JP2024527597A - 腸管透過性亢進の処置のためのプロバイオティクス組成物 - Google Patents

Abstract

ビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４を含むプロバイオティクス組成物を提供する。プロバイオティクス組成物は、ポリリン酸塩を生成することにより、それを必要とする対象における腸管バリア機能障害（例えば、腸管透過性亢進）若しくは関連状態、又はその症状、合併症及び／若しくは後遺症を処置、防止、又は改善するのに有用である。プロバイオティクス組成物と少なくとも１種のヒトミルクオリゴ糖の組み合わせも提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、医学及び微生物学の分野、特にヒト及び動物の健康に恩恵をもたらす、特に腸管バリア機能障害若しくは関連状態の処置に有用なプロバイオティクス組成物に関する。

ビフィズス菌は、ヒトの健康に重要な役割を果たしているヒトの腸内細菌叢のメンバーである。乳児では、腸内細菌叢はビフィズス菌が優勢であるが、成人期にはそのレベルは低くなる。異なる種類のビフィズス菌の存在は、小児期から老年期まで、年齢と共に変化する。ビフィズス菌は、腸内細菌叢の正常な発達及びそのバリア効果において、食品化合物の吸収及び人生の初期段階の重要な時期における免疫系の成熟において有益な効果を有する重要な役割を果たす。

ビフィズス菌の減少は、帝王切開、早産、人工栄養、又は出生前及び出生後の抗生物質処置などの要因によって引き起こされ得るアレルギー、肥満又は炎症性腸疾患などの長期的な障害のリスクの増加に関連する。その結果、ビフィズス菌株は、疾患の防止及び処置におけるプロバイオティクスとしての使用について研究されている。

ＷＯ２０１５０１８８８３Ａ２号は、乳児が過度に泣くことの改善に有用な、ペディオコッカス・ペントサス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＥＣＴ８３３０を含む、及び任意にビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）ＣＥＣＴ７８９４を含むプロバイオティクス組成物を開示している。両方のプロバイオティクス細菌の組成物を試験する臨床試験は、プロバイオティクスの摂取により、１日の平均の泣く時間と各エピソードの期間が大きく短縮されることを示した。また、それは、「上記で説明した細菌組成物の関連特性から、細菌組成物の投与が、免疫系の未成熟の結果としての炎症に関連する胃腸障害を特徴とする他の状態を処置するため；腸過敏症を処置するため及び腸内の過剰な望ましくない細菌のバランスをとるためにも有用であることが導き出される」と説明している。組成物に含まれる各プロバイオティクス株の特性に関して、ＷＯ２０１５０１８８８３Ａ２号は、Ｐ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＣＥＣＴ ８３３０が、ＩＬ－１０を誘導するより高い能力を示し、その結果、腸管内の炎症を改善する可能性があるのに対し、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４は、過度に泣く乳児に一般的に豊富な望ましくない細菌の増殖を阻害するより高い能力を示したことを開示している。

ＪＰ２００６１７６４５０Ａ号は、リンを吸収することによってポリリン酸を蓄積することができるビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）ＪＣＭ１２５１又はビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）ＪＣＭ１２７３などの乳酸菌を含むプロバイオティクス組成物について記載している。この組成物は、小腸におけるリンの過剰吸収を抑制する能力を有し得るため、腎結石症を含む様々な疾患の防止に正の効果を有し得る。

乳酸菌及びビフィズス菌の一部の株は、ポリリン酸塩（ｐｏｌｙＰ）を生成する能力を示しており、ポリリン酸塩は腸管バリア機能を高め、宿主の腸の恒常性を維持する役割があることから、ポストバイオティクス効果があることが発見されている。宿主－プロバイオティクス相互作用は、プロバイオティクス由来のｐｏｌｙＰの上皮エンドサイトーシスを通じて促進される。腸細胞では、ｐｏｌｙＰは、インテグリンβ１－ｐ３８ ＭＡＰＫ経路を通じて熱ショックタンパク質ＨＳＰ２７などの細胞保護因子を誘導する。

ビフィズス菌のｐｏｌｙＰ形成能力は、Ｑｉａｎら（２０１１）によって示唆された。この著者らは、ビフィズス菌株Ｂ．アドレセンティスＡＴＣＣ１５７０３（ＪＣＭ１２７５）、Ｂ．ロンガムＡＴＣＣ１５７０７、Ｂ．ロンガムＡＴＣＣ５５８１６、ビフィズス菌種ＢＡＡ－７１８及びＢ．スカルドビＢＡＡ－７７３が、ｐｏｌｙＰ顆粒と一致し得る観察可能な顆粒を生成することを示しているが、これは証明されていない。さらに、顆粒の定量化も特徴付けも行われていない。これらの顆粒は、例えば、金属又はタンパク質顆粒を含有する顆粒とも一致し得る。加えて、ｐｏｌｙＰ生合成酵素ＰＰＫをコードするｐｐｋ遺伝子の発現は、酸化ストレスに応答する非プロバイオティクス株Ｂ．スカルドビＢＡＡ－７７３で研究されている。

別の研究も、培養期間後に培地に残るリン酸塩の量を測定する間接分析を通じて、乳酸菌、ビフィズス菌、乳酸球菌及び連鎖球菌がｐｏｌｙＰを形成する能力を評価している（Ａｎａｎｄら、２０１９）。Ｂ．アドレセンティスＪＣＭ１２７５は、最も高いリン蓄積能力を示すが、この実験ではｐｏｌｙＰの定量化は行われていない。

さらに、Ｓａｉｋｉら、２０１６は、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）を添加した後のＡＴＰの直接定量化を通じて、乳酸菌及びビフィズス菌によるｐｏｌｙＰ生成を間接的に定量化している。ＰＰＫは、ＡＴＰ及びリン酸塩からｐｏｌｙＰ及びＡＤＰを生成する可逆的反応を触媒する酵素である。その結果、種間及び菌株間で広く多様なｐｏｌｙＰ生成能力が示される。ラクチカゼイバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイＪＣＭ １１６３は、最も高いｐｏｌｙＰ濃度を示す。

これらの研究は、ｐｏｌｙＰを生成できるプロバイオティクス細菌の使用に向けた初期段階を表している。それにもかかわらず、プロバイオティクスの特徴は、同じ種の細菌間であっても菌株に依存する。したがって、宿主に有益な効果をもたらすために、有意な量のｐｏｌｙＰを生成できる菌株を発見することが重要である。さらに、それらは、胃腸の状態に対する耐性、適切な増殖などの全てのプロバイオティクス要件で優れた性能を発揮し、大規模な製造にも適している必要がある。

２０２２年５月３０日に受理されたＸｉａｏらの抄録は、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４が、腸内細菌叢及び胆汁酸代謝を調節することを介して、マウスにおいてデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発性大腸炎に対するインフリキシマブの有効性を改善したと結論付けている。

本発明が解決すべき課題は、それを必要とする対象における腸管バリア機能障害に正の効果をもたらすことができる新しい組成物を提供することである。

本発明者らは、腸管バリアに正の効果をもたらす、ポリリン酸塩（ｐｏｌｙＰ）を大量に生成する能力を有する新しいプロバイオティクス組成物を見出した。プロバイオティクス組成物は、ヒトの腸の状態に適合するヒト腸起源株であるビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム株を含む。特に、本発明のビフィズス菌株は、ブダペスト条約に基づきスペインタイプカルチャーコレクション（ＣＥＣＴ）に受託番号ＣＥＣＴ７８９４（本明細書ではＫＡＢＰ－０４２ともいう）で寄託されたビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム株である。驚くべきことに、本発明の菌株は、ｐｏｌｙＰを大量に生成する能力に加えて、ｐｏｌｙＰを生成しながら成長することもできる。さらに、これは、一生の全ての段階でヒト微生物叢に存在するＢ．ロンガム亜種ロンガムに属することから、新生児から高齢者まで正の効果を有する潜在能を有する。加えて、本発明の発明者らは、菌株が乳児及び成人の胃腸状態、例えば、胃及び胆汁塩ストレスに対する耐性、腸上皮への良好な接着性、ヒトミルクからの複合糖類の利用に十分に適合していることを証明し、また驚くべきことに、当技術分野で公知の他のビフィズス菌とは異なり、１２ヶ月にわたってわずか３分の１しか減少しない良好な安定性を有することも証明している。

本明細書における実施例は、本発明のプロバイオティクス組成物が、その成長速度を損なうことなく有意な量のｐｏｌｙＰを生成する能力を実証する詳細な実験データを提供する。この菌株の継続的な増殖は、腸のバリアに保護効果を有するポストバイオティクス分子であるｐｏｌｙＰの漸増レベルの生成を可能にする。さらに、本文脈において当業者によって理解されるように、このビフィズス菌株の自然の生息地はヒトの腸内である。したがって、この菌株は、これらの最適な環境条件下で増殖しながらｐｏｌｙＰを生成する潜在能を明確に示す。

実施例１は、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４が、いくつかの試験菌株（例えば、Ｂ．アニマリス（ａｎｉｍａｌｉｓ）ＢＢ－１２、Ｂ．アドレセンティスＪＣＭ１２７５、Ｌ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＷＣＦＳ１及びＢ．スカルドビＢＡＡ－７７３）と比較して、ｐｏｌｙＰを生成する能力が最も高いことを示している。さらに、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４は、ｐｏｌｙＰを生成しながら増殖する高い潜在能を示し、これは、腸での生着にとって不可欠であり、生後初期から菌株の増殖を可能にし得る。したがって、乳児におけるこの健康増進株の早期投与は、腸に有益であり、一生のさらなる段階でその正の効果を維持することができる。

長期的な観点から、本発明の菌株の増殖速度が高いｐｏｌｙＰ生成によって損なわれないという事実は、その後、ヒトの腸においてより多量のｐｏｌｙＰを得るのに有利である。図２及び表２は、この試験で考慮された全ての時点で増殖しながら、大量のｐｏｌｙＰを生合成するＢ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４の優れた能力を示す。同様に、Ｂ．ロンガム亜種ロンガム３６５２４（商標）、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＡＴＣＣ１５７０７及びＢ．アニマリスＢＢ－１２も大量のｐｏｌｙＰを生成し、高い増殖速度を有する。しかし、２種のＢ．ロンガム株は１６時間の時点で高いｐｏｌｙＰ生成を維持できず、Ｂ．アニマリスＢＢ－１２のみが、１６時間の時点で検出可能な量のｐｏｌｙＰを生成できる。

さらに、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４は、ヒト常在性ビフィズス菌（ＨＲＢ）株であるのに対し、Ｂ．アニマリスＢＢ－１２は、非ＨＲＢ株として分類される。ＨＲＢ株は、健康なヒトの糞便及び口腔から頻繁に単離され、より優れた健康増進効果を発揮し、したがって、それらの代謝がヒトの消化管に適応しているため、ヒトでの使用により良好なプロバイオティクス候補として役立つことを特徴とする。これに対して、Ｂ．アニマリスＢＢ－１２は、ヒトの腸に適切に適応して生着せず、ヒトの腸の状態に耐えることができず、大量のｐｏｌｙＰを生成しながら増殖能力を維持することができない。

Ｂ．ブレーベＪＣＭ１２７３は、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４と比較して、６時間で類似の増殖率を示し、１６時間でより速い増殖速度を示す。それにもかかわらず、ｐｏｌｙＰを生成する能力は、いずれの時点でもかなり低い。

Ｂ．アドレセンティスＪＣＭ１２７５も、ある程度の量のｐｏｌｙＰを生成することが可能であるが、同時に増殖する能力はない。その結果、目的が菌株の持続的な存在、すなわち、ｐｏｌｙＰの持続的な生成を達成することであるため、全体として生成が損なわれ得る。この菌株は、成人及び高齢者に豊富に存在するが、乳児にはほとんど存在しないため、成人型のＨＲＢと考えられていることに留意されたい。

特に、ゲノム解析及びインビトロ実験により、実施例３で、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４が乳児及び成人の消化管に適切に適合する潜在能を有することが示された。加えて、亜種Ｂ．ロンガム亜種ロンガムは、乳児における分布及び存在量が他の菌株及び種よりも高い長期生着菌であるため、本発明の菌株は、赤ん坊の腸に生着する高い潜在能を有する。さらに、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムはまた、成人及び高齢者のヒトの腸に多く存在するため、宿主に有益な効果をもたらす。

加えて、Ｂ．スカルドビは、活性ｐｐｋ遺伝子を保有することが知られており、例外的な増殖能力を有するが（Ｂ．スカルドビＢＡＡ－７７３株を用いた実施例１に示されているように）、ｐｏｌｙＰを生成する能力は最小限であった。さらに、Ｂ．スカルドビは、病原性株であることが知られているため、プロバイオティクス組成物には適していない。

最後に、Ｌ．プランタルムＷＣＦＳ１は、ｐｏｌｙＰ生成を通じて腸管バリアを保護することが知られているが、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４は、さらに大量のｐｏｌｙＰを生成する。加えて、Ｌ．プランタルムは、乳児の腸内における優占種ではない。

全体として、本発明の菌株は、同じ初期用量のプロバイオティクス組成物を対象に投与した場合に、最大量のｐｏｌｙＰを生成できるであろう。例えば、同じｃｆｕの異なる研究菌株を含有する錠剤を比較すると、本発明の菌株は、最大量のｐｏｌｙＰを生成する潜在能が最も高い。

