CN114787369B

CN114787369B - 生产含硫氨基酸或其衍生物的方法

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Publication number: CN114787369B
Application number: CN202080059719.6A
Authority: CN
Inventors: S·崔; 金喜珠; 鲁镇雅; 李珍南; 李翰衡; 李善英; 金相俊; 沈知炫
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2020-06-26
Publication date: 2023-11-28
Anticipated expiration: 2040-06-26
Also published as: JP2022539565A; EP3978615A1; JP7439142B2; US20220315963A1; WO2020263043A1; KR102472559B1; CN114787369A; BR112021026486A2; EP3978615A4; KR20210002260A

Abstract

本申请涉及生产含硫氨基酸或含硫氨基酸衍生物的方法。

Description

生产含硫氨基酸或其衍生物的方法

技术领域

本公开涉及生产含硫氨基酸或含硫氨基酸衍生物的方法。

背景技术

L-氨基酸已经通过使用属于短杆菌(Brevibacterium)属、棒杆菌(Corynebacterium)属、埃希氏菌(Escherichia)属等微生物的发酵方法来工业化生产。在这种生产方法中，已经使用了从自然界分离的细菌菌株、其人工突变菌株或经由DNA重组技术修饰以具有参与L-氨基酸生物合成的酶的增强活性的菌株。

同时，含硫氨基酸已被用作合成动物饲料、食品添加剂、药用注射液和药物的成分(原料，)，并已经进行了生物生产含硫氨基酸及其衍生物的研究。

例如，美国专利申请公开号US2009-0298135 A1公开了通过缺失大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的基因组上的metJ基因并过表达L-甲硫氨酸输出因子(exporter)YjeH蛋白来生产0.8g/L的L-甲硫氨酸。此外，BrnF和BrnE多肽也已经被报道为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的L-甲硫氨酸输出因子(C.Troschel等人.,Journal ofBacteriology,pp.3786–3794,June 2005)。

同时，在含硫氨基酸的生产中，微生物中消耗NADPH的量可能根据硫源的还原能力而变化。例如，不需要NADPH的硫化物(sulfide)具有最高的理论产率，而需要四个NADPH的硫酸盐(sulfate)具有低的理论产率。然而，硫化物是不利的，因为已知它们导致细胞损伤并且具有低稳定性。因此，在含硫氨基酸生产中使用硫代硫酸盐(硫代硫酸盐是具有低NADPH需求和高细胞内稳定性的硫源)的情况下，可以预期高产率。然而，在棒杆菌属微生物中有效利用硫代硫酸盐方面还没有实质性的研究。

发明内容

[技术问题]

本发明人新发现由ssuD基因编码的蛋白质参与利用硫代硫酸盐，并确认了被修饰以具有增强的蛋白质的活性的微生物具有增强的使用硫代硫酸盐作为硫源生产含硫氨基酸的能力，从而完成了本公开。

[技术方案]

本发明提供了生产含硫氨基酸及含硫氨基酸衍生物的方法，该方法包括在含有硫代硫酸盐的培养基中培养基因修饰的微生物，其中该微生物包括与未修饰的微生物相比由ssuD基因编码的蛋白质的活性增加的基因修饰。

本公开提供了微生物，其生产含硫氨基酸或该含硫氨基酸衍生物，并包括与未修饰的微生物相比由ssuD基因编码的蛋白质的活性增加的基因修饰。

本公开提供了用于生产含硫氨基酸或含硫氨基酸衍生物的组合物，其中该组合物包括：包括与未修饰的微生物相比由ssuD基因编码的蛋白质的活性增加的基因修饰的微生物或其培养物；以及硫代硫酸盐。

本公开提供了由ssuD基因编码的蛋白质作为硫代硫酸盐还原酶的用途。

本发明提供了微生物用于生产含硫氨基酸或含硫氨基酸衍生物的用途，该微生物包括与未修饰微生物相比增加由ssuD基因编码的蛋白质的活性的基因修饰。

[有益效果]

含硫氨基酸或其衍生物可以使用根据本公开的微生物、组合物和使用其的含硫氨基酸或其含硫氨基酸衍生物的生产方法来大量生产，且因此可以被有效地用于生产包括含硫氨基酸或其衍生物的有用产品。

具体实施方式

将详细描述本公开。同时，本公开中公开的每个描述和实施方式可应用于本文中的不同描述和实施方式。换句话说，本公开中公开的各种组成部分的所有组合都被包括在本公开的范围内。此外，本公开的范围不应受下面提供的描述的限制。

本领域技术人员仅使用常规实验就将认识或能够确定与本公开的特定实施方式的许多等同物。这些等同物旨在被涵盖在本公开的范围内。

本公开的一个方面提供了生产含硫氨基酸或含硫氨基酸衍生物的基因修饰的微生物。

本公开的另一方面提供了生产含硫氨基酸和含硫氨基酸衍生物的方法，该方法包括在含有硫代硫酸盐的培养基中培养基因修饰的微生物。

微生物可以包括增加由ssuD基因编码的蛋白质的活性的基因修饰。

本公开提供了生产含硫氨基酸和含硫氨基酸衍生物的方法，该方法包括在含硫代硫酸盐的培养基中培养基因修饰的微生物，其中该微生物可以包括与修饰前的微生物相比由ssuD基因编码的蛋白质的活性增加的基因修饰。在本公开的实施方式中，该方法可以是通过微生物增加含硫氨基酸或含硫氨基酸衍生物的生产的方法。

制造方法可以包括使微生物或其培养物与硫代硫酸盐接触，该微生物具有与内在活性相比增强的由ssuD基因编码的蛋白质的活性。

如本文所用，表达“由ssuD基因编码的蛋白质”是指ssuD基因编码的蛋白质或由ssuD基因表达的蛋白质，并可以称为“SsuD蛋白”(以下称为“SsuD蛋白”)。通常，已知SsuD蛋白参与磺酸盐(sulfonate，R-SO₃)的降解，具体是作为烷基磺酸盐单氧酶(alkanesulfonate monooxygenase)之一，称为磺酸盐单氧酶。然而，尚不知道该SsuD蛋白是否参与利用除有机硫酸盐以外的硫代硫酸盐。

在本公开中，新揭示了SsuD蛋白参与利用硫代硫酸盐，具体地，其用作还原硫代硫酸盐的还原酶，并且确认了通过增强SsuD蛋白的活性可以增加含硫氨基酸的生产量。

本公开的SsuD蛋白可以是由ssuD基因编码的蛋白，并且可以称为“SsuD蛋白”、“硫代硫酸盐还原酶”或通常已知的“烷基磺酸盐单氧酶”。在一个实施方式中，本公开的SsuD蛋白可以是来源于属于棒杆菌属的微生物的“磺酸盐单氧酶”或“硫代硫酸盐还原酶”，具体地是来源于属于棒杆菌属的微生物的命名为LLM类黄素依赖性氧化还原酶(LLM classflavin-dependent oxidoreductase)的蛋白质。具体地，SsuD蛋白可来源于谷氨酸棒杆菌、克氏棒杆菌(Corynebacterium crudilactis)、沙漠棒杆菌(Corynebacterium deserti)、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、石南棒杆菌(Corynebacterium callunae)、停滞短杆菌(Corynebacterium stationis)、单一棒杆菌(Corynebacterium singulare)、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerans)、纹带棒杆菌(Corynebacterium striatum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、污染棒杆菌(Corynebacteriumpollutisoli)、模拟棒杆菌(Corynebacterium imitans)、睾丸棒杆菌(Corynebacteriumtestudinoris)、石南棒杆菌(Corynebacterium callunae)、钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)、沙漠棒杆菌(Corynebacterium deserti)、微黄棒杆菌(Corynebacteriumflavescens)、Corynebacterium pacaense、或Corynebacterium suranareeae，更具体地，谷氨酸棒杆菌，但不限于此。SsuD蛋白的氨基酸序列可从已知数据库，如美国国家生物技术信息中心(NCBI)获得。

在一个实施方式中，SsuD蛋白可以包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列或与SEQ IDNO:43的氨基酸序列具有至少80％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性或同一性的氨基酸序列。此外，将明显的是，只要氨基酸序列保持上述同源性或同一性，并且与多肽的作用等效，任何具有包括一些氨基酸的缺失、修饰或添加的氨基酸序列的蛋白质都在本公开的范围内。

此外，也可以不受限制地包括具有磺酸盐单氧酶活性和硫代硫酸盐还原活性，并由与使用已知基因序列构建的探针(例如，在严格条件下完全或部分与多核苷酸互补的核苷酸序列)杂交的多核苷酸编码的任何多肽。

即，在本公开中，尽管使用表达“包括预先确定的SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白质或多肽”，“由预先确定的SEQ ID NO的氨基酸序列组成的蛋白质或多肽”，或“具有预先确定的SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白质或多肽”，但显然地，在本公开中可以使用包括一个或几个氨基酸的缺失、修饰、取代、保守取代或添加的任何蛋白质，只要该蛋白质具有与由SEQ ID NO的氨基酸序列组成的多肽的活性相等或等同的活性即可。例如，可以使用不改变蛋白质功能的序列向氨基酸序列的N-端和/或C-端的添加、自然发生的突变、其沉默突变(silent mutation)或其保守取代。

如本文所用，术语“保守取代”是指一个氨基酸用具有相似结构和/或化学性质的不同氨基酸取代。这种氨基酸取代可通常基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性而发生。

在本公开的实施方式中，SsuD蛋白可以由具有SEQ ID NO:8的核苷酸序列的多核苷酸编码，但不限于此。

如本文所用，术语“多核苷酸”具有包括DNA和RNA分子的含义，并且作为多核苷酸中基本结构单元的核苷酸不仅可以包括天然核苷酸，而且可以包括其中糖或碱基被修饰的类似物(Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York(1980)；Uhlman and Peyman,Chemical Reviews,90:543–584(1990))。

多核苷酸可以是编码本公开的SsuD蛋白的多核苷酸(ssuD基因)。由于密码子简并性或考虑到其中表达蛋白质的活生物体优选的密码子，只要不改变从编码区表达的多肽的氨基酸序列，则本公开的多核苷酸可以包括在编码区中进行的各种修饰。本公开的多核苷酸可以是，例如编码与本公开的SsuD蛋白具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性或同一性的多肽的多核苷酸。具体地，编码包括与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少80％同源性或同一性的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸可以是与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少80％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性或同一性的多核苷酸。

此外，显然，可以包括可翻译成蛋白质(包括由于密码子简并性而与SEQ ID NO:43具有至少80％同源性或同一性的氨基酸序列)的任何多核苷酸。可替代地，可以不受限制地包括编码蛋白质的任何多核苷酸，该蛋白质包括与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，并与使用已知基因序列构建的探针(例如，在严格条件下完全或部分与多核苷酸序列互补的核苷酸序列)杂交。术语“严格条件”意指允许多核苷酸间特异性杂交的条件。这些条件在已知文献(例如，J.Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,ColdSpring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)中详细公开。例如，严格的条件可以包括在具有高度同源性或同一性(例如，同源性或同一性为70％或更多、80％或更多、85％或更多、具体地90％或更多、更具体地95％或更多、甚至更具体地97％或更多、或最具体为99％或更多)的基因之间进行杂交，而不在具有低于上述同源性或同一性的同源性或同一性的基因之间进行杂交的条件，或在60℃、1×SSC和0.1％ SDS、具体地60℃、0.1×SSC、0.1％ SDS和更具体地68℃、0.1×SSC和0.1％ SDS的盐浓度和温度下，在用于Southern杂交的常规洗涤条件下洗涤一次、具体地两次或三次的条件。

尽管碱基根据杂交的严格程度而错配，但杂交需要两个多核苷酸具有互补序列。术语“互补的”用于描述能够彼此杂交的核苷酸的碱基之间的关系。例如，关于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开不仅可以包括基本上相似的核苷酸序列，而且可以包括分离但与整个序列互补的多核苷酸片段。

具体地，可以使用杂交条件和上述条件来检测与本公开的多核苷酸具有同源性或同一性的多核苷酸，杂交条件包括在55℃的T_m值下进行的杂交过程。此外，T_m值可以是但不限于60℃、63℃或65℃，并可由本领域技术人员根据预期目的适当地调整。

多核苷酸杂交的适当严格程度可取决于多核苷酸的长度和互补程度，且其参数在本领域中是公知的(Sambrook等人,supra,9.50–9.51,11.7–11.8)。

如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关程度，并可以用百分比来表示。术语同源性和同一性经常可以互换地使用。

保守的多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法来确定，并且可与由程序建立的默认空位罚值一起使用。基本上，同源性或同一性序列可在中等或高度严格的条件下以整个序列或整个长度的至少约50％、60％、70％、80％、或90％彼此杂交。显然地，在杂交中也可考虑包括简并密码子的多核苷酸。

