CN114480173A

CN114480173A - 一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产l-色氨酸中的应用

Info

Publication number: CN114480173A
Application number: CN202111610434.XA
Authority: CN
Inventors: 周旭波; 王健; 方培新; 王华萱
Original assignee: Jiangsu Aochuang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Aochuang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-27
Filing date: 2021-12-27
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2041-12-27
Also published as: CN114480173B

Abstract

一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产L‑色氨酸中的应用，所述大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ACTrp104，该大肠埃希氏菌ACTrp104已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏日期为2018年12月3日，菌种保藏编号为CGMCC No.16861。本发明通过将大肠杆菌E.coli AC‑1042进行ARTP诱变育种技术和抗性定向筛选技术相结合，筛选得到，该菌株具有独特的生理和生化特性可在科研、工业等领域进行研究和应用。

Description

一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产L-色氨酸中的应用

技术领域

本发明生物技术领域，具体涉及一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产L-色氨酸中的应用。

背景技术

L-色氨酸是人和动物体内的必需氨基酸之一，是构成蛋白的重要组成部分，人和动物自身不能合成，必须从食物中摄取。L-色氨酸主要用于医药、食品、化妆品、饲料等多个行业，最新研究表明，色氨酸及其代谢物在许多人体疾病调控中发挥了不同的生物学效应，比如神经系统疾病、肿瘤、肾病、糖尿病、炎症、免疫性疾病等，在食品和饲料添加剂领域，色氨酸可以用来强化食品和做饲料添加剂，对补充食物和饲料中的营养、提高蛋白质的利用率具有重要的作用。近年来，色氨酸的市场需求不断增加，市场前景看好。

L-色氨酸的生产方法目前主要采用微生物发酵法生产。微生物发酵法生产L-色氨酸，比传统的采用化学合成法和蛋白质水解法，具有更低的生产成本、更加绿色环保、更易于大规模生产等显著的优越性。近年来，国内外大量企业和研究机构致力于L-色氨酸发酵生产技术的研究。目前菌种对原材料、培养条件和控制工艺都要求较高，在生产过程中菌种的遗传性也不稳定，使得发酵生产水平不稳定，产酸和转化率波动较大，造成原材料及能耗较大，使生产成本偏高。通过基因表达，将目的基因插入质粒，以提高更大基因拷贝数的质粒，来提高色氨酸的产量，但是L-色氨酸是初级代谢产物，在培养过程中，基因改造的微生物菌种，出现质粒丢失、遗传不稳定的情况较多，也是造成生产水平波动的一个原因。在微生物发酵法生产L-色氨酸的过程中，微生物菌种的优劣决定着整个发酵生产过程中的生产工艺、生产成本以及产品质量等，因此，选育高产色氨酸优良菌株具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产L-色氨酸中的应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一株大肠埃希氏菌，所述大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)ACTrp104，该大肠埃希氏菌ACTrp104已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏日期为2018年12月3日，菌种保藏编号为CGMCC No.16861。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：所述大肠埃希氏菌ACTrp104在发酵生产L-色氨酸中的应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种采用权利要求1所述的大肠埃希氏菌ACTrp104发酵生产L-色氨酸的方法，包含如下步骤：

步骤1：菌种培养

将大肠埃希氏菌ACTrp104菌种接至已灭菌的种子培养基中进行培养，培养至对数生长期；培养条件：温度30-40℃、pH值6.5-7.5、溶氧≥30％、罐压0.02-0.05MPa；

步骤2：将步骤1得到的对数生长期菌种接入已灭菌的发酵培养基中进行发酵培养30-50h，得到含L-色氨酸的发酵液；发酵培养条件：温度30-40℃、pH值6.5-7.5、溶氧≥30％、罐压0.02-0.10MPa、发酵过程中残糖含量控制在0.05-1％。

优选的技术方案为：每升种子培养基包含葡萄糖5-50g、酵母粉1-20g、硫酸铵0.5-4g、磷酸二氢钾0.5-5g、硫酸镁0.05-2g、柠檬酸0.1-2g、微量元素1份。

