟知的一般方法。这些方法描述于，例如，Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T.，“Molecular Cloning A LaboratoryManual，Second Edition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。

2.本发明的方法

本发明的方法是用于产生由具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质催化的反应的产物的方法，该方法通过在含有该反应的底物的培养基中培养本发明的细菌，并从所述培养基分离所产生的产物来进行。

根据产物和所使用的具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质的特异性，合适地选择底物。例如，当产物为(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸，且所述蛋白质具有L-异亮氨酸双加氧酶活性时，所述底物可以是L-亮氨酸。

因此本发明的方法可以是通过在含有L-异亮氨酸的培养基中培养本发明的细菌，并从所述培养基分离所产生的(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸，而产生(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的方法。

用于培养的培养基可以是合成的或天然的培养基，只要所述培养基包含碳源和氮源和矿质，以及，如有必要，包含细菌生长所需的适量的营养。碳源可包括多种糖类如葡萄糖和蔗糖，和多种有机酸。取决于所使用微生物的同化模式，可使用醇，包括乙醇和甘油。作为氮源，可使用多种铵盐如氨和硫酸铵，其它含氮化合物如胺，天然氮源如蛋白胨、大豆水解产物和消化的发酵微生物。作为矿质，可使用磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙等。作为维生素，可使用硫胺素、酵母提取物等。本发明的培养基含有L-异亮氨酸(20-40g/l)。

培养优选在有氧条件下进行，如振荡培养，和带有通气的搅拌培养，在20～40℃的温度下，优选30～38℃的温度下进行。培养的pH通常为5～9，优选在6.5～7.2。培养的pH可使用氨、碳酸钙、多种酸、多种碱和缓冲液调整。

分离和纯化方法的实例可包括将(2S，3R，4S)-4HIL与离子交换树脂接触以吸附碱性氨基酸，继之以洗脱和结晶的方法；以及对洗脱所得产物进行脱色并用活性炭过滤，继之以结晶以获取(2S，3R，4S)-4HIL的方法。

关于除(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸外的产物，培养条件、分离和纯化方法、以及品系根据所使用的细菌和目标产物的性质类似地选择。

实施例

本发明将以通过引述下列实施例对进一步的详细解释，然而，本发明并不受其限定。

实施例1.构建MG1655[pELAC-IDO(Lys，23)]和MG1655(P _L -brnQ) [pELAC-IDO(Lys，23)]菌株

1.1构建pMW119-IDO(Lys，23)质粒

对苏云金芽孢杆菌菌株2-e-2染色体的0.8kb片段使用寡核苷酸SVS 170(SEQ ID No：15)和SVS 169(SEQ ID No：16)作为引物以及纯化的染色体DNA作为模板加以扩增。使用下述PCR实验方法：起始循环为94℃下30秒；4个循环的94℃下40秒；49℃下30秒；72℃下40秒；35个循环的94℃下30秒；54℃下30秒；72℃下30秒。将PCR片段使用BamHI和SacI内切核酸酶消化，并随即连接至之前经相同限制酶处理的pMW119载体中。

1.2.构建pELAC-IDO(Lys，23)质粒

使用XbaI、SacI内切核酸酶将0.76kb的DNA片段从pMW119-IDO(Lys，23)质粒切出，并随即克隆入pELAC-ilvA/XbaI-SacI载体(参见参考实施例1)，得到重组质粒pELAC-IDO(Lys，23)(图3)。

1.3.构建MG1655(P _L -brnQ)菌株

增加Ile转运蛋白BrnQ在MG1655菌株中的表达以改善Ile流入。将携带Cm标记和P_L启动子的1.9kbp DNA片段使用寡核苷酸SVS179(SEQ IDNo：17)和SVS 180(SEQ ID No：18)作为引物以及BW25113cat-P_L-yddG(EP1449918A1，俄国专利RU2222596)菌株的染色体DNA作为模板进行PCR扩增。用于PCR的条件如下：在95℃下3分钟的变性步骤；前两个循环的概略：95℃下1分钟，50℃下30秒，72℃下40秒；最后25个循环的概略：95℃下30秒，54℃下30秒，72℃下40秒；最终步骤，72℃下5分钟。

得到了1.9kbp的PCR产物，并将其在琼脂糖凝胶中纯化，再用于对大肠杆菌菌株MG1655(ATCC 700926)的电穿孔，所述菌株包含具有温度敏感性复制起点的质粒pKD46。所述质粒pKD46(Datsenko，K.A.and Wanner，B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97：12：6640-45)包含噬菌体λ的2154核苷酸DNA片段(核苷酸位置31088-33241，GenBank登录号J02459)，并包含在阿拉伯糖诱导型P_araB启动子控制下的λRed同源重组系统的基因(γ、β、exo基因)。质粒pKD46对将所述PCR产物整合入菌株MG1655的染色体为必需的。

电感受态细胞如下所述制备：将大肠杆菌MG1655/pKD46在含氨苄西林(100mg/l)的LB培养基中在30℃下培养过夜，并将该培养物用含有氨苄西林和L-阿拉伯糖(1mM)的5ml SOB培养基(Sambrook et al，“MolecularCloning：A Laboratory Manual，Second Edition”，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)稀释100倍。在30℃下将细胞通气培养到OD₆₀₀≈0.6，并随即通过浓缩100倍并用冰冷的去离子水洗涤三次来制成电感受态。电穿孔使用70μl细胞和≈100ng的PCR产物实施。电穿孔后，将细胞与1ml SOC培养基(Sambrook et al，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)在37℃下培育2.5小时，并随即铺板于含有氯霉素(30μg/ml)的L-琼脂上，并在37℃下培养以选择Cm^R重组体。然后，为了消除pKD46质粒，在42℃下在含有Cm的L-琼脂上进行两次传代，并测试所得的菌落对氨苄西林的敏感性。

由此构建了大肠杆菌MG1655(P_L-brnQ)菌株(图4)。

1.4.构建MG1655[pELAC-IDO(Lys，23)]和MG1655(P _L -brnQ) [pELAC-IDO(Lys，23)]菌株

将菌株MG1655和MG1655(P_L-brnQ)的细胞各自用质粒pELAC-IDO(Lys，23)转化。所得克隆在X-gal/IPTG琼脂板(蓝/白测试)上选择。由此，分别获得了菌株[pELAC-IDO(Lys，23)]和MG1655(P_L-brnQ)[pELAC-IDO(Lys，23)]。

实施例2.通过大肠杆菌菌株MG1655(P _L -brnQ)[pELAC-IDO(Lys，23)]产生4HIL

为了测试增强表达编码L-异亮氨酸转运蛋白的基因对4HIL的产生的作用，将MG1655[pELAC-IDO(Lys，23)]和MG1655(P_L-brnQ)[pELAC-IDO(Lys，23)]菌株的细胞在补充有氨苄西林(200μg/ml)和IPTG(1mM)的LB培养基中在37℃下培养约4-5小时。对每个培养的重组大肠杆菌菌株如下测量粗蛋白质提取物中的IDO比活性。通过在4℃下离心来收获来自5ml培养物的细胞，将其重悬于0.5ml缓冲液A^*(50mM TRIZMA、5％甘油、1mM EDTA、1mM DTT，pH用HCl调为7)中，并在4℃下通过超声处理破坏。反应混合物含有50mM HEPES pH7.0；5mM Ile；0.5mMα-酮戊二酸；5mM抗坏血酸；5mM FeSO₄和蛋白质制备物的等分试样。将所述反应物在34℃下振荡培育1小时。4HIL使用TLC或HPLC分析如下检测。TLC分析：将用反应溶液的等分试样(1-2μl)点样的薄层硅胶板(10x15cm)用显影溶剂(2-丙醇∶丙酮∶氨∶水＝100∶100∶25∶16)显影，并用茚三酮试剂检测4HIL。HPLC分析：使用带有荧光分光光度计1100系列(Agilent，USA)的高压层析(Waters，USA)。所选的检测波长范围：激发波长在250nm，发射波长的范围在320-560nm。通过accq-标签方法的分离在柱Nova-Pak^TMC18150×3.9mm，4μm(Waters，USA)中在+40℃下实施。试样的注入体积为5μl。氨基酸衍生物的形成及其分离根据Waters生产商的推荐加以实施(Liu，H.et al，J.Chromatogr.A，828，383-395(1998)；Waters accq-tag chemistry package.Instruction manual.Millipore Corporation，pp.1-9(1993))。为了获取具有6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯(6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate)的氨基酸衍生物，使用试剂盒Accq-Fluor^TM(Waters，USA)。accq-标签方法的分析使用浓缩的Accq-标签Eluent A(Waters，USA)进行。所有的溶液使用Milli-Q水制备，标准溶液在+4℃下储藏。在IDO生产菌株的粗提取物中IDO活性的测量结果示于表1。

MG1655[pELAC-IDO(Lys，23)]和MG1655(P_L-brnQ)[pELAC-IDO(Lys，23)]菌株的细胞通过离心收获，并在补充以L-异亮氨酸和酮戊二酸、不同组合的葡萄糖或甘油的MI30ch培养基(50mM KH₂PO₄(用NaOH调节到pH7)；20mM NH₄C、2mM MgSO₄、白垩-1.25g/100ml、30g/l Ile、2mM FeSO₄、2mM抗坏血酸、氨苄西林200mg/l)(参见表2，表3)中重悬至终体积为2ml(到OD₅₄₀≈0.03-0.04)。将细胞在32℃下带有剧烈搅拌地培养约15小时。然后，通过如上所述的HPLC分析调查4HIL的积累。由MG1655[pELAC-IDO(Lys，23)]和MG1655(P_L-brnQ)[pELAC-IDO(Lys，23)]菌株依赖于α-酮戊二酸、葡萄糖和甘油产生的4HIL的测量结果示于表2(至少3个试管)。由MG1655[pELAC-IDO(Lys，23)]和MG1655(P_L-brnQ)[pELAC-IDO(Lys，23)]菌株依赖于不同浓度的甘油产生的4HIL的测量结果示于表3(至少3个试管)。如下根据表2和表3，较之MG1655[pELAC-IDO(Lys，23)]，MG1655(P_L-brnQ)[pELAC-IDO(Lys，23)]产生了更大量的4HIL。

表1

菌株	IDO活性(nmoles/min*mg)
		MG1655[pELAC-IDO(Lys，23)]	300±12
MG1655(P_L-brnQ)[pELAC-IDO(Lys，23)]	280±10

表2.

表3

实施例3.构建MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P _L -brnQ)[pELAC-IDO(Lys， 23)]菌株

3.1.构建MG1655(ΔsucAB)菌株

为缺失sucAB基因，进行了下列的操作。将含有Cm^R标记和P_tac启动子的1.8kbDNA片段通过PCR用寡核苷酸SVS-192(SEQ ID No：19)和SVS-193(SEQ ID No：20)作为引物以及MG1655(attR-Cm-attL-P_tac)菌株(Katashkina J.I.et al.，Molekularnaya biologiya(RU)，v.39，No.5，1-10(2005))的染色体DNA作为模板进行扩增。用于PCR条件如下：在95℃下3分钟的变性步骤；前两个循环的概略：在95℃下1分钟，50℃下30秒，72℃下40秒；最后25个循环的概略：95℃下30秒，54℃下30秒，72℃下40秒；最终步骤：72℃下5分钟。

获得了1.8kbp的PCR产物，并将其在琼脂糖凝胶中纯化，再用于大肠杆菌菌株MG1655的电穿孔，所述菌株包含具温度敏感性复制的pKD46质粒。

电穿孔如上所述进行。将电穿孔后的细胞与1ml SOC培养基在37℃下培育2.5小时，并随即铺板于含有氯霉素(30μg/ml)的L-琼脂上，并在37℃下培养以选择Cm^R重组体。然后，为了消除pKD46质粒，在42℃下在含有Cm的L-琼脂上进行两次传代，并测试所得的菌落对氨苄西林的敏感性。

由此构建了大肠杆菌MG1655(ΔsucAB)菌株。

3.2.构建MG1655(ΔaaceAK)菌株

为缺失aceAK基因，进行了下列的操作。将含有Km^R标记和P_tac启动子的1.8kb DNA片段通过PCR用寡核苷酸SVS-199(SEQ ID No：21)和SVS-200(SEQ ID No：22)作为引物以及pMW118-(λattL-Km^r-λattR)(参见参考实施例2)质粒DNA作为模板进行扩增。

用于PCR条件如下：在95℃下3分钟的变性步骤；前两个循环的概略：95℃下1分钟，50℃下30秒，72℃下40秒；最后25个循环的概略：95℃下30秒，54℃下30秒，72℃下40秒；最终步骤：72℃下5分钟。

获得了1.8kbp的PCR产物，并将其在琼脂糖凝胶中纯化，再用于大肠杆菌菌株MG1655的电穿孔，所述菌株包含具有温度敏感性复制起点的质粒pKD46。

电穿孔如上所述进行。将电穿孔后的细胞与1ml SOC培养基在37℃下培育2.5小时，并随即铺板于含有卡那霉素(20μg/ml)的L-琼脂上，并在37℃培养以选择Km^R重组体。然后，为了消除pKD46质粒，在42℃下在含有Km的L-琼脂上进行两次传代，并测试所得的菌落对氨苄西林的敏感性。

由此构建了大肠杆菌MG1655(ΔaceAK)菌株。

3.3.构建MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P _L -brnQ)菌株

为了从菌株MG1655(P_L-brnQ)中消除氯霉素抗性标记，用质粒pMW118-int-xis(Ap^R)(WO2005/010175)转化细胞。将Ap^R克隆在含有150mg/l氨苄西林的LB琼脂板上在30℃下培养。挑取了数十个Ap^R克隆，并测试其氯霉素敏感性。通过在LB琼脂板上在42℃下培养，从Cm^S细胞中消除了质粒pMW118-int-xis。所得的菌株用于进一步的构建。

将来自大肠杆菌MG1655(ΔsucAB)菌株染色体的DNA片段通过P1转导(Miller，J.H.Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Lab.Press，1972，Plainview，NY)转移至从菌株MG1655(P_L-brnQ)消除氯霉素抗性标记后所得的菌株。由此，构建了MG1655(ΔsucAB，P_L-brnQ)菌株。将来自大肠杆菌MG1655(ΔaceAK)菌株染色体的DNA片段转移至菌株MG1655(ΔsucAB，P_L-brnQ)。由此，构建了MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)菌株。

将菌株MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)的细胞用质粒pELAC-IDO(Lys，23)转化。所得的克隆在X-gal/IPTG琼脂板上选择(蓝/白测试)。由此，得到了菌株MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)[pELAC-IDO(Lys，23)]。

3.4.调查菌株MG1655、MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P _L -brnQ)、MG1655 [pELAC-IDO(Lys，23)]和MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P _L -brnQ) [pELAC-IDO(Lys，23)]的生长

