CN108567845A - 一种防治结肠炎的生物发酵产品及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种防治动物结肠炎的生物发酵产品及其制备方法，对结肠炎具有一定的防治作用，本发明稳定性高，发酵后丁酸梭菌的活菌量、多糖含量与对照组相比有很大增长。说明龙眼浸提液能促进丁酸梭菌的生长，进一步提高了含丁酸梭菌益生菌制剂的产品性能，在生物工程发酵领域发挥着重要的作用。

Description

一种防治结肠炎的生物发酵产品及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种防治动物结肠炎的生物发酵产品及其制备方法，属于生物工程领域。
背景技术
丁酸梭菌作为饲料添加剂具有促生长，提高饲料转化率的作用，是极有利用价值和开发前景的菌种。但是丁酸梭菌的研究时间不长，与其它的益生菌相关的微生态制剂相比，丁酸梭菌微生态制剂的研究还处于初始阶段。目前市面上的含丁酸梭菌的微生态制剂存在一定的不足。而液体发酵是生产丁酸梭菌工艺的关键一步，其中发酵培养基的性质，发酵条件(温度、pH及接种量等)都会直接影响到丁酸梭菌液体发酵的水平。本发明为进一步提高含丁酸梭菌的益生菌制剂的产品性能提供了新的思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种防治动物结肠炎的生物发酵产品。
本发明的再一目的在于提供一种防治动物结肠炎的生物发酵产品的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种防治动物结肠炎的生物发酵产品的应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种防治动物结肠炎的生物发酵产品的制备方法，由丁酸梭菌对龙眼浸提液进行发酵所得。
进一步的，包括以下步骤：
1)取龙眼果肉浆，纤维素酶解反应后，灭菌，过滤取上清，减压浓缩至原体积的30～ 50％，得龙眼浸提液；
2)将龙眼浸提液与灭菌培养基按体积比(1～4)：(6～9)混合，调节pH为5～9，得龙眼发酵培养基；
3)将丁酸梭菌接种到龙眼发酵培养基，其中丁酸梭菌的接种量1％～4％，厌氧发酵12～ 20h，得龙眼发酵液，即防治动物结肠炎的生物发酵产品。
进一步的，包括以下步骤：
1)取龙眼果肉浆，纤维素酶解反应后，灭菌，过滤取上清，减压浓缩至原体积的20～ 30％，得龙眼浸提液；
2)将龙眼浸提液与灭菌培养基按体积比(2～3)：(7～8)混合，调节pH为6～7，得龙眼发酵培养；
3)将丁酸梭菌接种到龙眼发酵培养基，其中丁酸梭菌的接种量2％～3％，厌氧发酵15～ 17h，得龙眼发酵液，即防治动物结肠炎的生物发酵产品。
进一步的，包括以下步骤：
1)取龙眼果肉浆，纤维素酶解反应后，灭菌，过滤取上清，减压浓缩至原体积的30％，得龙眼浸提液；
2)将龙眼浸提液与灭菌培养基按体积比2:8混合，调节pH为7，得龙眼发酵培养基；
3)将丁酸梭菌接种到龙眼发酵培养基，其中丁酸梭菌的接种量3％，厌氧发酵16h，得龙眼发酵液，即防治动物结肠炎的生物发酵产品。
进一步的，所述龙眼果肉浆制备方法为，将水和龙眼果肉按液料比(15ml～20ml):1g混合，进行匀浆得到。
进一步的，步骤1)所述的纤维素酶解反应中，纤维素酶添加量为1％～2％w/v、酶解反应温度30～60℃、酶解反应时间150～210min。
进一步的，步骤2)中所述的发酵温度为35～38℃、时间为15～17h。
进一步的，步骤2)、3)中所述的灭菌培养基为肉汤培养基。
进一步的，步骤4)中使用液体石蜡、油液封。
上述任一项所述的方法制备的龙眼发酵液。
上述所述龙眼发酵液在制备防治动物结肠炎产品中的应用。
进一步的，所述的结肠炎为溃疡性结肠炎。
上述所述龙眼发酵液在制备抑制小鼠结肠炎症因子产品中的应用；所述的炎症因子为IL-6 和TNF-α。
上述所述龙眼发酵液在制备促进小鼠结肠炎症因子产品中的应用；所述的炎症因子为 IL-10。
本发明的有益效果是：
本发明的龙眼发酵液对结肠炎小鼠具有一定的防护作用，而且龙眼发酵液稳定性高，发酵后丁酸梭菌的活菌量高，发酵后多糖含量与对照组相比有很大增长。龙眼浸提液促进丁酸梭菌的生长，在生产上进一步提高了含丁酸梭菌益生菌制剂的产品性能，在生物工程发酵领域发挥着重要的作用。
附图说明
图1为葡萄糖浓度与吸光度A的标准曲线图。
