KR20010024411A - 아스파테이트 및 글루타메이트계열 아미노산의 미생물적제조방법과 이 방법에 사용되는 작용제 - Google Patents

아스파테이트 및 글루타메이트계열 아미노산의 미생물적제조방법과 이 방법에 사용되는 작용제 Download PDF

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하트무트 그뤼벨
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Abstract

본 발명은 아스파테이트 및/또는 글루타메이트계열 아미노산의 미생물적 제조방법에 관계하며 이때의 피루베이트 카르복시라아제 활성은 대응하는 아미노산을 생성할 미생물의 효소 및/또는 피루베이트 카르복시라아제 유전자 발현의 유전학적 변화에 따라 증가된다. 또한, 본 발명은 피루베이트 카르복시라아제 유전자와 상기의 방법에 사용될 수 있는 작용제에도 관계한다.

Description

아스파테이트 및 글루타메이트계열 아미노산의 미생물적 제조방법과 이 방법에 사용되는 작용제{METHOD FOR MICROBIAL PRODUCTION OF AMINO ACIDS OF THE ASPARTATE AND/OR GLUTAMATE FAMILY AND AGENTS WHICH CAN BE USED IN SAID METHOD}
＜110＞ FORSCHUNGSZENTRUM JULICH GMBH
＜120＞ METHOD FOR MICROBIAL PRODUCTION OF AMINO ACIDS OF THE ASPARATATE
AND/OR GLUTAMATE FAMILY AND..
＜150＞ DE 197 43 894.6
＜151＞ 1997-10-04
＜160＞ 2
＜170＞ KOPATIN 1.5
＜210＞ 1
＜211＞ 3728
＜212＞ DNA
＜213＞ Corynebacterium glutamicum
＜400＞ 1
cgcaaccgtg cttgaagtcg tgcaggtcag gggagtgttg cccgaaaaca ttgagaggaa 60
aacaaaaacc gatgtttgat tgggggaatc gggggttacg atactaggac gcagtgactg 120
ctatcaccct tggcggtctc ttgttgaaag gaataattac tctagtgtcg actcacacat 180
cttcaacgct tccagcattc aaaaagatct tggtagcaaa ccgcggcgaa atcgcggtcc 240
gtgctttccg tgcagcactc gaaaccggtg cagccacggt agctatttac ccccgtgaag 300
atcggggatc attccaccgc tcttttgctt ctgaagctgt ccgcattggt accgaaggct 360
caccagtcaa ggcgtacctg gacatcgatg aaattatcgg tgcagctaaa aaagttaaag 420
cagatgccat ttacccggga tacggcttcc tgtctgaaaa tgcccagctt gcccgcgagt 480
gtgcggaaaa cggcattact tttattggcc caaccccaga ggttcttgat ctcaccggtg 540
ataagtctcg cgcggtaacc gccgcgaaga aggctggtct gccagttttg gcggaatcca 600
ccccgagcaa aaacatcgat gagatcgtta aaagcgctga aggccagact taccccatct 660
ttgtgaaggc agttgccggt ggtggcggac gcggtatgcg ttttgttgct tcacctgatg 720
agcttcgcaa attagcaaca gaagcatctc gtgaagctga agcggctttc ggcgatggcg 780
cggtatatgt cgaacgtgct gtgattaacc ctcagcatat tgaagtgcag atccttggcg 840
atcacactgg agaagttgta cacctttatg aacgtgactg ctcactgcag cgtcgtcacc 900
aaaaagttgt cgaaattgcg ccagcacagc atttggatcc agaactgcgt gatcgcattt 960
gtgcggatgc agtaaagttc tgccgctcca ttggttacca gggcgcggga accgtggaat 1020
tcttggtcga tgaaaagggc aaccacgtct tcatcgaaat gaacccacgt atccaggttg 1080
agcacaccgt gactgaagaa gtcaccgagg tggacctggt gaaggcgcag atgcgcttgg 1140
ctgctggtgc aaccttgaag gaattgggtc tgacccaaga taagatcaag acccacggtg 1200
cagcactgca gtgccgcatc accacggaag atccaaacaa cggcttccgc ccagataccg 1260
gaactatcac cgcgtaccgc tcaccaggcg gagctggcgt tcgtcttgac ggtgcagctc 1320
agctcggtgg cgaaatcacc gcacactttg actccatgct ggtgaaaatg acctgccgtg 1380
gttccgactt tgaaactgct gttgctcgtg cacagcgcgc gttggctgag ttcaccgtgt 1440
ctggtgttgc aaccaacatt ggtttcttgc gtgcgttgct gcgggaagag gacttcactt 1500
ccaagcgcat cgccaccgga ttcattgccg atcacccgca cctccttcag gctccacctg 1560
ctgatgatga gcagggacgc atcctggatt acttggcaga tgtcaccgtg aacaagcctc 1620
atggtgtgcg tccaaaggat gttgcagctc ctatcgataa gctgcctaac atcaaggatc 1680
tgccactgcc acgcggttcc cgtgaccgcc tgaagcagct tggcccagcc gcgtttgctc 1740
gtgatctccg tgagcaggac gcactggcag ttactgatac caccttccgc gatgcacacc 1800
agtctttgct tgcgacccga gtccgctcat tcgcactgaa gcctgcggca gaggccgtcg 1860
caaagctgac tcctgagctt ttgtccgtgg aggcctgggg cggcgcgacc tacgatgtgg 1920
cgatgcgttt cctctttgag gatccgtggg acaggctcga cgagctgcgc gaggcgatgc 1980
cgaatgtaaa cattcagatg ctgcttcgcg gccgcaacac cgtgggatac accccgtacc 2040
cagactccgt ctgccgcgcg tttgttaagg aagctgccag ctccggcgtg gacatcttcc 2100
gcatcttcga cgcgcttaac gacgtctccc agatgcgtcc agcaatcgac gcagtcctgg 2160
agaccaacac cgcggtagcc gaggtggcta tggcttattc tggtgatctc tctgatccaa 2220
atgaaaagct ctacaccctg gattactacc taaagatggc agaggagatc gtcaagtctg 2280
gcgctcacat cttggccatt aaggatatgg ctggtctgct tcgcccagct gcggtaacca 2340
agctggtcac cgcactgcgc cgtgaattcg atctgccagt gcacgtgcac acccacgaca 2400
ctgcgggtgg ccagctggca acctactttg ctgcagctca agctggtgca gatgctgttg 2460
acggtgcttc cgcaccactg tctggcacca cctcccagcc atccctgtct gccattgttg 2520
ctgcattcgc gcacacccgt cgcgataccg gtttgagcct cgaggctgtt tctgacctcg 2580
agccgtactg ggaagcagtg cgcggactgt acctgccatt tgagtctgga accccaggcc 2640
caaccggtcg cgtctaccgc cacgaaatcc caggcggaca gttgtccaac ctgcgtgcac 2700
aggccaccgc actgggcctt gcggatcgtt tcgaactcat cgaagacaac tacgcagccg 2760
ttaatgagat gctgggacgc ccaaccaagg tcaccccatc ctccaaggtt gttggcgacc 2820
tcgcactcca cctcgttggt gcgggtgtgg atccagcaga ctttgctgcc gatccacaaa 2880
agtacgacat cccagactct gtcatcgcgt tcctgcgcgg cgagcttggt aaccctccag 2940
gtggctggcc agagccactg cgcacccgcg cactggaagg ccgctccgaa ggcaaggcac 3000
ctctgacgga agttcctgag gaagagcagg cgcacctcga cgctgatgat tccaaggaac 3060
gtcgcaatag cctcaaccgc ctgctgttcc cgaagccaac cgaagagttc ctcgagcacc 3120
gtcgccgctt cggcaacacc tctgcgctgg atgatcgtga attcttctac ggcctggtcg 3180
aaggccgcga gactttgatc cgcctgccag atgtgcgcac cccactgctt gttcgcctgg 3240
atgcgatctc tgagccagac gataagggta tgcgcaatgt tgtggccaac gtcaacggcc 3300
agatccgccc aatgcgtgtg cgtgaccgct ccgttgagtc tgtcaccgca accgcagaaa 3360
aggcagattc ctccaacaag ggccatgttg ctgcaccatt cgctggtgtt gtcaccgtga 3420
ctgttgctga aggtgatgag gtcaaggctg gagatgcagt cgcaatcatc gaggctatga 3480
agatggaagc aacaatcact gcttctgttg acggcaaaat cgatcgcgtt gtggttcctg 3540
ctgcaacgaa ggtggaaggt ggcgacttga tcgtcgtcgt ttcctaaacc tttctgtaaa 3600
aagccccgcg tcttcctcat ggaggaggcg gggctttttg ggccaagatg ggagatgggt 3660
gagttggatt tggtctgatt cgacactttt aagggcagag atttgaagat ggagaccaag 3720
gctcaaag 3728
＜210＞ 2
＜211＞ 1140
＜212＞ PRT
＜213＞ Corynebacterium glutamicum
＜400＞ 2
Met Ser Thr His Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ala Phe Lys Lys Ile Leu
1 5 10 15
Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Val Arg Ala Phe Arg Ala Ala Leu
20 25 30
Glu Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Ile Tyr Pro Arg Glu Asp Arg Gly
35 40 45
Ser Phe His Arg Ser Phe Ala Ser Glu Ala Val Arg Ile Gly Thr Glu
50 55 60
Gly Ser Pro Val Lys Ala Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Ile Ile Gly Ala
65 70 75 80
Ala Lys Lys Val Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Pro Gly Tyr Gly Phe Leu