さらに、医薬組成物中のＢ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４は、実施例２及び図４に示されるように、生菌数が経時的に安定していることを示した。これらの結果から、製造時の３倍過量が、１２ヶ月の時点で１０^９ｃｆｕの生菌を確実にするのに十分であることが示され、それによりプロバイオティクス組成物の大規模製造及び長期保存が可能になる。

多くのプロバイオティクスビフィズス菌株が、酸素に対する耐性が低く、したがって、適切な安定性を示さないことが従来技術でよく知られているため、プロバイオティクス株Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４のこの長期安定性は予想外である。Ｂ．ｐｙｓｃｈｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂ．ｉｎｄｉｃｕｍ及びＢ．ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓなどの一部のビフィズス菌株はより高い安定性を有するが、これらはプロバイオティクス組成物にとって適切なＨＲＢ株ではない。これに対して、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４は、ＨＲＢであるだけでなく、高い安定性を示し、したがって酸素に対する耐性も示す。そのため、この菌株は、長期保存を必要とし得るプロバイオティクス組成物の製造に適している。

さらに、実施例４に示されるように、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４によって生成されるｐｏｌｙＰの効果は、バリアの完全性、腸の透過性及び腸のバリアの恒常性に正の効果を有することが証明されている。加えて、そのような効果は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ２７）の生成及びタイトジャンクションタンパク質を含むバリア完全性の他のマーカーの誘導に関係することも証明されており、それらは全て、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４由来のｐｏｌｙＰの存在によって誘導される。

加えて、本発明者らは、実施例５で、母乳の存在下でＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４がｐｏｌｙＰを生成する能力を証明し、これは、授乳中の乳児におけるＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４の有益な効果を示す。母乳は炭水化物ＨＭＯを含有する。ＨＭＯラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）は、実施例３で確認されるように、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４によって使用される。さらに、ＬＮＴは、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４株においてｐｏｌｙＰ生合成に正の影響を与えることが証明されている。驚くべきことに、実施例６は、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４が、ＨＭＯ ２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）を利用できる他のビフィズス菌の上清の存在下で増殖できることを示している。全体として、これらの結果は、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４が、母乳中の最も豊富な２種類のＨＭＯ（ＬＮＴと２’－ＦＬ）の存在下で増殖し、ｐｏｌｙＰ生成を増加させることができることを実証し、このように例えば、乳児におけるＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４補給の有益な役割を強調する。

全体として、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４は、増殖しながらｐｏｌｙＰを大量に生成し、腸管透過性に正の効果を有することが見事に実証されている。さらに、ＨＭＯの添加は、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４におけるｐｏｌｙＰ生合成に正に影響を与えることも示されている。

２０２２年５月３０日に受理されたＸｉａｏらの抄録は、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４が、腸内細菌叢及び胆汁酸代謝を調節することを介して、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発性大腸炎に対するインフリキシマブの有効性を改善したと結論付けている。使用した実験モデルは、マウスにおけるＤＳＳ誘発性急性大腸炎である。潰瘍性大腸炎は、明白な腸の炎症及び正常な腸内細菌の変化を特徴とする炎症性腸疾患と考えられている。抄録に記載されている処置は、インフリキシマブ（大腸炎などの炎症状態の処置に使用される免疫抑制効果を有するモノクローナル抗体）、及びインフリキシマブ＋Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４である。Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４を単独で投与された動物群はない。インフリキシマブは、ヒト及び動物モデルの両方で大腸炎の処置に非常に有効であるが、その使用は、いくつかの臨床試験では感染リスクの増加に関連している（Ｓｈａｈら、２０１７）。

この著者らは、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４をインフリキシマブに添加すると、微生物叢及び胆汁酸代謝が変化すると説明している。この著者らは、胆汁酸の変化がその効果を説明し得ると認めている。Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４は、ビフィズス菌、ブラウティア属、ブチリシコッカス属、クロストリジウム属、コプロコッカス属、ジェミガー属（Ｇｅｍｍｉｇｅｒ）、及びパラバクテリオイド属の相対存在量を増加させ、エンテロコッカス属及びシュードモナス属の細菌の相対存在量を減少させた。腸球菌、特にシュードモナスは病原性であり得ること、及びインフリキシマブの使用が炎症を軽減するが、感染のリスクを増加させることが知られていることを考慮すると、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４を添加するという単なる事実が、インフリキシマブ療法の欠点を補い、そのため、腸内にすでに存在する病原菌のレベルを低減させることによって腸のより迅速な治癒を容易にすることができた。留意すべきは、観察された効果が、既存の腸内細菌叢及びインフリキシマブとの併用に依存していることである。

その上、著者らは、ＤＳＳ大腸炎モデルの改善がいくつかの胆汁酸の変化に関連することを報告している。しかし、マウス及びヒトの胆汁酸の組成は大きく異なり、前者は妥当な量のアルファ及びベータムロコール酸を含有するが、後者には実際存在しないため、この発見のヒトへの一般化可能性は限定的である。

一方で、彼らは、インフリキシマブ＋Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４群でいくつかのパラメータ、例えば、タイトジャンクション（ＺＯ－１、オクルディン）が改善することを開示しているが、この効果を十分に証明するデータはない。要約すると、この抄録は、腸内細菌叢及び胆汁酸代謝を調節することにより、マウスの特定の実験的（ＤＳＳ）誘発性大腸炎モデルにおけるインフリキシマブの有効性に及ぼすＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４の効果に関するいくつかの結果を示している。

特に、インフリキシマブと組み合わせても結果が決定的ではないタイトジャンクションの実験では、インフリキシマブで処置しなければ、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４単独の効果を導き出すことはできない。さらに、考察したように、インフリキシマブとの組み合わせで観察される効果は、既存の腸内細菌叢に依存するため、この試験で使用された実験的大腸炎モデルとは異なる疾患におけるＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４の効果を導き出すことはできない。

驚くべきことに、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４の疾患改善に及ぼす効果（前述のように、微生物叢及び胆汁酸代謝を調節することによるインフリキシマブの有効性の改善を通じて）は、間接的な効果であると考えることができる。これに対して、本発明では、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４の直接的な効果、すなわち、ポリリン酸塩の腸上皮への直接送達を通じての腸管透過性の保護が示されている。さらに、その効果は、疾患モデル及び周囲の微生物叢とは無関係である。

全体として、発明者らは、ビフィズス菌ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４株が、特に腸管バリア機能障害に罹患しているヒトの腸内で、プロバイオティクス組成物が有益な効果を発揮するのに望ましい全ての主要な特性を包含することを見出した。これらは、胃腸の状態に対する耐性（胃のストレス及び胆汁塩に対するそのような耐性）、長期安定性、一生の全ての段階に存在する種に属すること、及び増殖中にｐｏｌｙＰを生成する顕著な能力を含む。したがって、本発明によるＢ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４を含有するプロバイオティクス製剤は、腸管透過性が損なわれる任意の臨床状態の改善に有用である。

したがって、本発明は、ポリリン酸塩を生成することによって、それを必要とする対象における腸管バリア機能障害若しくは関連状態、又はその症状、合併症及び／若しくは後遺症を処置、防止、又は改善する方法で使用するための、ブダペスト条約に基づきスペインタイプカルチャーコレクション（ＣＥＣＴ）に受託番号ＣＥＣＴ７８９４で寄託されたビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム株、又は、
（ａ）対応する寄託株のゲノムと少なくとも９９％同一のゲノムを有し；かつ
（ｂ）対応する寄託株がポリリン酸塩を生成する能力を保持する
その派生細菌株を含むプロバイオティクス組成物に関する。

「ブダペスト条約に基づきスペインタイプカルチャーコレクション（ＣＥＣＴ）に受託番号ＣＥＣＴ７８９４で寄託されたビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム株、又は（ａ）対応する寄託株のゲノムと少なくとも９９％同一のゲノムを有し；かつ（ｂ）ポリリン酸塩を生成する対応する寄託株の能力を保持するその派生細菌株」を、以降、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株と略記する。

別の態様では、本発明は、対象における腸管透過性亢進及び関連状態の処置で使用するための、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株を含むプロバイオティクス組成物であって、腸管透過性亢進の処置がポリリン酸塩を生成することによるものであり、関連状態が腸以外の状態であるプロバイオティクス組成物を提供する。

プロバイオティクス組成物は、腸管バリア機能障害、特に腸管透過性亢進の処置に有用であり、また、関連状態自体、すなわち、腸管バリア機能障害に関連する状態、特に腸管透過性亢進の処置にも有用であることが本明細書で理解される。これを、ポリリン酸塩の生成による腸管透過性亢進を処置することによって、本明細書に記載の状態の処置に使用するためのプロバイオティクス組成物として代替的に表すことができる。

本発明の別の態様は、
（ｉ）Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株、及び
（ｉｉ）少なくとも１種のヒトミルクオリゴ糖
を含む組み合わせであって、同時、別々又は逐次投与のために構成される組み合わせに関する。

この態様を、少なくとも１種のヒトミルクオリゴ糖と組み合わせて使用するための、本明細書に記載のＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株を含むプロバイオティクス組成物に関して代替的に説明することができ、組み合わせは、同時、別々の又は逐次投与のために構成される。

別の態様では、本発明は、対象における腸管透過性亢進及び関連状態の処置で使用するための、本明細書に提供される組み合わせであって、腸管透過性亢進の処置は、ポリリン酸塩を生成することによるものであり、関連状態は、免疫障害又は疾患、代謝性又は心血管の障害又は疾患、神経又は精神の障害又は疾患、及び胃腸障害又は疾患からなる群から選択される。

別の態様では、本発明は、
（ｉ）Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株；及び
（ｉｉ）少なくとも１種のヒトミルクオリゴ糖
を含む組成物を提供する。

プロバイオティクス組成物、組み合わせ、及び本発明の態様による組成物は、本明細書に詳細に記載される異なる医療用途／使用に使用することができる。本明細書に記載の全ての使用を、本明細書に開示される腸管バリア機能障害若しくは関連状態、又はその症状、合併症及び／若しくは後遺症の処置、防止又は改善のための、医薬組成物、栄養補助食品組成物、獣医用組成物、又は食品／栄養組成物の製造のための、本明細書に記載の組成物のいずれかの使用として代替的に説明することができる。これはまた、それを必要とする対象の腸管バリア機能障害若しくは関連状態、又はその症状、合併症及び／若しくは後遺症を処置、防止又は改善する方法であって、本発明の態様による本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含む方法として代替的に説明され得る。

本発明の特許請求の範囲及び態様で使用される用語は、この説明におけるその広く一般的な意味で理解される。それにもかかわらず、それらを、本発明の詳細な説明において以降に定義する。本明細書及び特許請求の範囲全体を通じて、「含む」という語及びその変形形態は、他の技術的特徴、付加物、成分、又は工程を排除することを意図するものではない。本発明の追加の目的、利点及び特徴は、本説明を検討することにより当業者に明らかになるか、又は本発明を実施することによって学ぶことができる。さらに、本発明は、本明細書に記載の特定の及び好ましい実施形態の全ての可能な組み合わせを包含する。以下の実施例及び図面は、例示の目的で本明細書に提供されるものであり、本発明に限定することを意図するものではない。

図１は、試験株の成長曲線を示す。６時間及び１６時間の時点でＰｏｌｙＰを抽出し、定量化した。ＯＤは、光学密度（５９５ｎｍで測定）を意味し、ｔ（時）は、時間単位の時間を意味する。 図２は、６時間及び１６時間の成長後の試験株のｐｏｌｙＰ生合成（ｎｍｏｌ）を示す。 図３は、調べたビフィズス菌株におけるＰＰＫタンパク質間の関係を示す隣接結合木を示す。 図４は、最終製品におけるＢ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）の経時的な安定性を示す。生菌を、ｌｏｇ ｃｆｕとして月単位（ｔ（月））で経時的に表す。 図５は、ＨＭＯラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、グルコース（Ｇｌｕｃ）の存在下及び炭素源の非存在下（Ｃ－）でのＢ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）の成長を示す。ＯＤは光学密度（５９５ｎｍで測定）を意味し、ｔ（時）は、時間単位の時間を意味する。 図６は、多量（ｓｂ＿ＭＥＩ）及び少量（ｓｂ＿ＬＰ）のｐｏｌｙＰを有するＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４の上清に曝露したＣａｃｏ－２バリアの見かけの透過係数（Ｐａｐｐ）（左）及び経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）（右）を示す。細胞を、対照としてＭＥＭ、非発酵ＭＥＩ及びＬＰ培地に曝露した。 図７は、多量（ＭＥＩ）及び少量（ＬＰ）のｐｏｌｙＰを有するＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４の上清に曝露したＣａｃｏ－２細胞におけるＨＳＰ２７タンパク質の相対的発現を示す。ＨＳＰ２７の量をΒアクチン量に対して正規化した（左）。ＨＳＰ２７の相対発現と上清中のｎｍｏｌのＰとして表記されるｐｏｌｙＰ量との相関（ピアソンｒ＝０．８７、ｐ＝０．０１）（右）。 図８は、多量（ｍｅｉ）及び少量（ｌｐ）のｐｏｌｙＰを有するＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４の上清に曝露したＣａｃｏ－２細胞におけるタイトジャンクションタンパク質のＺｏｎｕｌａ ｏｃｌｕｄｅｎｓ－１（ＺＯ１）、ジャンクション接着タンパク質－１（ＪＡＭ１）及びオクルディン（occluding）の相対発現（ＲＥ）を示す。発現を１８Ｓ ｒＲＮＡ及びＧＡＤＰＨ遺伝子発現に対して正規化した。 図９は、異なる条件下で６時間及び１６時間インキュベートしたＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４培養物のｐｏｌｙＰ生合成（ｎｍｏｌ）を示す:対照（Ｃ）、母乳（ＢＭ）、ＬＮＴ、ポリアミン（Ｐｏｌｙａ）。 図１０は、ＨＭＯ２’－フコシルラクトース（ＳＮ Ｂ．ビフィダム２’－ＦＬ）、グルコース（Ｇｌｕｃ）と培養したＢ．ビフィダムＢｂ０１の上清の存在下、及び炭素源の非存在下（Ｃ－）でのＢ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）の成長を示す。ＯＤは光学密度（５９５ｎｍで測定）を意味し、ｔ（時）は時間単位の時間を意味する。