图2为本发明的丁酸梭菌实物图。
图3为龙眼多糖添加量与丁酸梭菌活菌量关系的柱状图，其中测量指标以表示，** 表示差异性显著。
图4为丁酸梭菌接种量与丁酸梭菌活菌量关系的柱状图，同上。
图5为发酵时间与丁酸梭菌活菌量关系的柱状图，同上。
图6为初始pH与丁酸梭菌活菌量关系的柱状图，同上。
图7为本发明最优发酵工艺试验前后的活菌量柱状图，同上。
图8为本发明最优发酵工艺试验前后的多糖含量柱状图，同上。
图9为各组小鼠体重变化折线图。测量指标以表示，相对于Ⅰ组而言，**表示差异性极显著，*表示差异性显著；相对于III组而言，#表示差异性显著。
图10为各组小鼠的结肠长度柱状统计图，同上。
图11为各组小鼠的DAL评分柱状图。
图12为各组小鼠的临床评分柱状图。
图13为Ⅰ组(A)、Ⅱ组(B)和Ⅲ组(C)的小鼠结肠组织HE染色切片(HE×200)。
图14为各组小鼠的组织学损伤评分柱状图，**表示相对于III组而言差异性极显著。
图15为龙眼发酵液对小鼠血清IL-6含量影响的柱状统计图。测量指标以表示，相对于Ⅰ组而言，*表示差异性显著；相对于III组而言，#表示差异性显著。
图16为龙眼发酵液对小鼠血清IL-10含量影响的柱状统计图。测量指标以表示，相对于Ⅰ组而言，**表示差异性极显著，*表示差异性显著；相对于III组而言，#表示差异性显著。
图17为龙眼发酵液对小鼠血清TNF-α含量影响的柱状统计图。测量指标以表示，相对于Ⅰ组而言，*表示差异性显著；相对于III组而言，#表示差异性显著。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
菌种：丁酸梭菌(Clostridium butyricum，GIMCC GIM1.676)，购自广东省微生物研究所菌种保藏中心。
龙眼品种：广东省高州市“鸡眼”品种的干龙眼。
实施例1丁酸梭菌发酵龙眼的发酵工艺
(1)龙眼浸提液的提取方法
称取干龙眼，捣碎匀浆，水和龙眼果肉按液料比15ml:1g混合，进行匀浆得到龙眼果肉浆，纤维素酶添加量为1.2％w/v、酶解温度45.0℃、酶解时间187.0min的条件下，放在转速为120r/min的摇床上进行酶解提取实验。提取结束后80℃水浴灭酶10min。经八层纱布过滤，弃去残渣，得上清液。将上清液减压浓缩至原体积的40％，得到龙眼浸提液。
(2)标准曲线制作
准确称量干燥的葡萄糖100mg，用去离子水溶解并定容于100mL容量瓶中，得到1mg/mL 葡萄糖标准液。用移液枪分别精确地吸取0，100，200，300，400，500，600μL的1mg/mL葡萄糖标准液于10mL容量瓶中定容，摇匀，得一系列不同浓度(0，10，20，30，40，50， 60μg/mL)的葡萄糖标准溶液。移取上述不同浓度的标准溶液2.0mL于10mL的试管中，依次加入6％苯酚溶液1.0mL，摇匀，再加入5.0mL浓硫酸，盖上胶塞，摇匀后置于沸水浴中加热25min，再迅速冷水浴直至冷却至室温，用紫外分光光度计在490nm处测定待测样品的吸光度。以葡萄糖浓度(μg/mL)为横坐标、以每个浓度相对应下的吸光度(A)为纵坐标，进行线性拟合后得到线性回归方程，即标准曲线。如图1所示。
(3)龙眼浸提液的多糖含量测定
先吸取一定量的龙眼浸提液，再加入四倍体积的无水乙醇，充分混合后放置于4℃冰箱中静置1h使其充分沉淀。然后在12000r/min下离心15min，除去上清液后取得淡黄色沉淀。沉淀用75％乙醇重复洗涤2次，以清除粗多糖沉淀中的单糖杂质。洗涤后将沉淀物用85℃水溶解，然后用苯酚-硫酸法以及步骤(2)得出的标准曲线，得知浸提液的多糖含量。苯酚-硫酸法原理：糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。
由于单糖和寡糖等物质在上述处理方法中已被去除，所以用此方法测得的总糖含量即为龙眼多糖含量。本发明测定的龙眼浸提液中的多糖得率为10.62mg/g，其计算公式如下：
结果：如图3所示，30％龙眼多糖添加量的丁酸梭菌活菌量最多，达到1.16×109cfu/mL。
(4)丁酸梭菌活化
从-80℃冰箱中取出丁酸梭菌菌种冻存管，立即放置在0℃冰盒中解冻。在无菌超净工作台内将解冻的菌液接入灭菌的肉汤培养基中，加入适量的液体石蜡液封后放入37℃恒温箱中培养24h。
结果：如图2所示丁酸梭菌呈圆形，稍凸起，边缘不规则，颜色为白色或淡黄色，不透明，表面湿润光滑，略有酸臭味。