优选的技术方案为：每升发酵培养基包含葡萄糖5-50g、酵母粉0.5-10g、硫酸铵0.5-10g、磷酸二氢钾0.5-10g、硫酸镁0.05-5g、柠檬酸0.5-10g、微量元素1份。

优选的技术方案为：微量元素包括铁、镁、锌、铜、锰、钠和钾；每升种子培养基含有微量元素0.5-1.5g；每升发酵培养基含有微量元素0.5-1.5g。

优选的技术方案为：将步骤2得到的L-色氨酸发酵液通过膜过滤去除菌体得到过滤清液，将过滤清液进行蒸发浓缩结晶，然后降温冷却结晶，进一步离心去除母液，得到湿晶，将湿晶进行干燥，得到L-色氨酸晶体。

优选的技术方案为：将步骤2得到的L-色氨酸发酵液通过蒸发浓缩系统进行浓缩，然后浓缩液中加入辅料进行配制，将配制液进行喷浆造粒，得到低含量饲料级L-色氨酸颗粒产品。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

1、本发明通过将大肠杆菌E.coli AC-1042进行ARTP诱变育种技术和抗性定向筛选技术相结合，筛选得到本申请中已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCC No.16861的大肠埃希氏菌ACTrp104。该菌株具有独特的生理和生化特性可在科研、工业等领域进行研究和应用。

2、本发明中的大肠埃希氏菌ACTrp104，菌种稳定性大大提高，采用该菌种发酵生产L-色氨酸，产酸和转化率有了显著提高，在技术上取得了突破性的进展，具有显著的进步。且该菌种培养条件粗放，大大降低了能耗，具有较好的工业应用前景。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

生物材料的保藏：本发明采用的大肠埃希氏菌ACTrp104，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)ACTrp104，保藏编号为CGMCC No.16861，保藏日期为2018年12月03日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

实施例1：一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产L-色氨酸中的应用

一株大肠埃希氏菌ACTrp104，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏时间为2018年12月03日，菌种保藏编号为CGMCC No.16861。

所述大肠埃希氏菌ACTrp104及其在发酵生产L-色氨酸中的应用，包含以下步骤：

(1)菌种培养，将种子培养基进行灭菌，冷却至35℃左右，pH调至7左右，将大肠埃希氏菌ACTrp104菌种接至种子培养基中进行培养，培养至对数生长期。菌种培养条件：温度35℃、pH值7左右、溶氧≥30％、罐压0.03MPa。

(2)发酵培养，将发酵培养基进行灭菌，冷却至37℃左右，pH调至7.0左右，将步骤(1)制得的对数生长期菌种接入发酵培养基中进行发酵培养以制取L-色氨酸发酵液。发酵培养条件：温度35℃、pH值7、溶氧≥30％、罐压0.06MPa、发酵过程中残糖含量控制在0.5％。培养至40h结束培养，得到L-色氨酸发酵液。

(3)提取纯化，将步骤(2)得到的L-色氨酸发酵液通过膜过滤去除菌体得到过滤清液，将过滤清液进行蒸发浓缩结晶，然后降温冷却结晶，进一步离心去除母液，得到湿晶，将湿晶进行干燥，得到L-色氨酸晶体。

所述菌种培养的培养基包含葡萄糖25g/L、酵母粉10g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、硫酸镁1g/L、柠檬酸1g/L、微量元素1份。

所述发酵培养的培养基包含葡萄糖25g/L、酵母粉5g/L、硫酸铵5g/L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸镁2.5g/L、柠檬酸5g/L、微量元素1份。

微量元素由镁、锌、铜按照1：2：1的质量比例混合后构成；每升种子培养基含有微量元素1g；每升发酵培养基含有微量元素0.9g。

所述膜过滤设备为陶瓷膜、有机膜或金属膜，孔径为50nm，蒸发浓缩结晶设备为多效蒸发结晶器，蒸发温度为65℃，浓缩比为8倍，冷却结晶设备为冷结晶器，降温控制速度为4℃/h，最低温度为10℃，L-色氨酸晶体干燥设备为流化床干燥机或真空双锥干燥机，L-色氨酸颗粒产品干燥设备为喷浆造粒干燥机。