発明の詳細な説明
定義
プロバイオティクス：本明細書で使用される場合、この用語は、適切な量の微生物を保有する宿主生物に健康上の恩恵を与えることができる生きている非病原性微生物、例えば、細菌を指す。いくつかの実施形態において、宿主生物は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、宿主生物はヒトである。非病原性細菌の一部の種、株、及び／又はサブタイプは、現在、プロバイオティクスとして認識されている。プロバイオティクスは、細菌の変異体又は突然変異株であり得る。プロバイオティクス細菌を自然に突然変異させてもよく、又は所望の生物学的特性、例えば、生存性を保持、強化、若しくは改善するように遺伝子操作により改変して、プロバイオティクス特性を提供するか、又はプロバイオティクス特性を保持、強化、若しくは改善してもよい。

派生する：本明細書で使用される場合、用語「派生する」、「派生体」、「変異体」、「突然変異体」（例えば、「突然変異体株」）、又はそれらの任意の文法的変形形態は、特定の分子／物質（例えば、本開示の菌株）から単離されるか、又はそれを使用して作製される成分を指す。例えば、第１の細菌株（例えば、寄託株）から派生する細菌株は、第１の菌株と同一の又は実質的に類似している菌株であり得る。細菌株の場合、派生株は、例えば、天然に存在する突然変異誘発、人為的定方向突然変異誘発、人為的ランダム突然変異誘発又は他の遺伝子工学技術によって得ることができ、それは、寄託株の少なくとも１つの能力を保持、増強又は改善する。

賦形剤／担体：これらの用語は、互換的に使用され、化合物、例えば、本開示の細菌株の投与をさらに容易にするために、例えば、医薬組成物に添加される不活性物質を指す。例としては、限定するものではないが、重炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類及び様々な種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、並びに例えば、ポリソルベートを含む界面活性剤が挙げられる。用語「生理学的に許容される賦形剤／担体」及び「薬学的に許容される賦形剤／担体」は、互換的に使用されてもよく、生物に著しい刺激を引き起こさず、投与された細菌化合物の生物活性及び特性を損なわない物質又は希釈剤を指す。アジュバントはこれらの用語に含まれる。

組成物：本明細書で使用される場合、この用語は、本発明の態様による異なる組成物及び組み合わせを指す。さらに、それは、本発明内で有用な少なくとも１種の化合物と賦形剤／担体の混合物などの製品形態を指す。例えば、「医薬組成物」は、本発明の細菌と、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤などの他の成分との調製物を指す。医薬組成物は、患者又は対象への化合物の投与を容易にする。

同一性：本明細書で使用される場合、この用語は、ポリマー分子間、例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子間の単量体配列の全体的な保存を指す。いかなる追加の修飾子もない用語「同一」は、それらの配列が１００％同一であること（１００％配列同一性）を意味する。２つの配列を、例えば「７０％同一」と記載することは、例えばそれらが「７０％の配列同一性」を有すると記載することと同等である。

２つのポリマー分子、例えば、ポリヌクレオチド配列のパーセント同一性の計算は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列を整列させることによって行うことができる（例えば、最適なアライメントのために、第１及び第２のポリヌクレオチド配列の一方又は両方にギャップを導入することができる）。ある特定の態様において、比較目的のために整列させた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％である。ポリヌクレオチドの場合、対応する塩基位置の塩基を、次に比較する。

２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり、数学的アルゴリズムを使用して決定することができる。タンパク質配列とヌクレオチド配列の両方のアライメントのために適切なソフトウェアプログラムが利用可能である。パーセント配列同一性の決定に適切なプログラムの１つはｂｌ２ｓｅｑであり、これは、ＢＬＡＳＴＮ（核酸配列を比較するために使用する）又はＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸配列を比較するために使用する）アルゴリズムのいずれかを使用して、２つの配列間の比較を行う。他の適切なプログラムは、例えば、バイオインフォマティクスプログラムのＥＭＢＯＳＳ ｓｕｉｔｅの一部であるＮｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、又はＭａｔｃｈｅｒである。配列アライメントは、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＵＶＥ、ＭＵＭＭＥＲ、ＲＡＳＴなどの当技術分野で公知の方法を使用して実施することができる。

ある特定の態様において、第２の配列に対する第１の配列のパーセンテージ同一性（％ＩＤ）は、％ＩＤ＝１００×（Ｙ／Ｚ）として計算され、ここで、Ｙは、第１及び第２の配列（例えば、目視検査又は特定の配列アライメントプログラムによって整列させた）のアライメントにおける同一の一致として点数化されたアミノ酸残基又は核酸塩基の数であり、Ｚは、第２の配列内の残基の総数である。完全又はほぼ完全なゲノム核酸塩基配列を比較する場合、％ＩＤは、ＡＮＩ(平均ヌクレオチド同一性（Ａｖｅｒａｇｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）)と呼ばれることがある。ＡＮＩの計算は、通常、ゲノム配列の断片化に続いて、ヌクレオチド配列検索、アライメント、及び同一性の計算を伴う。

防止する：本明細書で使用される場合、用語「防止する」、「防止すること」、「予防」及びそれらの変形形態は、例えば、
（ｉ）本明細書に開示される疾患、障害及び／若しくは状態の発症を部分的又は完全に遅らせること；
（ｉｉ）本明細書に開示される特定の疾患、障害、及び／若しくは状態の１以上の症状、特徴、若しくは臨床徴候、合併症、若しくは後遺症の発症を部分的又は完全に遅らせること；
（ｉｉｉ）本明細書に開示される特定の疾患、障害、及び／若しくは状態の１以上の症状、特徴、若しくは徴候、合併症、若しくは後遺症の発症を部分的又は完全に遅らせること；
（ｉｖ）本明細書に開示される特定の疾患、障害及び／若しくは状態からの進行を部分的又は完全に遅らせること；及び／又は
（ｖ）本明細書に開示される疾患、障害、及び／又は状態に関連する病状を発症するリスクを低下させること
を指す。

対象：用語「対象」、「患者」、「個体」、及び「宿主」、並びにそれらの変形形態は、本明細書では互換的に使用され、その診断、処置、又は治療が望まれる任意の哺乳類対象、特にヒトを指し、限定されないが、ヒト、飼育動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）も含む。本明細書に記載の組成物は、ヒトの治療及び獣医学的応用の両方に適用可能である。

乳児：用語「乳児」は、本説明では、ヒト又は動物の非常に幼い子孫、例えば、１歳未満の子供として理解されるものとする。ヒトに適用される場合、この用語は、用語「赤ん坊」と同義と見なされる。用語「子供」は、誕生の段階から思春期の段階の間のヒトを指す。「幼児」とは、１歳から７歳までの子どもを指し、及び「歩き始めの子供」は１～３歳の間を指す。しかし、本説明では、用語「乳児」、「赤ん坊」、「幼児」及び「歩き始めの子供」は、同義と見なされ、互換的に使用される。

乳児以外のヒト又は乳児以外：本明細書で使用される場合、これらの用語は、７歳超のヒトを指す。乳児以外のヒトは、１０代の若者、成人、又は高齢者（６５歳以上）であり得る。このカテゴリーには、運動選手及び乳児以外の虚弱者も含まれる。

それを必要とする対象：本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」は、本開示の組成物の投与から恩恵を受ける哺乳類対象などの対象を含む。

治療有効量：用語「治療有効用量」及び「治療有効量」は、それを必要とする対象に対して所望の治療効果、薬理学的及び／又は生理学的効果を生じるために十分である本開示の組成物の量を指すために使用される。特に、この用語は、状態、例えば、下痢の防止、症状の発症の遅延、又は症状の改善をもたらす化合物の量を指す。治療有効量は、例えば、腸管バリア機能の低下に関連する疾患若しくは状態の１以上の症状を処置、防止、その重症度の軽減、発症の遅延、及び／又は発生リスクを低減するために十分であり得る。治療有効量、並びに治療的に有効な投与頻度は、当技術分野において公知であり、以下で考察される方法によって決定することができる。

処置：本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置」、「治療」は、例えば、本明細書に開示される疾患又は状態の重症度の低減；本明細書に開示される疾患（例えば、腸管バリア機能障害若しくは関連状態）に関連する１以上の症状、合併症、若しくは後遺症の緩和／改善又は排除；必ずしも疾患若しくは状態を治癒する必要はないが、本明細書に開示される状態／疾患を有する対象への有益な効果の提供を指す。この用語は、疾患若しくは状態、又はそれらの症状、合併症、若しくは後遺症の予防又は防止も含む。したがって、本明細書で使用される場合、表現「処置すること」は、疾患、又はその症状、合併症及び／若しくは後遺症を処置、防止又は改善することを包含する。

この用語は、例えば、本開示の組成物による処置の非存在下で予想されることに関して、疾患若しくは状態を防止する；疾患若しくは状態を治癒する；疾患若しくは状態の発症を遅らせる；症状、合併症若しくは後遺症の発症を遅らせる；疾患若しくは状態の重症度を軽減する；症状、合併症、若しくは後遺症の重症度を低減する；１以上の症状を改善する；１以上の合併症を改善する；１以上の後遺症を改善する；１以上の症状を防止する；１以上の合併症を防止する；１以上の後遺症を防止する；１以上の症状を遅らせる；１以上の症状を遅らせる；１以上の合併症を遅らせる；１以上の後遺症を遅らせる；１以上の症状を軽減／改善する；１以上の合併症を軽減／改善する；１以上の後遺症を軽減／改善する；１以上の症状の期間を短縮する；１以上の合併症の期間を短縮する；１以上の後遺症の期間を短縮する；１以上の症状の頻度を低減する；１以上の合併症の頻度を低減する；１以上の後遺症の頻度を低減する；１以上の症状の重症度を低減する；１以上の合併症の重症度を低減する；１以上の後遺症の重症度を低減する；生活の質を改善する；生存率を増加させる；疾患若しくは状態の再発を防止する；疾患若しくは状態の再発を遅らせる；又はそれらの任意の組み合わせのための臨床的又は栄養的介入を指す。

食事管理及び／又は食事による二次予防：これらの用語は、患者が罹患している疾患、障害、又は病態のために、通常の食品又はそれに含有されるある特定の栄養素、又は代謝物を摂取、消化、吸収、代謝若しくは排泄する能力が限定されている、損なわれている、若しくは妨げられているか、又は他の医学的に決定された栄養素要件を有する患者の専用食又は部分食を指す。本明細書において、「処置すること」又は「処置」は、食事管理及び／又は食事による二次防止を包含する。

症状：本明細書で使用される場合、この用語は、対象によって観察される疾患若しくは身体的障害の主観的又は身体的徴候、兆候、若しくは証拠を指す。一般に、この用語は、患者が経験し、疾患を示す、任意の病的現象、または構造、機能、又は感覚の正常からの逸脱を指す。症状は、症状を経験している個人が感じるか又は気づくが、他の人が簡単に気づかない場合がある。いくつかの実施形態において、症状は、軽度の症状、中等度の症状、又は重篤な症状であり得る。本明細書で使用される場合、用語「軽度の症状」は、生命を脅かすものではなく、例えば、集中治療を必要としない症状を指す。本明細書で使用される場合、用語「中等度の症状」は、生命を脅かすものとなり、例えば、入院を必要し得るため、モニタリングを必要とする症状を指す。本明細書で使用される場合、用語「重篤な症状」は、生命を脅かし、例えば、集中治療を必要とする症状を指す。

合併症：本明細書で使用される場合、この用語は、疾患若しくは状態の本質的な部分ではない、疾患若しくは状態中に生じる病理学的プロセス又は事象を指し；それは、疾患／状態又は独立した原因から生じる場合がある。例えば、抗生物質又は非ステロイド性抗炎症薬によって病態を処置すると、副作用として腸に上皮損傷が生じ、透過性亢進をもたらし得る。この透過性亢進は、長期的な合併症として、アレルギー性疾患、炎症性疾患又は代謝性疾患のリスクの増加をもたらし得る。いくつかの態様では、合併症は一時的なものであり得る。いくつかの態様では、合併症は慢性的又は永続的であり得る。本明細書で使用される場合、用語「後遺症」は、長期的、慢性的、又は永久的な合併症を指す。

腸管バリア：本明細書で使用される場合、この用語は、腸管腔を内部宿主から分離し、機械的要素（粘液、上皮層）、体液性要素（ディフェンシン、ＩｇＡ）、免疫学的要素（リンパ球、自然免疫細胞）、筋肉、神経学的要素及び微生物叢からなる機能的実体を指す。