(5)龙眼发酵培养基配制
将龙眼浸提液与灭菌的肉汤培养基按体积比2:8的比例混合均匀，得到龙眼发酵培养基，并调整初始pH为6。
(6)接菌发酵
量取10mL龙眼发酵培养基分装于数只10mL试管中，在121℃高压灭菌20min，待培养基冷却至室温后在无菌超净工作台中接入已培养好的丁酸梭菌菌液，丁酸梭菌的接菌量为 2％，并且加适量油液封后放入37℃恒温箱中进行发酵，发酵时间为15h。
实施例2丁酸梭菌发酵龙眼的发酵工艺
(1)龙眼浸提液的提取方法
称取干龙眼，捣碎匀浆，水和龙眼果肉按液料比20ml:1g混合，进行匀浆得到龙眼果肉浆，纤维素酶添加量为2％w/v、酶解温度60.0℃、酶解时间210min的条件下，放在转速为 120r/min的摇床上进行酶解提取实验。提取结束后80℃水浴灭酶10min，经八层纱布过滤，弃去残渣，得上清液。将上清液减压浓缩至原体积的30％，得到龙眼浸提液。
(2)标准曲线制作
准确称量干燥的葡萄糖100mg，用去离子水溶解并定容于100mL容量瓶中，得到1mg/mL 葡萄糖标准液。用移液枪分别精确地吸取0，100，200，300，400，500，600μL的1mg/mL葡萄糖标准液于10mL容量瓶中定容，摇匀，得一系列不同浓度(0，10，20，30，40，50， 60μg/mL)的葡萄糖标准溶液。移取上述不同浓度的标准溶液2.0mL于10mL的试管中，依次加入6％苯酚溶液1.0mL，摇匀，再加入5.0mL浓硫酸，盖上胶塞，摇匀后置于沸水浴中加热25min，再迅速冷水浴直至冷却至室温，用紫外分光光度计在490nm处测定待测样品的吸光度。以葡萄糖浓度(μg/mL)为横坐标、以每个浓度相对应下的吸光度(A)为纵坐标，进行线性拟合后得到线性回归方程，即标准曲线。如图1所示。
(3)龙眼浸提液的多糖含量测定
先吸取一定量的龙眼浸提液，再加入四倍体积的无水乙醇，充分混合后放置于4℃冰箱中静置1h使其充分沉淀。然后在12000r/min下离心15min，除去上清液后取得淡黄色沉淀。沉淀用75％乙醇重复洗涤2次，以清除粗多糖沉淀中的单糖杂质。洗涤后将沉淀物用85℃水溶解，然后用苯酚-硫酸法以及步骤(2)得出的标准曲线，得知浸提液的多糖含量。
由于单糖和寡糖等物质在上述处理方法中已被去除，所以用此方法测得的总糖含量即为龙眼多糖含量。本发明测定的龙眼浸提液中的多糖得率为10.62mg/g，其计算公式如下：
(4)丁酸梭菌活化
从-80℃冰箱中取出丁酸梭菌菌种冻存管，立即放置在0℃冰盒中解冻。在无菌超净工作台内将解冻的菌液接入灭菌的肉汤培养基中，加入适量的液体石蜡液封后放入37℃恒温箱中培养24h。
结果：如图2所示丁酸梭菌呈圆形，稍凸起，边缘不规则，颜色为白色或淡黄色，不透明，表面湿润光滑，略有酸臭味。
(5)龙眼发酵培养基配制
将龙眼浸提液与灭菌的肉汤培养基按体积比3:7的比例混合均匀，得到龙眼发酵培养基，并调整初始pH为7。
(6)接菌发酵
量取10mL龙眼发酵培养基分装于数只10mL试管中，在121℃高压灭菌20min，待培养基冷却至室温后在无菌超净工作台中接入已培养好的丁酸梭菌菌液，丁酸梭菌的接菌量为 3％，并且加适量液体石蜡液封后放入38℃恒温箱中进行发酵，发酵时间为17h。
实施例3丁酸梭菌发酵龙眼的发酵工艺
(1)龙眼浸提液的提取方法
称取干龙眼，捣碎匀浆，水和龙眼果肉按液料比16ml:1g混合，进行匀浆得到龙眼果肉浆，纤维素酶添加量为1.5％w/v、酶解温度45.0℃、酶解时间180min的条件下，放在转速为 120r/min的摇床上进行酶解提取实验。提取结束后80℃水浴灭酶10min，经八层纱布过滤，弃去残渣，得上清液。将上清液减压浓缩至原体积的30％，得到龙眼浸提液。
(2)标准曲线制作
准确称量干燥的葡萄糖100mg，用去离子水溶解并定容于100mL容量瓶中，得到1mg/mL 葡萄糖标准液。用移液枪分别精确地吸取0，100，200，300，400，500，600μL的1mg/mL葡萄糖标准液于10mL容量瓶中定容，摇匀，得一系列不同浓度(0，10，20，30，40，50， 60μg/mL)的葡萄糖标准溶液。移取上述不同浓度的标准溶液2.0mL于10mL的试管中，依次加入6％苯酚溶液1.0mL，摇匀，再加入5.0mL浓硫酸，盖上胶塞，摇匀后置于沸水浴中加热25min，再迅速冷水浴直至冷却至室温，用紫外分光光度计在490nm处测定待测样品的吸光度。以葡萄糖浓度(μg/mL)为横坐标、以每个浓度相对应下的吸光度(A)为纵坐标，进行线性拟合后得到线性回归方程，即标准曲线。如图1所示。
