CN110448576A - 丁酸梭菌对球虫病肠道损伤的防治作用研究 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了丁酸梭菌对球虫病肠道损伤的防治作用研究。丁酸梭菌添加在饲料中，可有效抵抗鸡球虫在鸡体内的繁殖。丁酸梭菌可以修复鸡肠道健康，可以增加球虫感染鸡的增重率、改善肠道病变情况、调节机体免疫水平，表明丁酸梭菌可以作为制剂应用于鸡球虫病的防治。本发明可有效缓解因抗球虫药物产生的耐药性问题，对家禽养殖业的健康发展具有重要作用。

Description

丁酸梭菌对球虫病肠道损伤的防治作用研究
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及丁酸梭菌对球虫病肠道损伤的防治作用研究。
背景技术
鸡球虫病是造成现代集约化养鸡业经济损失最大的寄生虫病之一，对养禽业的生产和发展影响重大。鸡球虫病主要通过感染鸡的肠道，造成组织损伤，营养吸收不良，生长发育受损，使得机体免疫下降，容易感染其他疾病。控制鸡球虫病的主要手段是使用药物和疫苗免疫，但同时会产生耐药性、药物残留、疫苗安全、虫株变异、疫苗副作用等问题。疫苗因其本身也是活虫卵，因此接种后不可避免也会引起鸡肠道的损伤。如何减少副作用，促使疫苗更好地发挥其保护作用，是眼下研究的热点。
丁酸梭菌(Clostridium butyricum)作为一种重要的肠道益生菌，对肠道健康有着积极的作用。丁酸作为其生长代谢主要产物之一，可作为肠道黏膜上皮细胞的生长能量来源，加速肠上皮细胞增殖分化，促进肠蠕动，维持肠动力和肠道菌群微生态的平衡。目前尚未见用丁酸梭菌改善鸡球虫对肠道损伤相关研究的报道。
本发明针对现今存在的问题，将丁酸梭菌应用于鸡球虫感染中，用以评价其效果。
发明内容
本发明的目的在于丁酸梭菌在抗鸡球虫病中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
丁酸梭菌在制备球虫感染引起的炎症反应制剂中的应用。
丁酸梭菌在制备预防鸡球虫病制剂中的应用。
丁酸梭菌在制备治疗鸡球虫病制剂中的应用。
丁酸梭菌在制备修复鸡肠道损伤制剂中的应用。
进一步的，所述肠道包括十二指肠、盲肠、空肠。
丁酸梭菌在制备提高鸡免疫力制剂中的应用。
丁酸梭菌在制备提高血清免疫球蛋白制剂中的应用；所述血清免疫球蛋白为IgA、IgM和/或IgG。
丁酸梭菌在制备调节炎性细胞因子分泌制剂中的应用；所述细胞因子包括白细胞介素、干扰素；所述白细胞介素为IL-2、IL-12和/或IL-17。
丁酸梭菌在制备调节鸡血清中干扰素制剂中的应用；所述干扰素为IFN-γ。
一种治疗鸡球虫病的组合物，其特征在于，所述组合物中含有丁酸梭菌。
通过人工接种混合球虫卵囊，建立鸡球虫病模型，考察丁酸梭菌对感染球虫的实验肉鸡的生产性能、肠道损伤预防以及免疫指标的影响，并以商品化的丁酸钠产品作为对照，研究实验鸡的生长指标、肠道病变情况以及血清中IL-2、IL-12、IL-17等指标，评价对丁酸钠、丁酸梭菌对病鸡肠道免疫及上皮细胞的修复作用，为丁酸梭菌作为微生态制剂在鸡球虫免疫治疗中的应用做初步的基础研究。
本发明的有益效果是：
丁酸梭菌抗鸡球虫病的效果明显，可有效抵抗鸡球虫在鸡体内的繁殖，丁酸梭菌可以增加球虫感染鸡的增重率、改善肠道病变情况、调节机体免疫水平，表明丁酸梭菌可以作为制剂应用于鸡球虫病的防治。丁酸梭菌的应用，可有效缓解当前养殖业使用抗球虫药物产生的严重耐药性问题，对养殖业的绿色、健康发展具有重要益处。