腸管透過性：本明細書で使用される場合、この用語は、とりわけ、腸壁全体又は壁構成成分を横切る流動速度を分析することによって測定可能な、所与の部位における腸管バリアの機能的特徴を指す。腸管透過性とは、消化管内から腸壁を覆う細胞を通って体の他の部分に通過する材料の制御を指す。健康な腸は選択的透過性を示し、これにより、栄養素が腸を通過する一方で、潜在的に有害な物質（抗原など）が腸から出て体内により広く移動するのを防止するバリア機能を維持することが可能になる。

正常な腸管透過性：本明細書で使用される場合、この用語は、中毒、炎症又は腸機能障害の徴候を有さない健康な個人に見られる安定した透過性を指す。

腸管バリア機能障害：用語「腸管バリア機能障害」、「腸管透過性障害」、「腸管透過性不均衡」及び「異常な腸管透過性」は、互換的に使用され、正常な透過性と比較して一過性でなく変化しており、腸の恒常性の喪失、機能障害及び疾患につながる透過性の乱れを指す。

腸管透過性亢進：本明細書で使用される場合、用語「腸管透過性亢進」は、腸上皮壁内のジャンクションがそれらの完全性を失い、内腔からの材料が血流、他の器官、又は脂肪組織に移動するようになる状態を指す。腸壁のタイトジャンクションが緩むと、腸の透過性が高まり、細菌及び毒素が腸から血流に流れ込むようになる。この現象は、例えば、一般に「リーキーガット」と呼ばれている。

腸管透過性亢進は、クローン病、セリアック病、１型糖尿病、２型糖尿病、関節リウマチ、脊椎関節症、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、統合失調症、特定の種類のがん、肥満、脂肪肝、アトピー及びアレルギー性疾患などのいくつかの疾患の要因である。ほとんどの場合、透過性亢進は疾患に先立って発症するが、これらの疾患のほとんどで腸管透過性亢進との因果関係は明らかではない。この理由から、本明細書では「腸管バリア機能障害（例えば、腸管透過性亢進及び関連状態）」を使用する。

「腸管バリア」、「腸管透過性」、「正常な腸管透過性」、「腸管バリア機能障害」、「腸管透過性の低下／亢進」は、Ｂｉｓｃｈｏｆｆら、２０１４でも定義されている用語である。

ヒトミルクオリゴ糖：この用語はＨＭＯと略され、「ヒトミルクグリカン」としても知られ、ヒトミルク中に存在するオリゴ糖を総称して指し、ヒトミルク中でラクトース及び脂肪に次いで３番目に大きな固形成分を構成する。ＨＭＯは単糖の短いポリマーであり、通常、還元末端にラクトース、非還元末端にフコース又はシアル酸を含有する場合が多い炭水化物コアからなる。ＨＭＯは、授乳段階に応じて、ヒトミルク中に１１．３～１７.７ｇ／Ｌの濃度で存在する。構造が異なる約２００のＨＭＯが知られており、異なる分類に従って、例えば、フコシル化、シアル化及び中性コアＨＭＯに分類され得る。母乳中のヒトミルクオリゴ糖の組成は、それぞれの母親によって異なり、授乳期間にわたって変化する。全ての女性の８０％で優勢なオリゴ糖は２’－フコシルラクトースであり、ヒトの母乳に約２．５ｇ／Ｌの濃度で存在する。他の豊富なオリゴ糖は、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、及びラクト－Ｎ－フコペンタオースを含む。

合成混合物：化学的及び／又は生物学的手段によって得られる混合物を意味し、例えば、哺乳類のミルク中に天然に存在する混合物と化学的に同一であり得る。本明細書に記載の全ての組成物は合成混合物である。

栄養組成物：この用語は、対象に栄養を与える組成物を指す。この栄養組成物は、通常、経口又は静脈内投与されるべきであり、通常、脂質源又は脂肪源及びタンパク質源を含む。特に、栄養組成物は、対象の栄養ニーズの全て又はほとんどを満たす完全な栄養混合物（例えば、乳児用調製粉乳）である。栄養組成物は食品を含む。

乳児用調製粉乳：この用語は、本明細書で使用される場合、生後数ヶ月間の乳児による特定の栄養使用を意図し、単独でこのカテゴリーの人の栄養要件（乳児用調製粉乳及びフォローオン調製粉乳に関する２００６年１２月２２日の欧州委員会指令９１／３２１／ＥＥＣ ２００６／１４１／ＥＣの第２条（ｃ））を満たす食品を指す。それはまた、乳児用であり、コーデックス・アリメンタリウス（Ｃｏｄｅｘ Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ）（Ｃｏｄｅｘ ＳＴＡＮ ７２－１９８１)及び乳児用特別品（特別な医療目的用食品を含む）で定義される栄養組成物も指す。用語「乳児用調製粉乳」は、以下の形態を包含するが、これらに限定されない。

スターター調製粉乳：生後６ヶ月の乳児による特定の栄養使用を目的とした食品を意味する。

フォローアップ調製粉乳又はフォローオン調製粉乳：６ヶ月目以降から与えられ得る。それは、このカテゴリーの人の、次第に多様化していく食事の中の主要な液体要素を構成する。

乳児用調製粉乳、フォローオン調製粉乳及びスターター乳児用調製粉乳は、液体のすぐに消費できる形態若しくは濃縮された形態、又は水を添加すると調製粉乳を形成するように再構成され得る乾燥粉末形態のいずれかであり得る。このような調製粉乳は、当技術分野において周知である。

離乳食：生後数年間、乳児又は幼児による特定の栄養使用を目的とした食品を意味する。

乳児用シリアル組成物：生後数年間、乳児又は幼児による特定の栄養使用を目的とした食品を意味する。

強化剤：母乳又は乳児用調製粉乳との混合に適する液体又は固体の栄養組成物を指す。

グローイングアップミルク：幼児の特定の栄養ニーズに適合したミルクベースの飲料を意味する。

離乳期：乳児の食事の中で、母乳が他の食品に置き換えられる期間を意味する。

経腸投与：消化管（胃を含む）に組成物を堆積させる、非乳児に組成物を送達するための任意の従来の形態を意味する。

経口投与：口を通じて非乳児に組成物を送達するための任意の従来の形態を意味する。したがって、経口投与は経腸投与の形態である。

プロバイオティクス組成物
一実施形態において、プロバイオティクス組成物は、受託番号ＣＥＣＴ７８９４で寄託されたビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガムを含む。

ビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４株は、ＷＯ２０１５０１８８８３Ａ２号に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。この菌株は、２０１１年３月３０日（３０．０３.２０１１）に受託番号ＣＥＣＴ７８９４で、スペインタイプカルチャーコレクション（ＣＥＣＴ、Ｐａｒｃ Ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｄｅ ｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ ｄｅ Ｖａｌｅｎｃｉａ, Ｃａｒｒｅｒ ｄｅｌ Ｃａｔｅｄｒａｔｉｃ Ａｇｕｓｔｉｎ Ｅｓｃａｒｄｉｎｏ Ｂｅｎｌｌｏｃｈ，９，４６９８０ Ｐａｔｅｒｎａ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｓｐａｉｎ）に寄託された。寄託はブダペスト条約の条件の下で行われ、生存可能であり、寄託に関係するその全ての機能を維持している。それは、同一申請者によって寄託された。

ビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４（この明細書ではＫＡＢＰ－０４２ともいう）は、健康な母乳で育てられた乳児の糞便から単離された。ＣＥＣＴ７８９４のインシリコ及びインビトロ分析が、この菌株のプロバイオティクス特性を研究するために行われており、この菌株がヒト消化管の負荷（胃の状態と胆汁塩）に耐え、腸上皮に接着することが確認された。遺伝子型解析は、これらの特徴を確認あいた。

ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）は、ヒトミルクに見出される複合糖であり、その利用はビフィズス菌において菌株特異的である。Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４は、インビトロでＨＭＯラクト－Ｎ－テトラオース（母乳中に見出される最も一般的なＨＭＯの１つ）を利用できることが本明細書で見出されている。同時に、そのゲノムは、ラクト－Ｎ－ビオシダーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、アルファ－ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ及びベータ－グルクロニダーゼを含む典型的なＨＭＯ分解遺伝子のほとんどを保有する。この分析から、この菌株がＨＭＯの利用、及びこのように乳児の腸に適合することが確認される。

さらに、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４は、そのゲノムの他の遺伝子が糖質活性酵素（ＣＡＺｙ）をコードしているため、多様な炭水化物代謝を有しており、広範囲の複合基質を分解できることを示唆している。加えて、ランチペプチドＢ、セルピン及びアドヘシンをコードする遺伝子は、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４のゲノムにも存在する。ランチペプチドＢ（ランチビオティック）は、ある範囲のグラム陰性及びグラム陽性の病原菌に対して強力な抗菌活性を示すクラスＩバクテリオシンである。セルピンは、ヒトの好中球及び膵臓のエラスターゼ（プロテアーゼ）を選択的に不活性化し、抗炎症作用をもたらし、腸の恒常性の維持に寄与する。

全体として、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４の表現型及び遺伝子型解析により、本明細書において、菌株がＨＭＯを分解する能力を有するため、乳児の腸を含むヒトの消化管に十分に適合することが確認される。

本文脈で当業者が理解するように、細菌株は、その天然の環境から単離されている、すなわち、その天然の環境には存在しないため、その天然の環境に存在する他の生物及び物質を含まない。

細菌における抗菌薬に対する耐性の出現及び広がりは、ヒト及び動物の健康に脅威をもたらし、大きな財政的及び社会的コストをもたらす。全ゲノム配列解析により、新規株Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４は、一般的に使用されている抗生物質に対する伝達性の抗生物質耐性遺伝子を保有していないことが判明した。全体として、これらの結果は、病原性種への抗生物質耐性の潜在的な移行のリスクを排除する。

寄託株を出発材料として使用することにより、当業者は、従来の突然変異誘発又は再単離技術によって日常的に、本発明の組成物を形成する菌株の、本明細書に記載される関連する特徴及び利点を保持、増強又は改善するさらなる変異体又はその突然変異体を得ることができることは明らかである。そのため、本発明は、本明細書に開示される菌株の変異体／突然変異体にも関する。実施形態において、プロバイオティクス組成物は、ビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４株から派生する細菌株を含み、派生細菌株は、
（ａ）対応する寄託株ＣＥＣＴ７８９４のゲノムと少なくとも９９％の平均ヌクレオチド同一性（ＡＮＩ）を有するゲノムを有し；及び
（ｂ）対応する寄託株のポリリン酸塩生成能を保持、強化、又は改善する。

特定の実施形態において、寄託株から派生する細菌株は、対応する寄託株のゲノムと少なくとも９９％の平均ヌクレオチド同一性（ＡＮＩ）を有するゲノムを有し、より特には、同一性の割合（％）は、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％である。特に、ＡＮＩの％は少なくとも９９．５％である。より特には、ＡＮＩの％は、９９．５０％、９９．５１％、９９．５２％、９９．５３％、９９．５４％、９９．５５％、９９．５６％、９９．５７％、９９．５８％、９９．５９％、９９．６０％、９９．６１％、９９．６２％、９９．６３％、９９．６４％、９９．６５％、９９．６６％、９９．６７％、９９．６８％，９９．６９％、９９．７０％、９９．７１％、９９．７２％、９９．７３％、９９．７４％、９９.７５％、９９．７６％、９９．７７％、９９．７８％、９９．７９％、９９．８０％、９９．８１％、９９．８２％、９９．８３％、９９．８４％、９９．８５％、９９．８６％、９９．８７％、９９．８８％、９９．８９％、９９．９０％、９９．９１％、９９．９２％、９９．９３％、９９．９４％、９９．９５％、９９．９６％、９９．９７％、９９．９８％又は９９．９９％である。別の実施形態において、ＡＮＩの％は少なくとも９９.９％であり；特に、ＡＮＩの％は、９９．９１％、９９．９２％、９９．９３％、９９．９４％、９９．９５％、９９．９６％、９９．９７％、９９．９８％又は９９．９９％である。

いくつかの態様において、突然変異体は、天然に存在する突然変異誘発、人為的定方向突然変異誘発、又は人為的ランダム突然変異誘発によって得られる。１つの特定の実施形態において、寄託株から派生する細菌株は、組換えＤＮＡ技術を使用することによって得られる。そのため、本発明の別の態様は、寄託株から派生する菌株を得る方法であって、寄託株を出発材料として使用し、突然変異誘発を適用することを含み、得られた変異体又は突然変異体が、本明細書に開示される寄託株の少なくとも１つの能力をさらに保持、増強、又は改善する方法に関する。

本発明の組成物の菌株形成部分は、生存細胞の形態であってもよい。或いは、菌株は、非生存細胞の形態であってもよい。これは、熱で殺滅された微生物、又はｐＨの変化、超音波処理、放射線若しくは高圧への曝露によって殺滅された微生物を含み得る。非生存細胞では、細胞を食事、医薬品又は食用製品に容易に組み込むことができ、保存要件が生存細胞よりもはるかに制限されないため、製品の調製は簡単である。非生存細胞として本発明の菌株を含む組成物は、培地中にある菌株に由来する生成物を含むことができる。