85 90 95
Ser Glu Asn Ala Gln Leu Ala Arg Glu Cys Ala Glu Asn Gly Ile Thr
100 105 110
Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Val Leu Asp Leu Thr Gly Asp Lys Ser
115 120 125
Arg Ala Val Thr Ala Ala Lys Lys Ala Gly Leu Pro Val Leu Ala Glu
130 135 140
Ser Thr Pro Ser Lys Asn Ile Asp Glu Ile Val Lys Ser Ala Glu Gly
145 150 155 160
Gln Thr Tyr Pro Ile Phe Val Lys Ala Val Ala Gly Gly Gly Gly Arg
165 170 175
Gly Met Arg Phe Val Ala Ser Pro Asp Glu Leu Arg Lys Leu Ala Thr
180 185 190
Glu Ala Ser Arg Glu Ala Glu Ala Ala Phe Gly Asp Gly Ala Val Tyr
195 200 205
Val Glu Arg Ala Val Ile Asn Pro Gln His Ile Glu Val Gln Ile Leu
210 215 220
Gly Asp His Thr Gly Glu Val Val His Leu Tyr Glu Arg Asp Cys Ser
225 230 235 240
Leu Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Ile Ala Pro Ala Gln His
245 250 255
Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Ile Cys Ala Asp Ala Val Lys Phe
260 265 270
Cys Arg Ser Ile Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val
275 280 285
Asp Glu Lys Gly Asn His Val Phe Ile Glu Met Asn Pro Arg Ile Gln
290 295 300
Val Glu His Thr Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Val Asp Leu Val Lys
305 310 315 320
Ala Gln Met Arg Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu
325 330 335
Thr Gln Asp Lys Ile Lys Thr His Gly Ala Ala Leu Gln Cys Arg Ile
340 345 350
Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro Asp Thr Gly Thr Ile
355 360 365
Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val Arg Leu Asp Gly Ala
370 375 380
Ala Gln Leu Gly Gly Glu Ile Thr Ala His Phe Asp Ser Met Leu Val
385 390 395 400
Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr Ala Val Ala Arg Ala
405 410 415
Gln Arg Ala Leu Ala Glu Phe Thr Val Ser Gly Val Ala Thr Asn Ile
420 425 430
Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp Phe Thr Ser Lys Arg
435 440 445
Ile Ala Thr Gly Phe Ile Ala Asp His Pro His Leu Leu Gln Ala Pro
450 455 460
Pro Ala Asp Asp Glu Gln Gly Arg Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Val
465 470 475 480
Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys Asp Val Ala Ala Pro
485 490 495
Ile Asp Lys Leu Pro Asn Ile Lys Asp Leu Pro Leu Pro Arg Gly Ser
500 505 510
Arg Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Ala Phe Ala Arg Asp Leu
515 520 525
Arg Glu Gln Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala
530 535 540
His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser Phe Ala Leu Lys Pro
545 550 555 560
Ala Ala Glu Ala Val Ala Lys Lys Thr Pro Glu Leu Leu Ser Val Glu
565 570 575
Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met Arg Phe Leu Phe Glu
580 585 590
Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu Ala Met Pro Asn Val
595 600 605
Asn Ile Gln Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr Val Gly Tyr Thr Pro
610 615 620
Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys Glu Ala Ala Ser Ser
625 630 635 640
Gly Val Asp Ile Phe Arg Ile Phe Asp Ala Leu Asn Asp Val Ser Gln
645 650 655
Met Arg Pro Ala Ile Asp Ala Val Leu Glu Thr Asn Thr Ala Val Ala
660 665 670
Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser Asp Pro Asn Glu Lys
675 680 685
Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala Glu Glu Ile Val Lys
690 695 700
Ser Gly Ala His Ile Leu Ala Ile Lys Asp Met Xaa Gly Leu Leu Arg
705 710 715 720
Pro Ala Ala Val Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu Arg Arg Glu Phe Asp
725 730 735
Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Ala Gly Gly Gln Leu Ala
740 745 750
Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp Gly Ala
755 760 765
Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro Ser Leu Ser Ala Ile
770 775 780
Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr Gly Leu Ser Leu Glu
785 790 795 800
Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala Val Arg Gly Leu Tyr
805 810 815
Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr Gly Arg Val Tyr Arg
820 825 830
His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Gln Ala Thr
835 840 845
Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu Ile Glu Asp Asn Tyr Ala
850 855 860
Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys Val Thr Pro Ser Ser
865 870 875 880
Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val Gly Ala Gly Val Asp
885 890 895
Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr Asp Ile Pro Asp Ser
900 905 910
Val Ile Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn Pro Pro Gly Gly Trp
915 920 925
Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly Arg Ser Glu Gly Lys
930 935 940
Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln Ala His Leu Asp Ala
945 950 955 960
Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn Arg Leu Leu Phe Pro
965 970 975
Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg Arg Phe Gly Asn Thr
980 985 990
Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly Leu Val Glu Gly Arg
995 1000 1005
Glu Thr Leu Ile Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr Pro Leu Leu Val Arg
1010 1015 1020
Leu Asp Ala Ile Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly Met Arg Asn Val Val
1025 1030 1035 1040
Ala Asn Val Asn Gly Gln Ile Arg Pro Met Arg Val Arg Asp Arg Ser
1045 1050 1055
Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala Asp Ser Ser Asn Lys
1060 1065 1070
Gly His Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val Thr Val Thr Val Ala
1075 1080 1085
Glu Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala Val Ala Ile Ile Glu Ala
1090 1095 1100
Met Lys Met Glu Ala Thr Ile Thr Ala Ser Val Asp Gly Lys Ile Asp
1105 1110 1115 1120
Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr Lys Val Glu Gly Gly Asp Leu Ile
1125 1130 1135
Val Val Val Ser
1140
아미노산은 용도가 많기 때문에 경제적 가치가 있다. 예를 들어서, L-라이신과 L-트레오닌, L-메티오닌과 L-트립토판은 마초 첨가제로, L-글루타메이트는 제약 산업에서 L-이소류신과 L-티로신을 제압하기 위해서 첨가제로, L-아르기닌과 L-이소류신은 약제로, L-글루타메이트, L-아스파테이트와 L-페닐알라닌은 미세한 화학약품의 합성에서 출발물질로서 필요하다.