通过该种方式培养，采用30L发酵罐培养，发酵培养至35h，产L-色氨酸86g/L，转化率35％。经过提取纯化，得到L-色氨酸晶体1095g。

转化率计算公式＝(发酵液体积L×发酵产酸含量g/L)/发酵葡萄糖用量g×100％。

实施例2：一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产L-色氨酸中的应用

一株大肠埃希氏菌ACTrp104，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏时间为2018年12月3日，菌种保藏编号为CGMCC No.16861。

(1)菌种培养，将种子培养基进行灭菌，冷却至30℃左右，pH调至6.5左右，将大肠埃希氏菌ACTrp104菌种接至种子培养基中进行培养，培养至对数生长期。菌种培养条件：温度30℃、pH值6.5左右、溶氧≥30％、罐压0.02MPa。

(2)发酵培养，将发酵培养基进行灭菌，冷却至37℃左右，pH调至7.0左右，将步骤(1)制得的对数生长期菌种接入发酵培养基中进行发酵培养以制取L-色氨酸发酵液。发酵培养条件：温度30℃、pH值6.5、溶氧≥30％、罐压0.02MPa、发酵过程中残糖含量控制在0.05％。培养至30h结束培养，得到L-色氨酸发酵液。

(3)将步骤(2)得到的L-色氨酸发酵液通过蒸发浓缩系统进行浓缩，然后浓缩液中加入辅料进行配制，将配制液进行喷浆造粒，得到低含量饲料级L-色氨酸颗粒产品。

所述菌种培养的培养基包含葡萄糖5g/L、酵母粉1g/L、硫酸铵0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸镁0.05g/L、柠檬酸0.1g/L、微量元素1份。

所述发酵培养的培养基包含葡萄糖5g/L、酵母粉0.5g/L、硫酸铵0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸镁0.05g/L、柠檬酸0.5g/L、微量元素1份。

微量元素由镁、锌、铜、锰、钠和钾等比例混合后狗哼；每升种子培养基含有微量元素0.5g；每升发酵培养基含有微量元素0.5g。

所述膜过滤设备为陶瓷膜、有机膜或金属膜，孔径为8nmnm，蒸发浓缩结晶设备为多效蒸发结晶器，蒸发温度为50℃，浓缩比为3倍，冷却结晶设备为冷结晶器，降温控制速度为2℃/h，最低温度为5℃，L-色氨酸晶体干燥设备为流化床干燥机或真空双锥干燥机，L-色氨酸颗粒产品干燥设备为喷浆造粒干燥机。

通过该种方式，采用50吨发酵罐培养，发酵培养至35h，产L-色氨酸90g/L，转化率30.18％。将L-色氨酸发酵液浓缩后喷浆造粒，得到L-色氨酸颗粒产品6.31吨。

实施例3：一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产L-色氨酸中的应用

大肠杆菌的诱变筛选方法

以大肠杆菌AC-1042为出发菌，经过常压室温等离子(atmospheric and roomtemperature plasma，ARTP)诱变处理，再经结构类似物抗性定向筛选，获得具有底物抗性和遗传标记的色氨酸高产菌株。ARTP诱变处理方法：从新鲜活化斜面上挑取一环菌种于种子培养基中，180r/min、36.5℃摇床培养4.5h，取1mL种子液于1.5mL EP管，4000rpm离心，去除上清液，加入1mL生理盐水，混匀，反复三次，将菌悬液稀释，使菌悬液OD₆₀₀为0.6-1.0；取10μL稀释菌液均匀涂到无菌不锈钢载片上，ARTP诱变条件为射频功率120W、处理距离2mm、载气流量10SLM(Standard liters per minute)、处理温度为室温(20-40℃)、处理时间选择致死率达到90％以上的处理时间。将处理过的载片放入装有1mL无菌生理盐水的EP管中，震荡混匀，然后稀释到10^-1、10^-2倍，取100μL均匀涂布到平板上，每个梯度做两个平行，36℃培养20h。