将菌株MG1655和MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)在下述培养基中培养：

A-M9盐+葡萄糖(0.4％)；

B-M9盐+葡萄糖(0.4％)+DAP、Met、Lys(各40mg/l)；

C-M9盐+甘油(0.4％)；

D-M9盐+甘油(0.4％)+DAP、Met、Lys(各40mg/l)。

将菌株在试管中在37℃下培养，并每小时测量细胞培养物的光密度(A₅₅₅)。如可从图5所见，菌株MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)缺乏琥珀酰CoA，且无法在培养基A或C中生长。只有添加赖氨酸、甲硫氨酸和二氨基庚二酸(DAP)才恢复了所述菌株的生长。

此外，将菌株MG1655[pELAC-IDO(Lys，23)]和MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)[pELAC-IDO(Lys，23)]菌株在下述培养基中培养：

G-M9盐+葡萄糖(137mM)

GI-M9盐+葡萄糖(137mM)+L-异亮氨酸(137mM)

Y-M9盐+甘油(136mM)

YI-M9盐+甘油(136mM)+L-异亮氨酸(137mM)

每种培养基均含氨苄西林(100mg/l)。将菌株在试管中在37℃下培养，且每小时测量细胞培养物的光密度(A₅₅₅)。

IDO基因的表达恢复了菌株MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)在补充有L-异亮氨酸的M9-盐培养基上的生长(图6)。其证明了本发明作者的看法，即异亮氨酸羟化导致所述菌株的生长。

实施例4.通过大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P _L -brnQ) [pELAC-IDO(Lys，23)]产生4HIL

为测试编码氧戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂合酶和异柠檬酸脱氢酶磷酸酶的基因减弱表达的作用，将MG1655(P_L-brnQ)[pELAC-IDO(Lys，23)]和MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)[pELAC-IDO(Lys，23)]菌株的细胞分别在补充有葡萄糖(300mM)或甘油(500mM)的培养基A[(NH₄)₂SO₄-1.5g/100ml；KH₂PO₄-0.15g/100ml；MgSO₄-0.1g/100ml(MgSO₄·7H₂O-0.205g/100ml)；Ile-220mM；FeCl₂-2mM、1mM IPTG、白垩-2g/100ml]中在32℃下带有剧烈搅拌地培养72小时。然后，4HIL的积累通过如上所述的HPLC分析调查。对MG1655(P_L-brnQ)[pELAC-IDO(Lys，23)]和MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)[pELAC-IDO(Lys，23)]菌株产生的4HIL的测量结果示于表4(至少3个试管)。如下根据表4，较之MG1655(P_L-brnQ)[pELAC-IDO(Lys，23)]，MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)[pELAC-IDO(Lys，23)]产生了更大量的4HIL。

表4

实施例5.通过大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P _L -brnQ) ^* [pEL-IDO(Lys，23)]产生4HIL

5.1.构建pEL-IDO(Lys，23)质粒

由于在pELAC-IDO(Lys，23)质粒中lacI基因的存在，添加IPTG对于在4-HIL产生的生物转化过程中诱导IDO表达为必需的。为了避免这种IPTG依赖性，通过使用相应的限制酶切除SbhI-EcoRV DNA片段继之以连接所述质粒的剩余部分将所述lacI基因的大部分从pELAC-IDO(Lys，23)质粒(图1)中缺失。由此，构建了pEL-IDO(Lys，23)质粒。

5.2.4HIL的产生

MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)^*菌株通过从MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)菌株如上所述使用质粒pMW118-int-xis(Ap^R)(WO2005/010175)顺次切除Cm和Kn标记来获取。将质粒pELAC-IDO(Lys，23)和pEL-IDO(Lys，23)导入所得菌株。由此，获取了MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)^*[pELAC-IDO(Lys，23)]和MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)^*[pEL-IDO(Lys，23)]菌株。

将来自新鲜制备的LB-琼脂板的MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)^*[pELAC-IDO(Lys，23)]或MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)^*[pEL-IDO(Lys，23)]菌株的生物质片分别接种于50ml补充有Ap(100mg/l)的LB培养液中，并在750ml烧瓶中在37℃下培养约4小时。将所得的细胞培养物用作在“Marubischi”发酵罐中进行的生物转化中的接种物。使用了下述培养参数：起始培养体积-500ml；搅拌-1200rev/min；空气-1∶1；培养温度-34℃；用2.5M NH₄OH将pH稳定在7.0。

将MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)^*[pELAC-IDO]菌株的接种物加入450ml含有(NH₄)₂SO₄-5g/l；KH₂PO₄-1.5g/l；MgSO₄ 7H₂O-1g/l；FeSO₄7H₂O-0.01g/l；异亮氨酸-22-23g/l(≈170mM)；葡萄糖-50g/l；1mM IPTG(pH通过KOH调节至7，最终体积＝500ml)的培养基中，并培养约20小时。

将MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)^*[pEL-IDO]菌株的接种物加入450ml无IPTG的上述培养基中，并培养约20小时。如上使用HPLC分析测定4HIL和L-异亮氨酸的浓度。如自表5所见，使用pEL-IDO质粒使避免IPTG-依赖性成为可能。

表5

参考实施例1.构建pELAC-ilvA质粒

质粒pET-ilvA如下构建。将大肠杆菌MG1655菌株染色体DNA的1.5kb片段使用PCR用寡核苷酸ilvA-5(SEQ ID NO：23)和ilvA-3(SEQ ID NO：24)作为引物加以扩增。将来自LB-琼脂板的大肠杆菌MG1655菌株的细胞培养物片用作供PCR过程的模板DNA的来源。结果，所述DNA片段包含ilvA基因，且侧翼为NdeI和BamHI限制性位点。将其克隆至pET22(b+)载体(Novagen，Germany)中的NdeI-BamHI位点之间。由此，构建了重组质粒pET-ilvA(图2)。

质粒pELAC-ilvA通过将含有T7启动子的BglII-XbaI片段用含有P_lac启动子的BglII-XbaI片段(SEQ ID NO：25)替代而自pET-ilvA构建。

参考实施例2.构建pMW118-(λattL-Km^r-λattR)质粒

pMW118-(λattL-Km^r-λattR)质粒是基于pMW118-attL-Tc-attR(WO2005/010175)质粒通过将四环素抗性标记基因用来自pUC4K质粒(Vieira，J.and Messing，J.，Gene，19(3)：259-68(1982))的卡那霉素抗性标记基因替代来构建的。

为此目的，将来自pMW118-attL-Tc-attR质粒的大EcoRI-HindIII片段连接至来自pUC4K质粒的两个片段：HindIII-PstI片段(676bp)和EcoRI-HindIII片段(585bp)。

基础pMW118-attL-Tc-attR通过将下述四个DNA片段连接得到：

1)携带attL(SEQ ID NO：26)的BglII-EcoRI片段(114bp)，其是使用寡核苷酸P3和P4(SEQ ID NOS：27和28)作为引物(这些引物包含BglII和EcoRI内切核酸酶的次要识别位点)通过PCR扩增大肠杆菌W3350(包含λ原噬菌体)染色体的相应区域获取的。

2)携带attR(SEQ ID NO：29)的PstI-HindIII片段(182bp)，其是使用寡核苷酸P5和P6(SEQ ID NOS：30和31)作为引物(这些引物包含PstI和HindIII内切核酸酶的次要识别位点)通过PCR扩增大肠杆菌W3350(包含λ原噬菌体)染色体的相应区域获取的。

3)pMW118-ter_rrnB的大BglII-HindIII片段(3916bp)。质粒pMW118-ter_rrnB是通过连接下述三个DNA片段而获取的：

a)携带pMW118的AatII-EcoRI片段的大DNA片段(2359bp)，其是通过下述方法获取的：用EcoRI限制性内切核酸酶消化pMW118，用DNA聚合酶I的Klenow片段处理，并随即用AatII限制性内切核酸酶消化；

b)携带供氨苄西林抗性(Ap^R)的bla基因的pUC19的小AatII-BglII片段(1194bp)是通过使用寡核苷酸P7和P8(SEQ ID NOS：32和33)作为引物(这些引物包含AatII和BglII内切核酸酶的次要识别位点)通过PCR扩增pUC19质粒的相应区域获取的。

c)转录终止子ter_rrnB的小BglII-PstIpol片段(363bp)是通过使用寡核苷酸P9和P10(SEQ ID NOS：34和35)作为引物(这些引物包含BglII和PstI内切核酸酶的次要识别位点)通过PCR扩增大肠杆菌MG1655染色体的相应区域获取的。

4)携带四环素抗性基因和ter_thrL转录终止子的pML-Tc-ter_thrL的小EcoRI-PstI片段(1388bp)(SEQ ID NO：36)；所述pML-Tc-ter_thrL质粒是在两个步骤中获取的：

·pML-ter_thrL质粒是通过用XbaI和BamHI限制性内切核酸酶消化pML-MCS质粒(Mashko，S.V.et al.，Biotekhnologiya(于俄国)，2001，no.5，3-20)，继之以将大片段(3342bp)与通过使用寡核苷酸P11和P12(SEQ ID NOS：37和38)作为引物(这些引物包含供XbaI和BamHI内切核酸酶用的次要识别位点)通过PCR扩增大肠杆菌MG1655染色体的相应区域获取的携带终止子ter_thrL的XbaI-BamHI片段(68bp)相连接来获取的。

·pML-Tc-ter_thrL质粒是通过用KpnI和XbaI限制性内切核酸酶消化pML-ter_thrL质粒，继之以用DNA聚合酶I的Klenow片段处理并与携带四环素抗性基因的pBR322的小EcoRI-Van91I片段(1317bp)连接来获取的(pBR322是用EcoRI和Van91I限制性内切核酸酶消化并随即用DNA聚合酶I的Klenow片段处理的)。

实施例6.通过大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P _L -brnQ) ^* 产生羟基-Pro

SEQ ID NO：39的DNA的合成委托于人(Invitrogen)，而来自编码指孢囊菌属菌种(Dactylosporangium sp.)的L-脯氨酰4-羟化酶的氨基酸序列(SEQ IDNO：40)的DNA以质粒的形式获取，其中所述DNA连接于BlueHeronpUCminusMCS。对所述质粒，如此插入序列使得由NdeI识别的序列和由HindIII识别的序列分别位于所述DNA的5’末端侧和3’末端侧，且用NdeI/HindIII消化所述质粒。另外，用NdeI/HindIII消化ptrp4载体(Journal ofMolecular Catalysis B：Enzymatic 32(2005)205-211)。将这两个用NdeI/HindIII消化的片段连接，并导入大肠杆菌菌株JM109以获取转化体JM109/ptrp4_PDO。

从所得转化体中提取质粒DNA，并导入大肠杆菌菌株MG1655和大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)^*以分别获取转化体MG1655/ptrp4_PDO和MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)^*/ptrp4_PDO。

将菌株MG1655/ptrp4_PDO和MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)^*/ptrp4_PDO在含100mg/l氨苄西林的LB培养基中在30℃下培养24小时，且将300μL的培养物接种于3ml含100mg/l氨苄西林的LB培养基中，并在37℃下培养6小时。向含有L-Pro和碳酸钙，且其终浓度分别为10g/l和20g/l的试管，添加所得培养物(0.3mg)与下列培养基(2.7ml)：

<培养基组成>

培养基A(300ml)：D-葡萄糖(20g/L)，MgSO₄·7H₂O(1g/L)；

培养基B(700ml)：硫酸铵(5g/L)，KH₂PO₄(1.5g/L)，抗坏血酸钠(0.01g/L)，FeSO₄7H₂O(0.1g/L)，用KOH将pH调整到7.0。

培养基A和B分别在120℃下高压灭菌20分钟，并在冷却后混合。

D-葡萄糖浓度(g/L)和4-羟基-脯氨酸浓度(mM)示于表6。使用葡萄糖分析器(SAKURA SI，Japan)分析D-葡萄糖。4-羟基-脯氨酸通过HPLC用Sumichiral OA-5000(Sumika Analysis Center，Japan)分析(流动相：2mM硫酸铜水溶液，柱温度：30℃，流速：1ml/min，检测：UV 254nm)。

结果，确认了MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK，P_L-brnQ)^*/ptrp4_PDO较之MG1655/ptrp4_PDO能够更有效地利用D-葡萄糖以供羟脯氨酸的产生反应。

表6

^**计算值

实施例7-1.构建大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucA，ΔaceAK)和大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucB，ΔaceAK)

为确认所述P_L-brnQ突变是否对有效利用D-葡萄糖为必需的，进行了下述实验。

为构建2-氧戊二酸脱氢酶(sucA和sucB)、异柠檬酸裂合酶(aceA)和异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶(aceK)中缺陷而在P_L-brnQ中无任何突变的菌株，将ΔaceAK导入来自大肠杆菌Keio Knockout Collection(http://ecoli.naist.jp)的大肠杆菌菌株MG1655ΔsucA菌株(JW0715)和大肠杆菌菌株MG1655ΔsucB菌株(JW0716)以获取大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucA，ΔaceAK)和大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucB，ΔaceAK)。sucA和sucB之一的缺陷导致2-氧戊二酸脱氢酶活性的缺陷。

为缺失aceAK基因，进行了下述的操作。将含有Cm^R标记的1.6kb DNA片段通过PCR用寡核苷酸SVS-199(SEQ ID NO：21)和SVS-200(SEQ IDNO：22)作为引物以及pMW118-(λattL-Cmr-λattR)(WO2005/010175)质粒DNA作为模板进行扩增。

用于PCR的条件如下：在94℃下3分钟的变性步骤；30个循环的概略：94℃下30秒，50℃下30秒，72℃下2分钟。

获得了1.6kbp的PCR产物，并将其在琼脂糖凝胶中纯化，并用于大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucA)、大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucB)的电穿孔，所述菌株含有具有温度敏感性复制起点的质粒pKD46(WO2005/010175)。

电穿孔如上所述实施。电穿孔后将细胞与1ml SOC在37℃下培育1小时，并随即铺板于含Cm(25μg/ml)的L-琼脂上，并在37℃下培养以选择Cm^R重组体。然后，为了消除pKD46质粒，在42℃下在含有Cm的L-琼脂上进行两次传代，并测试所得的菌落对氨苄西林的敏感性。

此后，使用质粒pMW118-int-xis-ts(Ap^R)(WO2005/010175)如上所述移除Cm^R-标记。

由此构建了大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucA，ΔaceAK)和大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucB，ΔaceAK)。

实施例7-2.通过大肠杆菌菌株MG1655[pEL-IDO(Lys，23)]、大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucA，ΔaceAK)[pEL-IDO(Lys，23)]和大肠杆菌菌株MG1655 (ΔsucB，ΔaceAK)[pEL-IDO(Lys，23)]的4HIL产生

将pEL-IDO(Lys，23)质粒导入大肠杆菌菌株MG1655、以及通过上述方法所得的大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucA，ΔaceAK)和大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucB，ΔaceAK)中的每一种以获取转化体大肠杆菌菌株MG1655[pEL-IDO(Lys，23)]、大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucA，ΔaceAK)[pEL-IDO(Lys，23)]和大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucB，ΔaceAK)[pEL-IDO(Lys，23)]。

将这些菌株在含100mg/l氨苄西林的LB培养基中在30℃下培养24小时，并将300μL的培养物接种于3ml含100mg/l氨苄西林的LB培养基中，并在37℃下培养6小时。向含有L-Ile和碳酸钙，且其终浓度分别为10g/l和20g/l的试管，添加所得培养物(0.3ml)和下列培养基(2.7ml)：

<培养基组成>

培养基A(300ml)：D-葡萄糖(20g/L)，MgSO₄·7H₂O(1g/L)；

培养基B(700ml)：硫酸铵(5g/L)，KH₂PO₄(1.5g/L)，抗坏血酸钠(0.01g/L)，FeSO₄7H₂O(0.1g/L)，用KOH将pH调整到7.0.