다른 아미노산을 바람직하게 제조하는 방법은 미생물을 사용하여 생물학적으로 생성하는 것으로, 이 방법으로 생물학적으로 효과적이고 광학적으로 활성이 있는 형태를 가진 각 아미노산을 획득할 수 있고 단순하고 값싼 원재료가 사용된다. 예를 들어서 미생물로서, 대장균과 관련세균외에 코리네박테리움 글루타미컴과 유도체 플라범과 락토퍼멘텀(Liebl et al. , Int J System Bacteriol 1991,41: 255 to 260)이 사용된다. 이 세균은 아미노산을 생성하지만 생장에 필요한 양만큼만 생성하기 때문에 잔여 아미노산의 생성이나 회수가 불가능하다. 이것은 세포에서 아미노산의 합성은 여러가지 방식으로 조절되기 때문이다. 따라서, 조절기작을 줄여서 산물형성을 증가시키는 다양한 방법이 이미 알려져 있다. 예를 들어, 이 과정에서 생합성의 효율적인 조절을 차단하기 위해서 아미노산 유도체가 도입된다. 예를 들어서, L-티로신 유도체와 L-페닐알라닌 유도체에 저항성인 공정이 사용되어져 왔다(JP 19037/1976 및 39517/1978). 조절 기작을 제압하기 위해서 L-라이신 유도체 또는 L-페닐알라닌 유도체에 저항성인 세균이 사용되는 공정이 사용된다(EP 0 205 849, GB 2 152 509).
또, 재조합 DNA기술로 만들어지고 생합성 조절을 회피하는 미생물은 더 이상 피드백 억제되지 않는 주효소에서 암호화된 유전자에서 클론되고 발현되었다. 예를 들어서, 플라스미드가 암호화하는 피드백 저항성인 아스파테이트 카이나아제를 가진 재조합 L-라이신 생성 세균이 알려져 있다 (EP 0 381 527). 추가로, 피드백 저항성의 프리페네이트 디하이드로제나아제로 재조합된 L-페닐알라닌 생성 세균이 제시되어 있다(JP 123475/1986, EP 0 488 424).
또, 아미노산 합성시 피드백에 반응하기 쉬운 효소를 암호화하지 않는 유전자를 과도발현하여 아미노산 수득을 증가시킬 수 있다. 예를 들어서 디하이드로디피코리네이트 합성을 증가시켜서 많은 양의 라이신 형성시킬 수 있다(EP 0 197 335). 트레오닌디하이드라타아제를 많이 합성해서 이소류신을 많이 형성할 수 있다(EP 0 436 886).
아미노산 생성을 증가시키는 데 대한 추가적 연구는 중심 신진대사의 세포 일차 대사산물의 향상된 유용성에 목표를 두어왔다. 재조합기술로 트랜스케톨라아제를 과도발현시키면 L-트립토판 또는 L-티로신 또는 L-페닐알라닌의 형성을 증가시킬 수 있다(EP 0 600 463). 또, 코리네박테리움에서 포스포에놀피루베이트 카복시라아제 활성을 감소시키면 방향 아미노산 형성을 증가시킬 수 있고(EP 0 3331145) 반면에 코리네박테리움에서 포스포에놀피루베이트 카복시라아제 활성을 증가시키면 아스파테이트 계열에서 아미노산 분리를 증가시킬 수 있다(EP 0 358 940).
특히 아미노산 생성 조건하에서 생장동안에, 트리카르복시산 싸이클은 지속적이고 효과적으로 C4 화합물, 예를 들어서 아미노산 생합성을 위해서 회수된 중간 산물을 대체하기 위해서 옥살릭 아세테이트로 보충해야한다. 최근까지 피루베이트 카르복시라아제 활성은 코리네박테리움 글루타미컴의 투과 세포에서 발견되었다(Peters-Wendisch et al., Microbiology 1997, 143: 1095 to 1103). 이 효소는 AMP, ADP, acetyl coenzyme A에 의해 억제되고 탄소의 원천으로서 락테이트가 존재할 때 많은 양이 형성된다.
이 효소는 증대하는 트리카르복시산 싸이클을 만족시킨다고 결정되기 때문에, 유전자 발현이나 효소 활성이 증가하면 아스파테이트에 속한 아미노산이 증가하지 않을 것으로 예상되었다. 또, 유전자 발현이나 피루베이트 카르복시라아제의 효소 활성이 증가하면 다른 계열의 아미노산의 생성에는 영향이 없을 것으로 기대되었다.
본 발명은 청구항 1에서 17까지 제시된 아스파테이트와 글루타메이트 계열의 아미노산의 미생물적제조방법과 18에서 23까지 제시된 피루베이트-카르복시라아제 유전자, 청구항 24에 제시된 유전자구조, 청구항 25에 제시된 벡터, 청구항 26에서 31까지 제시된 형질전환된 세포, 청구항 32에서 37까지 제시된 이들의 사용에 관계한다.
효소의 유전자 변형으로 피루베이트-카르복시라아제 활성을 증가시키고 피루베이트-카르복시라아제 유전자 발현을 증가시키면 아스파테이트와 글루타메이트 계열의 아미노산의 미생물적 생성이 증가된다는 것이 밝혀졌다. 피루베이트-카르복시라아제의 카피수가 많은 균주는 배양 배지에서 50% 이상의 라이신, 40% 이상의 트레오닌, 150% 이상의 호모세린을 생성할 수 있다. 게다가, 글루타메이트 형성도 증가되었다 (표 4에 있는 예를 비교해본다).