抗性突变株筛选方法：配置基本培养基，灭菌后加入适量的结构类似物；用接种环从诱变后的平板中取一满环菌种于无菌离心管中，用无菌水离心洗涤两次，然后悬于无菌水中制成菌悬液。按浓度梯度制备一系列的5-甲基色氨酸(5-MT)、5-氟色氨酸(5-FT)、色氨酸氧肟酸盐(TrpHx)、6-氟色氨酸(6-FT)、6-甲基色氨酸(6-MT)、4-甲基色氨酸(4-MT)、对氟苯丙氨酸(PFP)、苯丙氨酸氧肟酸盐(PheHx)、对氨基苯丙氨酸(PAP)、3-氨基酪氨酸(3-AT)、酪氨酸氧肟酸盐(TyrHx)抗性培养基平板，直接将菌悬液分别涂布于抗性平板上，36℃培养2～3d。根据出发菌株耐受结构类似物的浓度确定诱变菌株筛选用结构类似物浓度。随机挑选生长菌落进行筛选。

菌种初筛方法：将种子培养基分装到96孔板中，每个1mL，将抗性平板上培养的单菌落挑到种子液孔板中，180r/min，36℃培养6h，并同时接种到另一块平板上，36℃培养22h后放入冰箱。将发酵培养基分装到孔板中，每个0.9mL，种子液接0.15mL，180r/min，36.5℃培养20h。挑取发酵产酸较高的菌种，将平板上对应序号的菌种挑至斜面，36.5℃培养20h，甘油管保存。

菌种复筛方法：将初筛甘油管保藏的菌种分别划一支斜面，36℃培养20h。从斜面上挑一环菌至种子摇瓶中，180r/min，36.5℃培养5.5h，转接发酵摇瓶，180r/min，36.5℃培养22h，测发酵摇瓶产酸，挑取产酸较高的菌种保存。

遗传稳定性试验：

将上述筛选获得的色氨酸高产菌株进行单菌落分离，连续摇瓶传代10代，每一代菌株先进行种子培养，选择遗传稳定和产酸高的菌株用于进一步研究。摇瓶传代方法：把色氨酸高产菌株从斜面转接摇瓶中，培养至对数生长期后转接至下一代摇瓶。

将最终获得的一株色氨酸高产菌株ACTrp104再连续传种十次，使用500mL摇瓶发酵培养考察其L-色氨酸的产量。结果如下：

表1菌株ACTrp104的遗传稳定性

从表1中可以看出，突变菌株ACTrp104的遗传稳定性良好，连续传代10次在500mL发酵罐培养结束的色氨酸产量基本稳定在15g/L左右，菌株ACTrp104的遗传稳定性良好。

对比实验：

使用本发明中的大肠埃希氏菌ACTrp104和原菌株AC-1042，结合本发明中的相关工艺分别进行30L罐发酵培养，分别培养三批次，取三个批次平均值计算结果如下表：

表2突变菌株和出发菌发酵生产色氨酸的性能比较

项目	ACTrp104	AC-1042
			产酸g/L	86.65	62.08
转化率％	35.64	19.52
			周期	35	48

从表2中可以看出，本发明中的菌株ACTrp104相比出发菌产酸率、转化率以及发酵周期都有了较大改善，菌株ACTRP104生产色氨酸的能力得到了较大提升，并且产酸稳定，应用于色氨酸工业化生产，可以显著提高发酵产酸率和转化率，降低生产成本，具有较好的工业化应用潜力。

对该菌株进行传代保藏，命名为大肠埃希氏菌ACTrp104，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏日期为2018年12月23日，菌种保藏编号为CGMCC No.16861，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

中国科学院微生物研究所对大肠埃希氏菌ACTrp104的细胞形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列(其基因序列如SEQ NO.1所示)、atpD基因序列(其基因序列如SEQ NO.2所示)等项目进行了检测鉴定，检测鉴定报告编号(2018)微检字第494号，经过对检测鉴定实验数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌手册》以及International Journal ofSystematic and Evolutionary Microbiology有关研究论文，菌株编号ACTrp104的鉴定结果为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