培养基A和B分别在120℃下高压灭菌20分钟，并在冷却后混合。

培养基中剩余的D-葡萄糖和产生的4-羟基-异亮氨酸示于表7。D-葡萄糖使用葡萄糖分析器(SAKURA SI，Japan)分析。4-羟基-异亮氨酸通过HPLC用MCI GEL CRS10W(Mitsubishi Kagaku，Japan)分析(流动相：1mM CuSO₄，5％MeOH，柱温度：30℃，流速：1ml/min，检测：UV 254nm)。

结果，确认了在使用大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucA，ΔaceAK)[pEL-IDO(Lys，23)]和无P_L-brnQ突变的大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucB，ΔaceAK)[pEL-IDO(Lys，23)]的反应中，较之MG1655[pEL-IDO(Lys，23)]能够更有效地利用D-葡萄糖以供Ile双加氧酶的转换反应。

从这些结果确认了ΔsucAB、ΔsucA、ΔsucB和ΔaceAK基因中缺陷的菌株，如大肠杆菌MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK)、大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucA，ΔaceAK)和大肠杆菌菌株MG1655(ΔsucB，ΔaceAk)可广泛用于2-氧戊二酸依赖性酶。

表7

序列说明

1：来自苏云金芽孢杆菌菌株2-e-2的L-异亮氨酸双加氧酶基因

2：来自苏云金芽孢杆菌菌株2-e-2的L-异亮氨酸双加氧酶

3：来自大肠杆菌的brnQ基因

4：来自大肠杆菌的BrnQ

5：来自大肠杆菌的sucA基因

6：来自大肠杆菌的SucA

7：来自大肠杆菌的sucB基因

8：来自大肠杆菌的SucB

9：来自大肠杆菌的aceA基因

10：来自大肠杆菌的AceA

11：来自大肠杆菌的aceK基因

12：来自大肠杆菌的AceK

13：来自大肠杆菌的ilvE基因

14：来自大肠杆菌的IlvE

15：引物SVS 170

16：引物SVS 169

17：引物SVS 179

18：引物SVS 180

19：引物SVS 192

20：引物SVS 193

21：引物SVS 199

22：引物SVS 200

23：引物IlvA-5

24：引物ilvA-3

25：含有P_lac启动子的BglII-XbaI片段

26：片段attL

27：引物P3

28：引物P4

29：片段attR

30：引物P5

31：引物P6

32：引物P7

33：引物P8

34：引物P9

35：引物P10

36：pML-Tc-ter_thrL的片段

37：引物P11

38：引物P12

39：来自指孢囊菌属菌种的L-脯氨酸4-羟化酶基因

40：来自指孢囊菌属菌种的L-脯氨酸4-羟化酶

虽然本发明参照其优选实施方式进行了详细描述，但是很明显对于本领域技术人员而言可以在不背离本发明范围的前提下进行多种改变，并使用等效手段。所有在此引用的文献均通过述及并入作为本申请的一部分。

产业实用性

根据本发明，可增强(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的产生。这种化合物作为具有促胰岛素活性的药物组合物的组分是有用的。(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的产生通过使用以含有编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的基因的DNA片段转化的细菌而增强。

序列表

<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)

<120>产生由具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质催化的反应的产物的细菌和生产所述产物的方法

<130>C891-C8279

<150>RU 2007147436

<151>2007-12-21

<160>40

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>717

<212>DNA

<213>苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株FERM BP-10688

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(717)

<223>

<400>1

aaa atg agt ggc ttt agc ata gaa gaa aag gta cat gaa ttt gaa tct 48

Lys Met Ser Gly Phe Ser Ile Glu Glu Lys Val His Glu Phe Glu Ser

1 5 10 15

aaa ggg ttt ctt gaa atc tca aat gaa atc ttt tta caa gag gaa gag 96

Lys Gly Phe Leu Glu Ile Ser Asn Glu Ile Phe Leu Gln Glu Glu Glu

20 25 30

aat cat agt tta tta aca caa gca cag tta gat tat tat aat ttg gaa 144

Asn His Ser Leu Leu Thr Gln Ala Gln Leu Asp Tyr Tyr Asn Leu Glu

35 40 45

gat gat gcg tac ggt gaa tgc cgt gct aga tct tat tca agg tat ata 192

Asp Asp Ala Tyr Gly Glu Cys Arg Ala Arg Ser Tyr Ser Arg Tyr Ile

50 55 60

aag tat gtt gat tca cca gat tat att tta gat aat agt aat gat tac 240

Lys Tyr Val Asp Ser Pro Asp Tyr Ile Leu Asp Asn Ser Asn Asp Tyr

65 70 75 80

ttc caa tct aaa gaa tat aac tat gat gat ggc ggg aaa gtt aga cag 288

Phe Gln Ser Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Asp Gly Gly Lys Val Arg Gln

85 90 95

ttc aat agc ata aat gat agc ttt tta tgt aat cct tta att caa aat 336

Phe Asn Ser Ile Asn Asp Ser Phe Leu Cys Asn Pro Leu Ile Gln Asn

100 105 110

atc gtg cgt ttc gat act gag ttt gca ttt aaa aca aat ata ata gat 384

Ile Val Arg Phe Asp Thr Glu Phe Ala Phe Lys Thr Asn Ile Ile Asp

115 120 125

aaa agt aaa gat tta att ata ggc tta cat caa gta aga tat aaa gct 432

Lys Ser Lys Asp Leu Ile Ile Gly Leu His Gln Val Arg Tyr Lys Ala

130 135 140

act aaa gaa aga cca tct ttt agt tca cct att tgg tta cat aaa gat 480

Thr Lys Glu Arg Pro Ser Phe Ser Ser Pro Ile Trp Leu His Lys Asp

145 150 155 160

gat gaa cca gta gta ttt tta cac ctt atg aat tta agt aat aca gct 528

Asp Glu Pro Val Val Phe Leu His Leu Met Asn Leu Ser Asn Thr Ala

165 170 175

atc ggc gga gat aat tta ata gct aat tct cct cgg gaa att aat cag 576

Ile Gly Gly Asp Asn Leu Ile Ala Asn Ser Pro Arg Glu Ile Asn Gln

180 185 190

ttt ata agt ttg aag gag cct tta gaa act tta gta ttt gga caa aag 624

Phe Ile Ser Leu Lys Glu Pro Leu Glu Thr Leu Val Phe Gly Gln Lys

195 200 205

gtc ttc cat gcc gta acg cca ctt gga aca gaa tgt agt acg gag gct 672

Val Phe His Ala Val Thr Pro Leu Gly Thr Glu Cys Ser Thr Glu Ala

210 215 220

ttt cgt gat att tta tta gta aca ttt tct tat aag gag aca aaa 717

Phe Arg Asp Ile Leu Leu Val Thr Phe Ser Tyr Lys Glu Thr Lys

225 230 235

<210>2

<211>239

<212>PRT

<213>苏云金芽孢杆菌菌株FERM BP-10688

<400>2

Lys Met Ser Gly Phe Ser Ile Glu Glu Lys Val His Glu Phe Glu Ser

1 5 10 15

Lys Gly Phe Leu Glu Ile Ser Asn Glu Ile Phe Leu Gln Glu Glu Glu

20 25 30

Asn His Ser Leu Leu Thr Gln Ala Gln Leu Asp Tyr Tyr Asn Leu Glu

35 40 45

Asp Asp Ala Tyr Gly Glu Cys Arg Ala Arg Ser Tyr Ser Arg Tyr Ile

50 55 60

Lys Tyr Val Asp Ser Pro Asp Tyr Ile Leu Asp Asn Ser Asn Asp Tyr

65 70 75 80

Phe Gln Ser Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Asp Gly Gly Lys Val Arg Gln

85 90 95

Phe Asn Ser Ile Asn Asp Ser Phe Leu Cys Asn Pro Leu Ile Gln Asn

100 105 110

Ile Val Arg Phe Asp Thr Glu Phe Ala Phe Lys Thr Asn Ile Ile Asp

115 120 125

Lys Ser Lys Asp Leu Ile Ile Gly Leu His Gln Val Arg Tyr Lys Ala

130 135 140

Thr Lys Glu Arg Pro Ser Phe Ser Ser Pro Ile Trp Leu His Lys Asp

145 150 155 160

Asp Glu Pro Val Val Phe Leu His Leu Met Asn Leu Ser Asn Thr Ala

165 170 175

Ile Gly Gly Asp Asn Leu Ile Ala Asn Ser Pro Arg Glu Ile Asn Gln

180 185 190

Phe Ile Ser Leu Lys Glu Pro Leu Glu Thr Leu Val Phe Gly Gln Lys

195 200 205

Val Phe His Ala Val Thr Pro Leu Gly Thr Glu Cys Ser Thr Glu Ala

210 215 220

Phe Arg Asp Ile Leu Leu Val Thr Phe Ser Tyr Lys Glu Thr Lys

225 230 235

<210>3

<211>1320

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1320)

<223>

<400>3

atg acc cat caa tta aga tcg cgc gat atc atc gct ctg ggc ttt atg 48

Met Thr His Gln Leu Arg Ser Arg Asp Ile Ile Ala Leu Gly Phe Met

1 5 10 15

aca ttt gcg ttg ttc gtc ggc gca ggt aac att att ttc cct cca atg 96

Thr Phe Ala Leu Phe Val Gly Ala Gly Asn Ile Ile Phe Pro Pro Met

20 25 30

gtc ggc tta cag gca ggc gaa cac gtc tgg act gcg gca ttc ggc ttc 144

Val Gly Leu Gln Ala Gly Glu His Val Trp Thr Ala Ala Phe Gly Phe

35 40 45

ctc att act gcc gtt ggc ctg ccg gta tta acg gta gtg gcg ctg gca 192

Leu Ile Thr Ala Val Gly Leu Pro Val Leu Thr Val Val Ala Leu Ala

50 55 60

aaa gtt ggc ggc ggt gtt gac agc ctc agc acg cca atc ggt aaa gtc 240

Lys Val Gly Gly Gly Val Asp Ser Leu Ser Thr Pro Ile Gly Lys Val

65 70 75 80

gct ggc gta ctg ctg gca acg gtt tgt tac ctg gcg gtg ggg ccg ctt 288

Ala Gly Val Leu Leu Ala Thr Val Cys Tyr Leu Ala Val Gly Pro Leu

85 90 95

ttc gct acg ccg cgt aca gct acc gtt tcc ttt gaa gtg ggg att gcg 336

Phe Ala Thr Pro Arg Thr Ala Thr Val Ser Phe Glu Val Gly Ile Ala

100 105 110

ccg ctg acg ggt gat tcc gcg ctg ccg ctg ttt atc tac agc ctg gtc 384

Pro Leu Thr Gly Asp Ser Ala Leu Pro Leu Phe Ile Tyr Ser Leu Val

115 120 125

tat ttc gct atc gtt att ctg gtt tcg ctc tat ccg ggc aag ctg ctg 432

Tyr Phe Ala Ile Val Ile Leu Val Ser Leu Tyr Pro Gly Lys Leu Leu

130 135 140

gat acc gtg ggc aac ttc ctt gcg ccg ctg aaa att atc gcg ctg gtc 480

Asp Thr Val Gly Asn Phe Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ile Ala Leu Val