两个多核苷酸或多肽序列之间的同源性、相似性、或同一性可以使用通过Pearson等人(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85]:2444引入的默认参数，使用任何本领域已知的任何计算机算法(例如，“FASTA”程序)来确定。可替代地，同源性、相似性、或同一性可以使用如在EMBOSS包的Needleman程序(EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite，Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277)(版本5.0.0或其后版本)中实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定(包括GCG程序包(Devereux,J.,等人,Nucleic Acids Research 12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,[S.][F.],[ET AL,J MOLEC BIOL 215]:403(1990)；Guideto Huge Computers,Martin J.Bishop,[ED.],Academic Press,San Diego,1994、和[CARILLO ETA/.](1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。例如，可以使用来自美国国家生物技术信息中心的BLAST、或ClustalW来确定同源性、相似性、或同一性。

多核苷酸或多肽之间的同源性、相似性、或同一性可通过使用如Smith andWaterman，Adv.Appl.Math(1981)2:482公开的由Needleman等人,(1970),J Mol Biol.48:443引入的GAP计算机程序比较序列信息来确定。简言之，GAP程序将相似性定义为将相似的对比符号(即，核苷酸或氨基酸)的数量除以两序列中较短者的符号总数的数值。用于GAP程序的默认参数可包括：(1)二进制比较矩阵(含有同一性值为1和非同一性值为0)和如Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure,NationalBiomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)描述的Gribskov等人,(1986),Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵)；(2)每个空位的罚值为3.0，且每个空位中每个符号为附加的0.10罚值(或空位开放罚值为10和空位延伸罚值为0.5)；和(3)末端空位无罚值。

此外，两个给定的多核苷酸或多肽之间的序列同源性、相似性或同一性可以在限定的严格条件下通过Southern杂交实验比较序列来确定，并且限定的杂交条件在相应技术的范围内，并且可以通过本领域普通技术人员公知的方法(例如，J.Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring HarborLaboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)来限定。

如本文所用，术语多肽或蛋白质的活性的“增强”是指与内在活性相比，多肽或蛋白质的活性增加。该增强可与上调、过表达、增加等互换使用。

在这方面，增加可以包括展示出本来不具有的活性或展示出与内在活性或修饰前活性相比增强的活性的那些全部。“内在活性”是指在微生物根据天然或人为因素引起的基因修饰而转化时，在转化前亲本菌株或未修饰的微生物本来具有的特定多肽或蛋白质的活性。这个术语可与“修饰前的活性”互换使用。多肽或蛋白质的活性与内在活性相比的“增强”或“增加”意指与转化前的亲本菌株或未修饰微生物本来具有的活性相比，特定多肽或蛋白质的活性得到提高。

术语“活性增加”可以通过引入外源的多肽或蛋白质或增强内源性多肽或蛋白质的活性来实现，具体地通过增强内源性多肽或蛋白质的活性来实现。多肽或蛋白质的活性的增强可以基于多肽或蛋白质的活性程度、其表达水平或从其释放的产物量的增加来确定。

如本文所用，表述“由ssuD基因编码的蛋白质或SsuD蛋白的活性的增强或增加”也可称为“基因修饰以增加由ssuD基因编码的蛋白质的活性”，且这意指着与内在活性相比，蛋白质的活性被增强。

SsuD蛋白的活性的增加可以包括通过引入外源SsuD蛋白的活性的增加和内源性SsuD蛋白活性的增加。

如本文所用，术语“蛋白质的引入”是指向本来不具有该蛋白质的微生物提供特定蛋白质的活性，或者与该蛋白质的内在活性或修饰前的活性相比，增强该蛋白质的活性。例如，蛋白质的引入可指引入特定蛋白质、将编码特定蛋白质的多核苷酸引入到微生物的染色体中、或将包括编码特定蛋白质的多核苷酸的载体引入到微生物中，从而表达蛋白质的活性。

只要与修饰前的微生物的活性相比，目标多肽或蛋白质的活性被增强，则可通过不受限制地应用本领域公知的各种方法来实现多肽或蛋白质的活性的增强。具体地，可以使用作为分子生物学常用方法的本领域公知的任何基因工程和/或蛋白质工程方法，但不限于此(Sitnicka等人Functional Analysis of Genes.Advances in CellBiology.2010,Vol.2.1–16,Sambrook等人Molecular Cloning 2012,等)。

具体地，在本公开中，活性的增强可通过以下方式实现：

(1)增加细胞中编码多肽或蛋白质的基因或多核苷酸的拷贝数；

(2)用更强活性的序列置换编码多肽或蛋白质的染色体上的基因表达调控区；

(3)修饰编码多肽或蛋白质的起始密码子或5’-UTR区的碱基序列；

(4)修饰染色体上的核苷酸序列，以增强多肽或蛋白质的活性；

(5)引入具有多肽或蛋白质的活性的外源多核苷酸或多核苷酸的密码子优化变体多核苷酸；或

(6)经由上述方法的任何组合修饰以增强活性，但不限于此。

通过蛋白质工程方法增强多肽或蛋白质的活性的方法可以通过修饰或化学修饰通过分析多肽或蛋白质的三维结构选择的暴露区域来进行，但不限于此。

上述(1)中所述的编码多肽或蛋白质的基因或多核苷酸的拷贝数的增加可以通过本领域中公知的任何方法——例如，通过将载体(该载体与宿主细胞无关地复制和发挥作用，且与编码该多肽或蛋白质的基因或多核苷酸可操作地连接)引入到宿主细胞中——来实现。可替代地，拷贝数的增加可以通过将载体(该载体可操作地连接到基因，并能够将基因或多核苷酸插入到宿主细胞的染色体中)引入到宿主细胞中来进行，但不限于此。

上述(2)中所述的用更强活性的序列对编码多肽或蛋白质的染色体上的基因表达调控区(或表达调控序列)的置换可以通过本领域已知的任何方法进行，例如，通过缺失、插入、非保守或保守取代或其任何组合诱导序列突变，或通过用具有更强活性的序列置换序列，以进一步增强表达调控区的活性。表达调控区可以包括启动子、操纵基因序列、核糖体结合位点编码序列和用于调控转录和翻译终止的序列，但不限于此。例如，该方法可以通过代替内源启动子连接更强的异源启动子来进行，而不限于此。

本领域已知的更强启动子的实例可包括cj1至cj7启动子(美国专利号US 7662943B2)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、Lambda噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、lysCP1启动子(US2010-0317067 A1)、spl1启动子、spl7启动子、spl13启动子(US10584338 B2)、gapA启动子、EF-Tu启动子、groEL启动子、aceA或aceB启动子、O2启动子(美国专利号US10273491 B2)、tkt启动子和yccA启动子，但不限于此。

上述(3)中描述的编码多肽或蛋白质的起始密码子或5’-UTR区的碱基序列的修饰可以通过本领域已知的任何方法进行，例如，通过将内在起始密码子取代为多肽或蛋白质表达水平更高的另一个起始密码子，但不限于此。

上述(4)中的修饰染色体上的核苷酸序列以增强描述的多肽或蛋白质的活性可以通过本领域中已知的任何方法进行，例如，通过缺失、插入、非保守或保守取代或其任何组合诱导表达调控序列上的修饰，以进一步增强核苷酸序列的活性或用修饰以具有更强活性的核苷酸序列置换该序列。置换可以是通过同源重组将基因插入到染色体中，但不限于此。本文使用的载体可进一步包括检测染色体插入的选择标记。

上述(5)中所述的具有多肽或蛋白质的活性的外源多核苷酸的引入可以通过本领域中已知的任何方法进行，例如，通过向宿主细胞中引入编码具有与多肽或蛋白质相同/相似活性的多肽或蛋白质的外源多核苷酸，或引入其密码子优化变体多核苷酸。外源多核苷酸的来源或序列没有特别限制，只要外源多核苷酸表现出与多肽或蛋白质相同/相似的活性即可。另外，为了优化宿主细胞中的转录和翻译而密码子优化的外源多核苷酸可以被引入宿主细胞中。引入可以通过由本领域普通技术人员适当选择的任何已知转化方法来进行。随着引入的多核苷酸在宿主细胞中表达，产生多肽或蛋白质，从而增加其活性。

最后，在(6)中描述的上述方法的组合可以通过应用在(1)到(5)中描述的一个或多个方法来进行。

上述多肽或蛋白质的活性的增强可以是与野生型或非修饰微生物菌株中表达的多肽或蛋白质的活性或浓度相比，多肽或蛋白质的活性或浓度的增加，或者从多肽或蛋白质获得的产物的量的增加，但不限于此。

如本文所用，术语“修饰前的菌株”或“修饰前的微生物”并不排除包括在微生物中自然发生的突变的菌株，并且可以指野生型菌株或自然型菌株，或由于自然或人工因素通过基因修饰转化前的菌株。“修饰前的菌株”或“修饰前的微生物”可与“未突变的菌株”、“未修饰的菌株”、“未突变的微生物”、“未修饰的微生物”或“参考微生物”互换使用。

如本文所用，术语“载体”是指含有编码目的蛋白并可操作地连接到合适的调控序列，以便能够在合适的宿主细胞中表达目的蛋白的的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体。调控序列可以包括能够启动转录的启动子、用于调控转录的任何操纵基因序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、以及用于调控转录和翻译终止的序列。当用该载体转化合适的宿主细胞时，该载体可以独立于宿主基因组复制或发挥作用，或者可以整合到其基因组中。例如，可以通过使用在细胞中用于染色体插入的载体将编码目的蛋白的多核苷酸插入到染色体中。将多核苷酸插入染色体中可以通过本领域已知的任何方法(例如，同源重组)进行，但不限于此。载体可进一步包括检测染色体插入的选择标记。选择标记用于选择用载体转化的细胞，即，用于确认所期望核酸分子的插入，选择标记的实例可以包括提供可选择表型的标记，如药物耐受性、营养需求、对细胞毒剂的耐性、或表面多肽的表达。只有表达选择标记的细胞才能够在用选择剂处理的环境下存活或表现出不同的表型，从而可以选择转化的细胞。

本公开中使用的载体没有特别限制，并且可以使用本领域中已知的任何载体。本领域中常用的载体的实例可包括天然或重组质粒、黏粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A可用作噬菌体载体或黏粒载体。作为质粒载体，可以使用pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型和pET型。具体地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118和pCC1BAC。然而，实施方式不限于此。

如本文所用，术语“转化”是指将包括编码目的蛋白的多核苷酸的载体引入到宿主细胞或微生物中的过程，以这种方式使多核苷酸编码的多肽在宿主细胞中表达。只要蛋白质在宿主细胞中表达，则转化的多核苷酸可以是插入到宿主细胞的染色体中的形式，或可以是位于染色体外的形式。此外，多核苷酸包括编码目的蛋白的DNA和/或RNA。只要将多核苷酸引入到宿主细胞中并在其中表达多肽，多核苷酸可以以任何形式引入到宿主细胞中。例如，多核苷酸可以以表达盒(expression cassette)的形式引入到宿主细胞中，表达盒是包括自我复制所需的所有必要元件的基因构建体。表达盒通常可以包括可操作地连接到多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以是可自复制的表达载体的形式。此外，多核苷酸可以以其原始形式引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中可操作地连接到表达所需的序列，而不限于此。

此外，如本文所用，术语“可操作地连接”是指启动子序列和基因序列之间的可操作连接，启动子序列能够启动并介导编码本公开的目的蛋白的多核苷酸的转录。

根据本公开的用载体进行转化的方法包括能够将核酸引入到宿主细胞中的任何方法，并且可以通过根据宿主细胞选择的本领域公知的适合的标准技术进行。例如，可以使用电穿孔、磷酸钙(CaHPO₄)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、微注射、聚乙二醇(PEG)方法、DEAE-葡聚糖方法、阳离子脂质体方法、和乙酸锂-DMSO方法，但本公开不限于此。

本公开的微生物可以包括野生型微生物和包括天然或人工基因修饰的微生物，并且根据本公开，引入有硫代硫酸盐还原酶或包括硫代硫酸盐还原酶的任何微生物都可以不受限制地包括在其中。

本公开的微生物可以包括：本公开的硫代硫酸盐还原酶；编码其的多核苷酸；和包括该多核苷酸的载体中的至少一种。

微生物可以是生产L-氨基酸和/或其衍生物的微生物。

如本文所用，术语“生产L-氨基酸和/或其衍生物的微生物”包括天然具有生产L-氨基酸/其衍生物能力的微生物和通过向不能生产L-氨基酸或其衍生物的亲本菌株提供生产L-氨基酸/其衍生物能力而制备的微生物。具体地，任何微生物，包括通过经由引入外源基因或者增强或失活内源性基因的活性而使特定机制减弱或增强，以生产目标L-氨基酸或其衍生物的基因修饰。