효소활성을 증가시키기 위해서 피루베이트-카르복시라아제를 유전적으로 변경시키는 것은 내인성 유전자를 변화시켜서 이룰 수 있다. 그러한 변경은 UV조사나 변경을 일으키는 화학약품과 같은 고전적인 방법으로 이룰 수 있거나 제거, 삽입, 뉴클레오티드 교환과 같은 유전자 기술적인 방법으로 수행된다.
유전자 카피 숫자를 증가시키거나 유전자의 발현에 영향을 주는 조절요소를 강화하면 피루베이트-카르복시라아제 유전자 발현이 증가된다. 따라서, 바람직하게 전사면에서 전사 신호가 증가되면 조절 요소가 강화된다. 예를 들어, 효과를 향상시키기 위해서 구조유전자의 선행 프로모터의 프로모터 서열을 변경하거나 더 효과적인 프로모터로 치환하여 유전자발현을 증가시킨다. 피루베이트-카르복시라아제와 관련된 조절 유전자에 영향을 주어 전사를 강화한다. 예를 들어서, 피루베이트-카르복시라아제 유전자의 DNA에 조절 단백질이 결합하는 효과에 영향을 주기 위해서 조절 유전자 서열을 돌연변이시키면 전사가 향상되고 유전자 발현이 증대된다. 게다가, 피루베이트-카르복시라아제 유전자는 조절 서열로서 소위 "인핸서"와 연결될 수 있고 RNA 폴리머라아제와 DNA를 상호교환하여 피루베이트-카르복시라아제의 유전자 발현을 증대시킬 수 있다. 하지만, 예를 들어서 m-RNA의 안정성이 향상되므로 번역이 강화된다.
유전자 카피 숫자를 증가시키기 위해서, 피루베이트-카르복시라아제 유전자를 유전자 구조물이나 벡터내로 제공한다. 유전자 구조물은 특별히 피루베이트-카르복시라아제 유전자와 관련된 조절 서열, 바람직하게는 유전자 발현을 강화하는 조절 서열을 포함한다. 유전자 구조물에 피루베이트-카르복시라아제 유전자를 공급하기 위해서, 코리네박테리움 미생물 계통으로부터 유전자를 지속적으로 분리하였고, 유전자는 아미노산을 생성하는 미생물 계통, 코리네박테리움, 대장균, 세라티아 마센신스에서 형질전환되었다. 본 발명의 방법에 있어서, 코리네박테리움 글루타미컴 또는 코리네박테리움 글루타미컴 클라범 또는 코리네박테리움 글루타미컴 락토퍼멘텀이 적절하다. 유전자를 분리하고 벡터와 생체외 재조합에서(예: Simon et al., Bio/Technology 1983, 1: 784 to 791; Eikmanns et al., Gene 1991, 102: 93 to 98), 형질전환은 아미노산을 생성하는 계통에서 전기영동법(Liebl et al., FEMS Microbiology Letters 1991, 65: 299 to 304)이나 접합(Schafer et al., J. Baceriol 1990, 172:1663 to 1666)으로 수행된다.
숙주세포로서 바람직한 아미노산 생성자는 대응하는 아미노산의 합성에서 조절되지 않았거나 또는 대응하는 아미노산에 대한 수송운반체의 활성이 증가되는 것을 사용한다. 또, 대응하는 아미노산의 합성에 참여한 것과 동일한 종류의 다수의 중심 대사물을 함유하는 균주 또는 대응하는 아미노산의 합성에 참여하지않는 소량의 중심 대사물 특히 경쟁반응에 대한 내성이 있는 대사물을 함유하는 균주가 바람직하다; 즉, 대응하는 아미노산 생합성 경로와 경쟁적인 합성경로에 의해 저활성으로 작용하는 균주가 바람직하다. 따라서, L-아스파라긴산-β-메틸에스테르(AME)에 저항성인 균주가 적절하기 때문에 시트르산염 합성 활성이 적은 코리네박테리움 형성 미생물균주가 특히 적절하다 (EP 0 551 614).
분리후에, [서열 2]에 기재된 아미노산 서열이나 이들의 대립형질 변형을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이나 또는 [서열 1]에 기재된 뉴클레오티드 165 내지 3587의 뉴클레오티드 서열 혹은 사실상 동일한 효과의 DNA서열을 가진 피루베이트-카르복시라아제 유전자를 획득할 수 있다. [서열 1]에 기재된 뉴클레오티드 20 내지 109의 뉴클레오티드 서열 혹은 사실상 동일한 효과의 DNA서열의 단백질 프로모터를 더 함유한다. 대립형질 변형이나 사실상 동일한 효과의 DNA서열은 뉴클레오티드의 결실, 삽입, 치환으로 형성된 뉴클레오티드 서열에 대응하는 기능적 변형물을 포함하고 이에의해 효소활성 혹은 기능을 유지하거나 혹은 더 증가시킬 수 있게된다.
본 발명의 방법에서 이 피루베이트-카르복시라아제 유전자가 바람직하게 이용된다. 선행 프로모터가 있거나 없는 유전자 및/또는 관련된 조절 유전자가 있거나 없는 피루베이트-카르복시라아제 유전자는 DNA서열의 앞이나 뒤에 존재하며 따라서 상기 유전자가 유전자구조에 포함된다.
피루베이트-카르복시라아제 유전자의 앞에는 조절서열과 관련된 택-프로모터(lacIO-Gen)가 있다.
피루베이트-카르복시라아제 유전자를 클로닝하여 유전자를 포함하고 또한 아미노산 생성자로 형질전환하는데 적합한 플라스미드를 획득할 수 있다. 코리네박테리움의 형질전환된 세포에 대응하는 형질전환된 세포는 복제될 수 있는 형태, 즉 염색체에 추가 카피로 존재하는 유전자를 포함하고 이 때 유전자 카피는 게놈이나 플라스미드 또는 벡터의 선택적 위치에서 재조합으로 결합된다.
1. 코리네박테리움 글루타미컴의 피루베이트-카르복시라아제 유전자의 클로닝
사카로마이세스 세레비시애(J. Biol Chem 1988, 263: 11493-11497; Mol Gen Genet 1991, 229: 307-315), 멘슈(Biochem Biophys Acta 1994, 1227: 46-52), 마우스(Proc Natl Acad Sci, USA 1993, 90: 1766-1770), 에이데스 애집티(EMBL-GeneBank: Accession Nr. L36530) 등 공지된 모든 피루베이트-카르복시라아제-(pyc-)의 보존영역과 마이코박테리움 투버쿨로시스(EMBL-GeneBank: Accession Nr. U00024)에서 출발하여, PCR 프라이머를 제작하였다. 프라이머는 마이코박테리움 투버쿨로시스의 pyc유전자의 염기 810 내지 831와 1015 내지 1037에 대응한다. Innis등의 표준방법(PCR protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic press)에 따라 비생산적 동일 프라이머에 대한 PCR을 이용하여 Eikmanns등이 제시한 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032의 염색체 DNA의 약 200 bp의 단편이 증폭방법에 의해 분리되었다. 200 bp는 pyc 유전자 크기에 대응한다. Sanger 등이 제시한 PCR 생성물(Proc Natl Acad Sci USA 1977, 74:5463-5467)의 염기서열이 결정되었다. 염기서열의 결정은 자동 DNA 염기서열 결정 도구를 이용하여 형광표지 ddNTPs로 수행하였다. 코리네박테리움 글루타미컴의 DNA단편에서 출발하여, 다음의 상동 올리고뉴클레오티드를 만들 수 있다.