附图说明
图1为病变记分值。
图2为十二指肠病理切片；其中图2A、B图分别为空白对照组20×、空白对照组100×；图2C、D图分别为单一攻虫组20×、单一攻虫组100×；图2E、F图分别为丁酸梭菌组20×、丁酸梭菌组100×。
图3为空肠病理切片；其中图3A、B图分别为空白对照组20×、空白对照组100×；图3C、D图分别为单一攻虫组20×、单一攻虫组100×；图3E、F图分别为丁酸梭菌组20×、丁酸梭菌组100×。
图4为盲肠病理切片；其中图4A、B图分别为空白对照组20×、空白对照组100×；图4C、D图分别为单一攻虫组20×、单一攻虫组100×；图4E、F图分别为丁酸梭菌组20×、丁酸梭菌组100×。
图5为不同添加组对IgA含量的影响。
图6为不同添加组对IgG含量的影响。
图7为不同添加组对IgM含量的影响。
图8为不同添加组对IFN-γ含量的影响。
图9为不同添加组对IL-2含量的影响。
图10为不同添加组对IL-12含量的影响。
图11为不同添加组对IL-17含量的影响。
具体实施方式
实施例1
实验材料
1.球虫卵囊
孢子化混合球虫卵囊由广东省农业科学院动物卫生研究所寄生生物学研究室提供，含量为4×104/mL。
2.菌种
Clostridium butyricum ATCC25755，购于广东省微生物菌种保藏中心。
3.实验基础日粮
参考美国NRC(1994)肉鸡营养标准，基础日粮组成及营养水平见表1。
表1日粮组成及营养水平
4.实验动物
1日龄岭南黄鸡，购自广东省农业科学院畜牧研究所，饲养于广东省农业科学院动物卫生研究所动物实验中心的无球虫感染环境下。
实验方法
1.实验饲养条件及实验鸡分组
实验前对鸡舍采用甲醛和高锰酸钾(2:1)熏蒸，甲醛用量为10mL/m3，火焰灭菌金属丝笼，饲养设备沸水加热10min进行严格消毒。饲养周期为28d，采用网上饲养的方式。实验过程中采用人工投料，自由采食，自由饮水。育雏期采用保温灯调节温度，在雏鸡活动趋于，水平悬挂温度计测量雏鸡体表温度。第一周保持体表温度为35℃左右，每周逐渐减低2-3℃，直至室温。各组饲养管理条件保持一致，由实验人员负责管理、饲养并记录。
将1日龄的雏鸡适应性饲喂三天后，称重去除掉体重差异较大的鸡只，将余下的雏鸡随机分为A、B、C三个组，每组四个重复，每个重复五只鸡。
A组(空白对照组)、B组(模型对照组)正常饲喂无添加日粮外，其余各组按表2方案饲喂不同添加的饲料，其中C组在日粮中添加500mg/kg丁酸梭菌菌粉。
表2实验分组及处理
2.实验动物模型的建立及样本采集处理
将复壮的球虫卵囊采用饱和盐水漂浮法收集后，放入平皿内，加入2.5％重铬酸钾溶液在29℃恒温孵育培养48h。通过镜检的方法，确认有90％以上的卵囊孢子化后停止孵育。对饲喂所用器具进行沸水加热10min，确保外界环境无球虫。感染前检测各组雏鸡粪便，确保无球虫感染。
从分组之日即4日龄起，每天连续用药。第14日龄时将B、C组内所有雏鸡称重后，灌胃接种已孢子化的混合球虫卵囊1×104个/只。自攻虫之日起，逐日检测各组鸡粪便中是否有球虫卵囊排出，并观察记录雏鸡的精神、食欲、粪便变化情况，以确定雏鸡能够成功感染球虫。
