CN106701735A - 一种生产dl‑色氨酸饲料添加剂的方法 - Google Patents

一种生产dl‑色氨酸饲料添加剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生产L‑色氨酸饲料添加剂的方法，其包括以下步骤：（1）L‑色氨酸高产菌株的培育；（2）将高产稳定的菌株放入培养基，在设定的发酵培养工艺条件下进行大规模发酵培养，获得L‑色氨酸发酵培养液；（3）C、L‑色氨酸的提取；（4）L‑色氨酸混合饲料的制备。本发明根据色氨酸代谢路径，设计诱变谱，通过不同诱变剂诱变筛选，得到产酸L‑色氨酸量为39.16g/L的菌株，并将L‑色氨酸发酵液应用于饲料添加剂。液态生产的L‑色氨酸饲料添加剂具有成本低廉、质量安全、动物吸收利用率高，可改善畜禽动物饲料中氨基酸平衡，提高饲料利用率与蛋白质合成。

Description

一种生产DL-色氨酸饲料添加剂的方法
技术领域
本发明属于色氨酸制备技术领域，具体为一种生产L-色氨酸饲料添加剂的方法。
背景技术
氨基酸类饲料添加剂因作用重大，价格较高，目前大多数为进口产品。猪的第一、第二限制性氨基酸为赖氨酸和蛋氨酸 ；鸡的第一、第二限制性氨基酸则刚好与之相反。而色氨酸是继赖氨酸、蛋氨酸之后的主要限制性氨基酸，其在自然界含量甚少，具有多种重要的生理功能。由于目前我国配合饲料中大量添加赖氨酸和蛋氨酸，使色氨酸处于相对缺乏的状态，需求量呈上升趋势 ；同时由于色氨酸的发酵产酸率很低，难以工业化大量生产，导致其价格高昂，目前需要大量进口。
色氨酸的生产方法主要有早期的化学合成法和蛋白质水解法，以及后来发展起来的微生物法。其中微生物法随着研究的不断深入，已经走向实用并且处于主导地位。微生物法大致可分为直接发酵法、微生物转化法和酶法。由于重组 DNA 技术在微生物育种中的应用，为优良的色氨酸生产菌株的筛选和产酸水平的提高提供了可靠的技术保障，使微生物直接发酵法生产色氨酸成为一种廉价的工业工业化生产方法。运用于色氨酸生产的菌种有谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、北京棒杆菌等。
近年来，随着蛋氨酸、赖氨酸的大量饲料化应用，色氨酸在饲料添加剂上的应用日益广泛。在我国对直接发酵法生产色氨酸虽作了一些研究工作，但发酵产酸水平较低。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种成本低廉、质量安全、产率高的生产L-色氨酸饲料添加剂的方法，具体技术方案如下：
一种生产L- 色氨酸饲料添加剂的方法，包括以下步骤：
A、L- 色氨酸高产菌株的培育
以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过对其进行紫外、亚硝酸钠、硫酸二乙酯以及亚硝基胍诱变以及一系列初筛和复筛得到高产稳定的菌株；
B、将高产稳定的菌株放入培养基，在设定的发酵培养工艺条件下进行大规模发酵培养，获得L-色氨酸发酵培养液；