本发明所述的大肠埃希氏菌ACTrp104及其在发酵生产色氨酸中的应用，菌种稳定性大大提高，发酵生产水平取得了突破性的进展，采用该菌种发酵生产色氨酸，产率和转化率具有相对较高水平，具有显著先进性，并且发酵配方原材料简单易得、工艺控制简单。经过50吨发酵罐生产，生产技术水平稳定。本发明技术适合进行工业化生产推广，具有显著的先进性和较好的应用前景。

SEQ NO.1

16S rRNA基因序列测定结果

CATGCAGTCG AACGGTAACA GGAAGAAGCT TGCTTCTTCG CTGACGAGTG GCGGACGGGTGAGTAATGTC TGGGAAACTG CCTGATGGAG GGGGATAACT ACTGGAAACG GTAGCTAATA CCGCATAACGTCGCAAGACC AAAGAGGGGG ACCTTCGGGC CTCTTGCCAT CGGATGTGCC CAGATGGGAT TAGCTAGTAGGTGGGGTAAC GGCTCACCTA GGCGACGATC CCTAGCTGGT CTGAGAGGAT GACCAGCCAC ACTGGAACTGAGACACGGTC CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTGGGGAA TATTGCACAA TGGGCGCAAG CCTGATGCAGCCATGCCGCG TGTATGAAGA AGGCCTTCGG GTTGTAAAGTA CTTTCAGCGG GGAGGAAGG GAGTAAAGTTAATACCTTTG CTCATTGACG TTACCCGCAG AAGAAGCACC GGCTAACTCC GTGCCAGCAG CCGCGGTAATACGGAGGGTG CAAGCGTTAA TCGGAATTAC TGGGCGTAAA GCGCACGCAG GCGGTTTGTT AAGTCAGATGTGAAATCCCC GGGCTCAACC TGGGAACTGC ATCTGATACT GGCAAGCTTG AGTCTCGTAG AGGGGGGTAGAATTCCAGGT GTAGCGGTGA AATGCGTAGA GATCTGGAGG AATACCGGTG GCGAAGGCGG CCCCCTGGACGAAGACTGAC GCTCAGGTGC GAAAGCGTGG GGAGCAAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTAAACGATGTCG ACTTGGAGGT TGTGCCCTTG AGGCGTGG、CT TCCGGAGCTA ACGCGTTAAG TCGACCGCCTGGGGAGTACG GCCGCAAGGT TAAAACTCAA ATGAATTGAC GGGGGCCCGC ACAAGCGGTG GAGCATGTGGTTTAATTCGA TGCAACGCGA AGAACCTTAC CTGGTCTTGA CATCCACGGA AGTTTTCAGA GATGAGAATGTGCCTTCGGG AACCGTGAGA CAGGTGCTGC ATGGCTGTCG TCAGCTCGTG TTGTGAAATG TTGGGTTAAGTCCCGCAACG AGCGCAACCC TTATCCTTTG TTGCCAGCGG TCCGGCCGGG AACTCAAAGG AGACTGCCAGTGATAAACTG GAGGAAGGTG GGGATGACGT CAAGTCATCA TGGCCCTTAC GACCAGGGCT ACACACGTGCTACAATGGCG CATACAAAGA GAAGCGACCT CGCGAGAGCA AGCGGACCTC ATAAAGTGCG TCGTAGTCCGGATTGGAGTC TGCAACTCGA CTCCATGAAG TCGGAATCGC TAGTAATCGT GGATCAGAAT GCCACGGTGAATACGTTCCC GGGCCTTGTA CACACCGCCC GTCACACCAT GGGAGTGGGT TGCAAAAGAA GTAGGTAGCTTAACCTTCGG GAGGGCGCTT ACCACTT。