pyc 1 5'- CGTCTTCATCGAAATGAAC- 3'
pyc 2 5'- ACGGTGGTGATCCGGCACT- 3'
올리고뉴클레오티드는 코리네박테리움 글루타미컴으로부터 피루베이트-카르복시라아제 유전자(pyc)에 대한 프로브를 분리할 때 PCR 프라이머로 사용된다. 코리네박테리움 글루타미컴의 염색체 DNA와 딕옥시제닌 표지된 뉴클리오티드를 반응시키는 PCR 반응으로 도입된다. 반응은 Boehringer Mannheim회사의 PCR DIG Labeling kits의 지침에 따라 수행되었다. 이 방식으로 약 200bp인 딕옥시제닌 표지된 DNA 단편이 증폭되었다. 이렇게 생성된 pyc 프로브는 사우던블롯 하이브리드법을 이용하여 pyc 유전자가 위치한 코리네박테리움 글루타미컴의 염색체 DNA에 있는 DNA 단편을 확인하는 데 사용된다. 이 목적으로 코리네박테리움 글루타미컴의 야생형의 염색체 DNA 2~5μg이 제한효소 HindⅢ, SphⅠ, SalⅠ, DdraⅠ, EcoRⅠ, BamHⅠ로 절단되었고 획득한 DNA단편을 0.8% 아가로스 젤에서 20볼트로 16시간동안 전기영동 처리하여 크기별로 분리하였다. 아가로스 젤에서 발견된 DNA 단편은 사우던블롯으로 변성시키고(J Mol Biol 1975, 98: 503-517), 나일론막(Nytran N13 of Schleicher and Schull, Dassel, Switzerland) 위로 옮겨진 유전자 매트릭스로부터 Pharmacia LKB의 VacuGene 블롯장치를 사용하여 진공분리한 후 고정시키고, 또한 알칼리를 이용한 NBT/X 인산염 전환법으로 인식한 디곡시제닌 표식자가 이 방식으로 인산화된다. pyc-DNA-프로브로 하이브리드 처리한 다음의 염색체 단편 즉 17kb HindⅢ 단편, 6.5 kb SalⅠ단편과 1.35kb EcoRⅠ 단편을 인식할 수 있다.
17kb HindⅢ 단편을 분리하고 서브클로닝하였다. 이 목적으로 코리네박테리움 글루타미컴의 게놈을 99%까지 대표하는 코스미드 pH C79에 있는 코리네박테리움 글루타미컴의 염색체 DNA의 염색체 유전자 은행이 사용되었다(Mol Microbiol 1992, 6:317-326). 대장균 균주 DH5α은 Sambrook등의 CaCl2방법(Molecular cloning, A Laboratory Manual, 1989, 콜드 스프링 하버 래버로토리 프레스)으로 이 유전자 은행을 사용하여 형질전환되고 50 ㎍/ℓ으로 LB-한천 플레이트 개당 300군집이 되게 평평하게 편다. 수득한 형질전환된 산물은 나일론 N13 필터에 옮겨졌고 세포의 알칼리융해를 위해서 5분동안 배양되었고 0.5 M NaOH와 1.5 M NaCl을 적신 왓맨 페이퍼에서 DNA의 알칼리융해 및 변성이 일어났다. 그 다음 중화는 1M Tris/HCl pH 7.5와 1.5 M NaCl으로 수행되었다.
필터를 2×SSC에서 배양한 후, 방출된 DNA를 필터에서 366nm에서 UV 조사로 고정한다. 남아있는 세포 단편을 50℃에서 3×SSC, 0.1% SDS에서 흔들어서 제거한다. 이 형태의 필터는 Southern(J Mol Biol 1975, 98: 503-517)이 제시하였듯이 pyc 프로브 하이브리드법으로 확인하였다. 이 형질전환체로부터 코스미드 DNA는 Birnboim의 알칼리융해법에 따라 플라스미드 비율에 의해 분리되었고(Meth Enzymol 1983, 100: 243-255) HindⅢ 단편이 있는지를 제한효소 분석과 사우던블롯 분석으로 검증하였다. 코스미드 pH C79-10은 40kb의 HindⅢ 전이를 모두 함유하였으며 이를 추가로 분석하였다. 엔도뉴클레아제 SalI과 EcoRⅠ로 제한효소 처리한 후 염색체 DNA와 동일한 하이브리드 단편, 즉 6.5 kb SalI 단편과 1.35 kb EcoRⅠ 단편이 나타났다. 17kb HindⅢ 단편은 코스미드로부터 제한효소 처리에 의해 분리되었고 대장균 벡터 pUC 18에 결찰되며 또한 HindⅢ로 분할한다. 그 결과로 나온 벡터 pUC pyc의 단편을 제한효소 분석하였다. 단편의 유전자지도는 FIG. 1.에 제시되어 있다.
2. 피루베이트-카르복시라아제 유전자의 염기서열 결정
후속의 서브클로닝 단계에서, 0.85 kb SalⅠ-EcoRⅠ단편은 이 단편과 중복되는 1.35 kb EcoRⅠ단편, 1.6 kb EcoRⅠ-EcoRⅠ-StuⅠ단편 및 1.6 kb ClaⅠ단편 등의 대응하는 제한효소로 처리하여 플라스미드 pUC pyc으로부터 분리되었다. 단편들은 결찰처리에 의해 제한벡터 pUC18에 클론화된 후 Sanger등이 제시한 방법에 따라 염기서열이 결정되었다(Proc Natl Acad Sci USA 1977, 74: 5463-5467). 수득한 뉴클레오티드 서열은 암연구를 위한 독일 지역의 프로그램 패키지 HUSAR(Release 3.0)(Heidelberg)에 따라 분석되었다. 단편의 염기서열을 분석한 결과 1140개 아미노산의 단백질 서열을 암호화하는 3576 bp의 암호해독구조를 밝혀냈다. 단백질 염기서열과 EMBL 유전자 정보 은행(Heidelberg)을 비교함으로써 공지된 피루베이트 카르복시라아제와 유사성이 있음을 알 수 있었다. 마이코박테리움 투버쿨로시스(EMBL-GeneBank: Accession No. U00024)의 추정 피루베이트 카르복시라아제와 가장 유사성이 높았다(62%). 보존 아미노산의 교환이 일어날 때 유사성은 76%에 이른다. 다른 유기체의 피루베이트 카르복시라아제와 비교했을 때 아미노산의 동일성이 46~47%이고 유사성이 64~65%에 달했다. (Gene 1997,191: 47-50; J Bacteriol 1996, 178: 5960-5970; Proc Natl Acad Sci USA 1993, 990: 1766-1770; Biochem J 1996, 316: 631-637; EMBL-GenBank: Accession No. L36530; J Biol Chem 1988, 263: 11493-11497; Mol Gen Genet 1991, 229: 307-315). 이 결과로서, 클론된 단편 염기는 코리네박테리움 글루타미컴의 피루베이트 카르복시라아제 유전자임을 확인했다. 이 유전자의 뉴클레오티드 서열은 [서열 1]에 기재된 바와 같고, 대응하는 아미노산 서열은 [서열 2]에 기재된 바와 같다.