(3)龙眼浸提液的多糖含量测定
先吸取一定量的龙眼浸提液，再加入四倍体积的无水乙醇，充分混合后放置于4℃冰箱中静置1h使其充分沉淀。然后在12000r/min下离心15min，除去上清液后取得淡黄色沉淀。沉淀用75％乙醇重复洗涤2次，以清除粗多糖沉淀中的单糖杂质。洗涤后将沉淀物用85℃水溶解，然后用苯酚-硫酸法以及步骤(2)得出的标准曲线，得知浸提液的多糖含量。
由于单糖和寡糖等物质在上述处理方法中已被去除，所以用此方法测得的总糖含量即为龙眼多糖含量。本发明测定的龙眼浸提液中的多糖得率为10.62mg/g，其计算公式如下：
(4)丁酸梭菌活化
从-80℃冰箱中取出丁酸梭菌菌种冻存管，立即放置在0℃冰盒中解冻。在无菌超净工作台内将解冻的菌液接入灭菌的肉汤培养基中，加入适量的液体石蜡液封后放入37℃恒温箱中培养24h。
结果：如图2所示丁酸梭菌呈圆形，稍凸起，边缘不规则，颜色为白色或淡黄色，不透明，表面湿润光滑，略有酸臭味。
(5)龙眼发酵培养基配制
将龙眼浸提液与灭菌的肉汤培养基按体积比2:8的比例混合均匀，得到龙眼发酵培养基，并调整初始pH为7。
(6)接菌发酵
量取10mL龙眼发酵培养基分装于数只10mL试管中，在121℃高压灭菌20min，待培养基冷却至室温后在无菌超净工作台中接入已培养好的丁酸梭菌菌液，丁酸梭菌的接菌量为 3％，并且加适量液体石蜡液封后放入38℃恒温箱中进行发酵，发酵时间为16h。
实施例4丁酸梭菌发酵龙眼的发酵工艺
(1)龙眼浸提液的提取方法
称取干龙眼，捣碎匀浆，水和龙眼果肉按液料比16ml:1g混合，进行匀浆得到龙眼果肉浆，纤维素酶添加量为1.5％w/v、酶解温度45.0℃、酶解时间180min的条件下，放在转速为 120r/min的摇床上进行酶解提取实验。提取结束后80℃水浴灭酶10min，经八层纱布过滤，弃去残渣，得上清液。将上清液减压浓缩至原体积的30％，得到龙眼浸提液。
(2)标准曲线制作
准确称量干燥的葡萄糖100mg，用去离子水溶解并定容于100mL容量瓶中，得到1mg/mL 葡萄糖标准液。用移液枪分别精确地吸取0，100，200，300，400，500，600μL的1mg/mL葡萄糖标准液于10mL容量瓶中定容，摇匀，得一系列不同浓度(0，10，20，30，40，50， 60μg/mL)的葡萄糖标准溶液。移取上述不同浓度的标准溶液2.0mL于10mL的试管中，依次加入6％苯酚溶液1.0mL，摇匀，再加入5.0mL浓硫酸，盖上胶塞，摇匀后置于沸水浴中加热25min，再迅速冷水浴直至冷却至室温，用紫外分光光度计在490nm处测定待测样品的吸光度。以葡萄糖浓度(μg/mL)为横坐标、以每个浓度相对应下的吸光度(A)为纵坐标，进行线性拟合后得到线性回归方程，即标准曲线。如图1所示。
(3)龙眼浸提液的多糖含量测定
先吸取一定量的龙眼浸提液，再加入四倍体积的无水乙醇，充分混合后放置于4℃冰箱中静置1h使其充分沉淀。然后在12000r/min下离心15min，除去上清液后取得淡黄色沉淀。沉淀用75％乙醇重复洗涤2次，以清除粗多糖沉淀中的单糖杂质。洗涤后将沉淀物用85℃水溶解，然后用苯酚-硫酸法以及步骤(2)得出的标准曲线，得知浸提液的多糖含量。
由于单糖和寡糖等物质在上述处理方法中已被去除，所以用此方法测得的总糖含量即为龙眼多糖含量。本发明测定的龙眼浸提液中的多糖得率为10.62mg/g，其计算公式如下：
(4)丁酸梭菌活化
从-80℃冰箱中取出丁酸梭菌菌种冻存管，立即放置在0℃冰盒中解冻。在无菌超净工作台内将解冻的菌液接入灭菌的肉汤培养基中，加入适量的液体石蜡液封后放入37℃恒温箱中培养24h。
结果：如图2所示丁酸梭菌呈圆形，稍凸起，边缘不规则，颜色为白色或淡黄色，不透明，表面湿润光滑，略有酸臭味。
(5)龙眼发酵培养基配制
将龙眼浸提液与灭菌的肉汤培养基按体积比2:8的比例混合均匀，得到龙眼发酵培养基，并调整初始pH为6.5。
(6)接菌发酵
量取10mL龙眼发酵培养基分装于数只10mL试管中，在121℃高压灭菌20min，待培养基冷却至室温后在无菌超净工作台中接入已培养好的丁酸梭菌菌液，丁酸梭菌的接菌量为2.5％，并且加适量液体石蜡液封后放入38℃恒温箱中进行发酵，发酵时间为16h。
实施例5丁酸梭菌发酵龙眼的发酵工艺
(1)龙眼浸提液的提取方法