本明細書に開示される菌株は、適切な人工培地中及び適切な条件下で細菌を培養（又は発酵）することによって生成される。表現「人工培地」は、天然物質、及び任意に血清の機能の一部を再現できるポリマーであるポリビニルアルコールなどの合成化学物質を含む培地であると理解される。一般的に適切な人工培地は、細菌成長に必要な炭素源（例えば、グルコース）、窒素源（例えば、アミノ酸及びタンパク質）、水及び塩を含む要素を含有する栄養ブロスである。増殖培地は、液体形態であり得るか、又はしばしば寒天若しくは別のゲル化剤と混合して固体培地を得ることができる。この菌株を、単独で培養して純粋培養物を形成するか、又は他の微生物と共に混合培養物として、又は異なる種類の細菌を別々に培養し、次いでそれらを所望の割合で組み合わせることによって培養することができる。培養後、及び最終製剤に応じて、菌株を精製細菌として使用してもよく、又は或いは、細菌培養物若しくは細胞懸濁液を、そのまま若しくは適切な後処置後に使用してもよい。この明細書では、用語「バイオマス」は、培養（又は培養と同義の用語としての発酵）後に得られる細菌株培養物であると理解される。

特定の実施形態において、菌株を人工培地中で発酵させ、発酵後に後処置に供して細菌細胞を得て、得られた細菌細胞は、液体培地中又は固体形態にある。特に、後処置は、乾燥、凍結、凍結乾燥、流動床乾燥、噴霧乾燥及び液体培地中での冷蔵からなる群から選択され、より特には、凍結乾燥である。

用語「後処置」は、本文脈では、保存可能な細菌細胞を得ることを目的として、バイオマスに対して実施される任意の処置であると理解すべきである。後処置の目的は、バイオマス中の細胞の代謝活性を低下させること、及びこのように細胞の有害な反応の速度を遅らせることである。後処置の結果として、細菌細胞は固体又は液体の形態であり得る。固体形態では、保存される細菌細胞は粉末又は顆粒であり得る。いずれにせよ、細菌細胞を含有する固体及び液体の形態はいずれも、自然界には存在せず、したがって、それらが人工的な後処置プロセス（複数可）の結果であるため、天然に存在しない。後処置プロセスは、特定の実施形態において、いわゆる１以上の後処置剤の使用を必要とし得る。本発明の文脈において、表現「後処置剤」は、本明細書に記載の後処置プロセスを実行するために使用される化合物を指す。後処置剤には、限定されないが、単独で又は組み合わせて使用される脱水剤、静菌剤、凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）（凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ））、不活性充填剤（凍結乾燥保護剤としても知られる）、担体材料（コア材料としても知られる）などが含まれる。

細菌細胞の代謝活性を低下させるには２つの基本的なアプローチがあり、そのため、後処置を実行するための２つのアプローチがある。１つ目は、全ての化学反応の速度を減少させることであり、これは冷蔵庫、機械式冷凍機、及び液体窒素冷凍庫を使用して冷蔵又は冷凍して温度を低下させることによって行うことができる。或いは、全ての化学反応の速度を減少させることは、細菌細胞の成長を阻害する物質、すなわち、Ｂｓｔａｔｉｃと略される静菌剤を添加することによって達成され得る。

後処置を行うための第２のアプローチは、バイオマスから水を除去することであり、このプロセスには凍結乾燥機を用いた水の昇華を伴い得る。バイオマスから水を除去する適切な技術は、乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥又は流動床乾燥である。固体形態をもたらす後処置は、乾燥、凍結、凍結乾燥、流動床乾燥、又は噴霧乾燥であり得る。

後処置は特に凍結乾燥であり、これは減圧下で昇華させることにより、凍結した細菌懸濁液からの水分の除去を伴う。このプロセスは、３つの工程：製品を事前凍結して凍結構造を形成する工程、一次乾燥でほとんどの水を除去する工程、及び二次乾燥で結合した水を除去する工程からなる。凍結乾燥細菌培養物の製造及び単離のための工業プロセスの客観的及び予想される変動性により、後者は一般に、凍結保護剤としても知られる一定量の不活性充填剤を含有する。その役割は、製品中の生きているプロバイオティクス細菌の含有量を標準化することである。市販の凍結乾燥培養物において、以下の不活性充填剤：スクロース、サッカロース、ラクトース、トレハロース、グルコース、マルトース、マルトデキストリン、コーンスターチ、イヌリン、及び他の薬学的に許容される非吸湿性充填剤が使用される。必要に応じて、アスコルビン酸のような他の安定化剤又は凍結防止剤も粘性ペーストを形成するために使用され、凍結乾燥に供される。いずれにせよ、そのようにして得られた材料を、粉末を含む適切なサイズに粉砕することができる。

バイオマスを固体形態で保存する代わりに、バイオマスを液体形態で保存してもよい。これは、細菌の成長を止めるために上記のように静菌剤を培地に添加することによって、又は細胞を回収し、静菌剤を有する生理食塩水にペレットを再懸濁し、任意に冷蔵する中間工程によって行われ得る。

時に、例えば、流動床乾燥プロセスにおいて上述したように、プロバイオティクス組成物を、貯蔵寿命及び／又は機能性を改善するために、固定化及び／又はコーティング、又はカプセル化プロセスに供する。細菌の固定化、コーティング又はカプセル化のためのいくつかの技術が当技術分野において公知である。

他の実施形態において、プロバイオティクス組成物は、例えば、リポソーム、マイクロバブル、マイクロ粒子又はマイクロカプセルなどへのカプセル化によって、徐放性投与のために製剤化される。適切な徐放性形態並びにそれらの調製のための材料及び方法は、当技術分野において周知である。そのため、本発明のプロバイオティクス組成物のいずれかの経口投与可能な形態は、少なくとも１種のコーティング又はマトリックスをさらに含む徐放性形態である。徐放性コーティング又はマトリックスは、限定されないが、天然の半合成又は合成ポリマー、水不溶性又は加工処理したワックス、脂肪、脂肪アルコール、脂肪酸、天然、半合成若しくは合成の可塑剤、又はこれらの２種以上の組み合わせを含む。腸溶コーティングを、当業者に公知の従来のプロセスを使用して適用することができる。

組成物中の菌株についてのコロニー形成単位（ｃｆｕ）の有効量は、当業者によって決定され、最終製剤に依存する。用語「コロニー形成単位」（「ｃｆｕ」）は、寒天プレート上の微生物数によって明らかにされる細菌細胞の数として定義される。

当業者に公知であるように、コロニー単位の有効量を、活性蛍光単位の有効量によっても測定することができる。「活性蛍光ユニット」（「ａｆｕ」）という用語は、おそらく生存している細胞の蛍光特性に特異的なゲート内のフローサイトメトリーカウントによって明らかにされる細菌細胞数として定義される。したがって、当業者は、上述した特定の量のｃｆｕがほぼ同じ量のａｆｕであると考える。

一実施形態において、プロバイオティクス組成物は、固体組成物である。別の実施形態において、プロバイオティクス組成物は液体組成物である。

別の実施形態において、プロバイオティクス組成物は、約１０^５ｃｆｕ～約１０^１２ｃｆｕの菌株、より特には、約１０^８ｃｆｕ～約１０^１１ｃｆｕの菌株を含む凍結乾燥細菌バイオマスを含む。

実施形態において、プロバイオティクス組成物は、凍結保護剤を含む。特に、プロバイオティクス組成物は、アレルゲンフリーの凍結保護剤である少なくとも１種の凍結保護剤を含む。いくつかの実施形態において、プロバイオティクス組成物は、少なくとも１種の凍結保護剤、例えば、マルトース、トレハロース、マンニトール（特に、ｄ－マンニトール）、サッカロース、ラクトース、デキストロース、アスコルビン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｌ－システイン、マルトデキストリン、無水デキストロース、デンプン、セルロース及びイヌリンを含む。特定の実施形態において、凍結保護剤及び／又は薬学的に許容される担体は、トレハロース、Ｄ－マンニトール、デキストロース、アスコルビン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｌ－システイン、マルトデキストリン、デンプン、及びセルロースからなる群から選択される。特に、デンプンは、トウモロコシ、トウモロコシデンプン及び／又は馬鈴薯デンプンである。

より特には、組成物は、エマルジョン、懸濁液、ゲル、ペースト、顆粒、粉末、及びガムから選択される薬学的に許容される担体をさらに含む。特に、担体はアレルゲンフリー担体である。

いくつかの実施形態において、プロバイオティクス組成物は、マルトデキストリン、セルロース、各種デンプン、イヌリン、ラクトース、又は水分活性が低減された担体からなる群から選択される１以上の担体を含む。

特定の実施形態において、プロバイオティクス組成物は、
－約１０^５ｃｆｕ～約１０^１２ｃｆｕの菌株を含む凍結乾燥細菌バイオマス；
－凍結保護剤並びに／又はエマルジョン、懸濁液、ゲル、ペースト、顆粒、粉末、及びガムから選択される薬学的に許容される担体
を含む組成物である。

ポリリン酸塩生成
一実施形態において、ビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４株又はその派生細菌株のポリリン酸塩の生成は、ポリリン酸塩生成が以下の工程：
（ａ）ＯＤ０．１で接種した菌株を、０．５％酵母エキス、０．５％トリプトン、０．４％ Ｋ_２ＨＰＯ_４、０．５％ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．０２％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．００５％ ＭｎＳＯ_４、１ｍｌのＴｗｅｅｎ ８０、０．０５％システイン、及び０.５％グルコースを含むリンゴ酸酵素誘導培地（ＭＥＩ）中、３７℃及び嫌気性条件下で培養する工程；
（ｂ）遠心分離により細胞を回収し、室温で４５分間穏やかに攪拌しながら５％次亜塩素酸ナトリウム１ｍｌに溶解する工程；
（ｃ）不溶性材料を１６,０００ｇ、４℃で５分間遠心分離してペレットを得て、１ｍｌの１．５ＭのＮａＣｌプラス１ｍＭのＥＤＴＡで２回洗浄し、その間に１６,０００ｇ、４℃で５分間遠心分離する工程；
（ｄ）１ｍｌの水で２回連続して洗浄し、その間に１６,０００ｇ、４℃で５分間遠心分離して、ペレットからｐｏｌｙＰを抽出する工程；
（ｅ）０．１ＭのＮａＣｌ及び１容量のエタノールを添加することにより、プールした水抽出物中のｐｏｌｙＰを沈殿させ、続いて氷上で１時間インキュベートする工程；
（ｆ）１６,０００ｇで１０分間遠心分離し、ｐｏｌｙＰペレットを５０μＬの水に再懸濁する工程；
（ｇ）工程：
ｉ．ラクトバチルス・プランタルムＷＣＦＳ１（Ａｌｃａｎｔａｒａら ２０１４）などのｐｏｌｙＰ生成対照株から単離したｐｏｌｙＰの試料の段階希釈液を２ＭのＨＣｌの１容量で加水分解し、９５℃で１５分間インキュベートする工程；
ｉｉ．２ＭのＮａＯＨの半分容量を添加して希釈液を中和する工程；
ｉｉｉ．放出されたリン酸塩をＢＩＯＭＯＬ Ｇｒｅｅｎキットで測定し、各希釈液中のリン酸塩の量を得る工程；
ｉｖ．放出されたリン酸塩を、蛍光計で励起波長４１５ｎｍ及び発光波長５５０ｎｍで、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中１０μＭの最終濃度で４’,６－ジアミジノ－２－フェニルインドール、ＤＡＰＩを用いて蛍光により測定し、各希釈液の蛍光値を得る工程；並びに
ｖ．（ｉｉｉ）で得たリン酸塩値及び（ｉｖ）で得た対応する蛍光値を用いて検量線を作成する工程
に従って、ｐｏｌｙＰ由来のリン酸塩の量を蛍光強度に関係させる検量線を作成する工程；及び
（ｈ）工程（ｆ）の再懸濁画分からｐｏｌｙＰを定量化する工程：
１）蛍光計で励起波長４１５ｎｍ及び発光波長５５０ｎｍで、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中１０μＭの最終濃度でＤＡＰＩを用いて蛍光によりｐｏｌｙＰを測定する工程；
２）検量線によりｐｏｌｙＰの量を計算する工程；及び
３）ｐｏｌｙＰ値をｎｍｏｌリン酸塩で表記する工程
によって６時間及び／又は１６時間培養時に決定した場合に、対照株のポリリン酸塩の生成よりも多い。

本明細書における実施例１（材料及び方法の節１．１．２）は、本発明の実施形態の工程（ａ）～（ｈ）を参照して、ｐｏｌｙＰを定量化し、その結果、細菌株のｐｏｌｙＰを生成する能力を評価するために適したアッセイの詳細な説明を提供する。

本発明の実施形態の工程（ａ）～（ｈ）で開示されるｐｏｌｙＰ定量化アッセイの説明及び条件は、本発明の範囲を限定するものではないことに留意することが適切である。アッセイは、細菌株（例えば、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４）がｐｏｌｙＰを生成する能力を試験する１つの適切な方法である。この実施例１の詳細な条件は、本明細書において、目的とする（派生）細菌株が本発明の実施形態の基準に適合するか否かを決定するための特定のアッセイを形成する。

したがって、本明細書に記載の詳細なアッセイに基づいて、当業者は、目的とする特異的細菌株が本発明の実施形態のｐｏｌｙＰを生成する能力を有するか否かを客観的に決定するために、このアッセイを日常的に繰り返すことができる。

前述のように、ｐｏｌｙＰの生成は、上記の方法によって定量化することができる。このような方法は、３つの主な工程、すなわち次亜塩素酸ナトリウムによる細胞からのｐｏｌｙＰ抽出から始まり、抽出されたｐｏｌｙＰをＤＡＰＩで染色し、試料の蛍光を定量化する工程からなる。ＰｏｌｙＰ量は、ｐｏｌｙＰ由来のリン酸塩量と蛍光単位を相関させる検量線から推測される。この方法は、蛍光によるリン酸塩の測定を通じた間接ｐｏｌｙＰ定量法である。