145 150 155 160

atc ctg tct gtt gcc gct att gtc tgg ccg gcg ggt tct atc agc acg 528

Ile Leu Ser Val Ala Ala Ile Val Trp Pro Ala Gly Ser Ile Ser Thr

165 170 175

gcg act gag gct tat caa aac gct gcg ttt tct aac ggc ttc gtt aac 576

Ala Thr Glu Ala Tyr Gln Asn Ala Ala Phe Ser Asn Gly Phe Val Asn

180 185 190

ggc tat ctg acc atg gat acg ctg ggc gca atg gtg ttt ggt atc gtt 624

Gly Tyr Leu Thr Met Asp Thr Leu Gly Ala Met Val Phe Gly Ile Val

195 200 205

att gtt aac gcg gcg cgt tct cgt ggc gtt acc gaa gcg cgt ctg ctg 672

Ile Val Asn Ala Ala Arg Ser Arg Gly Val Thr Glu Ala Arg Leu Leu

210 215 220

acc cgt tat acc gtc tgg gct ggc ctg atg gcg ggt gtt ggt ctg act 720

Thr Arg Tyr Thr Val Trp Ala Gly Leu Met Ala Gly Val Gly Leu Thr

225 230 235 240

ctg ctg tac ctg gcg ctg ttc cgt ctg ggg tca gac agc gcg tcg ctg 768

Leu Leu Tyr Leu Ala Leu Phe Arg Leu Gly Ser Asp Ser Ala Ser Leu

245 250 255

gtc gat cag tct gca aac ggc gct gct att ctg cat gct tac gtt cag 816

Val Asp Gln Ser Ala Asn Gly Ala Ala Ile Leu His Ala Tyr Val Gln

260 265 270

cac acc ttt ggc ggc ggc ggt agc ttc ctg ctg gcg gcg tta atc ttc 864

His Thr Phe Gly Gly Gly Gly Ser Phe Leu Leu Ala Ala Leu Ile Phe

275 280 285

atc gcc tgc ctg gta acg gca gtt ggc ctg acc tgt gct tgt gca gaa 912

Ile Ala Cys Leu Val Thr Ala Val Gly Leu Thr Cys Ala Cys Ala Glu

290 295 300

ttc ttt gcc cag tac gta ccg ctc tct tat cgt acg ctg gtg ttt atc 960

Phe Phe Ala Gln Tyr Val Pro Leu Ser Tyr Arg Thr Leu Val Phe Ile

305 310 315 320

ctc ggc ggc ttc tcg atg gtg gtt tct aac ctc ggc tta agc cag ctg 1008

Leu Gly Gly Phe Ser Met Val Val Ser Asn Leu Gly Leu Ser Gln Leu

325 330 335

atc cag atc tcc gta ccg gtg ctg acc gct att tat ccg ccg tgt atc 1056

Ile Gln Ile Ser Val Pro Val Leu Thr Ala Ile Tyr Pro Pro Cys Ile

340 345 350

gca ctg gtt gta tta agt ttt aca cgc tca tgg tgg cat aat tcg tcc 1104

Ala Leu Val Val Leu Ser Phe Thr Arg Ser Trp Trp His Asn Ser Ser

355 360 365

cgc gtg att gct ccg ccg atg ttt atc agc ctg ctt ttt ggt att ctc 1152

Arg Val Ile Ala Pro Pro Met Phe Ile Ser Leu Leu Phe Gly Ile Leu

370 375 380

gac ggg atc aaa gca tct gca ttc agc gat atc tta ccg tcc tgg gcg 1200

Asp Gly Ile Lys Ala Ser Ala Phe Ser Asp Ile Leu Pro Ser Trp Ala

385 390 395 400

cag cgt tta ccg ctg gcc gaa caa ggt ctg gcg tgg tta atg cca aca 1248

Gln Arg Leu Pro Leu Ala Glu Gln Gly Leu Ala Trp Leu Met Pro Thr

405 410 415

gtg gtg atg gtg gtt ctg gcc att atc tgg gat cgc gcg gca ggt cgt 1296

Val Val Met Val Val Leu Ala Ile Ile Trp Asp Arg Ala Ala Gly Arg

420 425 430

cag gtg acc tcc agc gct cac taa 1320

Gln Val Thr Ser Ser Ala His

435

<210>4

<211>439

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>4

Met Thr His Gln Leu Arg Ser Arg Asp Ile Ile Ala Leu Gly Phe Met

1 5 10 15

Thr Phe Ala Leu Phe Val Gly Ala Gly Asn Ile Ile Phe Pro Pro Met

20 25 30

Val Gly Leu Gln Ala Gly Glu His Val Trp Thr Ala Ala Phe Gly Phe

35 40 45

Leu Ile Thr Ala Val Gly Leu Pro Val Leu Thr Val Val Ala Leu Ala

50 55 60

Lys Val Gly Gly Gly Val Asp Ser Leu Ser Thr Pro Ile Gly Lys Val

65 70 75 80

Ala Gly Val Leu Leu Ala Thr Val Cys Tyr Leu Ala Val Gly Pro Leu

85 90 95

Phe Ala Thr Pro Arg Thr Ala Thr Val Ser Phe Glu Val Gly Ile Ala

100 105 110

Pro Leu Thr Gly Asp Ser Ala Leu Pro Leu Phe Ile Tyr Ser Leu Val

115 120 125

Tyr Phe Ala Ile Val Ile Leu Val Ser Leu Tyr Pro Gly Lys Leu Leu

130 135 140

Asp Thr Val Gly Asn Phe Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ile Ala Leu Val

145 150 155 160

Ile Leu Ser Val Ala Ala Ile Val Trp Pro Ala Gly Ser Ile Ser Thr

165 170 175

Ala Thr Glu Ala Tyr Gln Asn Ala Ala Phe Ser Asn Gly Phe Val Asn

180 185 190

Gly Tyr Leu Thr Met Asp Thr Leu Gly Ala Met Val Phe Gly Ile Val

195 200 205

Ile Val Asn Ala Ala Arg Ser Arg Gly Val Thr Glu Ala Arg Leu Leu

210 215 220

Thr Arg Tyr Thr Val Trp Ala Gly Leu Met Ala Gly Val Gly Leu Thr

225 230 235 240

Leu Leu Tyr Leu Ala Leu Phe Arg Leu Gly Ser Asp Ser Ala Ser Leu

245 250 255

Val Asp Gln Ser Ala Asn Gly Ala Ala Ile Leu His Ala Tyr Val Gln

260 265 270

His Thr Phe Gly Gly Gly Gly Ser Phe Leu Leu Ala Ala Leu Ile Phe

275 280 285

Ile Ala Cys Leu Val Thr Ala Val Gly Leu Thr Cys Ala Cys Ala Glu

290 295 300

Phe Phe Ala Gln Tyr Val Pro Leu Ser Tyr Arg Thr Leu Val Phe Ile

305 310 315 320

Leu Gly Gly Phe Ser Met Val Val Ser Asn Leu Gly Leu Ser Gln Leu

325 330 335

Ile Gln Ile Ser Val Pro Val Leu Thr Ala Ile Tyr Pro Pro Cys Ile

340 345 350

Ala Leu Val Val Leu Ser Phe Thr Arg Ser Trp Trp His Asn Ser Ser

355 360 365

Arg Val Ile Ala Pro Pro Met Phe Ile Ser Leu Leu Phe Gly Ile Leu

370 375 380

Asp Gly Ile Lys Ala Ser Ala Phe Ser Asp Ile Leu Pro Ser Trp Ala

385 390 395 400

Gln Arg Leu Pro Leu Ala Glu Gln Gly Leu Ala Trp Leu Met Pro Thr

405 410 415

Val Val Met Val Val Leu Ala Ile Ile Trp Asp Arg Ala Ala Gly Arg

420 425 430

Gln Val Thr Ser Ser Ala His

435

<210>5

<211>2802

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2802)

<223>

<400>5

atg cag aac agc gct ttg aaa gcc tgg ttg gac tct tct tac ctc tct 48

Met Gln Asn Ser Ala Leu Lys Ala Trp Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Ser

1 5 10 15

ggc gca aac cag agc tgg ata gaa cag ctc tat gaa gac ttc tta acc 96

Gly Ala Asn Gln Ser Trp Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr

20 25 30

gat cct gac tcg gtt gac gct aac tgg cgt tcg acg ttc cag cag tta 144

Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Asn Trp Arg Ser Thr Phe Gln Gln Leu

35 40 45

cct ggt acg gga gtc aaa ccg gat caa ttc cac tct caa acg cgt gaa 192

Pro Gly Thr Gly Val Lys Pro Asp Gln Phe His Ser Gln Thr Arg Glu

50 55 60

tat ttc cgc cgc ctg gcg aaa gac gct tca cgt tac tct tca acg atc 240

Tyr Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Ser Ser Thr Ile

65 70 75 80

tcc gac cct gac acc aat gtg aag cag gtt aaa gtc ctg cag ctc att 288

Ser Asp Pro Asp Thr Asn Val Lys Gln Val Lys Val Leu Gln Leu Ile

85 90 95

aac gca tac cgc ttc cgt ggt cac cag cat gcg aat ctc gat ccg ctg 336

Asn Ala Tyr Arg Phe Arg Gly His Gln His Ala Asn Leu Asp Pro Leu

100 105 110

gga ctg tgg cag caa gat aaa gtg gcc gat ctg gat ccg tct ttc cac 384

Gly Leu Trp Gln Gln Asp Lys Val Ala Asp Leu Asp Pro Ser Phe His

115 120 125

gat ctg acc gaa gca gac ttc cag gag acc ttc aac gtc ggt tca ttt 432

Asp Leu Thr Glu Ala Asp Phe Gln Glu Thr Phe Asn Val Gly Ser Phe

130 135 140

gcc agc ggc aaa gaa acc atg aaa ctc ggc gag ctg ctg gaa gcc ctc 480

Ala Ser Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Gly Glu Leu Leu Glu Ala Leu

145 150 155 160

aag caa acc tac tgc ggc ccg att ggt gcc gag tat atg cac att acc 528

Lys Gln Thr Tyr Cys Gly Pro Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Thr

165 170 175

agc acc gaa gaa aaa cgc tgg atc caa cag cgt atc gag tct ggt cgc 576

Ser Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ser Gly Arg

180 185 190

gcg act ttc aat agc gaa gag aaa aaa cgc ttc tta agc gaa ctg acc 624

Ala Thr Phe Asn Ser Glu Glu Lys Lys Arg Phe Leu Ser Glu Leu Thr

195 200 205

gcc gct gaa ggt ctt gaa cgt tac ctc ggc gca aaa ttc cct ggc gca 672

Ala Ala Glu Gly Leu Glu Arg Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro Gly Ala

210 215 220

aaa cgc ttc tcg ctg gaa ggc ggt gac gcg tta atc ccg atg ctt aaa 720

Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Ile Pro Met Leu Lys

225 230 235 240

gag atg atc cgc cac gct ggc aac agc ggc acc cgc gaa gtg gtt ctc 768

Glu Met Ile Arg His Ala Gly Asn Ser Gly Thr Arg Glu Val Val Leu

245 250 255

ggg atg gcg cac cgt ggt cgt ctg aac gtg ctg gtg aac gtg ctg ggt 816

Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Val Asn Val Leu Gly

260 265 270

aaa aaa ccg caa gac ttg ttc gac gag ttc gcc ggt aaa cat aaa gaa 864

Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ala Gly Lys His Lys Glu

275 280 285

cac ctc ggc acg ggt gac gtg aaa tac cac atg ggc ttc tcg tct gac 912

His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser Ser Asp

290 295 300

ttc cag acc gat ggc ggc ctg gtg cac ctg gcg ctg gcg ttt aac ccg 960

Phe Gln Thr Asp Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe Asn Pro

305 310 315 320

tct cac ctt gag att gta agc ccg gta gtt atc ggt tct gtt cgt gcc 1008

Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val Val Ile Gly Ser Val Arg Ala

325 330 335

cgt ctg gac aga ctt gat gag ccg agc agc aac aaa gtg ctg cca atc 1056

Arg Leu Asp Arg Leu Asp Glu Pro Ser Ser Asn Lys Val Leu Pro Ile

340 345 350

acc atc cac ggt gac gcc gca gtg acc ggg cag ggc gtg gtt cag gaa 1104

Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Thr Gly Gln Gly Val Val Gln Glu

355 360 365

acc ctg aac atg tcg aaa gcg cgt ggt tat gaa gtt ggc ggt acg gta 1152

Thr Leu Asn Met Ser Lys Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly Thr Val

370 375 380

cgt atc gtt atc aac aac cag gtt ggt ttc acc acc tct aat ccg ctg 1200

Arg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn Pro Leu

385 390 395 400

gat gcc cgt tct acg ccg tac tgt act gat atc ggt aag atg gtt cag 1248

Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met Val Gln

405 410 415

gcc ccg att ttc cac gtt aac gcg gac gat ccg gaa gcc gtt gcc ttt 1296

Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala Phe

420 425 430

gtg acc cgt ctg gcg ctc gat ttc cgt aac acc ttt aaa cgt gat gtc 1344

Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Phe Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp Val

435 440 445

ttc atc gac ctg gtg tgc tac cgc cgt cac ggc cac aac gaa gcc gac 1392

Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu Ala Asp

450 455 460

gag ccg agc gca acc cag ccg ctg atg tat cag aaa atc aaa aaa cat 1440

Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys Lys His

465 470 475 480

ccg aca ccg cgc aaa atc tac gct gac aag ctg gag cag gaa aaa gtg 1488

Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Lys Leu Glu Gln Glu Lys Val

485 490 495

gcg acg ctg gaa gat gcc acc gag atg gtt aac ctg tac cgc gat gcg 1536

Ala Thr Leu Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg Asp Ala

500 505 510

ctg gat gct ggc gat tgc gta gtg gca gag tgg cgt ccg atg aac atg 1584

Leu Asp Ala Gly Asp Cys Val Val Ala Glu Trp Arg Pro Met Asn Met

515 520 525

cac tct ttc acc tgg tcg ccg tac ctc aac cac gaa tgg gac gaa gag 1632

His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp Glu Glu

530 535 540

tac ccg aac aaa gtt gag atg aag cgc ctg cag gag ctg gcg aaa cgc 1680

Tyr Pro Asn Lys Val Glu Met Lys Arg Leu Gln Glu Leu Ala Lys Arg

545 550 555 560

atc agc acg gtg ccg gaa gca gtt gaa atg cag tct cgc gtt gcc aag 1728

Ile Ser Thr Val Pro Glu Ala Val Glu Met Gln Ser Arg Val Ala Lys

565 570 575

att tat ggc gat cgc cag gcg atg gct gcc ggt gag aaa ctg ttc gac 1776

Ile Tyr Gly Asp Arg Gln Ala Met Ala Ala Gly Glu Lys Leu Phe Asp

580 585 590

tgg ggc ggt gcg gaa aac ctc gct tac gcc acg ctg gtt gat gaa ggc 1824

Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp Glu Gly

595 600 605

att ccg gtt cgc ctg tcg ggt gaa gac tcc ggt cgc ggt acc ttc ttc 1872

Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr Phe Phe

610 615 620

cac cgc cac gcg gtg atc cac aac cag tct aac ggt tcc act tac acg 1920

His Arg His Ala Val Ile His Asn Gln Ser Asn Gly Ser Thr Tyr Thr

625 630 635 640

ccg ctg caa cat atc cat aac ggg cag ggc gcg ttc cgt gtc tgg gac 1968

Pro Leu Gln His Ile His Asn Gly Gln Gly Ala Phe Arg Val Trp Asp

645 650 655

tcc gta ctg tct gaa gaa gca gtg ctg gcg ttt gaa tat ggt tat gcc 2016

Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr Ala

660 665 670

acc gca gaa cca cgc act ctg acc atc tgg gaa gcg cag ttc ggt gac 2064

Thr Ala Glu Pro Arg Thr Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp

675 680 685

ttc gcc aac ggt gcg cag gtg gtt atc gac cag ttc atc tcc tct ggc 2112

Phe Ala Asn Gly Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser Ser Gly

690 695 700

gaa cag aaa tgg ggc cgg atg tgt ggt ctg gtg atg ttg ctg ccg cac 2160

Glu Gln Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu Pro His

705 710 715 720

ggt tac gaa ggg cag ggg ccg gag cac tcc tcc gcg cgt ctg gaa cgt 2208

Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu Glu Arg

725 730 735

tat ctg caa ctt tgt gct gag caa aac atg cag gtt tgc gta ccg tct 2256

Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val Pro Ser

740 745 750

acc ccg gca cag gtt tac cac atg ctg cgt cgt cag gcg ctg cgc ggg 2304

Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu Arg Gly

755 760 765

atg cgt cgt ccg ctg gtc gtg atg tcg ccg aaa tcc ctg ctg cgt cat 2352

Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu Arg His

770 775 780

ccg ctg gcg gtt tcc agc ctc gaa gaa ctg gcg aac ggc acc ttc ctg 2400

Pro Leu Ala Val Ser Ser Leu Glu Glu Leu Ala Asn Gly Thr Phe Leu

785 790 795 800

cca gcc atc ggt gaa atc gac gag ctt gat ccg aag ggc gtg aag cgc 2448

Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Glu Leu Asp Pro Lys Gly Val Lys Arg