称取干龙眼，捣碎匀浆，水和龙眼果肉按液料比17ml:1g混合，进行匀浆得到龙眼果肉浆，纤维素酶添加量为1.5％w/v、酶解温度45.0℃、酶解时间180min的条件下，放在转速为 120r/min的摇床上进行酶解提取实验。提取结束后80℃水浴灭酶10min，经八层纱布过滤，弃去残渣，得上清液。将上清液减压浓缩至原体积的50％，得到龙眼浸提液。
(2)标准曲线制作
准确称量干燥的葡萄糖100mg，用去离子水溶解并定容于100mL容量瓶中，得到1mg/mL 葡萄糖标准液。用移液枪分别精确地吸取0，100，200，300，400，500，600μL的1mg/mL葡萄糖标准液于10mL容量瓶中定容，摇匀，得一系列不同浓度(0，10，20，30，40，50， 60μg/mL)的葡萄糖标准溶液。移取上述不同浓度的标准溶液2.0mL于10mL的试管中，依次加入6％苯酚溶液1.0mL，摇匀，再加入5.0mL浓硫酸，盖上胶塞，摇匀后置于沸水浴中加热25min，再迅速冷水浴直至冷却至室温，用紫外分光光度计在490nm处测定待测样品的吸光度。以葡萄糖浓度(μg/mL)为横坐标、以每个浓度相对应下的吸光度(A)为纵坐标，进行线性拟合后得到线性回归方程，即标准曲线。如图1所示。
(3)龙眼浸提液的多糖含量测定
先吸取一定量的龙眼浸提液，再加入四倍体积的无水乙醇，充分混合后放置于4℃冰箱中静置1h使其充分沉淀。然后在12000r/min下离心15min，除去上清液后取得淡黄色沉淀。沉淀用75％乙醇重复洗涤2次，以清除粗多糖沉淀中的单糖杂质。洗涤后将沉淀物用85℃水溶解，然后用苯酚-硫酸法以及步骤(2)得出的标准曲线，得知浸提液的多糖含量。
由于单糖和寡糖等物质在上述处理方法中已被去除，所以用此方法测得的总糖含量即为龙眼多糖含量。本发明测定的龙眼浸提液中的多糖得率为10.62mg/g，其计算公式如下：
(4)丁酸梭菌活化
从-80℃冰箱中取出丁酸梭菌菌种冻存管，立即放置在0℃冰盒中解冻。在无菌超净工作台内将解冻的菌液接入灭菌的肉汤培养基中，加入适量的液体石蜡液封后放入37℃恒温箱中培养24h。
结果：如图2所示丁酸梭菌呈圆形，稍凸起，边缘不规则，颜色为白色或淡黄色，不透明，表面湿润光滑，略有酸臭味。
(5)龙眼发酵培养基配制
将龙眼浸提液与灭菌的肉汤培养基按体积比1:9的比例混合均匀，得到龙眼发酵培养基，并调整初始pH为9。
(6)接菌发酵
量取10mL龙眼发酵培养基分装于数只10mL试管中，在121℃高压灭菌20min，待培养基冷却至室温后在无菌超净工作台中接入已培养好的丁酸梭菌菌液，丁酸梭菌的接菌量为 4％，并且加适量液体石蜡液封后放入38℃恒温箱中进行发酵，发酵时间为20h。
实施例6丁酸梭菌发酵龙眼的发酵工艺
(1)龙眼浸提液的提取方法
称取干龙眼，捣碎匀浆，水和龙眼果肉按液料比15ml:1g混合，进行匀浆得到龙眼果肉浆，纤维素酶添加量为1.5％w/v、酶解温度45.0℃、酶解时间180min的条件下，放在转速为 120r/min的摇床上进行酶解提取实验。提取结束后80℃水浴灭酶10min，经八层纱布过滤，弃去残渣，得上清液。将上清液减压浓缩至原体积的30％，得到龙眼浸提液。
(2)标准曲线制作
准确称量干燥的葡萄糖100mg，用去离子水溶解并定容于100mL容量瓶中，得到1mg/mL 葡萄糖标准液。用移液枪分别精确地吸取0，100，200，300，400，500，600μL的1mg/mL葡萄糖标准液于10mL容量瓶中定容，摇匀，得一系列不同浓度(0，10，20，30，40，50， 60μg/mL)的葡萄糖标准溶液。移取上述不同浓度的标准溶液2.0mL于10mL的试管中，依次加入6％苯酚溶液1.0mL，摇匀，再加入5.0mL浓硫酸，盖上胶塞，摇匀后置于沸水浴中加热25min，再迅速冷水浴直至冷却至室温，用紫外分光光度计在490nm处测定待测样品的吸光度。以葡萄糖浓度(μg/mL)为横坐标、以每个浓度相对应下的吸光度(A)为纵坐标，进行线性拟合后得到线性回归方程，即标准曲线。如图1所示。
(3)龙眼浸提液的多糖含量测定
先吸取一定量的龙眼浸提液，再加入四倍体积的无水乙醇，充分混合后放置于4℃冰箱中静置1h使其充分沉淀。然后在12000r/min下离心15min，除去上清液后取得淡黄色沉淀。沉淀用75％乙醇重复洗涤2次，以清除粗多糖沉淀中的单糖杂质。洗涤后将沉淀物用85℃水溶解，然后用苯酚-硫酸法以及步骤(2)得出的标准曲线，得知浸提液的多糖含量。