3. 피루베이트 카르복시라아제의 과도발현
코리네박테리움 글루타미컴의 피루베이트 카르복시라아제 유전자의 과도발현을 위해서, 유전자는 대장균의 6.2 kb SspⅠ-ScaⅠ-단편으로 플라스미드 pUCpyc으로부터 클론되었다. 클레노-폴리머라아제를 처리하여 걸친 말단은 EcoRⅠ을 봉합하거나 pstⅠ을 결합하여 스무드말단에 결찰되고, 선형 벡터는 6.2 kb SspⅠ-ScaⅠ-단편에 결찰되었다. 결과 구조물인 pEK0pyc는 대장균균주 DH5α에서 형질전환되었고 플라스미드DNA는 형질전환체에서 분리되고 삽입체의 정확도는 제한효소처리에 의해서 조절되었다. DNA는 균주SP 733에 전기영동법으로 도입되었다(FEMS Microbiol Lett 1989, 65: 299-304).
이 균주는 제한적 음성 코리네박테리움 글루타미컴균주 R127(Dechema Biotechnology Conference 1990, 4: 323-327, Verlag Chemie)의 변형체이고 균주 R127은 화학적 돌연변이 유발로 획득되었고, 피루베이트와 락테이트가 유일한 탄소제공원인 최소 배지에서는 자랄 수 없는 특성을 가졌다(Microbiology 1997, 143: 1095-1103). 이 표현형은 피루베이트 카르복시라아제의 결함으로 인지되며, C.글루타미컴 즉, 플라스미드pEK0pyc에 의해 운반되고 유일한 탄소제공원인 락테이트를 가진 최소배지 존재하에서 다시 성장할 수 있는 출발균주와 대비되는 균주로부터 나온 피루베이트 카르복시라아제 유전자를 도입하여 보충할 수 있다. 이 사실은 상기 유전자가 피루베이트 카르복시라아제를 암호화함을 검증하는 것이다.
게다가, 플라스미드 pEK0pyc는 전기영동법에 의하여 코리네박테리움 글루타미컴 야생형 ATCC 13032에서 형질전환되었다. 야생형 균주 pEK0pyc는 피루베이트 카르복시라아제 활성에 대해 야생형 ATCC 13032과 비교조사 하였다. 균주는 0.5% 락테이트를 포함한 복합배지(Luria-Bertani, Molecular Cloning, A laboratory mannual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press)와 2% 락테이트 또는 4% 글루코스를 포함한 최소배지에서 배양되고 Peters-Wendisch 등이 제시한 방법에 따라 피루베이트 카르복시라아제 활성을 시험하였다. 분석 결과에 따르면 pEK0-pyc를 가지는 균주의 피루베이트 카르복시라아제 활성이 출발균주보다 4배 더 높다.
4. 균주 코리네박테리움 글루타미컴 DG 52-5내의 피루베이트 카르복시라아제 유전자의 과도발현에 의한 라이신의 축적
라이신 생성 균주 DG52-5(J Gen Microbiol 1988,134: 3221-3229)에서 피루베이트 카르복시라아제 유전자의 과도 발현의 영향을 조사하기 위해서, 발현 벡터 pVWEX1를 IPTG-유도성 발현을 촉진하기 위해 사용하였다. 이 벡터에서 pyc 유전자는 프로모터 없이 클론되었다. 이 목적을 위해서, PCR-프라이머( [서열 1]에 따른 뉴클레오티드 서열에서 프라이머 1= 위치 112-133; 프라이머 2= 위치 373-355)를 합성하였고 피루베이트 카르복시라아제 유전자의 프로모터가 없는 출발영역 261bp를 PCR로 증폭하였다.
프라이머 1은 PstⅠ 분열위치를 가능하게 하고, 프라이머 2는 BamH Ⅰ 분열위치를 가능하게 하도록 선택되었다. PCR후에 274bp PCR산물을 분리하여 콘카터머에 결찰시키고 제한효소 PstⅠ와 BamHⅠ으로 분할한다. 제한효소산물을 에탄올 침전으로 농축하고 PstⅠ-BamHⅠ분할벡터 pVWEX1에 결찰시킨다. 이렇게 형성된 구조물pVWEXⅰ-PCR을 제한효소처리로 시험하였다. pyc 유전자의 말단을 벡터 pEK0pyc로부터 RcaⅠ-Klenow-SalⅠ처리로 분리하고 벡터 pVWEX1-PCR 과정에서 BamHⅠ-Klenow-SalⅠ에 결찰시켰다. 이렇게 형성된 구조물 pVWEX1pyc를 제한지도법으로 분석하였다. 플라스미드의 지도는 도2에 나와있다.
플라스미드를 코리네박테리움 글루타미컴 DG 52-5에 전기영동법으로 도입하였다. 대조군으로서 균주 DG 52-5를 삽입체없이 벡터 pVWEX1로 형질전환시키고 세가지 형질전환체의 L-lysine의 침전을 비교하였다. 이 목적으로 DG 52-5(pVWEX1pyc)3,4와 2xTY(Molecular cloning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press with 50 ㎍/ℓ 카나마이신)와 전단계 배지로부터 각 발효배지가 독립적으로 접종되었다. 배지는 플라스미드를 안정화시키기 위해서 카나마이신을 더 포함한다. 각 경우에서, 1개의 플라스크에는 200 ㎍ IPTG/ml이 첨가되고 반면에 2번째 플라스크는 IPTG를 포함하지 않는 두가지의 동등한 실험을 수행하였다. 30℃에서 48시간동안 회전 쉐이커에서 120 RPM에서 배양한 후에 배지에 축적된 라이신의 양을 결정하였다. 아미노산 농도는 고압액체크로마토그래피(J Chromat 1983, 266; 471-482)로 결정하였다.
발효결과는 표2에 나와 있고 주어진 값은 다른 클론으로 3번 실험한 값의 평균값이다. 피루베이트 카르복시라아제 유전자를 과도발현하면 배지에서 라이신이 50% 더 축적되었다. 보전효소 피루베이트 카르복시라아제의 유전자는 라이신 형성과정을 더욱 향상시킨다.