例如，微生物可以是其中L-氨基酸的生物合成途径被增强或其降解途径被减弱的微生物。例如，微生物可以是其中L-甲硫氨酸生物合成途径被增强的微生物。

例如，微生物可以是其中甲硫氨酸和半胱氨酸生物合成阻遏物(methionine andcysteine biosynthesis repressor，McbR)蛋白或MetJ蛋白的活性被减弱或消除的微生物，或者是其中通过增强甲硫氨酸合成酶(MetH)或亚硫酸还原酶(CysI)的活性而增强和/或增加甲硫氨酸生产能力的微生物。或者，微生物可以是其中编码参与L-氨基酸生物合成途径的酶的基因的表达被增强或参与L-氨基酸降解途径的酶被减弱/失活的微生物。

具体地，蛋白质或基因——蛋白质或基因的表达可被控制，以增强L-氨基酸的生物合成途径或减弱/失活其降解途径——的实例如下。它们按蛋白质、编码蛋白质的代表性基因和其代表性EC号的顺序提供。蛋白质的第一个字母用大写字母写，而基因用斜体字体写。例如，可使用硫代硫酸盐硫转移酶(thiosulfate sulfurtransferase)，如Rdl2p、GlpE、PspE、YgaP、ThiI、YbbB、SseA、YnjE、YceA、YibN、NCgl0671、NCgl1369、NCgl2616、NCgl0053、NCgl0054、NCGl2678和NCGL2890；亚硫酸还原酶，cysl；硫代硫酸盐/硫酸盐转运系统(thiosulfate/sulphate transport system)，cysPUWA(EC 3.6.3.25)；3’-磷酸腺苷5’-磷酸硫酸还原酶(3′-phosphoadenosine 5′-phosphosulphate reductase)，cysH(EC1.8.4.8)；亚硫酸还原酶(sulfite reductase)，cysJI(EC 1.8.1.2)；半胱氨酸合成酶A，cysK(EC 2.5.1.47)；半胱氨酸合成酶B，cysM(EC 2.5.1.47)；丝氨酸乙酰转移酶，cysE(EC2.3.1.30)；甘氨酸裂解系统，gcvTHP-lpd(EC 2.1.2.10，EC 1.4.4.2，EC 1.8.1.4)；硫辛酰合成酶，lipA(EC 2.8.1.8)；硫辛酰蛋白连接酶，lipB(EC 2.3.1.181)；磷酸甘油酸脱氢酶，serA(EC 1.1.1.95)；3-磷酸丝氨酸磷酸酶，serB(EC 3.1.3.3)；3-磷酸丝氨酸/磷酸羟苏氨酸氨基转移酶，serC(EC 2.6.1.52)；丝氨酸羟甲基转移酶，glyA(EC 2.1.2.1)；天冬氨酸激酶I(EC 2.7.2.4)；高丝氨酸脱氢酶I，thrA(EC1.1.1.3)；天冬氨酸激酶；lysC(EC2.7.2.4)；高丝氨酸脱氢酶，hom(EC 1.1.1.3)；高丝氨酸O-乙酰转移酶，metX(EC2.3.1.31)；高丝氨酸O-琥珀酰转移酶，metA(EC 2.3.1.46)；胱硫醚γ-合成酶，metB(EC2.5.1.48)；β-C-S-裂解酶，aecD(EC 4.4.1.8，β-裂解酶)；胱硫醚β-裂解酶，metC(EC4.4.1.8)；B12非依赖性同型半胱氨酸S-甲基转移酶，metE(EC 2.1.1.14)；甲硫氨酸合成酶，metH(EC 2.1.1.13)；亚甲基四氢叶酸还原酶，metF(EC 1.5.1.20)；L-甲硫氨酸输出蛋白BrnFE；缬氨酸输出蛋白YgaZH(B2682,B2683)、ygaZH(b2682,b2683)；输出蛋白YjeH，b4141；吡啶核苷酸转氢酶PntAB、pntAB(EC 1.6.1.2)；O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶，MetZ(EC2.5.1.48)；和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，Pyc(EC 4.1.1.31)。通过增强上述一种或多种蛋白质或组成系统的一些蛋白质的活性，或者通过过表达编码其的多核苷酸，可以增强L-氨基酸的生物合成途径，或者可以减弱其降解途径。或者，在葡萄糖6-磷酸异构酶中，pgi(EC 5.3.1.9)；高丝氨酸激酶，thrB(EC 2.7.1.39)；S-腺苷甲硫氨酸合成酶，metK(EC2.5.1.6)；二氢吡啶二羧酸合成酶，dapA(EC 4.2.1.52)；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；pck(EC 4.1.1.49)；甲酰四氢叶酸水解酶，purU(EC 3.5.1.10)；丙酮酸激酶I，pykF(EC2.7.1.40)；丙酮酸激酶II，pykA(EC 2.7.1.40)；胱硫醚γ-裂解酶，cg3086(EC 4.4.1.1)；胱硫醚β-合成酶，cg2344(EC 4.2.1.22)；调控蛋白Cg3031、cg3031；甲硫氨酸和半胱氨酸生物合成阻遏蛋白McbR、mcbR；Met转录阻遏蛋白,metJ；L-甲硫氨酸转运蛋白MetQNI、metQ、metN、metI；N-酰基转移酶，yncA；sRNAfnrS；和L-甲硫氨酸转运蛋白，metP，从其中选择的至少一种蛋白质可以被失活或减弱，或者编码该蛋白质的基因的表达可以被抑制或移除。

然而，这些仅仅是实例，且微生物可以是其中编码参与各种已知L-氨基酸生物合成途径的酶的基因表达被增强或参与降解途径的酶被减弱/失活的微生物，但不限于此。该L-氨基酸生产微生物可以通过本领域已知的各种方法制备。蛋白质的活性的增强和基因表达的增加如上文所述。

如本文所用，术语多肽或蛋白质的“失活”或“减弱”是包括与内在活性相比活性的降低和消除的概念。失活或减弱可与下调、降低和减少互换。失活或减弱可以包括以下情况：其中通过编码蛋白质的基因突变、表达调控序列的修饰、或基因的全部或部分缺失，使蛋白质的活性与微生物的内在活性相比减少或消除的情况，其中由于编码相同基因的表达或翻译的抑制，细胞中蛋白质的总体活性低于天然菌株或非修饰菌株的总体活性的情况，其中基因不表达的情况，以及其中尽管基因表达了但没有获得活性的情况。

在本公开中，蛋白质的失活/减弱可通过本领域公知的各种方法来实现，但不限于此(Nakashima N.等人,Bacterial cellular engineering by genome editing and genesilencing.Int JMol Sci.2014；15(2):2773–2793,Sambrooket al.Molecular Cloning2012,等)。

这些方法的实例包括

(1)编码蛋白质的基因全部或部分的缺失，

(2)表达调控区(或表达调控序列)的修饰，以减少编码蛋白质的基因的表达，

(3)编码蛋白质的基因序列的修饰，以消除或减弱蛋白质的活性，

(4)与编码蛋白质的基因转录物互补结合的反义寡核苷酸(例如，反义RNA)的引入，

(5)在Shine-Dalgarno序列上游添加与编码蛋白质的基因的Shine-Dalgarno序列互补的序列，以形成阻止核糖体与其结合的二级结构，

(6)在编码蛋白质的基因的核苷酸序列的开放阅读框(ORF)的3’端添加用于逆转录的启动子(逆转录工程，RTE)，或其任何组合，但不限于此。

具体地，编码蛋白质的基因的全部或部分的缺失可以通过使用用于在微生物中进行染色体插入的载体，用缺失一些核苷酸的多核苷酸或标记基因置换编码染色体中内在目的蛋白质的多核苷酸来进行。作为缺失多核苷酸的全部或部分的实例，可以使用通过同源重组缺失多核苷酸的方法，但不限于此。

此外，可以通过使用光(如UV光)或化学物质诱导突变，并从突变体中选择其中缺失目的基因的菌株来进行基因的全部或部分的缺失。基因的缺失可包括通过DNA重组技术的方法。DNA重组技术可以通过将与目的基因具有同源性的核苷酸序列或载体插入到微生物中诱导同源重组来进行。此外，所插入的核苷酸序列或载体可以包括显性选择标记，但不限于此。

此外，表达调控序列的修饰可以通过应用本领域公知的各种方法来实现。例如，可以通过以下方式进行修饰：通过缺失、插入、非保守或保守取代或其任何组合在表达调控区(表达调控序列)中诱导突变，以进一步减少表达调控区(表达调控序列)的活性，或者通过用具有更弱活性的序列置换该序列。表达调控区可以包括启动子、操纵基因序列、核糖体结合位点编码序列、和用于调控转录和翻译终止的序列，但不限于此。

此外，基因序列的修饰可以通过以下方式进行：通过缺失、插入、非保守或保守取代或其任何组合诱导基因序列中的突变，以进一步减弱多肽的活性，或者通过用修饰为具有更弱活性的基因序列或修饰为不具有活性的基因序列置换该序列，但不限于此。

例如，可以通过向基因序列中引入突变而形成终止密码子来抑制或减弱基因的表达。

然而，上述方法仅仅是实例，且本领域普通技术人员可以使用本领域已知的任何方法来制备生产L-氨基酸和/或其衍生物的微生物。

L-氨基酸和/或其衍生物可以是含硫氨基酸和/或含硫氨基酸衍生物。

如本文所使用的，术语“含硫氨基酸”或“含硫氨基酸衍生物”是指包括硫及其衍生物的氨基酸，具体地选自甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、羊毛硫氨酸、同型半胱氨酸、同型胱氨酸、同型羊毛硫氨酸和牛磺酸中的一种，但不限于此，包括硫的任何氨基酸及其衍生物都可以不受限制地包括在本公开的范围内。

本公开的微生物可以是属于棒杆菌属(Corynebacterium sp.)、埃希氏菌属(Escherichiasp.)或乳杆菌属(Lactobacillus sp.)的微生物，但不限于此。该微生物可以不受限制地包括通过增强SsuD蛋白的内在活性或引入外源SsuD蛋白而具有增强生产L-氨基酸和/或其衍生物的能力的任何微生物。

“属于棒杆菌属的微生物”可包括棒杆菌属的所有微生物。具体地，该微生物可以是谷氨酸棒杆菌、克氏棒杆菌、钝齿棒杆菌、沙漠棒杆菌、有效棒杆菌、石南棒杆菌、停滞短杆菌、单一棒杆菌、耐盐棒杆菌、纹带棒杆菌、产氨棒杆菌、污染棒杆菌、模拟棒杆菌、睾丸棒杆菌、或微黄棒杆菌、和更具体地谷氨酸棒杆菌，石南棒杆菌、钝齿棒杆菌、停滞短杆菌、产氨棒杆菌、或沙漠棒杆菌、甚至更具体地谷氨酸棒杆菌，但不限于此。

“属于埃希氏菌属的微生物”可以包括属于大肠埃希氏菌属的所有微生物。具体地，微生物可以是大肠埃希氏菌，但不限于此。

本公开的微生物可以是包括本公开的硫代硫酸盐还原酶，并使用硫代硫酸盐作为硫源的任何微生物。

本公开的生产方法可以包括在含有硫代硫酸盐的培养基中培养本公开的微生物。

如本文所用，术语“培养”是指使微生物在适当调节的环境中生长。本公开的培养过程可以根据本领域已知的适当培养基和培养条件进行。培养过程可以根据待选择的菌株由本领域技术人员容易地调节以使用。微生物的培养可以在本领域已知的分批过程、连续过程、和补料分批过程等中进行，但不限于此。

这里所用的术语“培养基”是指其中将培养微生物所需的营养物质作为主要成分混合在一起，并供给生存和生长所必需的营养物质和生长因子以及水的物质。具体地，尽管只要该培养基通常用于培养微生物，则用于培养本公开的微生物的培养基和其他培养条件就没有特别限制，但本公开的微生物可以在含有适当的碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素的普通培养基中在好氧条件下，同时调节温度、pH等来进行培养。

在本公开中，碳源可以包括碳水化合物，如葡萄糖、甘蔗糖、乳糖、果糖、蔗糖和麦芽糖；糖醇类，如甘露醇和山梨醇；有机酸，如丙酮酸、乳酸、和柠檬酸；和氨基酸，如谷氨酸、甲硫氨酸、和赖氨酸。另外，可以使用天然有机营养物，如淀粉水解物、糖蜜、赤糖糊、米糠、木薯、甘蔗渣、玉米浆等)，且具体地，可以使用碳水化合物，如葡萄糖和灭菌预处理的糖蜜(即，转化为还原糖的糖蜜)，且可以不受限制地使用适量的任何其它碳源。这些碳源可以单独使用或以其至少两种的组合使用，但不限于此。

氮源可包括无机氮源，如氨、硫酸铵、氯化铵、醋酸铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵；和有机氮源，如氨基酸，例如(谷氨酸、甲硫氨酸和谷氨酰胺)、蛋白胨、NZ-胺、肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼或其降解产物、和脱脂豆饼或其降解产物。这些氮源可以单独使用，或者其至少两种组合使用，但不限于此。