805 810 815

gta gtg atg tgt tct ggt aag gtt tat tac gac ctg ctg gaa cag cgt 2496

Val Val Met Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Gln Arg

820 825 830

cgt aag aac aat caa cac gat gtc gcc att gtg cgt atc gag caa ctc 2544

Arg Lys Asn Asn Gln His Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu Gln Leu

835 840 845

tac ccg ttc ccg cat aaa gcg atg cag gaa gtg ttg cag cag ttt gct 2592

Tyr Pro Phe Pro His Lys Ala Met Gln Glu Val Leu Gln Gln Phe Ala

850 855 860

cac gtc aag gat ttt gtc tgg tgc cag gaa gag ccg ctc aac cag ggc 2640

His ValLys Asp Phe ValTrp Cys Gln Glu Glu Pro Leu Asn Gln Gly

865 870 875 880

gca tgg tac tgc agc cag cat cat ttc cgt gaa gtg att ccg ttt ggg 2688

Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe Arg Glu Val Ile Pro Phe Gly

885 890 895

gct tct ctg cgt tat gca ggc cgc ccg gcc tcc gcc tct ccg gcg gta 2736

Ala Ser Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro Ala Val

900 905 910

ggg tat atg tcc gtt cac cag aaa cag caa caa gat ctg gtt aat gac 2784

Gly Tyr Met Ser Val His Gln Lys Gln Gln Gln Asp Leu Val Asn Asp

915 920 925

gcg ctg aac gtc gaa taa 2802

Ala Leu Asn Val Glu

930

<210>6

<211>933

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>6

Met Gln Asn Ser Ala Leu Lys Ala Trp Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Ser

1 5 10 15

Gly Ala Asn Gln Ser Trp Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr

20 25 30

Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Asn Trp Arg Ser Thr Phe Gln Gln Leu

35 40 45

Pro Gly Thr Gly Val Lys Pro Asp Gln Phe His Ser Gln Thr Arg Glu

50 55 60

Tyr Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Ser Ser Thr Ile

65 70 75 80

Ser Asp Pro Asp Thr Asn Val Lys Gln Val Lys Val Leu Gln Leu Ile

85 90 95

Asn Ala Tyr Arg Phe Arg Gly His Gln His Ala Asn Leu Asp Pro Leu

100 105 110

Gly Leu Trp Gln Gln Asp Lys Val Ala Asp Leu Asp Pro Ser Phe His

115 120 125

Asp Leu Thr Glu Ala Asp Phe Gln Glu Thr Phe Asn Val Gly Ser Phe

130 135 140

Ala Ser Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Gly Glu Leu Leu Glu Ala Leu

145 150 155 160

Lys Gln Thr Tyr Cys Gly Pro Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Thr

165 170 175

Ser Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ser Gly Arg

180 185 190

Ala Thr Phe Asn Ser Glu Glu Lys Lys Arg Phe Leu Ser Glu Leu Thr

195 200 205

Ala Ala Glu Gly Leu Glu Arg Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro Gly Ala

210 215 220

Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Ile Pro Met Leu Lys

225 230 235 240

Glu Met Ile Arg His Ala Gly Asn Ser Gly Thr Arg Glu Val Val Leu

245 250 255

Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Val Asn Val Leu Gly

260 265 270

Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ala Gly Lys His Lys Glu

275 280 285

His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser Ser Asp

290 295 300

Phe Gln Thr Asp Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe Asn Pro

305 310 315 320

Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val Val Ile Gly Ser Val Arg Ala

325 330 335

Arg Leu Asp Arg Leu Asp Glu Pro Ser Ser Asn Lys Val Leu Pro Ile

340 345 350

Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Thr Gly Gln Gly Val Val Gln Glu

355 360 365

Thr Leu Asn Met Ser Lys Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly Thr Val

370 375 380

Arg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn Pro Leu

385 390 395 400

Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met Val Gln

405 410 415

Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala Phe

420 425 430

Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Phe Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp Val

435 440 445

Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu Ala Asp

450 455 460

Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys Lys His

465 470 475 480

Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Lys Leu Glu Gln Glu Lys Val

485 490 495

Ala Thr Leu Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg Asp Ala

500 505 510

Leu Asp Ala Gly Asp Cys Val Val Ala Glu Trp Arg Pro Met Asn Met

515 520 525

His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp Glu Glu

530 535 540

Tyr Pro Asn Lys Val Glu Met Lys Arg Leu Gln Glu Leu Ala Lys Arg

545 550 555 560

Ile Ser Thr Val Pro Glu Ala Val Glu Met Gln Ser Arg Val Ala Lys

565 570 575

Ile Tyr Gly Asp Arg Gln Ala Met Ala Ala Gly Glu Lys Leu Phe Asp

580 585 590

Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp Glu Gly

595 600 605

Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr Phe Phe

610 615 620

His Arg His Ala Val Ile His Asn Gln Ser Asn Gly Ser Thr Tyr Thr

625 630 635 640

Pro Leu Gln His Ile His Asn Gly Gln Gly Ala Phe Arg Val Trp Asp

645 650 655

Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr Ala

660 665 670

Thr Ala Glu Pro Arg Thr Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp

675 680 685

Phe Ala Asn Gly Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser Ser Gly

690 695 700

Glu Gln Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu Pro His

705 710 715 720

Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu Glu Arg

725 730 735

Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val Pro Ser

740 745 750

Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu Arg Gly

755 760 765

Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu Arg His

770 775 780

Pro Leu Ala Val Ser Ser Leu Glu Glu Leu Ala Asn Gly Thr Phe Leu

785 790 795 800

Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Glu Leu Asp Pro Lys Gly Val Lys Arg

805 810 815

Val Val Met Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Gln Arg

820 825 830

Arg Lys Asn Asn Gln His Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu Gln Leu

835 840 845

Tyr Pro Phe Pro His Lys Ala Met Gln Glu Val Leu Gln Gln Phe Ala

850 855 860

His Val Lys Asp Phe Val Trp Cys Gln Glu Glu Pro Leu Asn Gln Gly

865 870 875 880

Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe Arg Glu Val Ile Pro Phe Gly

885 890 895

Ala Ser Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro Ala Val

900 905 910

Gly Tyr Met Ser Val His Gln Lys Gln Gln Gln Asp Leu Val Asn Asp

915 920 925

Ala Leu Asn Val Glu

930

<210>7

<211>1218

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1218)

<223>

<400>7

atg agt agc gta gat att ctg gtc cct gac ctg cct gaa tcc gta gcc 48

Met Ser Ser Val Asp Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala

1 5 10 15

gat gcc acc gtc gca acc tgg cat aaa aaa ccc ggc gac gca gtc gta 96

Asp Ala Thr Val Ala Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Val

20 25 30

cgt gat gaa gtg ctg gta gaa atc gaa act gac aaa gtg gta ctg gaa 144

Arg Asp Glu Val Leu Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu

35 40 45

gta ccg gca tca gca gac ggc att ctg gat gcg gtt ctg gaa gat gaa 192

Val Pro Ala Ser Ala Asp Gly Ile Leu Asp Ala Val Leu Glu Asp Glu

50 55 60

ggt aca acg gta acg tct cgt cag atc ctt ggt cgc ctg cgt gaa ggc 240

Gly Thr Thr Val Thr Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Arg Glu Gly

65 70 75 80

aac agc gcc ggt aaa gaa acc agc gcc aaa tct gaa gag aaa gcg tcc 288

Asn Ser Ala Gly Lys Glu Thr Ser Ala Lys Ser Glu Glu Lys Ala Ser

85 90 95

act ccg gcg caa cgc cag cag gcg tct ctg gaa gag caa aac aac gat 336

Thr Pro Ala Gln Arg Gln Gln Ala Ser Leu Glu Glu Gln Asn Asn Asp

100 105 110

gcg tta agc ccg gcg atc cgt cgc ctg ctg gct gaa cac aat ctc gac 384

Ala Leu Ser Pro Ala Ile Arg Arg Leu Leu Ala Glu His Asn Leu Asp

115 120 125

gcc agc gcc att aaa ggc acc ggt gtg ggt ggt cgt ctg act cgt gaa 432

Ala Ser Ala Ile Lys Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu

130 135 140

gat gtg gaa aaa cat ctg gcg aaa gcc ccg gcg aaa gag tct gct ccg 480

Asp Val Glu Lys His Leu Ala Lys Ala Pro Ala Lys Glu Ser Ala Pro

145 150 155 160

gca gcg gct gct ccg gcg gcg caa ccg gct ctg gct gca cgt agt gaa 528

Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gln Pro Ala Leu Ala Ala Arg Ser Glu

165 170 175

aaa cgt gtc ccg atg act cgc ctg cgt aag cgt gtg gca gag cgt ctg 576

Lys Arg Val Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu Arg Leu

180 185 190

ctg gaa gcg aaa aac tcc acc gcc atg ctg acc acg ttc aac gaa gtc 624

Leu Glu Ala Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn Glu Val

195 200 205

aac atg aag ccg att atg gat ctg cgt aag cag tac ggt gaa gcg ttt 672

Asn Met Lys Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Gly Glu Ala Phe

210 215 220

gaa aaa cgc cac ggc atc cgt ctg ggc ttt atg tcc ttc tac gtg aaa 720

Glu Lys Arg His Gly Ile Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr Val Lys

225 230 235 240

gcg gtg gtt gaa gcc ctg aaa cgt tac ccg gaa gtg aac gct tct atc 768

Ala Val Val Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala Ser Ile

245 250 255

gac ggc gat gac gtg gtt tac cac aac tat ttc gac gtc agc atg gcg 816

Asp Gly Asp Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser Met Ala

260 265 270

gtt tct acg ccg cgc ggc ctg gtg acg ccg gtt ctg cgt gat gtc gat 864

Val Ser Thr Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp Val Asp

275 280 285

acc ctc ggc atg gca gac atc gag aag aaa atc aaa gag ctg gca gtc 912

Thr Leu Gly Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu Ala Val

290 295 300

aaa ggc cgt gac ggc aag ctg acc gtt gaa gat ctg acc ggt ggt aac 960

Lys Gly Arg Asp Gly Lys Leu Thr Val Glu Asp Leu Thr Gly Gly Asn

305 310 315 320

ttc acc atc acc aac ggt ggt gtg ttc ggt tcc ctg atg tct acg ccg 1008

Phe Thr Ile Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser Thr Pro

325 330 335

atc atc aac ccg ccg cag agc gca att ctg ggt atg cac gct atc aaa 1056

Ile Ile Asn Pro Pro Gln Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ala Ile Lys

340 345 350

gat cgt ccg atg gcg gtg aat ggt cag gtt gag atc ctg ccg atg atg 1104

Asp Arg Pro Met Ala Val Asn Gly Gln Val Glu Ile Leu Pro Met Met

355 360 365

tac ctg gcg ctg tcc tac gat cac cgt ctg atc gat ggt cgc gaa tcc 1152

Tyr Leu Ala Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg Glu Ser

370 375 380

gtg ggc ttc ctg gta acg atc aaa gag ttg ctg gaa gat ccg acg cgt 1200

Val Gly Phe Leu Val Thr Ile Lys Glu Leu Leu Glu Asp Pro Thr Arg

385 390 395 400

ctg ctg ctg gac gtg tag 1218

Leu Leu Leu Asp Val

405

<210>8

<211>405

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>8

Met Ser Ser Val Asp Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala

1 5 10 15

Asp Ala Thr Val Ala Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Val

20 25 30

Arg Asp Glu Val Leu Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu

35 40 45

Val Pro Ala Ser Ala Asp Gly Ile Leu Asp Ala Val Leu Glu Asp Glu

50 55 60

Gly Thr Thr Val Thr Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Arg Glu Gly

65 70 75 80

Asn Ser Ala Gly Lys Glu Thr Ser Ala Lys Ser Glu Glu Lys Ala Ser

85 90 95

Thr Pro Ala Gln Arg Gln Gln Ala Ser Leu Glu Glu Gln Asn Asn Asp

100 105 110

Ala Leu Ser Pro Ala Ile Arg Arg Leu Leu Ala Glu His Asn Leu Asp

115 120 125

Ala Ser Ala Ile Lys Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu

130 135 140

Asp Val Glu Lys His Leu Ala Lys Ala Pro Ala Lys Glu Ser Ala Pro

145 150 155 160

Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gln Pro Ala Leu Ala Ala Arg Ser Glu

165 170 175

Lys Arg Val Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu Arg Leu

180 185 190

Leu Glu Ala Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn Glu Val

195 200 205

Asn Met Lys Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Gly Glu Ala Phe

210 215 220

Glu Lys Arg His Gly Ile Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr Val Lys

225 230 235 240

Ala Val Val Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala Ser Ile

245 250 255

Asp Gly Asp Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser Met Ala

260 265 270

Val Ser Thr Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp Val Asp

275 280 285

Thr Leu Gly Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu Ala Val

290 295 300

Lys Gly Arg Asp Gly Lys Leu Thr Val Glu Asp Leu Thr Gly Gly Asn

305 310 315 320

Phe Thr Ile Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser Thr Pro

325 330 335

Ile Ile Asn Pro Pro Gln Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ala Ile Lys

340 345 350

Asp Arg Pro Met Ala Val Asn Gly Gln Val Glu Ile Leu Pro Met Met

355 360 365

Tyr Leu Ala Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg Glu Ser

370 375 380

Val Gly Phe Leu Val Thr Ile Lys Glu Leu Leu Glu Asp Pro Thr Arg

385 390 395 400

Leu Leu Leu Asp Val

405

<210>9

<211>1305

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1305)