由于单糖和寡糖等物质在上述处理方法中已被去除，所以用此方法测得的总糖含量即为龙眼多糖含量。本发明测定的龙眼浸提液中的多糖得率为10.62mg/g，其计算公式如下：
(4)丁酸梭菌活化
从-80℃冰箱中取出丁酸梭菌菌种冻存管，立即放置在0℃冰盒中解冻。在无菌超净工作台内将解冻的菌液接入灭菌的肉汤培养基中，加入适量的液体石蜡液封后放入37℃恒温箱中培养24h。
结果：如图2所示丁酸梭菌呈圆形，稍凸起，边缘不规则，颜色为白色或淡黄色，不透明，表面湿润光滑，略有酸臭味。
(5)龙眼发酵培养基配制
将龙眼浸提液与灭菌的肉汤培养基按体积比4:6的比例混合均匀，得到龙眼发酵培养基，并调整初始pH为5。
(6)接菌发酵
量取10mL龙眼发酵培养基分装于数只10mL试管中，在121℃高压灭菌20min，待培养基冷却至室温后在无菌超净工作台中接入已培养好的丁酸梭菌菌液，丁酸梭菌的接菌量为 1％，并且加适量液体石蜡液封后放入38℃恒温箱中进行发酵，发酵时间为12h。
下面对各因素与丁酸梭菌活菌量的相关性进一步验证。
实施例7不同接种量对丁酸梭菌生长的影响
不同接种量对丁酸梭菌生长的影响不同，本试验中，在温度37℃，龙眼多糖添加量为 30％，pH为7.0条件下，研究了不同接种量(1％，2％，3％，4％，5％)对丁酸梭菌生长的影响。在发酵14h后，进行稀释涂布平板计数法，测定丁酸梭菌活菌量。结果如图4所示，当接种量为2％时，丁酸梭菌的活菌量最高，达到5.03×108cfu/mL，且与其他组相比差异极显著(p<0.01)，表明在接种量为2％时丁酸梭菌生长的效果最好。因此，在后续的试验中，将接种量暂定为2％，在后面的试验中继续优化。
实施例8不同发酵时间对丁酸梭菌生长的影响
不同发酵时间对丁酸梭菌生长的影响不同，本试验中，在温度37℃，龙眼多糖添加量为 30％，接种量2％，pH为7.0条件下，研究了不同发酵时间(10h，12h，14h，16h，18h)对丁酸梭菌生长的影响。各组在相应的发酵时间采用稀释涂布平板计数法测定丁酸梭菌活菌量。结果如图5所示，当发酵时间为14h时，丁酸梭菌的活菌量达到最大值，达到2.70×108cfu/mL，且与其他添加量相比差异极显著(p<0.01)，表明在发酵时间为14h时丁酸梭菌生长的效果最好。而当发酵时间超过14h后丁酸梭菌的活菌量开始大幅减少，表明此时丁酸梭菌的死亡速度已经远远超过了生长速度。因此，在后续的试验中，将发酵时间暂定为14h，在后面的试验中继续优化。
实施例9不同初始pH对丁酸梭菌生长的影响
不同初始pH对丁酸梭菌生长的影响不同，本试验中，在温度37℃，龙眼多糖添加量为 30％，接种量2％条件下，研究了不同初始pH(5.0，6.0，7.0，8.0，9.0)对丁酸梭菌生长的影响。在发酵14h后，采用稀释涂布平板计数法测定丁酸梭菌的活菌量。结果如图6所示，当初始pH为6.0时，丁酸梭菌的活菌量最高，达到1.11×108cfu/mL。当初始pH为7.0时，丁酸梭菌的活菌量达到9.80×107cfu/mL，两者相比无显著性差异(p>0.05)，而初始pH为5.0 和8.0时，两者丁酸梭菌活菌量与初始pH为6.0时的丁酸梭菌活菌量相比均有极显著的差异(p<0.01)。表明只有在适宜的初始pH条件下才有利于丁酸梭菌的生长，极酸或极碱的环境都不利于丁酸梭菌的生长。因此，最佳初始pH条件应该在6.0～7.0之间。
实施例10发酵工艺正交试验优化
方法：结合单因素试验的结果，通过正交试验进一步优化丁酸梭菌与龙眼多糖的发酵工艺。本研究选取了龙眼多糖添加量(A)、接种量(B)、发酵时间(C)和初始pH(D)4 个因素，每个因素设定三个水平，以丁酸梭菌的活菌量为指标，选择正交表L9(34)进行正交试验，确定丁酸梭菌与龙眼多糖的最佳发酵工艺参数。
结果：正交试验表及试验结果如表1和表2所示，丁酸梭菌发酵龙眼的最佳发酵工艺参数为龙眼多糖含量为20～30％，丁酸梭菌的接菌量为2～3％，发酵时间为15～17h，初始pH 为6.0～7.0；表3的极差分析结果表明各个因素的主次顺序依次为发酵时间(因素C)、初始pH(因素D)、龙眼多糖添加量(因素A)、接种量(因素B)，各因素的最佳搭配为 C3D3A1B3；表4的方差分析结果表明四个因素对丁酸梭菌活菌量的影响差异极显著(p<0.01)。综上所述，丁酸梭菌发酵龙眼的最佳发酵工艺参数为：龙眼多糖含量为20％，接种量为3％，发酵时间为16h，初始pH为7.0。