磷源可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或与之对应的含钠盐。作为无机化合物，可以使用氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等。此外，可以进一步包括氨基酸、维生素和/或适当的前体。这些组分和前体可以分批或连续的方法添加到培养基中，而不限于此。

此外，在微生物的培养过程期间，可以以适当的方式向培养基添加化合物(如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸、硫酸)来调节培养基的pH。此外，在培养期间，可以添加消泡剂(如脂肪酸聚乙二醇酯)，以防止泡沫的生成。另外，为了维持培养基的好氧状态，可以向培养基中注入氧气或含氧气体，或者为了维持培养基的厌氧或微好氧状态，可以在不向其注入任何其他气体或向培养基中注入氮气、氢气或二氧化碳气体，但实施方式不限于此。

培养基的温度可维持在25℃至40℃下，更具体地在30℃至37℃下，但不限于此。可以继续培养直到获得期望量的产物，例如，0.5小时至60小时，但不限于此。

本公开的“硫源”可与“供应硫的源”互换使用，并指可用于生产含硫氨基酸的含硫物质。

在微生物培养中，硫源可能是确定微生物中代谢途径的重要因素。然而，涉及各种硫源转运的因素和参与其降解的因素尚未被准确揭示。例如，尽管已知野生型的谷氨酸棒杆菌使用各种硫源，但已知SsuD蛋白不参与硫酸盐(sulfate)或亚硫酸盐(sulfite)的转运，而只参与脂肪磺酸盐(aliphatic sulfonate)的转运(D.J.Koch,C.Ruckert,D.A.Rey,A.Mix,A.Puhler,J.Kalinowski.2005.Role of the ssu and seu Genes ofCorynebacterium glutamicumATCC 13032 in Utilization of Sulfonates andSulfonate Esters as Sulfur Sources.AEM.71.10.6104–6114.2005)。也就是说，将硫源转运到细胞中的蛋白质具有底物特异性。另外，在硫源被转运到细胞中后，根据硫源的结构和官能团，降解硫源的酶可能不同，使用硫源的代谢途径也可能不同。例如，当使用硫酸盐作为硫源时，已知CysZ转运硫酸盐，并且CysDN、CysH和CysI参与其中，直到产生硫化物(Bolten,Christoph J.,Hartwig Schroder,Jeroen Dickschat,and ChristophWittmann.Towards Methionine Overproduction in Corynebacterium glutamicumMethanethiol and Dimethyl disulfide as Reduced SulfurSources.J.Microbiol.Biotechnol.(2010),20(8),1196–1203)，然而，在使用硫代硫酸盐作为含硫氨基酸生产的硫源时，用于转运和降解硫代硫酸盐的因素尚未明确揭示。

硫源可能是硫代硫酸盐。具体地，在本公开中，硫源可以包括硫代硫酸盐(如硫代硫酸铵或硫代硫酸钠)或硫代硫酸盐与有机或无机含硫化合物(如亚硫酸盐、还原原料(如H₂S)、硫化物、硫化物的衍生物、甲硫醇、硫代乙醇酸盐硫氰酸盐和硫脲)的混合物。可替代地，硫源可以不包括硫代硫酸盐以外的任何物质。然而，实施方式不限于此。

生产含硫氨基酸或含硫氨基酸衍生物的方法可以包括从微生物或培养基中回收含硫氨基酸或含硫氨基酸衍生物。

可以通过根据本公开的培养方法，使用本领域已知的适当方法(如分批、连续或补料分批方法)收集期望的含硫氨基酸或含硫氨基酸衍生物，来进行回收步骤。例如，可以使用离心、过滤、用蛋白质沉淀剂处理(盐析)、萃取、超声破碎、超滤、透析、各种色谱方法(如分子筛色谱(凝胶渗透)、吸附色谱、离子交换色谱和亲和色谱)、高效液相色谱(HPLC)及其任何组合，但不限于此。

回收步骤可进一步包括纯化过程。纯化过程可以使用本领域已知的适当方法进行。

本公开的另一方面提供了用于生产含硫氨基酸或含硫氨基酸衍生物的组合物，其中组合物包括：与内在活性相比由ssuD基因编码的蛋白质活性增强的微生物或其培养物；以及硫代硫酸盐。

由ssuD基因编码的蛋白质、微生物、硫代硫酸盐和含硫氨基酸如上文所述。

该培养基可通过在培养基中培养本公开的微生物来制备。

根据本公开的用于生产含硫氨基酸或含硫氨基酸衍生物的组合物可以进一步包括能够帮助生产含硫氨基酸或含硫氨基酸衍生物的任何组分，并且该组分可以适当地选自本领域已知的那些组分。

本公开的另一个方面提供了由ssuD基因编码的蛋白质作为硫代硫酸盐还原酶的用途。

本发明的另一个方面提供了微生物用于生产含硫氨基酸或含硫氨基酸衍生物的用途，该微生物包括与未修饰的微生物相比由ssuD基因编码的蛋白质的活性增加的基因修饰。

由ssuD基因编码的蛋白质、微生物、培养物、硫代硫酸盐和含硫氨基酸如上文所述。

实施例

以下，将参考以下实施例和实验实施例更详细地描述本公开。然而，以下实施例和实验实施例仅仅是为了举例说明本公开而呈现的，并且本公开的范围不限于此。

实施例1：用于mcbR基因缺失的重组载体的制备

首先，为了制备生产甲硫氨酸(作为代表性含硫氨基酸)的菌株，使用谷氨酸棒杆菌ATCC 13032菌株制备了用于失活已知的编码甲硫氨酸和半胱氨酸转录调控蛋白的mcbR基因的载体(J.Biotechnol.103:51–65,2003)。

具体地，为了从谷氨酸棒杆菌ATCC 13032菌株的染色体缺失mcbR基因，按照以下方法制备了重组质粒载体。

基于美国国立卫生研究院(NIH)GenBank中保存的核苷酸序列，获得了谷氨酸棒杆菌的mcbR基因及其侧翼序列(SEQ ID NO:1)。

使用谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的引物，在以下条件下进行了PCR：在95℃下变性5分钟；30个循环(在95℃下变性30秒，在53℃下退火30秒，和在72℃下聚合30秒)；以及在72℃下聚合7分钟。结果，分别获得了700bp的DNA片段。

用用于染色体插入的限制性内切酶SmaI处理不能在谷氨酸棒杆菌中复制的pDZ载体(美国专利号：US 9109242 B2)和扩增的mcbR基因片段，然后等温装配克隆(isothermalassembly cloing)。用该载体转化了大肠埃希氏菌DH5α，并将其平皿接种在含25mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。通过PCR选择了用载体转化的菌落，载体中插入有目的基因缺失的片段，以及然后通过质粒提取法获得了质粒，并命名为pDZ-ΔmcbR。

实施例2：mcbR基因缺失菌株的制备和培养

用上述实施例1中制备的pDZ-ΔmcbR载体，通过同源染色体重组通过电穿孔转化了ATCC 13032菌株(Van der Rest et al.,Appl Microbiol Biotechnol 52:541–545,1999)。随后，在含蔗糖的固体培养基中进行了第二次重组。第二次重组完成后，使用SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:7通过进行PCR确认了具有mcbR基因缺失的转化的谷氨酸棒杆菌菌株，并将重组的菌株命名为CM02-0618。

CM02-0618菌株于2019年1月4日被保藏在布达佩斯条约下的韩国微生物保藏中心，保藏号为KCCM12425P。

为了分析制备的CM02-0618菌株的生产L-甲硫氨酸的能力，对该菌株和亲本菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032菌株按以下方式进行了培养。

谷氨酸棒杆菌ATCC 13032和谷氨酸棒杆菌CM02-0618被接种到含有25mL种子培养基的250mL的角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养20小时。然后，将1mL的其培养液接种到含有24mL生产培养基的250mL的角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养48小时。种子培养基和生产培养基的组成如下。在生产培养基中，作为硫源使用了硫代硫酸盐的一种类型，(NH₄)₂S₂O₃。

<种子培养基(pH7.0)>

20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH₂PO₄、8g K₂HPO₄、0.5gMgSO₄·7H₂O、100μg生物素、1000μg盐酸硫胺素、2000μg泛酸钙、和2000μg烟酰胺(基于1L蒸馏水)

<生产培养基(pH 8.0)>

50g葡萄糖、12g(NH₄)₂S₂O₃、5g酵母抽提物、1g KH₂PO₄、1.2g MgSO₄·7H₂O、100μg生物素、1000μg盐酸硫胺素、2000μg泛酸钙、3000μg烟酰胺、30g CaCO₃和1μg氰钴胺素(维生素B12)(基于1L蒸馏水)。

按上述培养方法对菌株进行培养，并对培养液中含有的L-甲硫氨酸浓度进行分析，且示于下表1中。

表1

野生型和mcbR基因缺失的菌株的L-甲硫氨酸生产能力的确认

菌株	L-甲硫氨酸(g/L)
		谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(野生型)	0.00
CM02-0618	0.04

结果，确认了mcbR基因缺失菌株的L-甲硫氨酸生产能力与对照菌株的L-甲硫氨酸生产能力相比增强了0.04g/L。此外，确认了即使当硫代硫酸盐被作为单一硫源时，也生产了甲硫氨酸。在此基础上，推测参与利用硫代硫酸盐的蛋白质可能存在于属于棒杆菌属的微生物中。

实施例3：通过转录分析选择参与利用硫代硫酸盐的基因

没有已知的棒杆菌属的菌株的硫代硫酸盐特异性蛋白。然而，如实施例2中所确认的，在使用了硫代硫酸盐作为单一硫源时，CM02-0618菌株生产了甲硫氨酸，且因此进行实验以选择参与利用硫代硫酸盐的蛋白质。

具体地，通过仅改变硫源(硫酸铵和硫代硫酸铵)培养实施例2中制备的CM02-0618菌株后，进行了转录组分析(RNA水平的分析)。使用与实施例2的培养方法相同的培养方法。

表2

在使用硫酸铵和硫代硫酸铵的条件下CM02-0618菌株的主要基因转录物的实验结果

	AMS(信号)	ATS(信号)	Log2比例(ATS/AMS)
				SsuD(Ncgl1173)	3691	55539	2.71

基于实验的结果，确认了编码SsuD(Ncgl1173)——其为通常所知的磺酸盐单氧酶——的基因的RNA水平显著增加了。

因此，确认了该SsuD蛋白不与硫酸盐反应，而是特异性地与硫代硫酸盐反应，且因此可以推测了蛋白质参与利用硫代硫酸盐。

实施例4：ssuD基因缺失的菌株的效果的确认

为了确认实施例3中选择作为与硫代硫酸盐特异性反应的蛋白质的SsuD蛋白的失活效果，制备载体以缺失SsuD基因。

实施例4-1：用于ssuD基因缺失的载体的制备

为了从棒杆菌ATCC 13032菌株的染色体缺失ssuD基因，按以下方法制备了重组质粒载体。

基于美国国立卫生研究院(NIH)GenBank中保存的核苷酸序列，获得了谷氨酸棒杆菌的ssuD基因及侧翼序列(SEQ ID NO:8)。

为了缺失ssuD基因的目的，使用谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA作为模板，以及SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物，进行了PCR。在以下条件下进行了PCR：在95℃下变性5分钟；30个循环(在95℃下变性30秒，在53℃下退火30秒，和在72℃下聚合30秒)；以及在72℃下聚合7分钟。结果，分别获得了700bp的DNA片段。

用用于染色体插入的限制性内切酶SmaI处理了不能在谷氨酸棒杆菌中复制的pDZ载体和扩增的ssuD基因片段，然后等温装配克隆。用该载体转化了大肠埃希氏菌DH5α，并将其平皿接种在含25mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。通过PCR选择了用载体转化的菌落，载体中插入有目的基因缺失的片段，以及然后通过质粒提取法获得了质粒，并将其命名为pDZ-ΔSsuD。

实施例4-2:ssuD基因缺失的菌株的制备和培养

用上述实施例4-1中制备的pDZ-ΔSsuD载体，通过同源染色体重组通过电穿孔转化了13032/ΔmcbR菌株(Van der Rest et al.,Appl Microbiol Biotechnol 52:541–545,1999)。随后，在含蔗糖的固体培养基中进行了第二次重组。第二次重组完成后，使用SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14通过进行PCR确认了具有ssuD基因缺失的转化的谷氨酸棒杆菌菌株，并将重组的菌株命名为谷氨酸棒杆菌CM02-0618/ΔSsuD。

实施例4-3：ssuD基因缺失的菌株的甲硫氨酸生产能力的分析

为了分析制备的CM02-0618/ΔSsuD菌株的生产L-甲硫氨酸的能力，对该菌株和亲本菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032菌株按以下方式进行了培养。

谷氨酸棒杆菌ATCC 13032和实施例2中制备的谷氨酸棒杆菌CM02-0618和CM02-0618/ΔSsuD被接种到含有25mL种子培养基的250mL的角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养20小时。然后，将1mL的其培养液接种到含有24mL生产培养基的250mL的角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养48小时。种子培养基和生产培养基的组成如下。