根据球虫生活史，选择在感染后第7d，即21日龄时，称重，记录。然后翅下静脉真空管采血，静置10min后，3000r/min离心10min，吸取上层血清样品于1.5mL EP管中，-80℃冰箱中保存待测。血液采集完毕后处死，剖开腹腔，取小肠部分的十二指肠、空肠段和盲肠部分记录病变值，观察病理变化，同时进行病变评分；分别剪取各肠段组织约3-5cm，生理盐水冲洗干净后，平铺在滤纸上吸干液体，浸入10％福尔马林溶液中固定以备制作病理组织切片。
3.体重的测定
记录接种球虫卵囊时雏鸡体重作为初重，实验结束时的体重作为末期重，以重复为单位计算14日龄至21日龄饲喂期内雏鸡的增重，计算平均增重和相对增重率。
4.肠道病变记分
感染球虫7天后的雏鸡，采血后处死，依次摘取病鸡的十二指肠、空肠、盲肠段，横向剪开肠道后平铺，观察并记录肠道病变情况。
肠道病变记分采用美国氰胺公司兽医助诊器---JOHNSON和REID球虫病变计分系统进行病变记分。
5.实验鸡肠粘膜病理切片
将各段肠道取出后，用0.9％的NaCl溶液将肠道内容物冲洗干净，滤纸吸干残余液体，分别浸入到10％福尔马林溶液中固定，进行肠组织切片的制作。
显微镜镜检：光学显微镜观察肠道组织结构和肠道上皮组织的病变情况，并进行图像采集分析。
6.血清免疫指标测定
使用ELISA试剂盒分别检测血清内细胞因子IL-2、IL-12、IL-17、IFN-γ含量，以及免疫球蛋白IgA、IgG、IgM的含量。
7.数据处理
实验数据采用SPSS23进行单因素方差分析，对于P＜0.05的数据采用LSD方法进行多重比较，数据结果用“平均值±标准差”表示，GraphPad Prism 6作图。
结果与分析
1.接种球虫后体重变化
14日龄雏鸡接种球虫卵囊七天后，称重，结果如表3所示，A组(空白对照组)平均增重明显大于其余各组，与其他组之间差异显著(P＜0.05)；B组(单一攻虫组)的平均增重明显小于其余各组，差异显著(P＜0.05)。
表3接种球虫后各组体重变化
同列数据肩标不同字母表示差异性显著(P＜0.05)，相同字母表示不显著(P﹥0.05)
2.肠道病变记分
雏鸡球虫感染7d后，每个重复取2只雏鸡，剖开腹腔，截取不同肠段，观察并记分，结果以组为单位计算平均值。如表4及图1所示，除A组空白对照组外，其余各组的十二指肠、空肠、盲肠都有不同程度的病变。其中C组在日粮中添加丁酸梭菌后，十二指肠和盲肠肠段观察到的病变情况较其他组有所减轻，能够协助机体修复肠道损伤，对鸡球虫混合卵囊所造成的肠道病变有一定的缓解作用。
表4肠道病变记分
3.十二指肠病理组织切片观察
通过20倍和100倍光学显微就观察十二指肠组织病变切片，分析肠道病变程度。观察结果如图4。
A组(图2A、图2B，空白对照组)的粘膜层肠上皮结构完整，上皮细胞排列紧密，固有层肠腺丰富，腺体清晰且绒毛相对完整，可见较多杯状细胞，未见明显炎症；B组(图2C、图2D，单一攻虫组)的粘膜层局部可见大量肠绒毛脱落，固有层局部可见肠腺数量减少，大量炎性细胞浸润，有明显的寄生虫感染的特征；除A组的十二指肠外，其余两组的十二指肠均有不同程度的损伤，在使用丁酸梭菌作为预防治疗组的十二指肠病变情况轻于B组(单一攻虫组)，肠绒毛有部分断裂或脱落，肌层有较少炎性细胞浸润，有寄生虫感染的特征。C组(图2E、图2F)的损伤情况较单一攻虫组有一定程度的减轻，表明丁酸梭菌在一定程度上可以减轻球虫对十二指肠造成的损伤。
4.空肠病理组织切片观察