いくつかの実施形態において、ｐｏｌｙＰの定量化は、代替的な間接ｐｏｌｙＰ定量法によって行うことができる。特定の実施形態において、ｐｏｌｙＰ加水分解から放出されたリン酸塩を、全ての試料、すなわち、対照株及び本発明の菌株の両方についてＢＩＯＭＯＬ Ｇｒｅｅｎキットで測定してリン酸塩の量を得る。別の特定の実施形態において、ｐｏｌｙＰの定量化を、ＰＰＫ酵素を添加して行い、ｐｏｌｙＰ異化作用からのリン酸塩を得る。

いくつかの実施形態において、本発明の菌株又はその派生細菌株のｐｏｌｙＰ生成は、全ての菌株について同じ初期接種量を考慮すると、６時間及び／又は１６時間培養時に決定した場合、対照株よりも多い。特に、ｐｏｌｙＰの生成は、６時間及び１６時間の時点で決定した場合に多い。他の実施形態において、ｐｏｌｙＰの生成は、１以上の時点で、例えば、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間及び／又は２０時間培養時に決定した場合により多い。

本明細書で及び本発明に従って理解されるように、対照株は、例えば、以下の対照株：ｐｏｌｙＰを生成することが知られているＬ．プランタルムＷＣＦＳ１及びＬ．パラカゼイＪＣＭ１１６３；リン酸塩を除去できることが知られているＢ．ブレーベＪＣＭ１２７３、Ｂ．アドレセンティスＪＣＭ１２７５及びＢ．ロンガム亜種ロンガムＡＴＣＣ１５７０７；及びｐｐｋ遺伝子を保有することが知られているＢ．スカルドビＤＳＭＺ１３７３４（ＢＡＡ－７７３）のうちの少なくとも１つである。

特定の実施形態において、対照株は、例えば、Ｌ．プランタルムＷＣＦＳ１、Ｌ．パラカゼイＪＣＭ１１６３、Ｂ．ブレーベＪＣＭ１２７３、Ｂ．アドレセンティスＪＣＭ１２７５、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＡＴＣＣ１５７０７又はＢ．スカルドビＤＳＭＺ１３７３４（ＢＡＡ－７７３）である。

記載のアッセイを使用する場合、いくつかの実施形態において、６時間及び１６時間でＢ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株によって生成されるｐｏｌｙＰのレベルは、同じ時点での対照株Ｌ．プランタルムＷＣＦＳ１のｐｏｌｙＰ生成よりも高い。

いくつかの実施形態において、６時間でのＢ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株によって生成されるｐｏｌｙＰのレベルは、対照株のｐｏｌｙＰ生成よりも少なくとも、例えば、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、５０倍又は１００倍高い。

特定の実施形態において、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株によって生成されるｐｏｌｙＰのレベルは、対照株Ｌ．プランタルムＷＣＦＳ１のｐｏｌｙＰ生成よりも少なくとも１０倍高い。特に、６時間の時点でのＢ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株によって生成されるｐｏｌｙＰのレベルは、対照株Ｌ．プランタルムＷＣＦＳ１のｐｏｌｙＰ生成よりも少なくとも１５倍又は１８倍高い。

特定の実施形態において、６時間でのＢ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株によって生成されるｐｏｌｙＰのレベルは、対照株Ｂ．ブレーベＪＣＭ１２７３のｐｏｌｙＰ生成よりも少なくとも３倍高い。

特定の実施形態において、６時間でのＢ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株によって生成されるｐｏｌｙＰのレベルは、対照株Β．アドレセンティスＪＣＭ１２７５のｐｏｌｙＰ生成よりも少なくとも４倍高い。特に、６時間の時点でのＢ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株によって生成されるｐｏｌｙＰのレベルは、対照株Ｂ．アドレセンティスＪＣＭ１２７５のｐｏｌｙＰ生成よりも少なくとも４．５倍高い。

特定の実施形態において、６時間でのＢ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株によって生成されるｐｏｌｙＰのレベルは、対照株Ｂ．スカルドビＤＳＭＺ１３７３４（ＢＡＡ－７７３）のｐｏｌｙＰ生成よりも少なくとも１００倍高い。特に、６時間の時点でのＢ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株によって生成されるｐｏｌｙＰのレベルは、対照株Ｂ．スカルドビＤＳＭＺ１３７３４（ＢＡＡ－７７３）のｐｏｌｙＰ生成よりも少なくとも１２０倍、１３０倍又は１４０倍高い。

いくつかの実施形態において、１６時間でのＢ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株によって生成されるｐｏｌｙＰのレベルは、対照株のｐｏｌｙＰ生成よりも少なくとも、例えば、１．２倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、５０倍又は１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍又は６００倍高い。

特定の実施形態において、１６時間でのＢ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株によって生成されるｐｏｌｙＰのレベルは、対照株のｐｏｌｙＰ生成よりも高く、１６時間の時点での対照株によるｐｏｌｙＰのレベルは存在しない。特に、１６時間での対照株によるｐｏｌｙＰのレベルは、対照株がＬ．プランタルムＷＣＦＳ１の場合には存在しない。

特定の実施形態において、１６時間でのＢ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株によって生成されるｐｏｌｙＰのレベルは、対照株Ｂ．ブレーベＪＣＭ１２７３のｐｏｌｙＰ生成よりも少なくとも２倍高い。

特定の実施形態において、１６時間でのＢ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株によって生成されるｐｏｌｙＰのレベルは、対照株Β．アドレセンティスＪＣＭ１２７５のｐｏｌｙＰ生成よりも少なくとも２．５倍高い。

特定の実施形態において、１６時間でのＢ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株によって生成されるｐｏｌｙＰのレベルは、対照株Ｂ．スカルドビＤＳＭＺ１３７３４（ＢＡＡ－７７３）のｐｏｌｙＰ生成よりも少なくとも５００倍高い。

特定の実施形態において、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株によって生成されるｐｏｌｙＰのレベルは、６時間で対照株Ｌ．プランタルムＷＣＦＳ１のｐｏｌｙＰ生成よりも少なくとも１０倍高く、１６時間でより高く、１６時間で対照株Ｌ．プランタルムＷＣＦＳ１のｐｏｌｙＰの生成及び対照株によるｐｏｌｙＰのレベルは存在しない。特に、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株によって生成されるｐｏｌｙＰのレベルは、６時間で対照株Ｌ．プランタルムＷＣＦＳ１のｐｏｌｙＰ生成よりも少なくとも１５倍又は１８倍高く、１６時間でより高く、１６時間での対照株Ｌ．プランタルムＷＣＦＳ１のｐｏｌｙＰの生成及び対照株によるｐｏｌｙＰのレベルは存在しない。

特定の実施形態において、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株によって生成されるｐｏｌｙＰのレベルは、対照株Ｂ．スカルドビＤＳＭＺ１３７３４（ＢＡＡ－７７３）のｐｏｌｙＰ生成よりも、６時間で少なくとも１００倍高く、１６時間で少なくとも５００倍高い。特に、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株によって生成されるｐｏｌｙＰのレベルは、対照株Ｂ．スカルドビＤＳＭＺ１３７３４（ＢＡＡ－７７３）のｐｏｌｙＰ生成よりも、６時間で少なくとも１２０倍、１３０倍又は１４０倍高く、１６時間で少なくとも５００倍高い。

プロバイオティクス組成物とＨＭＯの組み合わせ
本明細書で使用するプロバイオティクス組成物という用語は、上記の用語においてビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム株ＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株を含む組成物を指す。

前述のように、本発明の態様によれば、本明細書に記載のプロバイオティクス組成物は、さらに少なくとも１種のヒトミルクオリゴ糖を組み合わせて含むことができる。

プロバイオティクス組成物及びＨＭＯは、単一の組成物又は別々の組成物で共に製剤化することができることから、以下で説明する実施形態が、「本発明の組成物」又は単に「組成物」を指す場合、プロバイオティクス組成物、ＨＭＯを含む組成物及びその両方を含む組成物を指す。

いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、ＨＭＯを分解することができるＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株とは異なる追加のプロバイオティクス、すなわち、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）を含む。特定の実施形態において、追加のプロバイオティクス株は、ビフィズス菌、より特には、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）又はビフィドバクテリウム・ロンガム亜種インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）である。

特定の実施形態において、ビフィドバクテリウム・ビフィダムは、ＣＥＣＴ３０６４６として寄託されたＢ．ビフィダムである。本株は、２０２２年５月１７日（１７．０５．２０２２）に受託番号ＣＥＣＴ３０６４６でスペインタイプカルチャーコレクション（ＣＥＣＴ、Ｐａｒｃ Ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｄｅ ｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ ｄｅ Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｒｒｅｒ ｄｅｌ Ｃａｔｅｄｒａｔｉｃ Ａｇｕｓｔｉｎ Ｅｓｃａｒｄｉｎｏ Ｂｅｎｌｌｏｃｈ、９、４６９８０ Ｐａｔｅｒｎａ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｓｐａｉｎ）に寄託された。寄託はブダペスト条約の条件の下で行われ、生存可能であり、寄託に関係するその全ての特徴を維持している。それは、同一申請者によって寄託された。Ｂ．ビフィダムＣＥＣＴ３０６４６（この明細書ではＢｂ０１ともいう）はヒト母乳から単離された。

一実施形態において、本発明の組成物は、フコシル化オリゴ糖、シアル化オリゴ糖、Ｎ－アセチルラクトサミン及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるＨＭＯを含む。

特定の実施形態において、組成物は、フコシル化オリゴ糖（特に、２’－フコシルラクトース（２－ＦＬ）及び／又はジフコシルラクトース（ＤＦＬ））及びＮ－アセチルラクトサミン（特に、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ））を含む。

ＨＭＯは、周知のプロセスによって、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、又はヤギの種、特にヒトを含むが、これらに限定されない哺乳類によって分泌されるミルク（複数可）から単離又は濃縮することができる。ＨＭＯは、微生物発酵、酵素プロセス、化学合成、又はこれらの技術の組み合わせを使用した周知のプロセスによっても生成することができる。

ＨＭＯは、例えば、本発明の組成物中の水に溶解、乳化、又は懸濁することができる。

一実施形態において、ＨＭＯは、０．１～５０ｇ／Ｌ又は０．３～５ｇ／Ｌ又は０．５～１ｇ／Ｌ、又は０．２５又は０．５又は１又は１．５又は２ｇ／Ｌの総量で組成物中に存在する。

フコシル化オリゴ糖
本発明による組成物は、１種以上のフコシル化オリゴ糖を含むことができる。特に、フコシル化オリゴ糖は、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）及び／又はジフコシルラクトース（ＤＦＬ）を含む。

いくつかの実施形態において、フコシル化オリゴ糖は、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオース（すなわち、ＬＮＦＰ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＶ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオース（ＬＮＤＦＨ Ｉ及びＩＩ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＦＬＮＨ Ｉ及びＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＦＬＮｎＨ）、ジフコシルラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ、ジフコシルラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（Ｉ及びＩＩ）並びにフコシル－パララクト－Ｎ－ヘキサオース（ＦｐＬＮＨ Ｉ及びＩＩ）を含む群から選択される。特定のフコシル化オリゴ糖は、２－ＦＬ又はＤＦＬ又はこれらの混合物である。

フコシル化オリゴ糖は、クロマトグラフィー又は濾過技術により、動物のミルクなどの天然源から単離することができる。或いは、酵素ベースの発酵技術（組換え酵素若しくは天然酵素）又は微生物発酵技術のいずれかの使用を通じて、特異的フコシル転移酵素及び／又はフコシダーゼを使用するバイオテクノロジー手段によって生成することができる。後者の場合、微生物は天然の酵素及び基質を発現することができるか、又はそれぞれの基質及び酵素を生成するように操作することができる。単一微生物培養及び／又は混合培養を使用できる。或いは、フコシル化オリゴ糖は、ラクトース及び遊離フコースからの化学合成によって生成される。フコシル化オリゴ糖はまた、例えば、日本の協和発酵工業からも入手可能である。

特に、本発明による組成物は、乾燥重量ベースで組成物１００ｇ当たり０．０２～１０ｇのフコシル化オリゴ糖（複数可）を含み、最も特には２ＦＬであり、例えば、乾燥重量ベースで組成物１００ｇ当たり０．２～０．５ｇ又は０．３～５ｇの２ＦＬ、及び特に、乾燥重量ベースで組成物１００ｇ当たり０．１～３ｇの２ＦＬを含む。

いくつかの実施形態において、組成物は、２ＦＬの量の以下の範囲又は量：すぐに与えられる液体形態の場合には、組成物１Ｌ当たり０．０５～２０ｇ若しくは０．１～５ｇ若しくは０．２～３ｇ若しくは０．１～２ｇ若しくは０．２５ｇ～１ｇ若しくは０．２５ｇ若しくは１ｇを含むか、又は組成物が、粉末形態で、希釈された液体形態に再構成されることが意図される場合には、（液体希釈形態の）組成物１Ｌ当たり０．０５～２０ｇ若しくは０．１～５ｇ若しくは０．２～３ｇ若しくは０．１～２ｇ若しくは０．２５ｇ～１ｇ若しくは０．２５ｇ若しくは１ｇを含むか、又は組成物が水若しくはヒト母乳で希釈（それぞれ、２、５、１０、２０、５０、若しくは１００倍）されることが意図される濃縮組成物の形態であるか、若しくは濃縮形態として直接使用することが意図される場合には、上記のものに２、５、１０、２０、５０若しくは１００を乗じた量を含むか、又は栄養組成物が乾燥粉末の形態である場合には、栄養組成物粉末１００ｇ当たり０．０４ｇ～１．５ｇ、若しくは栄養組成物粉末１００ｇ当たり０．０８～１．２ｇ、若しくは１００ｇ当たり０．１～１ｇ、若しくは１００ｇ当たり０．２～０．８ｇ若しくは１００ｇ当たり０．２ｇ若しくは１００ｇ当たり０．４ｇ若しくは１００ｇ当たり０．８ｇ若しくは１００ｇ当たり１ｇ若しくは１００ｇ当たり１ｇを含む。