所述种子培养基各组分的重量比为：葡萄糖6-8，硫酸铵0.3-0.4，玉米浆5-6，酵母膏1.2-1.5，硫酸镁0.02-0.03，磷酸二氢钾0.2-0.3，磷酸氢二钾0.1-0.2，pH7.0-7.5；
所述发酵培养基各组分的重量比为：蔗糖5-7，磷酸二氢钾0.2-0.3，磷酸氢二钾 0.13-0.15，硫酸镁0.08-0.12，硫酸铵0.8-1.2，玉米浆5-6，硫酸亚铁0.0013-0.0015，硫酸锰0.0013-0.0015，硫酸铜0.0006-0.0007，L- 酪氨酸0.035-0.045，盐酸硫胺0.00004-0.000045，pH7.0-7.5；
C、L-色氨酸的提取
将L-色氨酸发酵液升温灭菌、调酸后，经管式超滤膜过滤得过滤清液和过滤浓液，超滤膜过滤清液经蒸发浓缩、结晶得L-色氨酸晶体和结晶母液，L-色氨酸晶体溶解后并经卷式超滤膜过滤脱色，卷式超滤膜的脱色液经蒸发浓缩、结晶、烘干得L-色氨酸；
D、卷式超滤膜浓缩液两次结晶，母液干燥后与饲料载体混合配制成混合饲料。
优选的，所述谷氨酸棒杆菌为LZS-1和LZS-2。
优选的，所述种子培养基各组分的重量比为：葡萄糖7，硫酸铵0.35，玉米浆5，酵母膏1.4，硫酸镁0.02，磷酸二氢钾0.25，磷酸氢二钾0.15，pH7.2；
所述发酵培养基各组分的重量比为：蔗糖5，磷酸二氢钾0.25，磷酸氢二钾 0.13，硫酸镁0.08，硫酸铵1.0，玉米浆5，硫酸亚铁0.0013，硫酸锰0.0013，硫酸铜0.0006，L-酪氨酸0.04，盐酸硫胺0.00004，pH7.2。
优选的，发酵培养工艺为，将高产稳定的菌种以 10％的接种量接入发酵培养基，控制温度 33-35℃，添加氨水调节 pH7.0-7.5，添加消泡剂，通气量200L/h，转速与溶氧联动，控制溶氧 30％，分批高浓度补糖。
优选的，分批高浓度补糖，补糖浓度为300g/L，补糖时间为每12小时补一次。
本发明根据色氨酸代谢路径，设计诱变谱，通过不同诱变剂诱变筛选，得到产酸L-色氨酸量为39.16g/L的菌株，并将 L-色氨酸发酵液应用于饲料添加剂。液态生产的 L-色氨酸饲料添加剂具有成本低廉、质量安全、动物吸收利用率高，可改善畜禽动物饲料中氨基酸平衡，提高饲料利用率与蛋白质合成。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
1、L- 色氨酸的高产菌的选育与生物学特性
对出发菌谷氨酸棒杆菌LZS-1和LZS-2进行紫外、亚硝酸钠、硫酸二乙酯以及亚硝基胍诱变以及一系列初筛和复筛，得到产酸L-色氨酸量为38.27g/L的菌株。该菌为酪氨酸营养缺陷型，对6-氟色氨酸、5-甲基色氨酸、5-氟色氨酸、4-氟苯丙氨酸、磺胺胍和肉桂酸表现出不同程度的抗性。
(1)、紫外诱变
在固定紫外灯40瓦，距离20cm的条件下，经过60s的紫外照射诱变。
(2)、亚硝酸钠诱变
固定NaNO2诱变浓度为0.03mol/L，经过360s的诱变。
(3)、硫酸二乙酯(DES)诱变
以25％Na282O3水溶液为诱变剂，经过30min诱变后。
(4)、亚硝基胍 (NTG) 诱变
固定诱变条件NTG的浓度为100μg/mL，室温下，诱变20min。