SEQ NO.2

atpD基因序列测定结果

GCGCGTGTAC GATGCTCTTG AGGTGCAAAT GGTAATGAGC GTCTGGTGCT GGAAGTTCAGCAGCAGCTCG GCGGCGGTAT CGTACGTACC ATCGCAATGG GTTCCTCCGA CGGTCTGCGT CGCGGTCTGGATGTAAAAGA CCTCGAACAC CCGATTGAAG TCCCGGTAGG TAAAGCGACT CTGGGCCGTA TCATGAACGTACTGGGTGAA CCGGTCGACA TGAAAGGCGA GATCGGTGAA GAAGAGCGTT GGGCGATTCA CCGCGCAGCACCTTCCTACG AAGAGCTGTC AAACTCTCAG GAACTGCTGG AAACCGGTAT CAAAGTTATC GACCTGATGTGTCCGTTCGC TAAGGGCGGT AAAGTTGGTC TGTTCGGTGG TGCGGGTGTA GGTAAAACCG TAAACATGATGGAGCTCATT CGTAACATCG CGATCGAGCA CTCCGGTTAC TCTGTGTTTG CGGGCGTAGG TGAACGTACTCGTGAGGGTA ACGACTTCTA CCACGAAATG ACCGACTCCA ACGTTATCGA CAAAGTATCC CTGGTGTATGGCCAGATGAA CGAGCCGCCG GGAAACCGTC TGCGCGTTGC TCTGACCGGT CTGACCATGG CTGAGAAATTCCGTGACGAA GGTCGTGACG TTCTGCTGTC GTTGACAACA TCTATCGTTA CACCCTGGCC GGTACGGAAGTATCCGCACT GCTGGGCCGT ATGCCTTCAG CGGTAGGTTA TCAGCCGACC CTGGCGGAAG AGATGGGCGTTCTGCAGGAA CGTATCACCT CCACCAAAAC TGGTTCTATC ACCTCCGTAC AGGCA。

以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏澳创生物科技有限公司

<120> 一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产L-色氨酸中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1417

<212> DNA

<213> 16S rRNA基因序列测定结果

<400> 1

catgcagtcg aacggtaaca ggaagaagct tgcttcttcg ctgacgagtg gcggacgggt 60

gagtaatgtc tgggaaactg cctgatggag ggggataact actggaaacg gtagctaata 120

ccgcataacg tcgcaagacc aaagaggggg accttcgggc ctcttgccat cggatgtgcc 180

cagatgggat tagctagtag gtggggtaac ggctcaccta ggcgacgatc cctagctggt 240

ctgagaggat gaccagccac actggaactg agacacggtc cagactccta cgggaggcag 300

cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag cctgatgcag ccatgccgcg tgtatgaaga 360

aggccttcgg gttgtaaagt actttcagcg gggaggaagg gagtaaagtt aatacctttg 420

ctcattgacg ttacccgcag aagaagcacc ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat 480

acggagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgcag gcggtttgtt 540

aagtcagatg tgaaatcccc gggctcaacc tgggaactgc atctgatact ggcaagcttg 600

agtctcgtag aggggggtag aattccaggt gtagcggtga aatgcgtaga gatctggagg 660

aataccggtg gcgaaggcgg ccccctggac gaagactgac gctcaggtgc gaaagcgtgg 720

ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgtcg acttggaggt 780

tgtgcccttg aggcgtggct tccggagcta acgcgttaag tcgaccgcct ggggagtacg 840

gccgcaaggt taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 900

tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac ctggtcttga catccacgga agttttcaga 960

gatgagaatg tgccttcggg aaccgtgaga caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg 1020

ttgtgaaatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttatcctttg ttgccagcgg 1080

tccggccggg aactcaaagg agactgccag tgataaactg gaggaaggtg gggatgacgt 1140

caagtcatca tggcccttac gaccagggct acacacgtgc tacaatggcg catacaaaga 1200

gaagcgacct cgcgagagca agcggacctc ataaagtgcg tcgtagtccg gattggagtc 1260

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gtaggtagct taaccttcgg gagggcgctt accactt 1417