5. 균주 코리네박테리움 글루타미컴 DM 368-3에서의 피루베이트 카르복시라아제 유전자의 고도발현에 의한 트레오닌과 호모세린의 축적
L-라이신 형성에 관한 실험과 동일하게, 피루베이트 카르복시라아제 유전자의 고도발현으로 배양 상층액에서 트레오닌의 축적도 제4단원에 제시한 바와 같이 이 목적으로 조사되었다. 트레오닌 생성 균주 코리네박테리움 글루타미컴 DM 368-3(Degussa AG)은 플라스미드 pVWEX1pyc로 형질전환되었고 대조군으로 플라스미드 pVWEX1로 형질전환하였고 트레오닌 분리에 대해 3가지의 다른 형질전환체가 분석되었다. 이목적으로 DM368-3(pVWEX1)2 및 3, DM 368-3(pVWEX1pyc) 1,2,3을 복합배지(50 ㎍/ℓ kanamycin을 가진 2xTY)에서 배양하고 각경우의 발효배지 CGXⅡ(J Bacteriol 1993, 175: 5595-5603)는 사전배양에서 각각 접종된 것이다. 배지는 플라스미드를 안정화시키기 위해서 카나마이신을 추가로 포함한다. 1개의 플라스크에는 200 ㎍ IPTG/ml이 첨가되고 반면에 2번째 플라스크는 IPTG를 포함하지 않는 형태의 두가지의 동등한 실험을 수행하였다. 30℃ 에서 48시간동안 회전 쉐이커에서 120 RPM에서 배양한 후에 배지에 축적된 트레오닌의 양을 결정하였다. 아미노산농도는 고압액체크로마토그래피(J Chromat 1983, 266; 471-482)로 결정하였다. 발효결과는 표3에 나와 있고 주어진 값은 다른 클론으로 3번 실험한 값의 평균값이다. 피루베이트 카르복시라아제 유전자를 과도발현하면 배지에서 트레오닌이 40% 더 축적되었다. 제시된 보전효소 피루베이트 카르복시라아제의 유전자를 L-트레오닌 형성과정에서 사용하면 L-트레오닌 형성이 향상된다.
게다가, 아미노산 농도 결정으로 피루베이트 카르복시라아제 유전자가 과도 발현된 균주는 과도발현 되지않은 유전자를 갖는 균주보다 150% 더 많은 호모세린을 생성함을 알 수 있다. 그 결과가 표3에 나와있다. 발명에 따른 공정에서 호모세린과 같이 트레오닌 형성도 크게 향상됨을 알 수 있다.
6. 코리네박테리움 글루타미컴 야생형에서의 피루베이트 카르복시라아제 유전자의 과도 발현에 의한 글루타메이트의 축적
L-라이신, L-트레오닌과 L-호모세린 형성에 대한 실험과 비슷하게(상기 제4 및 5 단원 참조) 피루베이트 카르복시라아제 유전자의 과도 발현에 의한 배양 상층액에서 글루타메이트의 축적이 조사되었다. 이 목적을 위해서, 제시된 바대로 플라스미드 pVWEX1을 가진 대조군에 추가적으로 플라스미드 pVWEX1을 가진 코리네박테리움 글루타미컴 야생형이 형질전환되었고 글루타메이트 분리가 2가지 다른 형질전환체로부터 결정되었다. 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032 (pVWEX1pyc) 1과 2와 함께 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032 pVWEX1pyc D1과 D2이 복합배지(50 ㎍/ℓ 가나마이신을 가진 2xTY)에서 배양되었고 각 경우에 발효배지 CGXⅡ(J Bacteriol 1993, 175: 5595-5603)는 각각 사전배양기간에 접종되었다. 배지는 플라스미드를 안정시키기 위해서 카나마이신을 더 포함한다. 접종 6시간 후에 글루타메이트 분리를 유도하기 위해서 ml당 25 ㎎에서 60㎎을 배지에 첨가하였다. 한 플라스크에는 200 ㎍ IPTG/ml이 첨가되고 반면에 2번째 플라스크는 IPTG를 포함하지 않는 두가지의 동등한 실험을 수행하였다. 30℃에서 48시간동안 회전 쉐이커에서 120 RPM로 배양한 후에 배지에 축적된 트레오닌의 양을 결정하였다. 아미노산농도는 고압액체크로마토그래피(J Chromat 1983, 266; 471-482)로 결정하였다. 발효결과는 표4에 나와있고 주어진 값은 다른 클론으로 3번 실험한 값의 평균값이다. 피루베이트 카르복시라아제 유전자를 과도발현하면 배지에서 글루타메이트의 농도가 200% 까지 증가하였다. 제시된 보전효소 피루베이트 카르복시라아제의 유전자를 사용하면 글루타메이트 형성이 향상된다.
게다가, 아미노산 농도 결정으로 피루베이트 카르복시라아제 유전자가 과도발현된 균주는 과도발현되지 않은 유전자를 갖는 균주보다 150% 더 많은 호모세린을 생성함을 알 수 있다. 그 결과가 표3에 나와있다. 발명에 따른 공정에서 호모세린과 같이 트레오닌 형성도 크게 향상됨을 알 수 있다.
표1
균주 IPTG 피루베이트 카르복시라아제
[㎍/ml] [nmol분-1mg, 무수중량-1]
13032(pEK0pyc) 0 75±13
ATCC 13032 0 19±4
DG52-5(pVWEX1pyc) 200 88±13
0 11±2
DG52-5(pVWEX1) 200 5±2
0 6±1
DM368-3(pVWEX1pyc) 200 76±10
0 12±3
DM368-3(pVWEX1) 200 10±1
0 11±2
표2
균주 IPTG 라이신
[㎍/ml] [mM]
DG52-5(pVWEX1pyc) 200 35.4±2.6
0 23.6±2.9
DG52-5(pVWEX1) 200 23.3±2.9
0 22.1±4.0
표3
균주 IPTG 트레오닌 호모세린
[㎍/ml] [mM] [mM]
DM368-3(pVWEX1pyc) 200 10.2±0.5 14.4±1.2
0 7.9±1.0 5.6±0.2
DM368-3(pVWEX1) 200 8.0±0.5 5.8±0.7
0 7.5±0.8 6.1±1.0
표4
균주 IPTG 글루타메이트
[㎍/ml] [mM]
ATCC 13032 200 11±2
ATCC 13032 0 13±2
ATCC 13032(pVWEX1-pyc) 200 67±4
ATCC 13032(pVWEX1-pyc) 0 32±4

Claims (37)

  1. 피루베이트 카르복시라아제 활성이 효소의 유전적 변형 및/또는 아미노산 형성 미생물의 피루베이트 카르복시라아제 유전자 발현에 의해 증가된 것을 특징으로하는 아스파테이트 및/또는 글루타메이트 계열 아미노산의 미생물적 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    고 피루베이트 카르복시라아제 활성 유전자가 내인성 피루베이트 카르복시라아제 유전자의 돌연변이에 의해 생성되는 것을 특징으로하는 아미노산의 미생물적 제조방법.
  3. 제 1항 또는 2항에 있어서,
    유전자 카피의 수를 증가시켜서 피루베이트 카르복시라아제의 유전자 발현을 증가시키는 것을 특징으로하는 아미노산의 미생물적 제조방법
  4. 제 3항에 있어서,
    유전자 카피의 수를 증가시키기 위해서 피루베이트 카르복시라아제의 유전자가 유전자 구조물에 결합되는 것을 특징으로하는 아미노산의 미생물적 제조방법
  5. 제 3항에 있어서,
    피루베이트 카르복시라아제의 유전자와 관련된 조절 유전자 서열을 포함하는 유전자 구조물에 피루베이트 카르복시라아제 유전자가 결합되는 것을 특징으로하는 아미노산의 미생물적 제조방법.