Ｎ－アセチルラクトサミン
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも１種のＮ－アセチルラクトサミンを含み、すなわち、組成物は、Ｎ－アセチルラクトサミン及び／又はＮ－アセチルラクトサミンを含有するオリゴ糖を含む。Ｎ－アセチルラクトサミンを含有する適切なオリゴ糖は、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＬＮｎＨ）、パララクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）、パララクト－Ｎ－ヘキサオース（ｐＬＮＨ）及びラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＬＮＨ）を含む。

一実施形態において、本発明による組成物は、特に、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）及びラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）を含む群から選択されるＮ－アセチルラクトサミンを含む。

ＬＮＴ及びＬＮｎＴは、糖転移酵素を使用してドナー部分からアクセプター部分への糖鎖単位の酵素的転移によって化学的に合成することができる。或いは、ＬＮＴ及びＬＮｎＴを、遊離又はオリゴ糖（例えば、ラクツロース）に結合したケトヘキソース（例えば、フルクトース）をＮ－アセチルヘキソサミン又はＮ－アセチルヘキソサミン含有オリゴ糖に化学変換することによって調製することができる。このようにして生成されたＮ－アセチルラクトサミンを、アクセプター部分としてラクトースに転移することができる。ＬＮＴは、例えば、ＥＦＳＡによって最近承認された大腸菌Ｋ－１２の遺伝子組み換え株を用いて微生物発酵によって生成することもできる。

特に、本発明による組成物は、乾燥重量ベースで組成物１００ｇ当たり０．０１～３ｇのＮ－アセチルラクトサミンを含む。特に、乾燥重量ベースで組成物１００ｇ当たり０．１～３ｇのＬＮｎＴ、例えば、乾燥重量ベースで組成物１００ｇ当たり０．１～０．２５ｇ又は０．１５～０．５ｇのＬＮｎＴを含む。

いくつかの実施形態において、組成物は、ＬＮｎＴの量の以下の範囲又は量：すぐに与えられる液体形態の場合には、組成物１Ｌ当たり０．０２～１０ｇ若しくは０．０５～２．５ｇ若しくは０．１～１．５ｇ若しくは０．０５～１ｇ若しくは０．１２ｇ～０．５ｇ若しくは０．１２ｇ若しくは０．５ｇ若しくは１ｇを含むか、又は組成物が、粉末形態で、希釈された液体形態に再構成されることが意図される場合には、（液体希釈形態の）組成物１Ｌ当たり０．０２～１０ｇ若しくは０．０５～２．５ｇ若しくは０．１～１．５ｇ若しくは０．０５～１ｇ若しくは０．１２ｇ～０．５ｇ若しくは０．１２ｇ若しくは０．５ｇ若しくは１ｇを含むか、又は組成物が水若しくはヒト母乳で希釈（それぞれ、２、５、１０、２０、５０、若しくは１００倍）されることが意図されるる濃縮組成物の形態であるか、若しくは濃縮形態として直接使用することが意図される場合には、上記のものに２、５、１０、２０、５０若しくは１００を乗じた量を含むか、又は栄養組成物が乾燥粉末の形態である場合には、栄養組成物粉末１００ｇ当たり０．０２ｇ～０．７５ｇ、若しくは栄養組成物粉末１００ｇ当たり０．０４～０．６ｇ、若しくは１００ｇ当たり０．０５～０．５ｇ、若しくは１００ｇ当たり０．１～０．４ｇ若しくは１００ｇ当たり０．１ｇ若しくは１００ｇ当たり０．２ｇ若しくは１００ｇ当たり０．２５ｇ若しくは１００ｇ当たり０．５ｇ若しくは１００ｇ当たり１ｇ若しくは１００ｇ当たり３ｇを含む。

シアリル化オリゴ糖
本発明による組成物は、いくつかの実施形態において、１種以上のシアリル化オリゴ糖を含み得る。

酸性ＨＭＯの例としては、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、３－フコシル－３’－シアリルラクトース（ＦＳＬ）、ＬＳＴ ａ、フコシル－ＬＳＴ ａ（ＦＬＳＴ ａ）、ＬＳＴ ｂ、フコシル－ＬＳＴ ｂ（ＦＬＳＴ ｂ）、ＬＳＴ ｃ、フコシル－ＬＳＴ ｃ（ＦＬＳＴ ｃ）、シアリル－ＬＮＨ（ＳＬＮＨ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＳＬＮＨ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ（ＳＬＮＨ－Ｉ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（ＳＬＮＨ－ＩＩ）及びジシアリル－ラクト－Ｎ－テトラオース（ＤＳ－ＬＮＴ）が挙げられる。

一実施形態において、本発明による組成物は、特に、３’－シアリルラクトース及び６’－シアリルラクトースを含む群から選択されるシアリル化オリゴ糖を含む。より特には、組成物は、３’－シアリルラクトース及び６’－シアリルラクトースの両方を含み、３’－シアリルラクトースと６’－シアリルラクトースとの比は、特に１００：１～１：１００の間、より特には１０：１～１：１０の間、さらにより特には５：１～１：２の間の範囲にある。

３’型及び６’型のシアリルラクトースを、クロマトグラフィー又は濾過技術によって、動物のミルクなどの天然源から単離することができる。或いは、それらは、特異的なシアリルトランスフェラーゼ又はシアリダーゼ、ノイラミニダーゼを使用するバイオテクノロジー手段によって、酵素ベースの発酵技術（組換え酵素又は天然酵素）、化学合成又は微生物発酵技術のいずれかによって生成することができる。後者の場合、微生物はその天然の酵素及び基質のいずれかを発現することができ、又はそれぞれの基質及び酵素を生成するように操作してもよい。単一微生物培養又は混合培養を使用することができる。或いは、シアリルラクトースを、ラクトース及び遊離Ｎ’－アセチルノイラミン酸（シアル酸）からの化学合成によって生成することができる。シアリルラクトースもまた、例えば、日本の協和発酵工業から市販されている。

特に、本発明による組成物は、乾燥重量ベースで組成物１００ｇ当たり０．０５～１０ｇ、より特には、０．１～５ｇ、さらにより特には０．１～２ｇのシアリル化オリゴ糖（複数可）を含む。

特定の製品形態
本文脈において当業者が理解するように、本明細書に提供される組み合わせに関連して、本明細書で言及される２つの「化合物」（すなわち、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株、及びＨＭＯ）が、例えば、単回摂取として又は単一の組成物として同時に投与されるか、又は例えば、２つの別々の組成物として逐次投与されるかは重要ではない。重要なことは、２つの化合物が患者の体内で共に効果を発揮できることである。特に、２つの化合物は、時間枠内に、例えば、成人では最大１８時間を要し得る消化期間内に投与される。

したがって、用語「組み合わせ」は、本明細書では、例えば、単一組成物中の２つの化合物、「タンクミックス」などの単一化合物の別々の組成物から構成される組み合わせ混合物中の２つの化合物、及び逐次、すなわち、数時間などの合理的に短い期間で順に、又は同時投与で適用される場合の単一化合物の併用での２つの化合物の様々な組み合わせを指す。Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株、及びＨＭＯを投与する順序は重要ではない。

そのため、プロバイオティクス組成物とＨＭＯの組み合わせは、同時、別々、又は逐次投与のために製剤化することができる。特に、投与が同時ではない場合、化合物は互いに比較的近い時間で投与される。さらに、化合物は、同じ若しくは異なる剤形で、又は同じ若しくは異なる投与経路によって、特に経口で投与される。いくつかの実施形態において、２つの化合物の組み合わせは、例えば、
－２つの化合物が常に同時に投与される,同じ組成物の一部である組み合わせとしてて；
－それぞれ、物質の１つが、同時、逐次又は別々の投与の可能性をもたらす、２つの単位／組成物の組み合わせとして
投与される。

例えば、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株は、ＨＭＯとは独立して（すなわち、２単位で）、しかし同時に投与される。

Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株、及びＨＭＯは、本説明に記載されているように任意の形態で製剤化され得る。異なる組み合わせの例を本明細書に提供する。

実施形態において、組み合わせは、母乳で育てられた乳児に投与されるＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株を含むプロバイオティクス組成物を含み、ＨＭＯは母乳中に存在する。

別の実施形態において、組み合わせは、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株を含むプロバイオティクス組成物と、ＨＭＯを含む乳児用調製製剤とを含む。そのため、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株を含む組成物は、調製粉乳で育てられた乳児に投与される。特に、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株を含む組成物は、油性滴剤の形態である。

実施形態において、組み合わせは、本説明に記載の製品形態のいずれかの、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株、及びＨＭＯを含む単一組成物を含む。

実施形態において、組み合わせは、非乳児用であり、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株、及びＨＭＯを含む単一組成物を含む。別の実施形態において、組み合わせは、例えば、発泡錠又はエネルギーバーの形態の、ＨＭＯを含む組成物、及びＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株を含む組成物を含む。

前述のように、組み合わせは、本明細書に記載の他の２つの化合物との同時、別々、又は逐次投与のために製剤化することができるさらなるビフィズス菌株も含み得る。

組成物の使用
この節の実施形態は、本発明による任意の「組成物」、すなわち、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株を含むプロバイオティクス組成物、並びにプロバイオティクス組成物とＨＭＯを含む組み合わせ及び組成物を指す。

本明細書で考察するように、プロバイオティクス組成物は、成長中にポリリン酸塩の生成に関して高い有効性を示す。ｐｏｌｙＰの作用機序は、腸管透過性を防止することにより、上皮細胞に対する保護効果に関連することが知られている。したがって、プロバイオティクス由来のｐｏｌｙＰは腸管バリア機能を増強し、腸の恒常性を維持する。ｐｏｌｙＰの生成と腸管透過性の防止／処置における保護効果との間の関係は、本明細書に提供される実施例（例えば、実施例４）によって実証されている。さらに、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４が、ｐｏｌｙＰの生成を通じて、腸管バリア機能及び本明細書に記載の関連条件において正の効果を有し得ることは、当業者にとって真実味がある。

例えば、Ｓａｉｋｉら、２０１６は、Ｌ．パラカゼイＪＣＭ１１６３から抽出したｐｏｌｙＰが、マウス小腸において酸化剤誘導性腸管透過性を抑制することを示している。Ｓｅｇａｗａら、２０１１は、小腸組織を用いたインビトロ実験において、ｐｏｌｙＰが粘膜透過性を阻害することを示している。彼らは、最初に、透過性を亢進する酸化剤に組織を曝露し、次いで、ｐｏｌｙＰを添加して保護効果を確認している。透過性を、マンニトールの流れを定量化することによって測定する。ｐｏｌｙＰは、マンニトールの流れを低減し、したがって、透過性を低減する。同様に、Ｔａｎａｋａら、２０１５は、ｐｏｌｙＰが、Ｃａｃｏ－２腸上皮細胞を通じたマンニトールの流れを低減し、したがって、透過性を低減することをインビトロで実証している。最後に、Ｆｕｊｉｙａら、２０２０は、ＴＥＥＲでバリアの抵抗を測定することによって（本明細書の実施例４、図６で評価されるように）透過性を試験している。彼らは、Ｃａｃｏ－２腸上皮細胞をＴＮＦ－アルファで処置して透過性を亢進しせ、次いで、ｐｏｌｙＰが抵抗性を改善する（ＴＥＲを改善する）ことを実証している。

したがって、本明細書の実験データは、プロバイオティクス組成物が、ｐｏｌｙＰを生成することによって、それを必要とする対象における腸管バリア機能障害及び関連状態の処置において顕著な正の効果を有することは真実味があるという証拠を提供した。

特定の実施形態において、プロバイオティクス組成物は、腸管バリア機能障害を処置する方法において使用するためのものである。実施形態において、腸管バリア門機能障害は、腸管透過性亢進に関連する。実施形態において、プロバイオティクス組成物は、腸管透過性亢進を処置する方法において使用するためのものである。別の実施形態において、プロバイオティクス組成物は、腸管透過性亢進及び関連状態を処置する方法において使用するためのものである。

特定の実施形態において、対象は哺乳動物である。より特定の実施形態において、哺乳動物はヒトである。特に、ヒトは乳児である。別の実施形態において、ヒトは乳児ではない。別の実施形態において、ヒトは、高齢者、早産児、乳児、運動選手及び虚弱者からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、腸管バリア機能障害（例えば、腸管透過性亢進）及び関連状態は、早産、老化、高強度の身体活動、バランスのとれていない食事、感染、薬物処置、又はストレスに関係する。特定の実施形態において、（例えば、腸管透過性亢進）及び関連状態は、老化に関係する。