空肠的组织切片经HE染色后，分别置于20倍和100倍光学显微镜下观察病变情况，结果如图3。
A组(图3A、图3B，空白对照组)粘膜层肠上皮结构完整，上皮细胞排列紧密，固有层肠腺丰富，可见较多杯状细胞，未见明显炎症；B组(图3C、图3D，单一攻虫组)粘膜层局部可见肠上皮脱落严重，固有层出现空泡化，肠腺大量减少且排列杂乱，绒毛结构被破坏，大量肠绒毛脱落损毁，覆盖在肠粘膜表面，组织中有较多炎性细胞浸润，未见有球虫裂殖体。C(图3E、图3F，丁酸梭菌)的损伤情况相比于B组有不同程度的减轻，其中C组粘膜层基本完整，固有层局部可见肠腺脱落。
结果表明，混合球虫卵囊对雏鸡空肠的损害程度有限，在观察到的结果中并未有寄生虫感染的特征，日粮中添加丁酸梭菌对球虫感染的空肠上皮细胞有一定修复作用。
5.盲肠病理组织切片观察
盲肠组织在切片、染色、制片等操作后，在光学显微镜下观察并描述，对应主要描述部位进行放大拍照，结果如图4。
A组(图4A、图4B，空白对照组)粘膜层肠上皮细胞结构完整，固有层肠腺正常，未见明显炎症与球虫裂殖体；B组(图4C、图4D，单一攻虫组)粘膜层可见大量肠上皮细胞脱落，固有层肠腺几乎消失，被增生的结缔组织取代，并伴有较多的炎性细胞浸润，局部可见球虫裂殖体；C组(图4E、图4F，丁酸梭菌组)的肠绒毛结构相对完好，固有层肠腺轮廓较为整齐，未发现有球虫裂殖体存在。
结果表明，日粮中添加丁酸梭菌对于球虫感染的雏鸡盲肠损伤，有一定的损伤修复效果。
血清免疫指标
日粮中不同成分的添加对雏鸡血清中免疫球蛋白、白细胞介素及γ干扰素含量的影响如表5。
表5免疫球蛋白、白细胞介素及γ干扰素含量
6.不同添加对血清免疫球蛋白A(IgA)含量的影响
图5中可知，与B组(模型对照)相比，在接种球虫的雏鸡日粮中添加不同的组分可以明显看出血清中IgA含量的提高。接种球虫卵囊后的第七天时，B、C组与A组相比，血清中免疫球蛋白A的含量分别增加了41.46μg/mL、205.59μg/mL。如图5，A、B两组间差异显著(P＜0.05)，表明人工接种鸡球虫卵囊后，使得雏鸡体内的IgA含量上升；B组和其余各组间差异极显著(P＜0.01)，C组中IgA含量比B组提高了228％。
结果表明，日粮中添加丁酸梭菌可以明显提高受球虫感染雏鸡体内的IgA的含量。
7.不同添加对血清免疫球蛋白G(IgG)含量的影响
图6可知，21日龄时，A、B两组雏鸡体内IgG含量差异显著(P＜0.05)；B组与其余各组间差异极显著(P＜0.01)，C比B组血清中IgG含量提高了40％。
结果表明，日粮中添加丁酸梭菌可以明显提高受球虫感染雏鸡体内的IgG的含量。
8.不同添加对血清免疫球蛋白M(IgM)含量的影响
由图7可以看出，接种球虫卵囊7d后，B组血清内IgM的含量比A组增加了19％，二组之间有显著性差异(P＜0.05)；与B组相比，C组血清中IgM的含量提高了40％(P＜0.01)。
结果表明，日粮中添加丁酸梭菌可以明显提高受球虫感染雏鸡体内的IgM的含量。
9.不同添加对血清IFN-γ含量的影响
由图8可见，在21日龄时，A组和B组的血清中IFN-γ的含量无显著性差异(P＜0.05)；C组与B组相比，血清中IFN-γ的含量降低了50％(P＜0.01)。
结果表明，日粮中添加丁酸梭菌可以明显降低受球虫感染雏鸡体内的IFN-γ的含量。
10.不同添加对血清IL-2含量的影响