<种子培养基(pH7.0)>

<生产培养基(pH 8.0)>

50g葡萄糖、12g(NH₄)₂S₂O₃、5g酵母抽提物、1g KH₂PO₄、1.2g MgSO₄·7H₂O、100μg生物素、1000μg盐酸硫胺素、2000μg泛酸钙、3000μg烟酰胺、和30g CaCO₃(基于1L蒸馏水)。

按上述培养方法对菌株进行培养，并对培养液中含有的L-甲硫氨酸浓度进行分析，且示于下表3中。

表3

ssuD基因缺失的菌株的L-甲硫氨酸生产能力的确认

菌株	L-甲硫氨酸(g/L)
		CM02-0618	0.04
CM02-0618/ΔSsuD	0.02

结果，确认了ssuD基因缺失的菌株的L-甲硫氨酸生产能力与对照菌株的L-甲硫氨酸生产能力相比降低了约50％。在此基础上，确认了SsuD蛋白是参与利用硫代硫酸盐的蛋白质。

实施例5：ssuD基因表达增加的菌株的制备和培养

制备了载体以增强SsuD蛋白的活性，SsuD蛋白在实施例3中被选为与硫代硫酸盐特异性反应的蛋白质。

实施例5-1：用于增加ssuD基因表达的载体的制备

为了向棒杆菌ATCC 13032的染色体中附加插入ssuD基因，按以下方法制备了质粒载体。

首先，制备了用于缺失Ncgl1464(转座酶)的载体，以插入ssuD基因。

基于美国国立卫生研究院(NIH)GenBank中保存的核苷酸序列，获得了谷氨酸棒杆菌的Ncgl1464基因及侧翼序列(SEQ ID NO:15)。为了缺失Ncgl1464基因，使用谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19的引物进行了PCR。在以下条件下进行了PCR：在95℃下变性5分钟；30个循环(在95℃下变性30秒，在53℃下退火30秒，和在72℃下聚合30秒)；以及在72℃下聚合7分钟。结果，分别获得了DNA片段。

用用于染色体插入的限制性内切酶SmaI处理了不能在谷氨酸棒杆菌中复制的pDZ载体和扩增的Ncgl1464基因片段，然后等温装配克隆。用该载体转化了大肠埃希氏菌DH5α，并将其平皿接种在含25mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。通过PCR选择了用载体转化的菌落，载体中插入有目的基因缺失的片段，以及然后通过质粒提取法获得了质粒，并将其命名为pDZ-ΔNcgl1464。

随后，为了获得ssuD基因片段的目的，使用谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21进行了PCR。另外，使用PgapA启动子来增强ssuD基因的表达。为了获得它们，使用谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA作为模板，使用SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的引物进行了PCR。在以下条件下进行了PCR：在95℃下变性5分钟；30个循环(在95℃下变性30秒，在53℃下退火30秒，和在72℃下聚合30秒)；以及在72℃下聚合7分钟。结果获得了ssuD基因片段和gapA启动子片段。

用限制性内切酶ScaI处理在谷氨酸棒杆菌中不能复制的pDZ-ΔNcgl1464载体，然后与两条扩增的DNA片段一起进行IST反应。用该载体转化了大肠埃希氏菌DH5α，并将其平皿接种在含25mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。通过PCR选择了用载体转化的菌落，载体中插入有目的基因，以及然后通过质粒提取法获得了质粒，并将其命名为pDZ-ΔNcgl1464-PgapASsuD。

实施例5-2：ssuD基因表达增强的菌株的制备和培养

用上述实施例5-1中制备的pDZ-ΔNcgl1464和pDZ-ΔNcgl1464-PgapASsuD载体，通过同源染色体重组通过电穿孔转化了CM02-0618(Van der Rest et al.,ApplMicrobiol Biotechnol 52:541–545,1999)。随后，在含蔗糖的固体培养基中进行了第二次重组。第二次重组完成后，使用SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的引物通过进行PCR确认了具有Ncgl1464基因缺失的转化的谷氨酸棒杆菌菌株和具有Ncgl1464基因缺失和ssuD基因插入的谷氨酸棒杆菌菌株。具有Ncgl1464基因缺失的菌株被命名为CM02-0618/ΔNcgl1464，而具有Ncgl1464基因缺失和ssuD基因插入的菌株被命名为CM02-0736。

CM02-0736菌株于2019年5月2日被保藏在布达佩斯条约下的韩国微生物保藏中心，保藏号为KCCM12512P。

实施例5-3：ssuD基因表达增强的菌株的甲硫氨酸生产能力的分析

为分析所制备的CM02-0618/ΔNcgl1464和CM02-0736菌株的生产L-甲硫氨酸的能力，对菌株及其亲本CM02-0618菌株按以下方式进行了培养。

将CM02-0618、CM02-0618/ΔNcgl1464和CM02-0736菌株接种到含有25mL种子培养基的250mL的角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养20小时。然后，将1mL的其培养液接种到含有24mL生产培养基的250mL的角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养48小时。种子培养基和生产培养基的组成如下。

<种子培养基(pH7.0)>

<生产培养基(pH 8.0)>

按上述培养方法对菌株进行培养，并对培养液中含有的L-甲硫氨酸浓度进行分析，且示于下表4中。

表4

ssuD基因增强的菌株的甲硫氨酸生产能力的确认

菌株	L-甲硫氨酸(g/L)
		CM02-0618	0.04
CM02-0618/ΔNcgl1464	0.04
		CM02-0736	0.06

结果表明，ssuD基因表达增强的菌株的L-甲硫氨酸生产能力与对照菌株的L-甲硫氨酸生产能力相比提高了约50％。此外，如实施例4所确认的，SsuD蛋白参与利用硫代硫酸盐。

实施例6：硫代硫酸盐与其他磺酸盐的比较培养

SsuD蛋白被认为是参与磺酸盐的脱磺酸基(desulfonation)的蛋白质。磺酸盐具有R-SO₃结构，其中R是有机基团，且与硫代硫酸盐不同，硫代硫酸盐具有S-SO₃结构。

因此，经由使用磺酸盐的对比实验确认了硫代硫酸盐对甲硫氨酸生产的作用。

谷氨酸棒杆菌CM02-0618和CM02-0736菌株被接种到含有25mL种子培养基的250mL的角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养20小时。然后，将1mL的其培养液接种到含有24mL生产培养基的250mL的角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养48小时。种子培养基和生产培养基的组成如下。

<种子培养基(pH7.0)>

<生产培养基(pH 8.0)>

50g葡萄糖、12g(NH₄)₂S₂O₃或12g甲烷磺酸盐(methane sulfonate)或12g乙烷磺酸盐(ethane sulfonate)(取决于硫源)、5g酵母抽提物、1g KH₂PO₄、1.2g MgSO₄·7H₂O、100μg生物素、1000μg盐酸硫胺素、2000μg泛酸钙、3000μg烟酰胺、30g CaCO₃和1μg氰钴胺素(维生素B12)(基于1L蒸馏水)。

按上述培养方法对菌株进行培养，并对培养液中含有的L-甲硫氨酸浓度进行分析，且示于下表5中。

表5

作为硫源的硫代硫酸盐与各种磺酸盐之间的甲硫氨酸生产能力的比较

结果表明，在各菌株使用硫代硫酸盐作为硫源的情况下，甲硫氨酸的生产量与使用磺酸盐作为硫源的情况相比提高了上至600％。

在此基础上，确认了当硫代硫酸盐被用作硫源时，甲硫氨酸的生产量是最高的，并还确认了SsuD蛋白活性的增强涉及这种甲硫氨酸生产量的增加。

实施例7：在不缺失mcbR基因的情况下，具有metH和cysI基因的增强表达的甲硫氨酸生产菌株的制备

实施例7-1：用于增强metH和cysI基因的重组载体的制备

为了确认是否可以通过增强本公开的SsuD蛋白的活性并使用硫代硫酸盐作为硫源来生产各种含硫氨基酸，将上述实验应用于另一种甲硫氨酸生产菌株。首先，为了制备不缺失mcbR的甲硫氨酸生产菌株，在ATCC 13032菌株中制备了用于同时增强编码甲硫氨酸合成酶的metH基因(Ncgl1450)和编码亚硫酸盐还原酶的cysI基因(Ncgl2718)的载体。

具体地，制备了重组质粒载体，以按照以下方法将metH和cysI基因附加插入到谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体中。基于美国国立卫生研究院(NIH)GenBank中保存的核苷酸序列，获得了谷氨酸棒杆菌的metH基因及侧翼序列(SEQ ID NO:26)和cysI基因及侧翼序列(SEQ ID NO:27)。

首先，制备了用于缺失Ncgl1201(转座酶)的载体，以插入这些基因。基于美国国立卫生研究院(NIH)GenBank中保存的核苷酸序列，获得了谷氨酸棒杆菌的Ncgl1201基因及侧翼序列(SEQ ID NO:28)。为了缺失Ncgl1201基因，使用谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的引物进行了PCR。在以下条件下进行了PCR：在95℃下变性5分钟；30个循环(在95℃下变性30秒，在53℃下退火30秒，和在72℃下聚合30秒)；以及在72℃下聚合7分钟。结果，获得了DNA片段。用用于染色体插入的限制性内切酶Xbal处理了不能在谷氨酸棒杆菌中复制的pDZ载体和扩增的Ncgl1201基因片段，然后等温装配克隆。用该载体转化了大肠埃希氏菌DH5α，并将其平皿接种在含25mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。通过PCR选择了用载体转化的菌落，载体中插入有目的基因缺失的片段，以及然后通过质粒提取法获得了质粒，并将其命名为pDZ-ΔNcgl1021。

随后，出于获得metH和cysI基因的目的，使用谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的引物进行了PCR。另外，Pcj7启动子用于增强metH基因的表达，以及Pspl1启动子用于增强cysI基因的表达。为获得它们，使用谷氨酸棒杆菌ATCC 6872的染色体DNA作为模板，并使用用于Pcj7启动子的SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的引物进行了PCR，并且使用已知的spl1-GFP载体(US10584338 B2)的DNA作为模板，并使用用于Pspl1启动子的SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40的引物进行了PCR。在以下条件下进行了PCR：在95℃下变性5分钟；30个循环(在95℃下变性30秒，在53℃下退火30秒，和在72℃下聚合30秒)；以及在72℃下聚合7分钟。结果，获得了metH和cysI基因的DNA片段、Pcj7启动子(US 7662943 B2)和Pspl1启动子(US10584338B2)。

用限制性内切酶ScaI处理在谷氨酸棒杆菌中不能复制的pDZ-ΔNcgl1021载体，以及用限制性内切酶ScaI处理扩增的四条DNA片段，然后进行IST反应。用该载体转化了大肠埃希氏菌DH5α，并将其平皿接种在含25mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。通过PCR选择了用载体转化的菌落，载体中插入有目的基因，以及然后通过质粒提取法获得了质粒，并将其命名为pDZ-ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI。

实施例7-2：L-甲硫氨酸生产菌株的开发和使用其确认L-甲硫氨酸的生产

用上述实施例7-1中制备的pDZ-ΔNcgl1021和pDZ-ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI载体，通过同源染色体重组通过电穿孔转化了ATCC 13032菌株(Van der Restet al.,Appl Microbiol Biotechnol 52:541–545,1999)。随后，在含蔗糖的固体培养基中进行第二次重组。在第二次重组完成后，使用SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42确认了Pcj7-metH-Pspl1cysI基因向转化的谷氨酸棒杆菌菌株中的插入。将重组的菌株命名为谷氨酸棒杆菌13032/ΔNcgl1021(用pDZ-ΔNcgl1021转化的菌株)和CM02-0753(用pDZ-ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysIn转化的菌株)。

为分析制备的13032/ΔNcgl1021和CM02-0753菌株的生产L-甲硫氨酸的能力，对菌株及亲本谷氨酸棒杆菌ATCC 13032菌株按以下方式进行了培养。

将谷氨酸棒杆菌ATCC 13032和本公开的菌株(即，谷氨酸棒杆菌13032/ΔNcgl1021和CM02-0753)接种到含有25mL种子培养基的250mL的角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养20小时。然后，将1mL的其培养液接种到含有24mL生产培养基的250mL的角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养48小时。种子培养基和生产培养基的组成如下。

<种子培养基(pH7.0)>

<生产培养基(pH 8.0)>

按上述培养方法对菌株进行培养，并对培养液中含有的L-甲硫氨酸浓度进行分析，且示于下表6中。

表6

含有mcbR基因的菌株的L-甲硫氨酸生产能力的确认

菌株	L-甲硫氨酸(g/L)
		谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(野生型)	0
13032/ΔNcgl1021	0
		CM02-0753	0.03