<223>

<400>9

atg aaa acc cgt aca caa caa att gaa gaa tta cag aaa gag tgg act 48

Met Lys Thr Arg Thr Gln Gln Ile Glu Glu Leu Gln Lys Glu Trp Thr

1 5 10 15

caa ccg cgt tgg gaa ggc att act cgc cca tac agt gcg gaa gat gtg 96

Gln Pro Arg Trp Glu Gly Ile Thr Arg Pro Tyr Ser Ala Glu Asp Val

20 25 30

gtg aaa tta cgc ggt tca gtc aat cct gaa tgc acg ctg gcg caa ctg 144

Val Lys Leu Arg Gly Ser Val Asn Pro Glu Cys Thr Leu Ala Gln Leu

35 40 45

ggc gca gcg aaa atg tgg cgt ctg ctg cac ggt gag tcg aaa aaa ggc 192

Gly Ala Ala Lys Met Trp Arg Leu Leu His Gly Glu Ser Lys Lys Gly

50 55 60

tac atc aac agc ctc ggc gca ctg act ggc ggt cag gcg ctg caa cag 240

Tyr Ile Asn Ser Leu Gly Ala Leu Thr Gly Gly Gln Ala Leu Gln Gln

65 70 75 80

gcg aaa gcg ggt att gaa gca gtc tat ctg tcg gga tgg cag gta gcg 288

Ala Lys Ala Gly Ile Glu Ala Val Tyr Leu Ser Gly Trp Gln Val Ala

85 90 95

gcg gac gct aac ctg gcg gcc agc atg tat ccg gat cag tcg ctc tat 336

Ala Asp Ala Asn Leu Ala Ala Ser Met Tyr Pro Asp Gln Ser Leu Tyr

100 105 110

ccg gca aac tcg gtg cca gct gtg gtg gag cgg atc aac aac acc ttc 384

Pro Ala Asn Ser Val Pro Ala Val Val Glu Arg Ile Asn Asn Thr Phe

115 120 125

cgt cgt gcc gat cag atc caa tgg tcc gcg ggc att gag ccg ggc gat 432

Arg Arg Ala Asp Gln Ile Gln Trp Ser Ala Gly Ile Glu Pro Gly Asp

130 135 140

ccg cgc tat gtc gat tac ttc ctg ccg atc gtt gcc gat gcg gaa gcc 480

Pro Arg Tyr Val Asp Tyr Phe Leu Pro Ile Val Ala Asp Ala Glu Ala

145 150 155 160

ggt ttt ggc ggt gtc ctg aat gcc ttt gaa ctg atg aaa gcg atg att 528

Gly Phe Gly Gly Val Leu Asn Ala Phe Glu Leu Met Lys Ala Met Ile

165 170 175

gaa gcc ggt gca gcg gca gtt cac ttc gaa gat cag ctg gcg tca gtg 576

Glu Ala Gly Ala Ala Ala Val His Phe Glu Asp Gln Leu Ala Ser Val

180 185 190

aag aaa tgc ggt cac atg ggc ggc aaa gtt tta gtg cca act cag gaa 624

Lys Lys Cys Gly His Met Gly Gly Lys Val Leu Val Pro Thr Gln Glu

195 200 205

gct att cag aaa ctg gtc gcg gcg cgt ctg gca gct gac gtg acg ggc 672

Ala Ile Gln Lys Leu Val Ala Ala Arg Leu Ala Ala Asp Val Thr Gly

210 215 220

gtt cca acc ctg ctg gtt gcc cgt acc gat gct gat gcg gcg gat ctg 720

Val Pro Thr Leu Leu Val Ala Arg Thr Asp Ala Asp Ala Ala Asp Leu

225 230 235 240

atc acc tcc gat tgc gac ccg tat gac agc gaa ttt att acc ggc gag 768

Ile Thr Ser Asp Cys Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Phe Ile Thr Gly Glu

245 250 255

cgt acc agt gaa ggc ttc ttc cgt act cat gcg ggc att gag caa gcg 816

Arg Thr Ser Glu Gly Phe Phe Arg Thr His Ala Gly Ile Glu Gln Ala

260 265 270

atc agc cgt ggc ctg gcg tat gcg cca tat gct gac ctg gtc tgg tgt 864

Ile Ser Arg Gly Leu Ala Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Val Trp Cys

275 280 285

gaa acc tcc acg ccg gat ctg gaa ctg gcg cgt cgc ttt gca caa gct 912

Glu Thr Ser Thr Pro Asp Leu Glu Leu Ala Arg Arg Phe Ala Gln Ala

290 295 300

atc cac gcg aaa tat ccg ggc aaa ctg ctg gct tat aac tgc tcg ccg 960

Ile His Ala Lys Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Ala Tyr Asn Cys Ser Pro

305 310 315 320

tcg ttc aac tgg cag aaa aac ctc gac gac aaa act att gcc agc ttc 1008

Ser Phe Asn Trp Gln Lys Asn Leu Asp Asp Lys Thr Ile Ala Ser Phe

325 330 335

cag cag cag ctg tcg gat atg ggc tac aag ttc cag ttc atc acc ctg 1056

Gln Gln Gln Leu Ser Asp Met Gly Tyr Lys Phe Gln Phe Ile Thr Leu

340 345 350

gca ggt atc cac agc atg tgg ttc aac atg ttt gac ctg gca aac gcc 1104

Ala Gly Ile His Ser Met Trp Phe Asn Met Phe Asp Leu Ala Asn Ala

355 360 365

tat gcc cag ggc gag ggt atg aag cac tac gtt gag aaa gtg cag cag 1152

Tyr Ala Gln Gly Glu Gly Met Lys His Tyr Val Glu Lys Val Gln Gln

370 375 380

ccg gaa ttt gcc gcc gcg aaa gat ggc tat acc ttc gta tct cac cag 1200

Pro Glu Phe Ala Ala Ala Lys Asp Gly Tyr Thr Phe Val Ser His Gln

385 390 395 400

cag gaa gtg ggt aca ggt tac ttc gat aaa gtg acg act att att cag 1248

Gln Glu Val Gly Thr Gly Tyr Phe Asp Lys Val Thr Thr Ile Ile Gln

405 410 415

ggc ggc acg tct tca gtc acc gcg ctg acc ggc tcc act gaa gaa tcg 1296

Gly Gly Thr Ser Ser Val Thr Ala Leu Thr Gly Ser Thr Glu Glu Ser

420 425 430

cag ttc taa 1305

Gln Phe

<210>10

<211>434

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>10

Met Lys Thr Arg Thr Gln Gln Ile Glu Glu Leu Gln Lys Glu Trp Thr

1 5 10 15

Gln Pro Arg Trp Glu Gly Ile Thr Arg Pro Tyr Ser Ala Glu Asp Val

20 25 30

Val Lys Leu Arg Gly Ser Val Asn Pro Glu Cys Thr Leu Ala Gln Leu

35 40 45

Gly Ala Ala Lys Met Trp Arg Leu Leu His Gly Glu Ser Lys Lys Gly

50 55 60

Tyr Ile Asn Ser Leu Gly Ala Leu Thr Gly Gly Gln Ala Leu Gln Gln

65 70 75 80

Ala Lys Ala Gly Ile Glu Ala Val Tyr Leu Ser Gly Trp Gln Val Ala

85 90 95

Ala Asp Ala Asn Leu Ala Ala Ser Met Tyr Pro Asp Gln Ser Leu Tyr

100 105 110

Pro Ala Asn Ser Val Pro Ala Val Val Glu Arg Ile Asn Asn Thr Phe

115 120 125

Arg Arg Ala Asp Gln Ile Gln Trp Ser Ala Gly Ile Glu Pro Gly Asp

130 135 140

Pro Arg Tyr Val Asp Tyr Phe Leu Pro Ile Val Ala Asp Ala Glu Ala

145 150 155 160

Gly Phe Gly Gly Val Leu Asn Ala Phe Glu Leu Met Lys Ala Met Ile

165 170 175

Glu Ala Gly Ala Ala Ala Val His Phe Glu Asp Gln Leu Ala Ser Val

180 185 190

Lys Lys Cys Gly His Met Gly Gly Lys Val Leu Val Pro Thr Gln Glu

195 200 205

Ala Ile Gln Lys Leu Val Ala Ala Arg Leu Ala Ala Asp Val Thr Gly

210 215 220

Val Pro Thr Leu Leu Val Ala Arg Thr Asp Ala Asp Ala Ala Asp Leu

225 230 235 240

Ile Thr Ser Asp Cys Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Phe Ile Thr Gly Glu

245 250 255

Arg Thr Ser Glu Gly Phe Phe Arg Thr His Ala Gly Ile Glu Gln Ala

260 265 270

Ile Ser Arg Gly Leu Ala Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Val Trp Cys

275 280 285

Glu Thr Ser Thr Pro Asp Leu Glu Leu Ala Arg Arg Phe Ala Gln Ala

290 295 300

Ile His Ala Lys Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Ala Tyr Asn Cys Ser Pro

305 310 315 320

Ser Phe Asn Trp Gln Lys Asn Leu Asp Asp Lys Thr Ile Ala Ser Phe

325 330 335

Gln Gln Gln Leu Ser Asp Met Gly Tyr Lys Phe Gln Phe Ile Thr Leu

340 345 350

Ala Gly Ile His Ser Met Trp Phe Asn Met Phe Asp Leu Ala Asn Ala

355 360 365

Tyr Ala Gln Gly Glu Gly Met Lys His Tyr Val Glu Lys Val Gln Gln

370 375 380

Pro Glu Phe Ala Ala Ala Lys Asp Gly Tyr Thr Phe Val Ser His Gln

385 390 395 400

Gln Glu Val Gly Thr Gly Tyr Phe Asp Lys Val Thr Thr Ile Ile Gln

405 410 415

Gly Gly Thr Ser Ser Val Thr Ala Leu Thr Gly Ser Thr Glu Glu Ser

420 425 430

Gln Phe

<210>11

<211>1602

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1602)