(5)、诱变菌JMU-N4-102抗性表型分析
对经过上述一系列诱变筛选，最终得到的高产突变菌进行抗性表型实验分析，经过在添加不同浓度、不同药物平板上，该菌对所实验的药物6-氟色氨酸、5-甲基色氨酸、4-氟苯丙氨酸、磺胺胍和肉桂酸均表现出不同程度的抗性。
2、L-色氨酸的规模化生产
将高产稳定的菌株放入培养基，在设定的发酵培养工艺条件下进行大规模发酵培养，获得L-色氨酸发酵培养液。
所述种子培养基各组分的重量比为：葡萄糖6，硫酸铵0.35，玉米浆5，酵母膏1.2，硫酸镁0.03，磷酸二氢钾0.2，磷酸氢二钾0.1，pH7.0；
所述发酵培养基各组分的重量比为：蔗糖6，磷酸二氢钾0.3，磷酸氢二钾0.15，硫酸镁0.12，硫酸铵1.2，玉米浆6，硫酸亚铁0.0015，硫酸锰0.0015，硫酸铜0.0007，L-酪氨酸0.045，盐酸硫胺0.000045，pH7.0。
发酵培养工艺为，将高产稳定的菌种以 10％的接种量接入发酵培养基，控制温度33-35℃，添加氨水调节 pH7.0-7.5，添加消泡剂，通气量200L/h，转速与溶氧联动，控制溶氧 30％，分批高浓度补糖。补糖浓度为300g/L，补糖时间每12小时一次。
3、L-色氨酸的提取
将L-色氨酸发酵液升温灭菌、调酸后，经管式超滤膜过滤得过滤清液和过滤浓液，超滤膜过滤清液经蒸发浓缩、结晶得L-色氨酸晶体和结晶母液，L-色氨酸晶体溶解后并经卷式超滤膜过滤脱色，卷式超滤膜的脱色液经蒸发浓缩、结晶、烘干得L-色氨酸。
4、L-色氨酸的饲料添加剂制备及应用
卷式超滤膜浓缩液两次结晶，母液干燥后与饲料载体混合配制成混合饲料。
在肉鸡饲料中加入重量百分比0.05％的L-色氨酸，肉仔鸡饲料配方如下(重量百分比)：玉米58.8、豆粕30.8、大豆油2.5、磷酸氢钙1.4、食盐0.3、石粉1.2、L-色氨酸发酵液5。将此配料按比例搅拌均匀，饲养1周龄肉仔鸡，饲喂4周后，肉鸡稳定生长，与饲喂未添加L-色氨酸饲料的对照组相比，实验组肉鸡的采食量增加，肉鸡攻击性降低，抗病率增强，仔鸡增重率比对照组提高11.16％。
实施例2
与实施例1不同在于：
所述种子培养基各组分的重量比为：葡萄糖7，硫酸铵0.35，玉米浆5，酵母膏1.4，硫酸镁0.02，磷酸二氢钾0.25，磷酸氢二钾0.15，pH7.2；
所述发酵培养基各组分的重量比为：蔗糖5，磷酸二氢钾0.25，磷酸氢二钾 0.13，硫酸镁0.08，硫酸铵1.0，玉米浆5，硫酸亚铁0.0013，硫酸锰0.0013，硫酸铜0.0006，L-酪氨酸0.04，盐酸硫胺0.00004，pH7.2。
实施例3
与实施例1不同在于：
所述种子培养基各组分的重量比为：葡萄糖8，硫酸铵0.4，玉米浆6，酵母膏1.5，硫酸镁0.03，磷酸二氢钾0.3，磷酸氢二钾0.2，pH7.5；
所述发酵培养基各组分的重量比为：蔗糖5.5，磷酸二氢钾0.2，磷酸氢二钾 0.14，硫酸镁0.10，硫酸铵0.8，玉米浆5.5，硫酸亚铁0.0014，硫酸锰0.0014，硫酸铜0.0006，L- 酪氨酸0.035，盐酸硫胺0.00004，pH7.5。