结果，确认了其中存在mcbR基因且过表达metH和cysI基因的菌株的L-甲硫氨酸生产能力与对照菌株的L-甲硫氨酸生产能力相比增强了。在此基础上，确认了其中在不缺失mcbR基因的情况下，过表达metH和cysI基因的菌株具有甲硫氨酸生产能力，并将该菌株用于以下实验。

实施例8：具有增强SsuD活性并包括mcbR的L-甲硫氨酸生产菌株的开发以及L-甲硫氨酸生产能力的确认

使用在实施例7中制备的甲硫氨酸生产菌株制备了SsuD蛋白的活性增强的菌株，以及然后确认其L-甲硫氨酸生产能力。

实施例8-1：SsuD活性增强的菌株的制备

具体地，用实施例5中制备的pDZ-ΔNcgl464-PgapASsuD载体，通过同源染色体重组通过电穿孔转化了实施例7的CM02-0753菌株(Van der Rest et al.,Appl MicrobiolBiotechnol 52:541–545,1999)。随后，在含蔗糖的固体培养基中进行了第二次重组。

第二次重组完成后，使用SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24确认了PgapA-SsuD基因向转化的谷氨酰杆菌的Ncgl1464位点中的插入。所制备的重组菌株命名为谷氨酸棒杆菌CM02-0756。

CM02-0756于2019年5月2日被保藏在布达佩斯条约下的韩国微生物保藏中心，保藏号为KCCM12513P。

实施例8-2：所制备菌株的甲硫氨酸生产能力的确认

为了分析实施例7的制备的CM02-0753菌株和实施例8-1中制备的CM02-0756菌株的L-甲硫氨酸生产能力，按以下方式培养了菌株。

将谷氨酸棒杆菌CM02-0753和CM02-0756菌株接种到含有25mL种子培养基的250mL的角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养20小时。然后，将1mL的其培养液接种到含有24mL生产培养基的250mL的角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养48小时。种子培养基和生产培养基的组成如下。

<种子培养基(pH7.0)>

<生产培养基(pH 8.0)>

按上述培养方法对菌株进行培养，并对培养液中含有的L-甲硫氨酸浓度进行分析，且示于下表7中。

表7

当ssuD被过表达时，含有mcbR基因的菌株的L-甲硫氨酸生产能力的确认

菌株	L-甲硫氨酸(g/L)
		CM02-0753	0.03
CM02-0756	0.05

结果，确认了通过增强SsuD蛋白的活性并使用硫代硫酸盐作为硫源，使包括mcbR的甲硫氨酸生产菌株中的L-甲硫氨酸的产率增加。

这些结果表明，通过增强SsuD蛋白的活性，可以使用硫代硫酸盐作为硫源，生产含硫氨基酸或含硫氨基酸衍生物，SsuD蛋白在本公开中被新确认为参与利用硫代硫酸盐的蛋白质。

以上对本公开的描述是出于示例的目的而提供的，且本领域技术人员将理解，可以在不改变本公开的技术概念和必要特征的情况下进行各种改变和修改。因此，很清楚，上述实施方式在所有方面是示例性的，并且不限制本公开。因此，本公开的范围不是由详细描述限定的，而是由权利要求及其等同物限定的，并且在权利要求及其等同物范围内的所有变化都应被解释为包括在本公开中。

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<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 生产含硫氨基酸或其衍生物的方法

<130> OPA20066

<150> KR 10-2019-0077999

<151> 2020-06-28

<160> 43

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 2642

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 1

ctcccgcgca ctgctgcaat ccgcaccgtg cccaatgatg gtggttcgcc cacctgagaa 60

gattaagaag tagtttcttt taagtttcga tgccccggtt tcctgatttt gtgcagggag 120

gccggggcat tggtgtttgc gggttagttc gggccattcg aaagggagaa accaagggca 180

gccagacaga cgtgccaaga atctggattt ccgccaggtt ttggcacgcc cgtctggttt 240

aggcaatgag ataccgaaca cacgtgccaa aagttcggct ttttcgccga tcttgtcacg 300

cctgcctggt ttgtcttgta aagagtgatt tcatggccga gactcctaaa agtttgacct 360

cacaggattg cttctaaggg cctctccaat ctccactgag gtacttaatc cttccgggga 420

attcgggcgc ttaaatcgag aaattaggcc atcacctttt aataacaata caatgaataa 480

ttggaatagg tcgacacctt tggagcggag ccggttaaaa ttggcagcat tcaccgaaag 540

aaaaggagaa ccacatgctt gccctaggtt ggattacatg gatcattatt ggtggtctag 600

ctggttggat tgcctccaag attaaaggca ctgatgctca gcaaggaatt ttgctgaaca 660

tagtcgtcgg tattatcggt ggtttgttag gcggctggct gcttggaatc ttcggagtgg 720

atgttgccgg tggcggcttg atcttcagct tcatcacatg tctgattggt gctgtcattt 780

tgctgacgat cgtgcagttc ttcactcgga agaagtaatc tgctttaaat ccgtagggcc 840

tgttgatatt tcgatatcaa caggcctttt ggtcattttg gggtggaaaa agcgctagac 900

ttgcctgtgg attaaaacta tacgaaccgg tttgtctata ttggtgttag acagttcgtc 960

gtatcttgaa acagaccaac ccgaaaggac gtggccgaac gtggctgcta gcgcttcagg 1020

caagagtaaa acaagtgccg gggcaaaccg tcgtcgcaat cgaccaagcc cccgacagcg 1080

tctcctcgat agcgcaacca accttttcac cacagaaggt attcgcgtca tcggtattga 1140

tcgtatcctc cgtgaagctg acgtggcgaa ggcgagcctc tattcccttt tcggatcgaa 1200

ggacgccttg gttattgcat acctggagaa cctcgatcag ctgtggcgtg aagcgtggcg 1260

tgagcgcacc gtcggtatga aggatccgga agataaaatc atcgcgttct ttgatcagtg 1320

cattgaggaa gaaccagaaa aagatttccg cggctcgcac tttcagaatg cggctagtga 1380

gtaccctcgc cccgaaactg atagcgaaaa gggcattgtt gcagcagtgt tagagcaccg 1440

cgagtggtgt cataagactc tgactgattt gctcactgag aagaacggct acccaggcac 1500

cacccaggcg aatcagctgt tggtgttcct tgatggtgga cttgctggat ctcgattggt 1560

ccacaacatc agtcctcttg agacggctcg cgatttggct cggcagttgt tgtcggctcc 1620

acctgcggac tactcaattt agtttcttca ttttccgaag gggtatcttc gttgggggag 1680

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atgcggagaa gtgcccagta aagaccaagg acaatcggta tctggatcag cccaggcaca 2520

caacctgcca gcgggttaat gccgtattcc ttattcaaat cattctggcg cttctgcaac 2580

tcccgaatgg acgcttcatc gtactttccc ttgtattctt cccggagcgc agcgcggtga 2640

gg 2642

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

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<212> DNA

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ctgctgaaag tggcaggaag ttcattttcg gttatgtcaa tgctgatacc gatgctgatg 180

tggcccaggt gtttggggtg cagggcttgc cgtcggtgat tgctgtggca gcgggacgcc 240

ctctggctga tttccagggc ggacagccag cggatgcact aaagcagtgg actgatcagg 300

tggttcaggc tgtgggtgga cagctggaag gactgccaga ggaggccaca gacggcgaac 360

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tcaggtggcg cagaaaatca actggatcaa cgagctagca gcacagcgcg gccgggaact 1680

gcgccatgga atccgcttcc atgtgatcac ccgcgatacg tctgaagaag catgggtggt 1740

ggcagagaag ttgattagcg gggtcactcc agaacaggtc gctaaggctc aagccgggtt 1800

tgcaacgtct aagtcggagg ggcagcgccg gatggctgag ctgcacagca agggtcgtgc 1860

ctttactagt ggctcaactg ctcgtgatct ggaggtgtat cccaatgtgt gggcaggcgt 1920

cggtttgctt cgcggaggtg caggaacagc ccttgtgggc tcgcatgaag aggtcgccga 1980

tcgcatcgaa gaatacgcag cactcggctt ggatcagttt gtactgtcgg gttatccaaa 2040

cttggaggag gccttccact tcggtgaggg tgtgattccg gagctgctgc gccgcggtgt 2100

ggatatcaaa aatcaagaat cacgagtttt ggaacctgtt gggtaaacgg gaagaacgag 2160

acgtcgataa gcaaatttct taaggaacct gacatgacta caaccttgac tcgccccaaa 2220

atcgcgctgc ccgcgcgcat ctattcaccg cttgcggtgc ttgttttctg gcagctcggc 2280

tcgagcctgg gcgccatccc ggagcggatt ctgccggcac caaccacgat cttggccgcc 2340

agctgggagg tcgccacaaa tggcacgctt ctcgacgccc tcctcgtctc aagccaacgc 2400

gtccttctag gcttcgccct cggtgctgtc ctaggcattt ccctaggtgt attgacaggc 2460

atgtccagat ttgcagacac cgccgttgat ccgctcattc aagctgcccg cgcgctgcct 2520

cacctgggtc ttgtgccgct gtttatcatc tggttcggta tcggtgagct gccgaaagta 2580

ctgattatta gcctcggcgt gctgtatccg ctgtacctca acaccgccag cgggttcagg 2640

caaattgatc caaagcttct ggaagccggc cacgtgatgg gcttcggatt tttccagagg 2700

ttgcggacca tcatcattcc ttctgccgcg ccgcaacttt ttgtcggcct gcgccaagca 2760

agtgcggccg cctggctctc actgatcgtg gcggaacagg tcaacgcccg cgaaggactc 2820

ggcttcctca tcaacaatgc gcgcgatttt taccgcaccg acctcgttat tttcggcctc 2880

attgtctacg ccagcctcgg tctgctgtct gaagcgctga tcagagcttg ggaacgtcac 2940

accttccgct accgaaacgc ataagaaagt tgctcgccat gactgccaca ttgtcactca 3000

aacccgcagc cactgtccgt ggattgcgca aatcatacgg aactaaagaa gtcctccaag 3060

gaatcgacct caccatcaac tgcggcgaag taaccgcgct gatcggacgc tcaggttcag 3120

gaaaatccac catcctgcgc gtgttg 3146

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

tcgagctcgg taccctggtt caggctgtgg gtgga 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

tcttcccgta gtactggcac atacttaaac agacc 35

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

gtatgtgcca gtactacggg aagaacgaga cgtcg 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

ctctagagga tcccctcgcg cgcattgttg atgag 35

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

ccaggtgttt ggggtgcagg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

aatccacgga cagtggctgc 20

<210> 15

<211> 3161

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 15

agacgattct ggaaggccac tttcttttga tcctggcggc gatttttcgg tgcttggtag 60

cggaatgtca atcgagacca agcgtccccc ggcgggtcga ttttttggtc tcgaatgaca 120

gtttcgctct ctggaaactc tcagtgtcag gtcagtggtg aaccaccatc cttagcaagg 180

agttcatcat gtccatcccc ttctcagtcc ttcaggacta cctggatctg atcagtcccg 240

aagccttacc ccagatccca cagcccccgg cccctgcccc cacagcaccc cagctaccac 300

cggcgccgga cccacacagc atcgagtggc cgatcttccc accagatcga atctccgcca 360

acgggcgacg ctactacgag ccacaaacac gactcgagtt catgcggatc tacaccaccc 420

tgccgcacgg ctaccgccag cccttcctta aagccaacaa catcggccac tgcaccgttc 480

gaacctggct agcagcaata agcaccttca gccgacttcc ccatgctttt gatgatgccc 540

accgcttcgg gatcgaacgc accaccccag tcgacgatgt caccacacta acggctgatg 600

acaaacgtga cctggtcata ggatacttag ctcaaccaca cggtcagggc cagcaattcc 660

tcacgtttta ccaactccgt aagcacacca tcatggcctg gtgcgccgct atgaccgacg 720

gggacttaga cgctgatatc tcaccccgcc agatcgggtt gatgaccacc cgaaccgtgg 780

tcgaaatcgt tcgactacgc cacatgattg cccaacaact agaaagagcc acgatcatgg 840

aaaacgagta cctcaaagaa atcgcagcgc tgaagaaaga actcgcgcac tacaagcaaa 900

aagaccatca gaatcaaatg gtgatcgata tcttgggaaa agctattggg accaggccca 960

atcctggcga gggcttagac gaggaggacg ccacctaaac gtggatgagc aacgcgcctt 1020

tgatcaagga ctcaaggaag aaaacacctt gatcacagat ctcaccacct gtgccaggct 1080

gagccataac aaggcattac ggctgatcaa gctgtcgaaa tcaacggcgt attaccgcaa 1140

caagccgcgt ccccgtcctg caccgaaacc tgtcctgcag gccgtgccag caccaacagc 1200

acctggtgtg gaacccacac cagagccttg gcaggggaag gagccagcag tgtcgtcggt 1260

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acaactgagc gttagtgggg tgtttaacat gttgtttaac aaaggcatct accgcgcatc 1380