<223>

<400>11

atg act gaa cag gca aca aca acc gat gaa ctg gct ttc aca agg ccg 48

Met Thr Glu Gln Ala Thr Thr Thr Asp Glu Leu Ala Phe Thr Arg Pro

1 5 10 15

tat ggc gag cag gag aag caa att ctt act gcc gaa gcg gta gaa ttt 96

Tyr Gly Glu Gln Glu Lys Gln Ile Leu Thr Ala Glu Ala Val Glu Phe

20 25 30

ctg act gag ctg gtg acg cat ttt acg cca caa cgc aat aaa ctt ctg 144

Leu Thr Glu Leu Val Thr His Phe Thr Pro Gln Arg Asn Lys Leu Leu

35 40 45

gca gcg cgc att cag cag cag caa gat att gat aac gga acg ttg cct 192

Ala Ala Arg Ile Gln Gln Gln Gln Asp Ile Asp Asn Gly Thr Leu Pro

50 55 60

gat ttt att tcg gaa aca gct tcc att cgc gat gct gat tgg aaa att 240

Asp Phe Ile Ser Glu Thr Ala Ser Ile Arg Asp Ala Asp Trp Lys Ile

65 70 75 80

cgc ggg att cct gcg gac tta gaa gac cgc cgc gta gag ata act ggc 288

Arg Gly Ile Pro Ala Asp Leu Glu Asp Arg Arg Val Glu Ile Thr Gly

85 90 95

ccg gta gag cgc aag atg gtg atc aac gcg ctc aac gcc aat gtg aaa 336

Pro Val Glu Arg Lys Met Val Ile Asn Ala Leu Asn Ala Asn Val Lys

100 105 110

gtc ttt atg gcc gat ttc gaa gat tca ctg gca cca gac tgg aac aaa 384

Val Phe Met Ala Asp Phe Glu Asp Ser Leu Ala Pro Asp Trp Asn Lys

115 120 125

gtg atc gac ggg caa att aac ctg cgt gat gcg gtt aac ggc acc atc 432

Val Ile Asp Gly Gln Ile Asn Leu Arg Asp Ala Val Asn Gly Thr Ile

130 135 140

agt tac acc aat gaa gca ggc aaa att tac cag ctc aag ccc aat cca 480

Ser Tyr Thr Asn Glu Ala Gly Lys Ile Tyr Gln Leu Lys Pro Asn Pro

145 150 155 160

gcg gtt ttg att tgt cgg gta cgc ggt ctg cac ttg ccg gaa aaa cat 528

Ala Val Leu Ile Cys Arg Val Arg Gly Leu His Leu Pro Glu Lys His

165 170 175

gtc acc tgg cgt ggt gag gca atc ccc ggc agc ctg ttt gat ttt gcg 576

Val Thr Trp Arg Gly Glu Ala Ile Pro Gly Ser Leu Phe Asp Phe Ala

180 185 190

ctc tat ttc ttc cac aac tat cag gca ctg ttg gca aag ggc agt ggt 624

Leu Tyr Phe Phe His Asn Tyr Gln Ala Leu Leu Ala Lys Gly Ser Gly

195 200 205

ccc tat ttc tat ctg ccg aaa acc cag tcc tgg cag gaa gcg gcc tgg 672

Pro Tyr Phe Tyr Leu Pro Lys Thr Gln Ser Trp Gln Glu Ala Ala Trp

210 215 220

tgg agc gaa gtc ttc agc tat gca gaa gat cgc ttt aat ctg ccg cgc 720

Trp Ser Glu Val Phe Ser Tyr Ala Glu Asp Arg Phe Asn Leu Pro Arg

225 230 235 240

ggc acc atc aag gcg acg ttg ctg att gaa acg ctg ccc gcc gtg ttc 768

Gly Thr Ile Lys Ala Thr Leu Leu Ile Glu Thr Leu Pro Ala Val Phe

245 250 255

cag atg gat gaa atc ctt cac gcg ctg cgt gac cat att gtt ggt ctg 816

Gln Met Asp Glu Ile Leu His Ala Leu Arg Asp His Ile Val Gly Leu

260 265 270

aac tgc ggt cgt tgg gat tac atc ttc agc tat atc aaa acg ttg aaa 864

Asn Cys Gly Arg Trp Asp Tyr Ile Phe Ser Tyr Ile Lys Thr Leu Lys

275 280 285

aac tat ccc gat cgc gtc ctg cca gac aga cag gca gtg acg atg gat 912

Asn Tyr Pro Asp Arg Val Leu Pro Asp Arg Gln Ala Val Thr Met Asp

290 295 300

aaa cca ttc ctg aat gct tac tca cgc ctg ttg att aaa acc tgc cat 960

Lys Pro Phe Leu Asn Ala Tyr Ser Arg Leu Leu Ile Lys Thr Cys His

305 310 315 320

aaa cgc ggt gct ttt gcg atg ggc ggc atg gcg gcg ttt att ccg agc 1008

Lys Arg Gly Ala Phe Ala Met Gly Gly Met Ala Ala Phe Ile Pro Ser

325 330 335

aaa gat gaa gag cac aat aac cag gtg ctc aac aaa gta aaa gcg gat 1056

Lys Asp Glu Glu His Asn Asn Gln Val Leu Asn Lys Val Lys Ala Asp

340 345 350

aaa tcg ctg gaa gcc aat aac ggt cac gat ggc aca tgg atc gct cac 1104

Lys Ser Leu Glu Ala Asn Asn Gly His Asp Gly Thr Trp Ile Ala His

355 360 365

cca ggc ctt gcg gac acg gca atg gcg gta ttc aac gac att ctc ggc 1152

Pro Gly Leu Ala Asp Thr Ala Met Ala Val Phe Asn Asp Ile Leu Gly

370 375 380

tcc cgt aaa aat cag ctt gaa gtg atg cgc gaa caa gac gcg ccg att 1200

Ser Arg Lys Asn Gln Leu Glu Val Met Arg Glu Gln Asp Ala Pro Ile

385 390 395 400

act gcc gat cag ctg ctg gca cct tgt gat ggt gaa cgc acc gaa gaa 1248

Thr Ala Asp Gln Leu Leu Ala Pro Cys Asp Gly Glu Arg Thr Glu Glu

405 410 415

ggt atg cgc gcc aac att cgc gtg gct gtg cag tac atc gaa gcg tgg 1296

Gly Met Arg Ala Asn Ile Arg Val Ala Val Gln Tyr Ile Glu Ala Trp

420 425 430

atc tct ggc aac ggc tgt gtg ccg att tat ggc ctg atg gaa gat gcg 1344

Ile Ser Gly Asn Gly Cys Val Pro Ile Tyr Gly Leu Met Glu Asp Ala

435 440 445

gcg acg gct gaa att tcc cgt acc tcg atc tgg cag tgg atc cat cat 1392

Ala Thr Ala Glu Ile Ser Arg Thr Ser Ile Trp Gln Trp Ile His His

450 455 460

caa aaa acg ttg agc aat ggc aaa ccg gtg acc aaa gcc ttg ttc cgc 1440

Gln Lys Thr Leu Ser Asn Gly Lys Pro Val Thr Lys Ala Leu Phe Arg

465 470 475 480

cag atg ctg ggc gaa gag atg aaa gtc att gcc agc gaa ctg ggc gaa 1488

Gln Met Leu Gly Glu Glu Met Lys Val Ile Ala Ser Glu Leu Gly Glu

485 490 495

gaa cgt ttc tcc cag ggg cgt ttt gac gat gcc gca cgc ttg atg gaa 1536

Glu Arg Phe Ser Gln Gly Arg Phe Asp Asp Ala Ala Arg Leu Met Glu

500 505 510

cag atc acc act tcc gat gag tta att gat ttc ctg acc ctg cca ggc 1584

Gln Ile Thr Thr Ser Asp Glu Leu Ile Asp Phe Leu Thr Leu Pro Gly

515 520 525

tac cgc ctg tta gcg taa 1602

Tyr Arg Leu Leu Ala

530

<210>12

<211>533

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>12

Met Thr Glu Gln Ala Thr Thr Thr Asp Glu Leu Ala Phe Thr Arg Pro

1 5 10 15

Tyr Gly Glu Gln Glu Lys Gln Ile Leu Thr Ala Glu Ala Val Glu Phe

20 25 30

Leu Thr Glu Leu Val Thr His Phe Thr Pro Gln Arg Asn Lys Leu Leu

35 40 45

Ala Ala Arg Ile Gln Gln Gln Gln Asp Ile Asp Asn Gly Thr Leu Pro

50 55 60

Asp Phe Ile Ser Glu Thr Ala Ser Ile Arg Asp Ala Asp Trp Lys Ile

65 70 75 80

Arg Gly Ile Pro Ala Asp Leu Glu Asp Arg Arg Val Glu Ile Thr Gly

85 90 95

Pro Val Glu Arg Lys Met Val Ile Asn Ala Leu Asn Ala Asn Val Lys

100 105 110

Val Phe Met Ala Asp Phe Glu Asp Ser Leu Ala Pro Asp Trp Asn Lys

115 120 125

Val Ile Asp Gly Gln Ile Asn Leu Arg Asp Ala Val Asn Gly Thr Ile

130 135 140

Ser Tyr Thr Asn Glu Ala Gly Lys Ile Tyr Gln Leu Lys Pro Asn Pro

145 150 155 160

Ala Val Leu Ile Cys Arg Val Arg Gly Leu His Leu Pro Glu Lys His

165 170 175

Val Thr Trp Arg Gly Glu Ala Ile Pro Gly Ser Leu Phe Asp Phe Ala

180 185 190

Leu Tyr Phe Phe His Asn Tyr Gln Ala Leu Leu Ala Lys Gly Ser Gly

195 200 205

Pro Tyr Phe Tyr Leu Pro Lys Thr Gln Ser Trp Gln Glu Ala Ala Trp

210 215 220

Trp Ser Glu Val Phe Ser Tyr Ala Glu Asp Arg Phe Asn Leu Pro Arg

225 230 235 240

Gly Thr Ile Lys Ala Thr Leu Leu Ile Glu Thr Leu Pro Ala Val Phe

245 250 255

Gln Met Asp Glu Ile Leu His Ala Leu Arg Asp His Ile Val Gly Leu

260 265 270

Asn Cys Gly Arg Trp Asp Tyr Ile Phe Ser Tyr Ile Lys Thr Leu Lys

275 280 285

Asn Tyr Pro Asp Arg Val Leu Pro Asp Arg Gln Ala Val Thr Met Asp

290 295 300

Lys Pro Phe Leu Asn Ala Tyr Ser Arg Leu Leu Ile Lys Thr Cys His

305 310 315 320

Lys Arg Gly Ala Phe Ala Met Gly Gly Met Ala Ala Phe Ile Pro Ser

325 330 335

Lys Asp Glu Glu His Asn Asn Gln Val Leu Asn Lys Val Lys Ala Asp

340 345 350

Lys Ser Leu Glu Ala Asn Asn Gly His Asp Gly Thr Trp Ile Ala His

355 360 365

Pro Gly Leu Ala Asp Thr Ala Met Ala Val Phe Asn Asp Ile Leu Gly

370 375 380

Ser Arg Lys Asn Gln Leu Glu Val Met Arg Glu Gln Asp Ala Pro Ile

385 390 395 400

Thr Ala Asp Gln Leu Leu Ala Pro Cys Asp Gly Glu Arg Thr Glu Glu

405 410 415

Gly Met Arg Ala Asn Ile Arg Val Ala Val Gln Tyr Ile Glu Ala Trp

420 425 430

Ile Ser Gly Asn Gly Cys Val Pro Ile Tyr Gly Leu Met Glu Asp Ala

435 440 445

Ala Thr Ala Glu Ile Ser Arg Thr Ser Ile Trp Gln Trp Ile His His

450 455 460

Gln Lys Thr Leu Ser Asn Gly Lys Pro Val Thr Lys Ala Leu Phe Arg

465 470 475 480

Gln Met Leu Gly Glu Glu Met Lys Val Ile Ala Ser Glu Leu Gly Glu

485 490 495

Glu Arg Phe Ser Gln Gly Arg Phe Asp Asp Ala Ala Arg Leu Met Glu

500 505 510

Gln Ile Thr Thr Ser Asp Glu Leu Ile Asp Phe Leu Thr Leu Pro Gly

515 520 525

Tyr Arg Leu Leu Ala

530

<210>13

<211>930

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(930)

<223>

<400>13

atg acc acg aag aaa gct gat tac att tgg ttc aat ggg gag atg gtt 48

Met Thr Thr Lys Lys Ala Asp Tyr Ile Trp Phe Asn Gly Glu Met Val

1 5 10 15

cgc tgg gaa gac gcg aag gtg cat gtg atg tcg cac gcg ctg cac tat 96

Arg Trp Glu Asp Ala Lys Val His Val Met Ser His Ala Leu His Tyr

20 25 30

ggc act tcg gtt ttt gaa ggc atc cgt tgc tac gac tcg cac aaa gga 144

Gly Thr Ser Val Phe Glu Gly Ile Arg Cys Tyr Asp Ser His Lys Gly

35 40 45

ccg gtt gta ttc cgc cat cgt gag cat atg cag cgt ctg cat gac tcc 192

Pro Val Val Phe Arg His Arg Glu His Met Gln Arg Leu His Asp Ser

50 55 60

gcc aaa atc tat cgc ttc ccg gtt tcg cag agc att gat gag ctg atg 240

Ala Lys Ile Tyr Arg Phe Pro Val Ser Gln Ser Ile Asp Glu Leu Met

65 70 75 80

gaa gct tgt cgt gac gtg atc cgc aaa aac aat ctc acc agc gcc tat 288

Glu Ala Cys Arg Asp Val Ile Arg Lys Asn Asn Leu Thr Ser Ala Tyr

85 90 95

atc cgt ccg ctg atc ttc gtc ggt gat gtt ggc atg gga gta aac ccg 336

Ile Arg Pro Leu Ile Phe Val Gly Asp Val Gly Met Gly Val Asn Pro

100 105 110

cca gcg gga tac tca acc gac gtg att atc gct gct ttc ccg tgg gga 384

Pro Ala Gly Tyr Ser Thr Asp Val Ile Ile Ala Ala Phe Pro Trp Gly

115 120 125

gcg tat ctg ggc gca gaa gcg ctg gag cag ggg atc gat gcg atg gtt 432

Ala Tyr Leu Gly Ala Glu Ala Leu Glu Gln Gly Ile Asp Ala Met Val

130 135 140

tcc tcc tgg aac cgc gca gca cca aac acc atc ccg acg gcg gca aaa 480

Ser Ser Trp Asn Arg Ala Ala Pro Asn Thr Ile Pro Thr Ala Ala Lys

145 150 155 160

gcc ggt ggt aac tac ctc tct tcc ctg ctg gtg ggt agc gaa gcg cgc 528

Ala Gly Gly Asn Tyr Leu Ser Ser Leu Leu Val Gly Ser Glu Ala Arg

165 170 175

cgc cac ggt tat cag gaa ggt atc gcg ctg gat gtg aac ggt tat atc 576

Arg His Gly Tyr Gln Glu Gly Ile Ala Leu Asp Val Asn Gly Tyr Ile

180 185 190

tct gaa ggc gca ggc gaa aac ctg ttt gaa gtg aaa gat ggt gtg ctg 624

Ser Glu Gly Ala Gly Glu Asn Leu Phe Glu Val Lys Asp Gly Val Leu

195 200 205

ttc acc cca ccg ttc acc tcc tcc gcg ctg ccg ggt att acc cgt gat 672

Phe Thr Pro Pro Phe Thr Ser Ser Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Asp

210 215 220

gcc atc atc aaa ctg gcg aaa gag ctg gga att gaa gta cgt gag cag 720

Ala Ile Ile Lys Leu Ala Lys Glu Leu Gly Ile Glu Val Arg Glu Gln

225 230 235 240

gtg ctg tcg cgc gaa tcc ctg tac ctg gcg gat gaa gtg ttt atg tcc 768

Val Leu Ser Arg Glu Ser Leu Tyr Leu Ala Asp Glu Val Phe Met Ser

245 250 255

ggt acg gcg gca gaa atc acg cca gtg cgc agc gta gac ggt att cag 816

Gly Thr Ala Ala Glu Ile Thr Pro Val Arg Ser Val Asp Gly Ile Gln

260 265 270

gtt ggc gaa ggc cgt tgt ggc ccg gtt acc aaa cgc att cag caa gcc 864

Val Gly Glu Gly Arg Cys Gly Pro Val Thr Lys Arg Ile Gln Gln Ala

275 280 285

ttc ttc ggc ctc ttc act ggc gaa acc gaa gat aaa tgg ggc tgg tta 912

Phe Phe Gly Leu Phe Thr Gly Glu Thr Glu Asp Lys Trp Gly Trp Leu

290 295 300

gat caa gtt aat caa taa 930

Asp Gln Val Asn Gln

305

<210>14

<211>309

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>14

Met Thr Thr Lys Lys Ala Asp Tyr Ile Trp Phe Asn Gly Glu Met Val

1 5 10 15

Arg Trp Glu Asp Ala Lys Val His Val Met Ser His Ala Leu His Tyr

20 25 30

Gly Thr Ser Val Phe Glu Gly Ile Arg Cys Tyr Asp Ser His Lys Gly

35 40 45

Pro Val Val Phe Arg His Arg Glu His Met Gln Arg Leu His Asp Ser

50 55 60

Ala Lys Ile Tyr Arg Phe Pro Val Ser Gln Ser Ile Asp Glu Leu Met

65 70 75 80

Glu Ala Cys Arg Asp Val Ile Arg Lys Asn Asn Leu Thr Ser Ala Tyr

85 90 95

Ile Arg Pro Leu Ile Phe Val Gly Asp Val Gly Met Gly Val Asn Pro

100 105 110

Pro Ala Gly Tyr Ser Thr Asp Val Ile Ile Ala Ala Phe Pro Trp Gly

115 120 125

Ala Tyr Leu Gly Ala Glu Ala Leu Glu Gln Gly Ile Asp Ala Met Val

130 135 140

Ser Ser Trp Asn Arg Ala Ala Pro Asn Thr Ile Pro Thr Ala Ala Lys

145 150 155 160

Ala Gly Gly Asn Tyr Leu Ser Ser Leu Leu Val Gly Ser Glu Ala Arg

165 170 175

Arg His Gly Tyr Gln Glu Gly Ile Ala Leu Asp Val Asn Gly Tyr Ile

180 185 190

Ser Glu Gly Ala Gly Glu Asn Leu Phe Glu Val Lys Asp Gly Val Leu

195 200 205

Phe Thr Pro Pro Phe Thr Ser Ser Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Asp