如图9，雏鸡在接种球虫卵囊后的第7d时，B组血清内IL-2的含量相比于A组(空白对照组)提高了29％，两组间差异极显著(P＜0.01)；C相比与B组有明显上升的趋势，比B组升高了23％(P＜0.01)。
结果表明，日粮中添加丁酸梭菌可以明显降低受球虫感染雏鸡体内的IL-2的含量。
11.不同组分添加对血清IL-12含量的影响
由图10可以看出，A组和B组的21日龄雏鸡血清内IL-12的含量差异显著(P＜0.05)；与B组相比，C组血清中的IL-12含量有极显著的差异(P＜0.01)，C组血清中IL-12的含量较B组降低了53％(P＜0.01)。
结果表明，日粮中添加丁酸梭菌可以降低受球虫感染雏鸡体内的白细胞介素12的含量。
12.不同添加对血清IL-17含量的影响
由图11可以看出，在接种球虫卵囊的第7d时，A组血清中IL-17与B组的差异性显著(P＜0.05)；C组血清中IL-17的含量比B组有明显的降低趋势，C组血清中IL-17含量比B组降低了28％(P＜0.01)。
结果表明，日粮中添加丁酸梭菌可以明显降低受球虫感染雏鸡体内的白细胞介素17的含量。
在日粮中添加丁酸梭菌能提高受球虫感染雏鸡的生长性能。对比于空白对照组，单一攻虫组的雏鸡在感染球虫卵囊后的七天内的体重增重有明显的降低；丁酸梭菌组对比单一攻虫组，体重增重有显著的提升，但增重量仍低于正常饲喂的未感染球虫的空白对照组。表明丁酸梭菌能对感染球虫的雏鸡生长起到一定积极作用。
病理切片分析结果表明，在日粮中添加丁酸梭菌对感染球虫卵囊的雏鸡肠道有较好的修复作用。在肠绒毛损伤、炎性细胞数量和固有层肠腺数量方面，实验中的丁酸梭菌在病理切片观察到的结果中有更好的修复效果。丁酸梭菌代谢产生的丁酸是重要的肠道上皮细胞修复能量来源。
血清中免疫指标的结果表明，日粮中添加丁酸梭菌可以明显提高球虫感染雏鸡的免疫水平。相比于空白对照组，单一攻虫组在接种球虫卵囊7d后，血清内IgA、IgM、IgG的含量都有显著性的增加，表明球虫感染后雏鸡机体产生了一系列的免疫应答反应。日粮中添加丁酸钠和丁酸梭菌后，各项血清免疫指标较单一攻虫组都有显著的变化，表明丁酸钠和丁酸梭菌可以明显提升感染球虫的雏鸡体内免疫水平。日粮中丁酸梭菌的添加，免疫水平有更加显著的提升。
实验表明，丁酸梭菌作为一种微生态制剂，对于降低鸡球虫病造成的肠道损伤及调控机体免疫方面，都有一定的效果。可以作为鸡球虫病防治过程中的佐剂使用。

Claims (10)

1.丁酸梭菌在制备球虫感染引起的炎症反应制剂中的应用。
2.丁酸梭菌在制备预防鸡球虫病制剂中的应用。
3.丁酸梭菌在制备治疗鸡球虫病制剂中的应用。
4.丁酸梭菌在制备修复鸡肠道损伤制剂中的应用。
5.根据权利要求4的应用，其特征在于，所述肠道包括十二指肠、盲肠、空肠。
6.丁酸梭菌在制备提高鸡免疫力制剂中的应用。
7.丁酸梭菌在制备提高血清免疫球蛋白制剂中的应用；所述血清免疫球蛋白为IgA、IgM和/或IgG。
8.丁酸梭菌在制备调节炎性细胞因子分泌制剂中的应用；所述细胞因子包括白细胞介素、干扰素；所述白细胞介素为IL-2、IL-12和/或IL-17。
9.丁酸梭菌在制备调节鸡血清中干扰素制剂中的应用；所述干扰素为IFN-γ。
10.一种治疗鸡球虫病的组合物，其特征在于，所述组合物中含有丁酸梭菌。
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