actacgtaca tggtggcgtg ttgccaagca gcacaagttg ttacacaaag accgagtcag 1440

tgccctgtcc ccggggaaac gatcaccaac gccacgggtt aagccgaggt tggaagcaac 1500

acagcctggt caggtggtgt gttgggatgt gacgttcttg ccgtcgctgg tacgtggtaa 1560

gacctatgcg ttgcatctgg cgattgattt gttttcccgc aagattgttg gggcgaaggt 1620

cgcgccgacg gaaaatacct ccaccgcggt ggagttgtta acgcaggtgt tagcggataa 1680

tccgggtgtg gtgacggtgc attcggataa tgggtcggcg atgacatcga cgagggtgcg 1740

gcggttgtta gcggatcatg gtgtggcgtt gtcgttgatt cggccgcggg tgagtgatga 1800

taatgcgttt gtggagtcgg tgtttcatac gttgaagtat cggccgtttt atccgaaggt 1860

gtttgcatcg atggatcagg cccgggtgtg ggtggaggag tttgtggtgt attacaacac 1920

ggttcatccg cattctggtg tggctgggca tactccgcag tcggtgtttg atggtagttg 1980

gagggcggct cataggttgc gtgtgcaggc gttggatgcc cattaccggc agttcccgca 2040

gcggtatgtg gggcggccgg tggttcagga agttgctggt gtggtgcgtc ttaatggtgc 2100

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agttagcatg tgttcttatc gcccccctgg ttcacaaacc cctggcagcg agcggaaaag 2220

tgcattttta ggccaagggc cctcggatct tcgagcgctt tggtctcttt tgcacgtctg 2280

accgaaccag atcacctaga aacgccaaag gccccgcaag tatcaaacct gcggggcctt 2340

tgaggtacct gtttcctatt ttgttgactt aggaagctgc gcacggcgga taaccaaacc 2400

gcacagcaag gcagccactc cccacgcggt gagccagaac tgctccacga cataaacctg 2460

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ctgtgtcttt gagcttggct cgtacttgct ggtggtagcg aatgcgccga gaatgatcga 2580

ggcaacgagg atcagaagga atcctggagt gatcacaaat gggctcagca tgccggcggt 2640

aaacagctca attgctgcaa acaccaacaa aaccagacct aaggctacga aagctccacc 2700

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ttttaatgat cttcccgatg ctgaactcat aatgtgacat accctactag ttctcgtacc 2820

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aacggtgcgg tgcgtggcca gctggaggtt gcgctccgta gaagccacgc ttgccggaat 3000

cacccttgag ggaaactacg ccttcgatgc cgccgagggt ttcatcgcca gcaccggtgg 3060

ggatctccgt gacagttgtg gggatgttaa acactgccca gtgccagaaa ccagcgccgg 3120

ttggggcatc tgggtcgagg caggtgatcg cgagggattt g 3161

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

tcgagctcgg tacccttttt tggtctcgaa tgaca 35

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

catgctaaca gtactgttta ggtggcgtcc tcctc 35

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

gtatgtgcca gtactacggg aagaacgaga cgtcg 35

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

ctctagagga tcccctcgcg cgcattgttg atgag 35

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

tagaggagac acaacatgac attaactttc cattg 35

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

acacatgcta acagtttacc caacaggttc caaaa 35

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

cgccacctaa acagtgaagc ctaaaaacga ccgag 35

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

gaaagttaat gtcatgttgt gtctcctcta aagat 35

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

ctggcggcga tttttcggtg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

cgcgatcacc tgcctcgacc 20

<210> 26

<211> 5666

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 26

tgtcatgctt ccggaggtgc gcagggctcg agactccgga aagctatttg ccactccgat 60

gtttgggtca ctcgacgaga tacgtgctga tcacctaatt tggtgcacag ggtttcggcc 120

ggcgattagg ccagttcgtc aacttctcaa acacggacaa ccaaaggttc ctggtcttta 180

tttagtaggc tacggagatt ggacgggacc tgggtctgcg actatcacag gggtcgggct 240

ttatgccaag cgagcagcca aagagattgc cgcgtcagtc ggcaaagtcg ttaaatagtt 300

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atgcgttctt tccagaatgc tttcatgaca gggatgctgt cttgatcagg caggcgtctg 420

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gcagattcac cgcgcctact ttgaggcggg agctgacttg gttgagacca atacttttgg 1260

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gcaggcgctg gctggattcg tctccgaata tggcctgtcc atggtgggtg gttgttgtgg 1920

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ccttgatgag cgcgccttgt tcatggggca gtggggtctg aaatccaccc gcggcaacga 3960

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ccagcccccg acatgtacct cgaagcagca cgacgtgtgg gctttgaccc atcagagtgc 5220

ctcgtgttcg aagattccta caacggcatg ctgggcgctg ttactgcagg ttgccgcgtc 5280

attggtctgc acccagaaga agtccaagcg ccagaaggtg tagtgccttt gcgttccctc 5340

cacggtaaaa actctttcga aggtgtcacc gctgagatgg tcactgcctg gtaccaccag 5400

atcgagccgg caggtgtcgc aaaataaaac caggtggggg agtgaaatta ttcgactaat 5460

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ttgactcgct gtacgaagaa cttcttaacc gtgctcagac ccgccctgaa gggtctggaa 5580

ccgtggccgc cttggataaa ggcatccatc atctaggtaa gaaggtcatc gaagaagccg 5640

gagaggtctg gattgcagcc gagtat 5666

<210> 27

<211> 3613

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 27

tcctgtgggg tgaacttgac ctgtgctggg ccacgacgtc cgaaaacgtg cacttcagtg 60

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tcgcctgtct tagccaggat gcgggctacg tcgaggccga cgttaccaac gccgataaca 180

gcgacggact gtgcagacag atcccaggag cgctcgaagc gtgggttgcc gtcgtagaag 240

ccaacgaact cgccggcacc gaaggagcct tctgcttcaa ttccggggat gttgaggtcg 300

cggtctgcaa ctgcgccggt ggagaacacg actgcatcgt agtagtcgcg gagttcttcg 360

acggtgatgt ctttgccgat ttcaatgtta ccgagcaggc gcaggcgtgg cttgtccaac 420

acgttgtgca gggacttaac gatgcccttg atgcgtgggt ggtctggagc aacgccgtaa 480

cggatgagtc cgaacggtgc aggcatttgc tcgaaaaggt caacgaacac ttcgcgctct 540

tcattgcgga tgaggaggtc ggatgcgtaa atgccagcag ggccagctcc gatgacggct 600

acgcgcaggg gagttgtcat gtgtttgaag ttgcctttcg tgagcccttt tatggaaaca 660

agggtgtgaa aatcaagtag ttaaaggtgt ttcaagtcca ggctgtttaa cactcctaga 720

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taatatcccc aggttaattc atttaaacgg gcattaggtg actccattgc tttcagtctc 900