  6. 제 4항이나 5항에 있어서,
    아미노산 생성 미생물이 유전자 함유 유전자 구조물에 의해 형질전환되는 것을 특징으로하는 아미노산의 미생물적 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    코리네박테리움 종 미생물이 유전자 함유 유전자 구조물에 의해 형질전환되는 것을 특징으로하는 아미노산의 미생물적 제조방법.
  8. 제 6항이나 7항에 있어서,
    형질전환을 위해서 대응되는 아미노산 합성에 참여하는 효소의 조절을 억제하고 및/또는 대응되는 아미노산의 외부운반체의 활성을 향상시키는 미생물을 사용하는 것을 특징으로하는 아미노산의 미생물적 제조방법.
  9. 제 6항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    형질전환을 위해서 합성에 참여하는 대응되는 아미노산의 중심 대사물을 다량으로 함유한 미생물을 사용하는 것을 특징으로하는 아미노산의 미생물적 제조방법.
  10. 제 6항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    형질전환을 위해서 대응되는 아미노산의 생합성 경로와 경쟁하고 저활성으로 진행되는 생합성 경로를 가진 미생물을 사용하는 것을 특징으로하는 아미노산의 미생물적 제조방법.
  11. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    피루베이트 카르복시라아제 유전자가 다양한 종류의 코리네박테리움 미생물균주로부터 분리되는 것을 특징으로하는 아미노산의 미생물적 제조방법.
  12. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    전사 신호를 강화하여 유전자 발현을 증가시키는 것을 특징으로하는 아미노산의 미생물적 제조방법.
  13. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    피루베이트 카르복시라아제 유전자가 피루베이트 카르복시라아제 유전자 앞에 택프로모터(tac-promoter)를 갖는 것을 특징으로하는 아미노산의 미생물적 제조방법.
  14. 제13항에 있어서,
    택프로모터는 조절 서열과 연결되는 것임을 특징으로하는 아미노산의 미생물적 제조방법.
  15. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    피루베이트 카르복시라아제 유전자는 [서열 2]에 기재된 아미노산 서열과 이것의 대립형질 변형을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자인 것을 특징으로하는 아미노산의 미생물적 제조방법.
  16. 제15항에 있어서,
    피루베이트 카르복시라아제 유전자와 함께 [서열 1]에 기재된 뉴클레오티드 165에서 3587까지의 뉴클레오티드 서열 혹은 사실상 동일한 효과의 DNA서열을 갖는 유전자를 사용하는 것을 특징으로하는 아미노산의 미생물적 제조방법.
  17. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    라이신, 트레오닌, 호모세린, 글루타메이트 및/또는 아르기닌을 생성하는 것을 특징으로하는 아미노산의 미생물적 제조방법.
  18. [서열 2]에 기재된 아미노산 서열을 암호화하거나 및/또는 이것의 대립형질 변형을 암호화할 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로하는 피루베이트 카르복시라아제 유전자.
  19. 제 18항에 있어서,
    [서열 1]에 기재된 뉴클레오티드 165 내지 3587의 뉴클레오티드 서열 또는 사실상 동일한 효과의 DNA서열을 갖는 것을 특징으로하는 피루베이트 카르복시라아제 유전자.
  20. 제 18항에 있어서,
    [서열 1]에 기재된 뉴클레오티드 20 내지 109의 뉴클레오티드 서열 또는 사실상 동일한 효과의 DNA서열의 선행 프로모터를 갖는 것을 특징으로하는 피루베이트 카르복시라아제 유전자.
  21. 제 18항 또는 19항에 있어서,
    선행 택프로모터를 갖는 것을 특징으로하는 피루베이트 카르복시라아제 유전자.
  22. 제 21항에 있어서,
    프로모터와 관련된 조절유전자 서열을 갖는 것을 특징으로하는 피루베이트 카르복시라아제 유전자.
  23. 제 18항 내지 20항 중의 어느 한 항에 있어서,
    이들 서열에 관련된 조절유전자 서열을 갖는 것을 특징으로하는 피루베이트 카르복시라아제 유전자.
  24. 제 18항 내지 23항 중의 어느 한 항에 따른 피루베이트 카르복시라아제 유전자를 포함하는 유전자구조.
  25. 제 18항 내지 23항 중의 어느 한 항에 따른 피루베이트 카르복시라아제 유전자 또는 제24항에 따른 유전자구조를 포함하는 벡터.
  26. 제 18항 내지 23항 중의 어느 한 항에 따른 피루베이트 카르복시라아제 유전자 또는 제24항에 따른 유전자구조를 복제형태로 포함하는 것으로된 형질전환된 세포.
  27. 제 26항에 있어서,
    제 25항에 따른 벡터를 포함하는 것을 특징으로하는 형질전환된 세포.
  28. 제 26항 또는 27항에 있어서,
    다양한 종류의 코리네박테리움에 속하는 것을 특징으로하는 형질전환된 세포.
  29. 제 26항 내지 28항 중 어느 한 항에 있어서,
    대응하는 아미노산의 합성에 참여하는 효소 및/또는 대응하는 아미노산의 외부수송에 참여하는 효소의 조절이 억제되는 것을 특징으로하는 형질전환된 세포.
  30. 제 26항 내지 29항 중 어느 한 항에 있어서,
    아미노산의 합성에 참여하는 중심 대사물을 다량 함유하는 것을 특징으로하는 형질전환된 세포.
  31. 제 26항 내지 30항 중 어느 한 항에 있어서,
    아미노산의 합성에 참여하지 않는 중심 대사물을 소량 함유하는 것을 특징으로하는 형질전환된 세포.
  32. 아스파테이트나 글루타메이트계열 아미노산의 생성을 증가시키는데 사용되는 것을 특징으로하는 피루베이트 카르복시라아제 유전자의 용도.
  33. 제 32항에 있어서,
    고 피루베이트 카르복시라아제 활성의 효소를 암호화하는 돌연변이형 피루베이트 카르복시라아제 유전자가 사용되는 것을 특징으로하는 피루베이트 카르복시라아제 유전자의 용도.
  34. 제 32항 또는 33항에 있어서,
    대응하는 아미노산을 생성하는 미생물은 피루베이트 카르복시라아제 유전자를 포함하는 유전자구조에 의해 형질전환되는 것을 특징으로하는 피루베이트 카르복시라아제 유전자의 용도.
  35. 제 34항에 있어서,
    유전자구조가 조절유전자 서열을 더 포함하는 것을 특징으로하는 피루베이트 카르복시라아제 유전자의 용도.
  36. 제 32항 또는 35항에 있어서,
    코리네박테리움의 피루베이트 카르복시라아제 유전자가 사용되는 것을 특징으로하는 피루베이트 카르복시라아제의 용도.
  37. 제 32항 또는 36항에 있어서,
    코리네박테리움이 아미노산 생성 미생물로 사용되는 것을 특징으로하는 피루베니트 카르복시라아제의 용도.
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