<210> 2

<211> 815

<212> DNA

<213> atpD基因序列测定结果

<400> 2

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cgcggtctgg atgtaaaaga cctcgaacac ccgattgaag tcccggtagg taaagcgact 180

ctgggccgta tcatgaacgt actgggtgaa ccggtcgaca tgaaaggcga gatcggtgaa 240

gaagagcgtt gggcgattca ccgcgcagca ccttcctacg aagagctgtc aaactctcag 300

gaactgctgg aaaccggtat caaagttatc gacctgatgt gtccgttcgc taagggcggt 360

aaagttggtc tgttcggtgg tgcgggtgta ggtaaaaccg taaacatgat ggagctcatt 420

cgtaacatcg cgatcgagca ctccggttac tctgtgtttg cgggcgtagg tgaacgtact 480

cgtgagggta acgacttcta ccacgaaatg accgactcca acgttatcga caaagtatcc 540

ctggtgtatg gccagatgaa cgagccgccg ggaaaccgtc tgcgcgttgc tctgaccggt 600

ctgaccatgg ctgagaaatt ccgtgacgaa ggtcgtgacg ttctgctgtc gttgacaaca 660

tctatcgtta caccctggcc ggtacggaag tatccgcact gctgggccgt atgccttcag 720

cggtaggtta tcagccgacc ctggcggaag agatgggcgt tctgcaggaa cgtatcacct 780

ccaccaaaac tggttctatc acctccgtac aggca 815

Claims

1.一株大肠埃希氏菌，其特征在于：所述大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ACTrp104，该大肠埃希氏菌ACTrp104已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏日期为2018年12月3日，菌种保藏编号为CGMCC No.16861。

2.根据权利要求1所述的大肠埃希氏菌ACTrp104，其特征在于：所述大肠埃希氏菌ACTrp104在发酵生产L-色氨酸中的应用。

3.一种采用权利要求1所述的大肠埃希氏菌ACTrp104发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于：包含如下步骤：

步骤1：菌种培养

将大肠埃希氏菌ACTrp104菌种接至已灭菌的种子培养基中进行培养，培养至对数生长期；培养条件：温度30-40℃、pH值6.5-7.5、溶氧≥30%、罐压0.02-0.05MPa；

步骤2：将步骤1得到的对数生长期菌种接入已灭菌的发酵培养基中进行发酵培养30-50h，得到含L-色氨酸的发酵液；发酵培养条件：温度30-40℃、pH值6.5-7.5、溶氧≥30%、罐压0.02-0.10 MPa、发酵过程中残糖含量控制在0.05-1%。

4.根据权利要求3所述的大肠埃希氏菌ACTrp104发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于：每升种子培养基包含葡萄糖5-50g、酵母粉1-20g、硫酸铵0.5-4 g、磷酸二氢钾0.5-5g、硫酸镁0.05-2 g、柠檬酸 0.1-2 g、微量元素1份。

5.根据权利要求3所述的大肠埃希氏菌ACTrp104发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于：每升发酵培养基包含葡萄糖5-50g、酵母粉0.5-10g、硫酸铵0.5-10g、磷酸二氢钾0.5-10g、硫酸镁0.05-5g、柠檬酸0.5-10g、微量元素1份。

6.根据权利要求4或5所述的大肠埃希氏菌ACTrp104发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于：微量元素包括铁、镁、锌、铜、锰、钠和钾；每升种子培养基含有微量元素0.5-1.5g；每升发酵培养基含有微量元素0.5-1.5g。

7.根据权利要求3所述的大肠埃希氏菌ACTrp104发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于：将步骤2得到的L-色氨酸发酵液通过膜过滤去除菌体得到过滤清液，将过滤清液进行蒸发浓缩结晶，然后降温冷却结晶，进一步离心去除母液，得到湿晶，将湿晶进行干燥，得到L-色氨酸晶体。

8.根据权利要求3所述的大肠埃希氏菌ACTrp104发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于：将步骤2得到的L-色氨酸发酵液通过蒸发浓缩系统进行浓缩，然后浓缩液中加入辅料进行配制，将配制液进行喷浆造粒，得到低含量饲料级L-色氨酸颗粒产品。