atgaatctaa tggttggtct agacagagcg gtacgtctaa gtttgcggat agatcaaacc 960

gagtgacatg tacttcacta gctctttaag gattaactcc ccatgacaac aaccaccgga 1020

agtgcccggc cagcacgtgc cgccaggaag cctaagcccg aaggccaatg gaaaatcgac 1080

ggcaccgagc cgcttaacca tgccgaggaa attaagcaag aagaacccgc ttttgctgtc 1140

aagcagcggg tcattgatat ttactccaag cagggttttt cttccattgc accggatgac 1200

attgccccac gctttaagtg gttgggcatt tacacccagc gtaagcagga tctgggcggt 1260

gaactgaccg gtcagcttcc tgatgatgag ctgcaggatg agtacttcat gatgcgtgtg 1320

cgttttgatg gcggactggc ttcccctgag cgcctgcgtg ccgtgggtga aatttctagg 1380

gattatgctc gttccaccgc ggacttcacc gaccgccaga acattcagct gcactggatt 1440

cgtattgaag atgtgcctgc gatctgggag aagctagaaa ccgtcggact gtccaccatg 1500

cttggttgcg gtgacgttcc acgtgttatc ttgggctccc cagtttctgg cgtagctgct 1560

gaagagctga tcgatgccac cccggctatc gatgcgattc gtgagcgcta cctagacaag 1620

gaagagttcc acaaccttcc tcgtaagttt aagactgcta tcactggcaa ccagcgccag 1680

gatgttaccc acgaaatcca ggacgtttcc ttcgttcctt cgattcaccc agaattcggc 1740

ccaggatttg agtgctttgt gggcggtggc ctgtccacca acccaatgct tgctcagcca 1800

cttggttctt ggattccact tgatgaggtt ccagaagtgt gggctggcgt cgccggaatt 1860

ttccgcgact acggcttccg acgcctgcgt aaccgtgctc gcctcaagtt cttggtggca 1920

cagtggggta ttgagaagtt ccgtgaagtt cttgagaccg aatacctcga gcgcaagctg 1980

atcgatggcc cagttgttac caccaaccct ggctaccgtg accacattgg cattcaccca 2040

caaaaggacg gcaagttcta cctcggtgtg aagccaaccg ttggacacac caccggtgag 2100

cagctcattg ccattgctga tgttgcagaa aagcacggca tcaccaggat tcgtaccacg 2160

gcggaaaagg aactgctctt cctcgatatt gagagaaaga accttactac cgttgcacgc 2220

gacctggatg aaatcggact gtactcttca ccttccgagt tccgccgcgg catcatttcc 2280

tgcaccggct tggagttctg caagcttgcg cacgcaacca ccaagtcacg agcaattgag 2340

cttgtcgacg aactggaaga gcgcctcggc gatttggatg ttcccatcaa gattgcactg 2400

aacggttgcc ctaactcttg tgcacgcacc caggtttccg acatcggatt caagggacag 2460

accgtcactg atgctgacgg caaccgcgtt gaaggtttcc aggttcacct gggcggttcc 2520

atgaacttgg atccaaactt cggacgcaag ctcaagggcc acaaggttat tgccgatgaa 2580

gtgggagagt acgtcactcg cgttgttacc cacttcaagg aacagcgcca cgaggacgag 2640

cacttccgcg attgggtcca gcgggccgct gaggaagatt tggtgtgagt cttcggagga 2700

aacccaatcc caaccgcaac caccctctgt actgcccata ctgcgcggga gaagttcttt 2760

tccccgatga gcaaacagaa ttcgcgtggt tgtgtgcgga ttgcaccaga gtttttgaag 2820

tgaaatatca cggccaggac gatccagtgc acaggccagc accagcaaag tccacatcgc 2880

aagcattaaa agaatctctc gaaagacaca aaagaggtga gtcgcaacaa tgagctttca 2940

actagttaac gccctgaaaa atactggttc ggtaaaagat cccgagatct cacccgaagg 3000

acctcgcacg accacaccgt tgtcaccaga ggtagcaaaa cataacgagg aactcgtcga 3060

aaagcatgct gctgcgttgt atgacgccag cgcgcaagag atcctggaat ggacagccga 3120

gcacgcgccg ggcgctattg cagtgacctt gagcatggaa aacaccgtgc tggcggagct 3180

ggctgcgcgg cacctgccgg aagctgattt cctctttttg gacaccggtt accacttcaa 3240

ggagaccctt gaagttgccc gtcaggtaga tgagcgctat tcccagaagc ttgtcaccgc 3300

gctgccgatc ctcaagcgca cggagcagga ttccatttat ggtctcaacc tgtaccgcag 3360

caacccagcg gcgtgctgcc gaatgcgcaa agttgaaccg ctggcggcgt cgttaagccc 3420

atacgctggc tggatcaccg gcctgcgccg cgctgatggc ccaacccgtg ctcaagcccc 3480

tgcgctgagc ttggatgcca ccggcaggct caagatttct ccaattatca cctggtcatt 3540

ggaggaaacc aacgagttca ttgcggacaa caacctcatc gatcacccac ttacccatca 3600

gggttatcca tca 3613

<210> 28

<211> 3311

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 28

ctcattccag cgtcacgacg ttccgaaggt actggttacc tggcattggg cactaccgtt 60

tctgcagcac ttggaccagc cctagcactt tttgtcctag gaacatttga ttacgacatg 120

ctgtttatcg tggtcttggc aacctcggtc atctctttga tcgccgtcgt gttcatgtac 180

tttaagacca gcgaccctga gccttctggg gaaccagcca agttcagctt caaatctatt 240

atgaacccaa agatcatccc catcggcatc tttatcttgc ttatttgctt tgcttactct 300

ggcgtcattg cctacatcaa cgcatttgct gaagaacgcg atctgattac gggtgctgga 360

ttgttcttca ttgcctacgc agtatcaatg tttgtgatgc gcagcttcct tggcaaactg 420

caggaccgtc gcggagacaa cgtcgttatt tactttggat tgttcttctt cgttatttcc 480

ttgacgattt tgtcctttgc cacttccaac tggcacgttg tgttgtccgg agtcattgca 540

ggtctgggat acggcacttt gatgccagca gtgcagtcca tcgctgttgg tgtagtagac 600

aaaaccgaat tcggtacggc cttctccact ttgttcctgt ttgtggactt aggttttggc 660

tttggaccta ttatcctggg agcagtttct gcggcaattg gtttcggacc tatgtatgca 720

gcactggcag gtgtgggtgt gattgccgga atcttctacc tgttcacaca cgctcgcacc 780

gatcgagcta agaatggctt tgttaaacac ccagagcctg tcgctttagt tagctagttc 840

tttcagcttt ccctcccgat cagcgtaaac cggcccttcc ggttttgggg tacatcacag 900

aacctgggct agcggtgtag acccgaaaat aaacgagcct tttgtcaggg ttaaggttta 960

ggtatctaag ctaaccaaac accaacaaaa ggctctaccc atgaagtcta ccggcaacat 1020

catcgctgac accatctgcc gcactgcgga actaggactc accatcaccg gcgcttccga 1080

tgcaggtgat tacaccctga tcgaagcaga cgcactcgac tacacctcca cctgcccaga 1140

atgctcccaa cctggggtgt ttcgtcatca cacccaccgg atgctcattg atttacccat 1200

cgtcgggttt cccaccaaac tgtttatccg tctacctcgc taccgctgca ccaaccccac 1260

atgtaagcaa aagtatttcc aagcagaact aagctgcgct gaccacggta aaaaggtcac 1320

ccaccgggtc acccgctgga ttttacaacg ccttgctatt gaccggatga gtgttcacgc 1380

aaccgcgaaa gcacttgggc tagggtggga tttaacctgc caactagccc tcgatatgtg 1440

ccgtgagctg gtctataacg atcctcacca tcttgatgga gtgtatgtca ttggggtgga 1500

tgagcataag tggtcacata atagggctaa gcatggtgat gggtttgtca ccgtgattgt 1560

cgatatgacc gggcatcggt atgactcacg gtgtcctgcc cggttattag atgtcgtccc 1620

aggtcgtagt gctgatgctt tacggtcctg gcttggctcc cgcggtgaac agttccgcaa 1680

tcagatacgg atcgtgtcca tggatggatt ccaaggctac gccacagcaa gtaaagaact 1740

cattccttct gctcgtcgcg tgatggatcc attccatgtt gtgcggcttg ctggtgacaa 1800

gctcaccgcc tgccggcaac gcctccagcg ggagaaatac cagcgtcgtg gtttaagcca 1860

ggatccgttg tataaaaacc ggaagacctt gttgaccacg cacaagtggt tgagtcctcg 1920

tcagcaagaa agcttggagc agttgtgggc gtatgacaaa gactacgggg cgttaaagct 1980

tgcgtggctt gcgtatcagg cgattattga ttgttatcag atgggtaata agcgtgaagc 2040

gaagaagaaa atgcggacca ttattgatca gcttcgggtg ttgaaggggc cgaataagga 2100

actcgcgcag ttgggtcgta gtttgtttaa acgacttggt gatgtgttgg cgtatttcga 2160

tgttggtgtc tccaacggtc cggtcgaagc gatcaacgga cggttggagc atttgcgtgg 2220

gattgctcta ggtttccgta atttgaacca ctacattctg cggtgcctta tccattcagg 2280

gcagttggtc cataagatca atgcactcta aaacaggaag agcccgtaaa cctctgacta 2340

gcgtcaccct ctgattaagg cgaccgcgga tttaagagca gaggctgcca cgagcgcatc 2400

ttcacggctg tgtgttgtac taaaagtaca gcgcacagcc gttcgtgctt gatcctcctc 2460

aagccccaac gccagcaaca catgggatac ctctccggaa ccacaggcag aaccagggga 2520

gcacacaatg ccttggcgtt ccaattccag aagaacagtt tcagatccta tgctgtcgaa 2580

gagaaaagat gcgtgtccat caatgcgcat cctaggatgt ccagtcaggt gtgctcccgg 2640

gatagtgaga acttcctcga tgaattcgcc aagatctgga taggattccg ccctggccaa 2700

ttccaaggca gtggcaaagg cgatagcccc cgcaacgttt tccgtgccac tacgccgccc 2760

tttttcctgg ccgccgccat ggattaccgg ctccagggga agctttgacc ataacactcc 2820

aatcccttta ggcgcaccga atttatgacc cgacaaactt aacgcgtcaa ctcccaagtc 2880

aaaggttaaa tgtgcagctt gcactgcatc ggtgtgaaaa ggcgtactgc ttaccgccgc 2940

caactcagct atcggctgaa tggttcccac ctcattgttg gcataaccaa tgctgatcaa 3000

tgtggtgtcc ggcctgactg ctttgcggag accctccggg gagatcagcc cagtgtgatc 3060

gggggatagg taggtgatct cgaaatcatg aaacctttca agataagcag cagtttctag 3120

gacactgtca tgctcgatcg gggtggtgat gaggtgccgg ccacgaggat tagctaagca 3180

cgctcctttg atagcgaggt tgttggcttc tgatccaccc gacgtaaacg tcacctgtgt 3240

ggggcgtcct ccgataatgc gggccacccg agttcgagca tcctccagcc ccgcagaggc 3300

gagtcttccc a 3311

<210> 29

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

acccggggat cctctagaat gtttgtgatg cgcag 35

<210> 30

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

gtcagagagt acttacgctg atcgggaggg aaagc 35

<210> 31

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

atcagcgtaa gtactctctg actagcgtca ccctc 35

<210> 32

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

ctgcaggtcg actctagaaa agggattgga gtgtt 35

<210> 33

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

caacgaaagg aaacaatgtc tacttcagtt acttc 35

<210> 34

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

tagtcagaga gtgatttaga cgttaaagta ctttg 35

<210> 35

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

atcaaaacag atatcatgac aacaaccacc ggaag 35

<210> 36

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

cgctagtcag agagttcaca ccaaatcttc ctcag 35

<210> 37

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

ccgatcagcg taagtagaaa catcccagcg ctact 35

<210> 38

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

aactgaagta gacattgttt cctttcgttg ggtac 35

<210> 39

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

tactttaacg tctaaggtac cggcgcttca tgtca 35

<210> 40

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

ggtggttgtt gtcatgatat ctgttttgat ctcct 35

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

atccccatcg gcatctttat 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

cgatcacact gggctgatct 20

<210> 43

<211> 381

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 43

Met Thr Leu Thr Phe His Trp Phe Leu Ser Thr Ser Gly Asp Ser Arg

1 5 10 15

Gly Ile Ile Gly Gly Gly His Gly Ala Glu Lys Ser Gly Thr Ser Arg

20 25 30

Glu Leu Ser His Ser Tyr Leu Lys Gln Leu Ala Leu Ala Ala Glu Thr

35 40 45

Asn Gly Phe Glu Ser Val Leu Thr Pro Thr Gly Thr Trp Cys Glu Asp

50 55 60

Ala Trp Ile Thr Asp Ala Ser Leu Ile Glu Ala Thr Lys Arg Leu Lys

65 70 75 80

Phe Leu Val Ala Leu Arg Pro Gly Gln Ile Gly Pro Thr Leu Ser Ala

85 90 95

Gln Met Ala Ser Thr Phe Gln Arg Leu Ser Gly Asn Arg Leu Leu Ile

100 105 110

Asn Val Val Thr Gly Gly Glu Asp Ala Glu Gln Arg Ala Phe Gly Asp

115 120 125

Phe Leu Asn Lys Glu Glu Arg Tyr Ala Arg Thr Gly Glu Phe Leu Asp

130 135 140

Ile Val Ser Arg Leu Trp Arg Gly Glu Thr Val Thr His His Gly Glu

145 150 155 160

His Leu Gln Val Glu Gln Ala Ser Leu Ala His Pro Pro Glu Ile Ile

165 170 175

Pro Glu Ile Leu Phe Gly Gly Ser Ser Pro Ala Ala Gly Glu Val Ala

180 185 190

Ala Arg Tyr Ala Asp Thr Tyr Leu Thr Trp Gly Glu Thr Pro Asp Gln

195 200 205

Val Ala Gln Lys Ile Asn Trp Ile Asn Glu Leu Ala Ala Gln Arg Gly

210 215 220

Arg Glu Leu Arg His Gly Ile Arg Phe His Val Ile Thr Arg Asp Thr

225 230 235 240

Ser Glu Glu Ala Trp Val Val Ala Glu Lys Leu Ile Ser Gly Val Thr

245 250 255

Pro Glu Gln Val Ala Lys Ala Gln Ala Gly Phe Ala Thr Ser Lys Ser

260 265 270

Glu Gly Gln Arg Arg Met Ala Glu Leu His Ser Lys Gly Arg Ala Phe

275 280 285

Thr Ser Gly Ser Thr Ala Arg Asp Leu Glu Val Tyr Pro Asn Val Trp

290 295 300

Ala Gly Val Gly Leu Leu Arg Gly Gly Ala Gly Thr Ala Leu Val Gly

305 310 315 320

Ser His Glu Glu Val Ala Asp Arg Ile Glu Glu Tyr Ala Ala Leu Gly

325 330 335

Leu Asp Gln Phe Val Leu Ser Gly Tyr Pro Asn Leu Glu Glu Ala Phe

340 345 350

His Phe Gly Glu Gly Val Ile Pro Glu Leu Leu Arg Arg Gly Val Asp

355 360 365

Ile Lys Asn Gln Glu Ser Arg Val Leu Glu Pro Val Gly

370 375 380

Claims

1.生产含硫氨基酸或含硫氨基酸衍生物的方法，所述方法包括在包括硫代硫酸盐的培养基中培养基因修饰的微生物，

其中所述微生物包括与未修饰的微生物相比由ssuD基因编码的蛋白质的活性增加的基因修饰，

其中所述由ssuD基因编码的蛋白质由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成，

其中所述微生物是属于棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述由ssuD基因编码的蛋白质具有硫代硫酸盐还原酶活性。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、石南棒杆菌(Corynebacterium callunae)、沙漠棒杆菌(Corynebacteriumdeserti)或钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)。

4.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括从所述微生物或所述培养基中回收所述含硫氨基酸和所述含硫氨基酸衍生物。

5.根据权利要求1所述的方法，其中增加所述蛋白质的活性的基因修饰通过以下方式实现：i)增加细胞中编码所述蛋白质的多核苷酸的拷贝数，ii)用活性更强的序列置换编码所述蛋白质的多核苷酸的表达调控区，iii)修饰编码所述蛋白质的多核苷酸的起始密码子或5’-UTR，iv)修饰染色体上的核苷酸序列，以增强所述蛋白质的活性，v)引入表达所述蛋白质的活性的外源多核苷酸或编码所述蛋白质的多核苷酸的密码子优化变体多核苷酸，或vi)它们的组合。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述含硫氨基酸或所述含硫氨基酸衍生物包括选自甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、羊毛硫氨酸、同型半胱氨酸、同型胱氨酸、同型羊毛硫氨酸和牛磺酸中的至少一种。

7.微生物，其生产含硫氨基酸和含硫氨基酸衍生物，并包括与未修饰的微生物相比由ssuD基因编码的蛋白质的活性增加的基因修饰，其中所述由ssuD基因编码的蛋白质具有硫代硫酸盐还原酶活性并且参与硫代硫酸盐的利用，

其中所述微生物是属于棒杆菌属的微生物。

8.权利要求7的所述微生物，其中增加所述蛋白质的活性的基因修饰通过以下方式实现：i)增加细胞中编码所述蛋白质的多核苷酸的拷贝数，ii)用活性更强的序列置换编码所述蛋白质的多核苷酸的表达调控区，iii)修饰编码所述蛋白质的多核苷酸的起始密码子或5’-UTR，iv)修饰染色体上的核苷酸序列，以增强所述蛋白质的活性，v)引入表达所述蛋白质的活性的外源多核苷酸或编码所述蛋白质的多核苷酸的密码子优化变体多核苷酸，或vi)它们的组合。

9.用于生产含硫氨基酸或含硫氨基酸衍生物的组合物，

其中所述组合物包括：包括与未修饰的微生物相比由ssuD基因编码的蛋白质的活性增加的基因修饰的微生物或其培养物；以及

硫代硫酸盐，

其中所述微生物是属于棒杆菌属的微生物。

10.由ssuD基因编码的蛋白质作为硫代硫酸盐还原酶的用途，其中所述由ssuD基因编码的蛋白质由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成。

11.微生物用于生产含硫氨基酸或含硫氨基酸衍生物的用途，所述微生物包括与未修饰微生物相比由ssuD基因编码的蛋白质的活性增加的基因修饰，其中在硫代硫酸盐存在的情况下，所述由ssuD基因编码的蛋白质具有硫代硫酸盐还原酶活性，

其中所述微生物是属于棒杆菌属的微生物。