表1正交试验因素
表2正交试验结果
表3极差分析结果
表4方差分析结果
下面对上述实施例制备的龙眼发酵液作进一步的效果检测。
一.丁酸梭菌发酵龙眼的最佳发酵工艺前后的活菌量变化
方法：利用优化的最佳发酵工艺，即在龙眼多糖含量为100mL，丁酸梭菌接种量为15mL，发酵时间16h，初始pH为7.0的条件下，将丁酸梭菌与龙眼多糖在500ml体系中连续发酵3 次进行验证试验。通过稀释涂布平板计数法测定发酵后丁酸梭菌的活菌量。
结果如图7所示，添加龙眼多糖发酵后丁酸梭菌的活菌量均能保持在1.30×107cfu/mL以上，三次活菌量的均值为1.53×107cfu/mL，证明了该工艺的稳定性。此外，与对照组相比，添加龙眼多糖发酵后丁酸梭菌的活菌量增长了2.8倍，差异极显著(p<0.01)。
二.最优发酵工艺发酵前后的多糖含量变化
测定发酵前后多糖的含量变化，试验结果如图8所示。经过发酵后的多糖含量均值为 1903.86mg/mL，比发酵前的多糖含量提高了464.65mg/mL，差异极显著(p<0.01)。
三.龙眼发酵液对小鼠体重的影响
方法：适应性饲养7天后，将30只小鼠随机分为3组：正常对照(Ⅰ)组、模型(Ⅱ)组和发酵液(Ⅲ)组，每组10只，以下简称为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组。用苦味酸给小鼠作好标记，开始进行试验，试验周期为14天，其中第1-7天为预防周期，具体试验方案为：每天上午9：00各组定时按10mL/kg的剂量灌胃，正常饮食。其中Ⅰ、Ⅱ组给予无菌去离子水，Ⅲ组给予龙眼发酵液，连续灌胃7天。灌胃7天后，Ⅰ组小鼠自由饮用无菌水，Ⅱ组及Ⅲ组自由饮用5％的葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液，饮用时间均为7天，诱导小鼠溃疡性结肠炎。第14d采集小鼠血液后处死小鼠，解剖小鼠取出结肠肠段并测量长度。然后采集结肠肠道内容物于-80℃保存，同时剪取结肠肠段1cm固定到10％的甲醛溶液中。采集的小鼠血液4℃过夜，然后在1000 ×g下离心20分钟，取上清，分装后置于-20℃冰箱保存备用。
结果：从图9可以看出，各组小鼠体重在饮用葡聚糖硫酸钠(DSS)前无显著性差异，随着饮用DSS时间的延长，Ⅰ组小鼠体重持续增长，Ⅱ组和Ⅲ组小鼠体重呈逐渐下降趋势，但Ⅱ组小鼠体重下降趋势比Ⅲ组更快更明显。在饮用DSS第7天，Ⅱ组小鼠体重下降至18.31g，与Ⅰ组相比差异极显著(p<0.01)，符合UC小鼠模型特征。与此同时Ⅲ组小鼠体重下降至21.80g，与Ⅱ组小鼠体重相比具有显著性差异(p<0.05)，表明发酵液对DSS诱导的UC小鼠的体重降低具有一定的抑制作用。
四.龙眼发酵液对小鼠结肠长度的影响
结果：处死小鼠后进行解剖，取出结肠并测量长度发现，Ⅱ组和Ⅲ组小鼠结肠长度均有缩短但Ⅱ组缩短的程度更大，如图10所示。其中Ⅱ组结肠长度缩短至7.17cm，与Ⅰ组相比差异极显著(p<0.01)，符合UC小鼠模型特征。与此同时Ⅲ组小鼠结肠长度仅缩短至9.33cm，与Ⅱ组小鼠相比差异极显著(p<0.01)，表明发酵液对DSS诱导的UC小鼠的结肠长度缩短具有一定的抑制作用。
五.龙眼发酵液对小鼠的临床症状影响
方法:在显微镜下观察结肠组织切片，选取具有代表性的结构损伤部位，按表5来评价组织结构损伤指数。
表5组织学损伤评分标准
结果：根据疾病活动指数(DAI)评分和临床评分的标准，对各组小鼠进行评分，结果如图11和图12所示。Ⅰ组小鼠精神状态良好，体重持续上升，粪便为完整颗粒状，无便血症状，结肠无增厚现象，两项评分均为0。Ⅱ组小鼠则精神萎靡，体重持续下降，粪便松散，严重的还会出现粘附到肛门的液体状粪便，便血，出现结肠增厚现象，DAL评分为3.56，临床评分为5.33。而Ⅲ组小鼠虽然也出现了与Ⅱ组小鼠相似的症状，但是症状较轻，DAL评分为1.22，临床评分为1.67，两项评分与Ⅱ组相比差异极显著(p<0.01)，表明龙眼发酵液对 DSS诱导的UC小鼠具有一定的保护作用。
六.龙眼发酵液对小鼠结肠组织结构的影响
结果：如图13所示，Ⅰ组(图13(A))小鼠结肠上皮层结构是完整的，可以观察到清晰的隐窝结构及大量的杯状细胞。Ⅱ组(图13(B))小鼠结肠组织的上皮层结构已经受到严重破坏，可以观察到隐窝结构异常，大部分的杯状细胞损伤及缺失，同时伴有大量中性粒细胞和淋巴细胞等炎症细胞浸润。Ⅲ组(图13(C))小鼠结肠组织表现出相对完整的上皮层结构及隐窝，仅观察到部分炎症细胞侵入到上皮组织。