210 215 220

Ala Ile Ile Lys Leu Ala Lys Glu Leu Gly Ile Glu Val Arg Glu Gln

225 230 235 240

Val Leu Ser Arg Glu Ser Leu Tyr Leu Ala Asp Glu Val Phe Met Ser

245 250 255

Gly Thr Ala Ala Glu Ile Thr Pro Val Arg Ser Val Asp Gly Ile Gln

260 265 270

Val Gly Glu Gly Arg Cys Gly Pro Val Thr Lys Arg Ile Gln Gln Ala

275 280 285

Phe Phe Gly Leu Phe Thr Gly Glu Thr Glu Asp Lys Trp Gly Trp Leu

290 295 300

Asp Gln Val Asn Gln

305

<210>15

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物SVS 170

<400>15

ctctagagga tccttaagaa ggagatatac catgaaaatg agtggcttta gcatagaaga 60

aaagg 65

<210>16

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物SVS 169

<400>16

gaattcgagc tcttattttg tctccttata agaaa 35

<210>17

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物SVS 179

<400>17

aatacgggcg ttagatttta caacgattgg tgattttttg ttcgctcaag ttagtataaa 60

aaagctgaac 70

<210>18

<211>72

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物SVS 180

<400>18

tgatatcgcg cgatcttaat tgatgggtca tagttactcc tccttcagct gtttccttct 60

agacggccaa tg 72

<210>19

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物SVS 192

<400>19

cgaagtaagc ataaaaaaga tgcttaaggg atcacgtcta gacgctcaag ttagtataaa 60

aaagctgaac 70

<210>20

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物SVS 193

<400>20

cctgatattc atgtaagttc atgtgttctg tccatccttc cgctcacaat tccacacatt 60

atacgagccg 70

<210>21

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物SVS 199

<400>21

tgttagcgta aaccaccaca taactatgga gcatctgcac cgctcaagtt agtataaaaa 60

agctgaacga 70

<210>22

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物SVS 200

<400>22

cctcgataca ttgcggagaa aaattatatg gaagctttac tgaagcctgc ttttttatac 60

taagttggca 70

<210>23

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物ilvA5

<400>23

gtcacgcata tggctgactc gcaacccctg tccgg 35

<210>24

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列：引物ilvA3

<220>

<223>

<400>24

cagtggatcc ttaacccgcc aaaaagaacc tgaac 35

<210>25

<211>138

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有侧翼为SalI和HindIII的Plac启动子的片段

<400>25

agatctgcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc 60

caggctttac actttatgct tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa 120

tttcacacag gatctaga 138

<210>26

<211>120

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>片段attL

<400>26

agatcttgaa gcctgctttt ttatactaag ttggcattat aaaaaagcat tgcttatcaa 60

tttgttgcaa cgaacaggtc actatcagtc aaaataaaat cattatttga tttcgaattc 120

<210>27

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物P3

<400>27

ctagtaagat cttgaagcct gcttttttat actaagttgg 40

<210>28

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物P4

<400>28

atgatcgaat tcgaaatcaa ataatgattt tattttgact g 41

<210>29

<211>184

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>片段attR

<400>29

ctgcagtctg ttacaggtca ctaataccat ctaagtagtt gattcatagt gactgcatat 60

gttgtgtttt acagtattat gtagtctgtt ttttatgcaa aatctaattt aatatattga 120

tatttatatc attttacgtt tctcgttcag cttttttata ctaacttgag cgtctagaaa 180

gctt 184

<210>30

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物P5

<400>30

atgccactgc agtctgttac aggtcactaa taccatctaa g 41

<210>31

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物P6

<400>31

accgttaagc tttctagacg ctcaagttag tataaaaaag ctgaac 46

<210>32

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物P7

<400>32

ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgc 38

<210>33

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物P8

<400>33

taacagagat ctcgcgcaga aaaaaaggat ctcaaga 37

<210>34

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物P9

<400>34

aacagagatc taagcttaga tcctttgcct ggcggcagta gcgcgg 46

<210>35

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物P10

<400>35

ataaactgca gcaaaaagag tttgtagaaa cgcaa 35

<210>36

<211>1388

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有Tc基因和ter_thrL的DNA片段

<400>36

gaattctcat gtttgacagc ttatcatcga taagctttaa tgcggtagtt tatcacagtt 60

aaattgctaa cgcagtcagg caccgtgtat gaaatctaac aatgcgctca tcgtcatcct 120

cggcaccgtc accctggatg ctgtaggcat aggcttggtt atgccggtac tgccgggcct 180

cttgcgggat atcgtccatt ccgacagcat cgccagtcac tatggcgtgc tgctagcgct 240

atatgcgttg atgcaatttc tatgcgcacc cgttctcgga gcactgtccg accgctttgg 300

ccgccgccca gtcctgctcg cttcgctact tggagccact atcgactacg cgatcatggc 360

gaccacaccc gtcctgtgga tcctctacgc cggacgcatc gtggccggca tcaccggcgc 420

cacaggtgcg gttgctggcg cctatatcgc cgacatcacc gatggggaag atcgggctcg 480

ccacttcggg ctcatgagcg cttgtttcgg cgtgggtatg gtggcaggcc ccgtggccgg 540

gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc accattcctt gcggcggcgg tgctcaacgg 600

cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat gcaggagtcg cataagggag agcgtcgacc 660

gatgcccttg agagccttca acccagtcag ctccttccgg tgggcgcggg gcatgactat 720

cgtcgccgca cttatgactg tcttctttat catgcaactc gtaggacagg tgccggcagc 780

gctctgggtc attttcggcg aggaccgctt tcgctggagc gcgacgatga tcggcctgtc 840

gcttgcggta ttcggaatct tgcacgccct cgctcaagcc ttcgtcactg gtcccgccac 900

caaacgtttc ggcgagaagc aggccattat cgccggcatg gcggccgacg cgctgggcta 960

cgtcttgctg gcgttcgcga cgcgaggctg gatggccttc cccattatga ttcttctcgc 1020

ttccggcggc atcgggatgc ccgcgttgca ggccatgctg tccaggcagg tagatgacga 1080

ccatcaggga cagcttcaag gatcgctcgc ggctcttacc agcctaactt cgatcactgg 1140

accgctgatc gtcacggcga tttatgccgc ctcggcgagc acatggaacg ggttggcatg 1200

gattgtaggc gccgccctat accttgtctg cctccccgcg ttgcgtcgcg gtgcatggag 1260

ccgggccacc tcgacctgaa tggaagccgg cggcacctcg ctaacggatt caccactcca 1320

actagaaagc ttaacacaga aaaaagcccg cacctgacag tgcgggcttt ttttttcgac 1380

cactgcag 1388

<210>37

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物P11

<400>37

agtaattcta gaaagcttaa cacagaaaaa agcccg 36

<210>38

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物P12

<400>38

ctagtaggat ccctgcagtg gtcgaaaaaa aaagcccgca ctg 43

<210>39

<211>828

<212>DNA

<213>指孢囊菌属菌种(Dactylosporangium sp.)

<220>

<221>CDS

<222>(4)..(819)

<400>39

cat atg tta acc ccg acc gaa ctc aaa caa tac cgt gaa gcc gga tat 48

Met Leu Thr Pro Thr Glu Leu Lys Gln Tyr Arg Glu Ala Gly Tyr

1 5 10 15

tta tta att gaa gat ggc ctc ggc cca cgt gaa gtt gac tgc tta cgt 96

Leu Leu Ile Glu Asp Gly Leu Gly Pro Arg Glu Val Asp Cys Leu Arg

20 25 30

cgc gca gcc gcc gct ctg tac gcc cag gac tcg ccc gat cgc aca tta 144

Arg Ala Ala Ala Ala Leu Tyr Ala Gln Asp Ser Pro Asp Arg Thr Leu

35 40 45

gaa aaa gat ggc cgc act gtt cgc gcc gtt cat ggc tgt cac cgc cgc 192

Glu Lys Asp Gly Arg Thr Val Arg Ala Val His Gly Cys His Arg Arg

50 55 60

gac cct gtt tgt cgt gat tta gta cgt cac cct cgt tta ctt gga ccc 240

Asp Pro Val Cys Arg Asp Leu Val Arg His Pro Arg Leu Leu Gly Pro

65 70 75

gca atg caa atc ctt tct ggt gac gtc tac gtt cat caa ttt aaa att 288

Ala Met Gln Ile Leu Ser Gly Asp Val Tyr Val His Gln Phe Lys Ile

80 85 90 95

aac gca aaa gca cca atg act gga gat gtt tgg cct tgg cat cag gat 336

Asn Ala Lys Ala Pro Met Thr Gly Asp Val Trp Pro Trp His Gln Asp

100 105 110

tac att ttt tgg gcc cgc gaa gat ggt atg gat cgc ccc cac gtt gtt 384

Tyr Ile Phe Trp Ala Arg Glu Asp Gly Met Asp Arg Pro His Val Val

115 120 125

aat gta gcc gtt ctc tta gac gaa gca act cac tta aat gga cca tta 432

Asn Val Ala Val Leu Leu Asp Glu Ala Thr His Leu Asn Gly Pro Leu

130 135 140

ctg ttt gtt ccc ggc act cac gaa ctc gga ttg att gat gta gaa cgt 480

Leu Phe Val Pro Gly Thr His Glu Leu Gly Leu Ile Asp Val Glu Arg

145 150 155

cgt gca cca gct ggc gac ggc gac gcc caa tgg ctc cca caa ctc tcc 528

Arg Ala Pro Ala Gly Asp Gly Asp Ala Gln Trp Leu Pro Gln Leu Ser

160 165 170 175

gca gat tta gac tat gca att gat gcc gac ctg tta gcc cgt ctc acc 576

Ala Asp Leu Asp Tyr Ala Ile Asp Ala Asp Leu Leu Ala Arg Leu Thr

180 185 190

gct ggc cgt ggt att gaa tca gca act ggc cca gca ggt tca atc tta 624

Ala Gly Arg Gly Ile Glu Ser Ala Thr Gly Pro Ala Gly Ser Ile Leu

195 200 205

tta ttt gac tca cgt att gtt cac gga tct ggt acc aac atg tct ccc 672

Leu Phe Asp Ser Arg Ile Val His Gly Ser Gly Thr Asn Met Ser Pro

210 215 220

cat ccc cgt ggt gta gtt ctt gtt aca tat aac cgt aca gat aac gcc 720

His Pro Arg Gly Val Val Leu Val Thr Tyr Asn Arg Thr Asp Asn Ala

225 230 235

tta ccc gct caa gca gct ccc cgt cca gaa ttt tta gcc gca cgt gat 768

Leu Pro Ala Gln Ala Ala Pro Arg Pro Glu Phe Leu Ala Ala Arg Asp

240 245 250 255

gca acc cca ctt gtc cct ctc ccc gca gga ttc gcc tta gct caa cct 816

Ala Thr Pro Leu Val Pro Leu Pro Ala Gly Phe Ala Leu Ala Gln Pro

260 265 270

gta taaaagctt 828

Val

<210>40

<211>272

<212>PRT

<213>指孢囊菌属菌种

<400>40

Met Leu Thr Pro Thr Glu Leu Lys Gln Tyr Arg Glu Ala Gly Tyr Leu

1 5 10 15

Leu Ile Glu Asp Gly Leu Gly Pro Arg Glu Val Asp Cys Leu Arg Arg

20 25 30

Ala Ala Ala Ala Leu Tyr Ala Gln Asp Ser Pro Asp Arg Thr Leu Glu

35 40 45

Lys Asp Gly Arg Thr Val Arg Ala Val His Gly Cys His Arg Arg Asp

50 55 60

Pro Val Cys Arg Asp Leu Val Arg His Pro Arg Leu Leu Gly Pro Ala

65 70 75 80

Met Gln Ile Leu Ser Gly Asp Val Tyr Val His Gln Phe Lys Ile Asn

85 90 95

Ala Lys Ala Pro Met Thr Gly Asp Val Trp Pro Trp His Gln Asp Tyr

100 105 110

Ile Phe Trp Ala Arg Glu Asp Gly Met Asp Arg Pro His Val Val Asn

115 120 125

Val Ala Val Leu Leu Asp Glu Ala Thr His Leu Asn Gly Pro Leu Leu

130 135 140

Phe Val Pro Gly Thr His Glu Leu Gly Leu Ile Asp Val Glu Arg Arg

145 150 155 160

Ala Pro Ala Gly Asp Gly Asp Ala Gln Trp Leu Pro Gln Leu Ser Ala

165 170 175

Asp Leu Asp Tyr Ala Ile Asp Ala Asp Leu Leu Ala Arg Leu Thr Ala

180 185 190

Gly Arg Gly Ile Glu Ser Ala Thr Gly Pro Ala Gly Ser Ile Leu Leu

195 200 205

Phe Asp Ser Arg Ile Val His Gly Ser Gly Thr Asn Met Ser Pro His

210 215 220

Pro Arg Gly Val Val Leu Val Thr Tyr Asn Arg Thr Asp Asn Ala Leu

225 230 235 240

Pro Ala Gln Ala Ala Pro Arg Pro Glu Phe Leu Ala Ala Arg Asp Ala

245 250 255

Thr Pro Leu Val Pro Leu Pro Ala Gly Phe Ala Leu Ala Gln Pro Val

260 265 270

Claims

1.一种用含有编码具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质的基因的DNA片段转化的细菌，其中所述细菌经修饰而减弱了编码氧戊二酸脱氢酶的基因的表达，并且其中所述细菌具有产生由所述蛋白质催化的反应的产物的能力。

2.依照权利要求1所述的细菌，其中所述表达是通过使所述编码氧戊二酸脱氢酶的基因失活而减弱的。

3.依照权利要求1所述的细菌，其中所述细菌经修饰而减弱了编码氧戊二酸脱氢酶和异柠檬酸裂合酶的基因的表达。

4.依照权利要求3所述的细菌，其中所述表达是通过使所述编码氧戊二酸脱氢酶和异柠檬酸裂合酶的基因失活而减弱的。

5.依照权利要求1所述的细菌，其中所述细菌经修饰而减弱了编码氧戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂合酶和异柠檬酸脱氢酶磷酸酶的基因的表达。

6.依照权利要求5所述的细菌，其中所述表达是通过使所述编码氧戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂合酶和异柠檬酸脱氢酶磷酸酶的基因失活而减弱的。

7.依照权利要求1-6所述的细菌，其中所述细菌属于选自下组的属：埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、棒杆菌属(Corynebacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、曲霉属(Aspergillus)和芽孢杆菌属(Bacillus)。

8.依照权利要求7所述的细菌，其中所述细菌选自下组：大肠杆菌(Escherichia coli)、简单节杆菌(Arthrobacter simplex)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)、硫磺节杆菌(Arthrobacter sulfureus)、粘节杆菌(Arthrobacter viscosus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

9.一种用于生产由具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质催化的反应的产物的方法，其包括：

在含有所述反应的底物的培养基中培养依照权利要求1～8中任一项的细菌；并

分离所述产物。

10.依照权利要求1所述的细菌，其中所述蛋白质具有L-异亮氨酸双加氧酶活性，并且所述产物为(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸。

11.依照权利要求6所述的细菌，其中所述细菌经修饰而过表达编码L-异亮氨酸转运蛋白的基因。

12.依照权利要求10所述的细菌，其中所述编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的基因选自下组：

(a)包含SEQ ID No：1的核苷酸序列的DNA；

13.依照权利要求10所述的细菌，其中所述细菌经修饰而增强了L-异亮氨酸双加氧酶的活性。

14.依照权利要求13所述的细菌，其中所述L-异亮氨酸双加氧酶的活性是通过增加编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因的表达而增强的。

15.依照权利要求14所述的细菌，其中所述L-异亮氨酸双加氧酶的表达是通过修饰编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因的表达控制序列或通过增加编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因的拷贝数而增加的。

16.依照权利要求11所述的细菌，其中所述编码L-异亮氨酸转运蛋白的基因是来自大肠杆菌的brnQ基因。

17.依照权利要求10所述的细菌，其经额外修饰而减弱了编码支链氨基酸氨基转移酶的基因的表达。

18.依照权利要求17所述的细菌，其中所述表达是通过使所述基因失活而减弱的。

19.一种生产(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法，其包括：

在含有L-异亮氨酸的培养基中培养依照权利要求10～18中任一项的细菌；并

分离(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸。

20.依照权利要求19所述的方法，其中所述培养基包含选自糖和醇的碳源。

21.依照权利要求20所述的方法，其中所述糖是葡萄糖，并且所述醇是甘油。

22.依照权利要求1所述的细菌，其中所述蛋白质具有L-脯氨酸羟化酶活性，并且所述产物是4-羟基-L-脯氨酸。

23.一种用于生产4-羟基-L-脯氨酸或其盐的方法，其包括：

在含有L-脯氨酸的培养基中培养依照权利要求22的细菌；并

分离4-羟基-L-脯氨酸。