Claims (5)

1.一种生产L- 色氨酸饲料添加剂的方法，其特征在于，包括以下步骤 ：
A、L- 色氨酸高产菌株的培育
以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过对其进行紫外、亚硝酸钠、硫酸二乙酯以及亚硝基胍诱变以及一系列初筛和复筛得到高产稳定的菌株；
B、将高产稳定的菌株放入培养基，在设定的发酵培养工艺条件下进行大规模发酵培养，获得L-色氨酸发酵培养液；
所述种子培养基各组分的重量比为：葡萄糖6-8，硫酸铵0.3-0.4，玉米浆5-6，酵母膏1.2-1.5，硫酸镁0.02-0.03，磷酸二氢钾0.2-0.3，磷酸氢二钾0.1-0.2，pH7.0-7.5；
所述发酵培养基各组分的重量比为：蔗糖5-7，磷酸二氢钾0.2-0.3，磷酸氢二钾 0.13-0.15，硫酸镁0.08-0.12，硫酸铵0.8-1.2，玉米浆5-6，硫酸亚铁0.0013-0.0015，硫酸锰0.0013-0.0015，硫酸铜0.0006-0.0007，L- 酪氨酸0.035-0.045，盐酸硫胺0.00004-0.000045，pH7.0-7.5；
C、L-色氨酸的提取
将L-色氨酸发酵液升温灭菌、调酸后，经管式超滤膜过滤得过滤清液和过滤浓液，超滤膜过滤清液经蒸发浓缩、结晶得L-色氨酸晶体和结晶母液，L-色氨酸晶体溶解后并经卷式超滤膜过滤脱色，卷式超滤膜的脱色液经蒸发浓缩、结晶、烘干得L-色氨酸；
D、卷式超滤膜浓缩液两次结晶，母液干燥后与饲料载体混合配制成混合饲料。
2.如权利要求1所述的生产L-色氨酸饲料添加剂的方法，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌为LZS-1和LZS-2。
3.如权利要求1所述的生产L-色氨酸饲料添加剂的方法，其特征在于：
所述种子培养基各组分的重量比为：葡萄糖7，硫酸铵0.35，玉米浆5，酵母膏1.4，硫酸镁0.02，磷酸二氢钾0.25，磷酸氢二钾0.15，pH7.2；
所述发酵培养基各组分的重量比为：蔗糖5，磷酸二氢钾0.25，磷酸氢二钾 0.13，硫酸镁0.08，硫酸铵1.0，玉米浆5，硫酸亚铁0.0013，硫酸锰0.0013，硫酸铜0.0006，L-酪氨酸0.04，盐酸硫胺0.00004，pH7.2。
4.如权利要求 1 所述的生产L-色氨酸饲料添加剂的方法，其特征在于：发酵培养工艺为，将高产稳定的菌种以 10％的接种量接入发酵培养基，控制温度 33-35℃，添加氨水调节 pH7.0-7.5，添加消泡剂，通气量200L/h，转速与溶氧联动，控制溶氧 30％，分批高浓度补糖。
5.如权利要求4所述的生产L-色氨酸饲料添加剂的方法，其特征在于：分批高浓度补糖，补糖浓度为300g/L，补糖时间为每12小时补一次。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114480173A (zh) * 2021-12-27 2022-05-13 江苏澳创生物科技有限公司 一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产l-色氨酸中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101878856A (zh) * 2009-05-08 2010-11-10 集美大学 利用发酵法生产l-色氨酸饲料添加剂
CN103435531A (zh) * 2013-09-05 2013-12-11 长沙道勤生物科技有限公司 饲料添加剂dl-色氨酸的制备方法
CN104262230A (zh) * 2014-09-22 2015-01-07 江苏久吾高科技股份有限公司 一种l-色氨酸的提取方法及装置

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101878856A (zh) * 2009-05-08 2010-11-10 集美大学 利用发酵法生产l-色氨酸饲料添加剂
CN103435531A (zh) * 2013-09-05 2013-12-11 长沙道勤生物科技有限公司 饲料添加剂dl-色氨酸的制备方法
CN104262230A (zh) * 2014-09-22 2015-01-07 江苏久吾高科技股份有限公司 一种l-色氨酸的提取方法及装置

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
罗建成: "《L-色氨酸基因工程菌发酵培养基配方优化研究》", 《生物技术》 *
赵春光: "《微生物法生产L-色氨酸的研究进展》", 《发酵科技通讯》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114480173A (zh) * 2021-12-27 2022-05-13 江苏澳创生物科技有限公司 一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产l-色氨酸中的应用
CN114480173B (zh) * 2021-12-27 2024-02-09 江苏澳创生物科技有限公司 一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产l-色氨酸中的应用

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