将观察到的各组小鼠结肠组织结构变化程度进行组织学损伤评分以评估各组小鼠结肠组织结构的损伤程度，结果如图14所示。Ⅰ组评分为0，II组模型组评分最高，为11.33，而Ⅲ组评分为4.67，与Ⅱ组相比差异极显著(p<0.01)，表明龙眼发酵液对DSS诱导的UC小鼠的结肠肠道具有一定的保护作用。
七.龙眼发酵液对小鼠炎症的影响
IL-6、TNF-α属于促炎细胞因子，可维持机体免疫并参加炎症反应；IL-10属于抑炎细胞因子，可以抑制炎症反应。
结果：小鼠血清中IL-6含量测定结果如图15所示，Ⅱ组含量最高，达到了34.63pg/mL，与Ⅰ组和Ⅲ组相比均具有显著性差异(p<0.05)。Ⅲ组含量为25.80pg/mL，与Ⅰ组相比有所增加但无显著性差异(p>0.05)，表明龙眼发酵液对DSS诱导的UC小鼠的IL-6具有一定的抑制作用。小鼠血清中IL-10含量测定结果如图16所示，Ⅱ组含量为29.71pg/mL，与Ⅰ组相比有显著性差异(p<0.05)。Ⅲ组含量最高，达到了34.68pg/mL，与Ⅱ组相比有显著性差异(p<0.05)，与Ⅰ组相比差异极显著(p<0.01)，表明龙眼发酵液对DSS诱导的UC小鼠的IL-10具有一定的促进作用。小鼠血清中TNF-α含量测定结果如图17所示，Ⅱ组含量最高，达到了37.62pg/mL，与Ⅰ组和Ⅲ组相比均具有显著性差异(p<0.05)。Ⅲ组含量为31.27pg/mL，与Ⅰ组相比无显著性差异(p>0.05)，表明龙眼发酵液对DSS诱导的UC小鼠的TNF-α具有一定的抑制作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种防治动物结肠炎的生物发酵产品的制备方法，其特征在于，由丁酸梭菌对龙眼浸提液进行发酵所得。
2.根据权利要求1所述的一种防治动物结肠炎的生物发酵产品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取龙眼果肉浆，纤维素酶解反应后，灭菌，过滤取上清，减压浓缩至原体积的30～50％，得龙眼浸提液；
2)将龙眼浸提液与灭菌培养基按体积比(1～4)：(6～9)混合，调节pH为5～9，得龙眼发酵培养基；
3)将丁酸梭菌接种到龙眼发酵培养基，其中丁酸梭菌的接种量1％～4％，厌氧发酵12～20h，得龙眼发酵液，即防治动物结肠炎的生物发酵产品。
3.根据权利要求1所述的一种防治动物结肠炎的生物发酵产品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取龙眼果肉浆，纤维素酶解反应后，灭菌，过滤取上清，减压浓缩至原体积的20～30％，得龙眼浸提液；
2)将龙眼浸提液与灭菌培养基按体积比(2～3)：(7～8)混合，调节pH为6～7，得龙眼发酵培养；
3)将丁酸梭菌接种到龙眼发酵培养基，其中丁酸梭菌的接种量2％～3％，厌氧发酵15～17h，得龙眼发酵液，即防治动物结肠炎的生物发酵产品。
4.根据权利要求1所述的一种防治动物结肠炎的生物发酵产品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取龙眼果肉浆，纤维素酶解反应后，灭菌，过滤取上清，减压浓缩至原体积的30％，得龙眼浸提液；
2)将龙眼浸提液与灭菌培养基按体积比2:8混合，调节pH为7，得龙眼发酵培养基；
3)将丁酸梭菌接种到龙眼发酵培养基，其中丁酸梭菌的接种量3％，厌氧发酵16h，得龙眼发酵液，即防治动物结肠炎的生物发酵产品。
5.根据权利要求2～4任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的发酵温度为35～38℃、时间为15～17h。
6.权利要求1～5任一项所述的方法制备的龙眼发酵液。
7.权利要求6所述龙眼发酵液在制备防治动物结肠炎产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的结肠炎为溃疡性结肠炎。
9.权利要求6所述龙眼发酵液在制备抑制小鼠结肠炎症因子产品中的应用；所述的炎症因子为IL-6和TNF-α。
10.权利要求6所述龙眼发酵液在制备促进小鼠结肠炎症因子产品中的应用；所述的炎症因子为IL-10。
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