関連状態
健康な腸管バリアは、バクテリアルトランスロケーション、菌血症、自己免疫、脳障害、心臓病及び肝臓病並びに肥満などの状態から保護すると考えられている。腸管バリア機能障害は、自己免疫疾患などの免疫疾患（クローン病、セリアック病、多発性硬化症、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎）、他の免疫疾患（喘息、アレルギー性鼻結膜炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー／過敏症などのアレルギー／過敏症）、非アルコール性脂肪肝疾患、肝硬変、ＩＩ型糖尿病及び肥満などの代謝性疾患、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）又はセリアック病などの胃腸疾患、並びに膵炎、多嚢胞性卵巣症候群及び自閉症を含むいくつかの他の疾患及び状態と強く関連付けられている。特に、粘膜損傷によるバリア機能障害は、経口抗生物質又は非ステロイド性抗炎症薬などのいくつかの薬物処置からも生じることが知られている。

いくつかの実施形態において、関連状態は、免疫障害若しくは疾患、代謝性若しくは心血管の障害若しくは疾患、神経若しくは精神の障害若しくは疾患、又は胃腸障害若しくは疾患である。特に、免疫障害又は疾患は、腸以外の免疫障害又は疾患である。別の実施形態において、関連状態は、腸以外の免疫障害若しくは疾患、代謝性若しくは心血管の障害若しくは疾患、又は神経若しくは精神の障害若しくは疾患である。

いくつかの実施形態において、腸管バリア機能障害（例えば、腸管透過性亢進）は、主に腸以外の臓器で生じる状態に関連し、本明細書では「腸以外の状態」又は「間接的に腸管に関連する状態」と称される。注目すべきことに、透過性亢進のため、免疫細胞の最小限の過剰活性化又は浸潤が、そのような状態における腸の一部の領域で時に起こり得る。しかし、そのような局所的な事象は、たとえあるとしても無症候性であり、当業者にとっては、そのような状態を有する患者における健康上の懸念の主要な原因ではない。当業者にとってのこのような腸以外の状態の明確な例は、神経又は精神の状態（アルツハイマー病、自閉症スペクトラム障害、統合失調症又はうつ病など）、代謝又は心血管の状態（前糖尿病、糖尿病、肥満、脂肪肝疾患、肝硬変、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脳卒中若しくは慢性心不全など）、又は全身レベル若しくは腸から遠位の身体部位で発生する免疫障害（紅斑性狼瘡、多発性硬化症、免疫老化、関節リウマチ、喘息、アレルギー性鼻結膜炎、アトピー性皮膚炎又は他の非食物アレルギー／過敏症）である。このような状態では、細菌毒素（限定されないが、リポ多糖（ＬＰＳ）若しくはトリメチルアミンＮ－オキシド（ＴＭＡＯ）など）が、腸内の透過性亢進により全身の血液循環に入り、心臓、脳、肺若しくは皮膚などの腸から遠く離れた臓器、並びに体の様々な場所にある血管の壁又は免疫細胞に炎症及び他の有害な健康影響を引き起こし得る。

当業者は、腸管透過性亢進が、本明細書に記載の腸以外の疾患、例えば、アレルギー、関節炎及び代謝性疾患（Ｂｉｓｃｈｏｆｆら、２０１４）、精神障害（Ｋｅｌｌｙら、２０１５）、高血圧及びアテローム性動脈硬化症（Ｖｅｒｈａｒｒら、２０２０）、心血管障害（Ｒｏｇｌｅｒら、２０１４）、アルツハイマー病（Ｊｉａｎｇら、２０１７）、肥満（Ｃｏｘら、２０１５）、アトピー性皮膚炎（Ｐｉｋｅら、１９８６）、関節炎（Ｔａｊｉｋら、２０２０）又は代謝性疾患（Ｍａｓｓｉｅｒら、２０２１）に関連することを認識している。

特定の実施形態において、関連状態は、特に、限定されないが、クローン病、多発性硬化症、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、及びアレルギー反応／過敏症（例えば、食物アレルギー／過敏症、喘息、アトピー性皮膚炎又はアレルギー性鼻結膜炎）などの自己免疫疾患からなる群から選択される免疫障害又は疾患である。特に、免疫障害又は疾患は、腸以外の自己免疫疾患（特に、多発性硬化症、紅斑性狼瘡又は関節リウマチ）；免疫老化、非食物アレルギー／過敏症、喘息、アトピー性皮膚炎又はアレルギー性鼻結膜炎などの腸以外の免疫障害又は疾患である。

特定の実施形態において、関連状態は、特に、限定されないが、脳卒中、慢性心不全、アテローム性動脈硬化症、高血圧、インスリン抵抗性（前糖尿病）、糖尿病、肥満、非アルコール性脂肪肝疾患及び肝硬変を含む群から選択される代謝性若しくは心血管の障害又は疾患である。

特定の実施形態において、関連状態は、特に、限定されないが、アルツハイマー病、自閉症スペクトラム障害、統合失調症及びうつ病を含む群から選択される神経若しくは精神の障害又は疾患である。

いくつかの実施形態において、腸以外の状態は、肥満、糖尿病、インスリン抵抗性、非アルコール性脂肪肝疾患、肝硬変、非食物アレルギー／過敏症、免疫老化、多発性硬化症、関節リウマチ、紅斑性狼瘡、サルコペニア、喘息、アレルギー性鼻結膜炎、アトピー性皮膚炎、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、高血圧、慢性心不全、脳卒中、自閉症スペクトラム障害、統合失調症及びうつ病からなる群から選択される。

特定の実施形態において、関連状態は、特に、限定されないが、早期発症型炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎、嚢炎又はリンパ球性大腸炎など）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、リーキーガット症候群、絨毛萎縮症、壊死性腸炎、腸虚血性損傷、非ステロイド性抗炎症薬によって誘発される上皮傷害及びセリアック病を含む群から選択される胃腸障害又は疾患である。

ＩＢＳは、高所得の国で最も蔓延している胃腸障害の１つであり、一般的に、腸管バリアの変化の存在に関連する。腸管バリアの変化は、下痢及び腹痛などのＩＢＳ患者のＧＩ症状に関連すると報告されている。バリア機能障害はＩＢＳの初期のイベントであり、軽度の腸の炎症と内臓知覚の増加に寄与する可能性があるようである。さらに、下痢型ＩＢＳ（ＩＢＳ－Ｄ）及び感染後ＩＢＳなどのＩＢＳサブタイプの腸管透過性は、腸管バリア機能の変化に関係することがよくある。

加えて、慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に分類される潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）も類似の症状を有し、下痢、腹痛、直腸出血及び体重減少を含む消化器障害をもたらす。上皮の完全性は、腸管透過性亢進も示すＩＢＤ患者で乱される。腸管バリアの喪失は、ＩＢＤの病因のマルチヒットメカニズムに潜在的に寄与する要素である。その上、粘膜が治癒している多くのＩＢＳ患者は依然として続く腸の症状を有しており、これらは腸の透過性障害に関連している。

別の実施形態において、関連状態は、消化管の微小炎症、血管損傷及び／又は嚥下障害を特徴とする。

特に、関連状態は、腸管に直接関連する。より特定の実施形態において、腸管バリア機能障害又は関連状態は、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、腸管感染症、胃潰瘍、下痢（例えば、再発性クロストリジウム・ディフィシル下痢などの胃又は感染性の）、セリアック病、消化管に関連するがん、大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、ミトコンドリア神経胃腸脳症（ＭＮＧＩＥ）、リーキーガット症候群、絨毛萎縮症、壊死性腸炎（ＮＥＣ）、腸虚血性傷害、慢性腸症、慢性便秘、及び腸粘膜傷害からなる群から選択される。特に、粘膜傷害による腸管バリア機能障害は、経口抗生物質又は非ステロイド性抗炎症薬などのいくつかの薬物処置薬からも生じることが知られている。特に、関連状態は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）である。特に、関連状態は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。特に、関連状態はがんである。より特には、消化管のがんは、食道がん、胃がん及び大腸がんからなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、プロバイオティクス組成物は、腹痛、便秘、体重減少、直腸出血、サルコペニア、フレイル、悪液質、胃腸障害、けいれん、腫脹、鼓腸、嘔吐、吐き気、胃痛、疲労、発熱、特定の栄養素の吸収の変化、食欲減退、全身性炎症、及び熱中症からなる群から選択される少なくとも１つの症状、合併症及び／又は後遺症の処置に使用するためのものである。特に、症状、合併症及び／又は後遺症は、体重減少、サルコペニア、フレイル、悪液質、疲労、発熱、全身性炎症及び熱中症からなる群から選択される。

実施形態において、プロバイオティクス組成物の投与は、
－腸の透過性の低減、胃腸のバリア機能の改善、腸上皮の完全性の改善又は腸粘膜の保護；
－腸の感受性の低減又は腸の耐性の改善；
－腸の運動性の改善；及び
－腸内バランスの維持
からなる群から選択される少なくとも１つの結果をもたらす。

用語「腸管透過性の低減」、「胃腸管バリア機能の改善」、「腸上皮の完全性の改善」及び「腸粘膜の保護」は、腸内の望ましくない管腔内容物の適切な封じ込めとして理解される。

用語「腸の感受性の低減」及び「腸の耐性の改善」は、痛みの刺激に対する正常な内臓反応として理解されている。

用語「腸の運動性の改善」は、消化管の規則的な運動、及びその中の内容物の移行として理解される。

用語「腸内バランスの維持」は、腸内生態系の平衡として理解される。

別の実施形態において、組成物の投与は、
－腸管透過性関連バイオマーカーのレベルの低下；
－腸粘膜傷害による腸管透過性関連バイオマーカーの増加の緩和又は軽減；及び
－腸粘膜傷害によって引き起こされる血清中のタイトジャンクションタンパク質レベル増加の減少
からなる群から選択される少なくとも１つの結果をもたらす。

バイオマーカーは、腸内脂肪酸結合タンパク質（Ｉ－ＦＡＢＰ、ＦＡＢＰ－２としても知られる）、ゾヌリン、クローディン３（又は他のタイトジャンクションタンパク質）、シトルリン、リポ多糖（ＬＰＳ）又は細菌ＤＮＡなどの循環指標；オリゴ糖（例えば、ラクツロース、マンニトール、スクラロース、セロビオース、及びラクツロース／マンニトール分配量などの比率）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、クロム－エチレンジアミン四酢酸（Ｃｒ－ＥＤＴＡ）などの尿の指標；又はカルプロテクチン、ゾヌリン、アルファ（α）－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ジアミンオキシダーゼ（ＤＡＯ）、又はリポカリン－２（ＬＣＮ－２）を含む糞便マーカーを含み得る。

乳児での使用
アレルギーなどの炎症性疾患を含む複数の障害による、人生初期の微生物叢を破壊する要因を示唆する証拠が増えている。抗生物質に早期に曝露された子供（生後２年）は、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、小児期発症の喘息、セリアック病及び肥満などのリスクが増加している。さらに、帝王切開で生まれた赤ん坊は、経腟分娩の赤ん坊よりもアレルギー性鼻結膜炎及び喘息に罹りやすく、ビフィズス菌の低減がアトピー性皮膚炎及びアレルギー性喘息に直結する。最後に、調製粉乳を与えられた乳児は、母乳で育てられた乳児と比較してアトピー性皮膚炎の発生率が高くなる。これらの結果は、腸内細菌叢が腸管バリア構造の形成と透過性に重要な役割を果たしており、腸内細菌叢の変化はいくつかの障害における腸管透過性亢進に関連するという事実と一致している。

実際、異常な腸管透過性はアレルギーに関与している。例えば、腸の透過性が、食物アレルギー及び消化器症状を有する子供の８０％で異常に亢進している。さらに、腸管バリアの障害は、アトピー性皮膚炎の発症に関与している。同様に、早期のアレルギー症状を有する赤ん坊は、アレルギーではない乳児と比較して、タンパク質の腸管透過性が亢進している。

そのため、本明細書に記載のプロバイオティクス組成物は、腸管バリアを回復する能力を有する分子（ｐｏｌｙＰ）を生成し、アレルギーを処置するための治療選択肢である。帝王切開で生まれ、調製粉乳を与えられるか、又は抗生物質を投与された赤ん坊及び早産児も、アレルギー発症を低減させ得る予防薬としてのこのプロバイオティクス処置から恩恵を受けることができた。

したがって、実施形態において、対象は乳児である。特に、乳児は、早産児、虚弱乳児、出生時体重以下で生まれた乳児、子宮内発育遅延の乳児対象、帝王切開で生まれた乳児、抗生物質を投与された乳児、調製粉乳で育てられた乳児又は母乳で育てられた乳児である。より特には、乳児は早産児である。

より特には、腸管バリア機能障害（例えば、腸管透過性亢進）及び関連状態は、早産、帝王切開による出産、調製粉乳育児、出生時体重以下及び／又は抗生物質投与に関係する。特定の実施形態において、腸管バリア機能障害（例えば、腸管透過性亢進）及び関連状態は、早産に関係する。特定の実施形態において、腸管バリア機能障害（例えば、腸管透過性亢進）及び関連状態は、帝王切開による出産に関係する。特定の実施形態において、腸管バリア機能障害（例えば、腸管透過性亢進）及び関連状態は、調製粉乳育児に関係する。特定の実施形態において、腸管バリア機能障害（例えば、腸管透過性亢進）及び関連状態は、抗生物質投与に関係する。

加えて、本発明のプロバイオティクス組成物は、これらの状態の処置及び異常な乳児微生物叢の回復に有用であるだけでなく、健康な乳児微生物叢を強化することによって、将来的にこれらの状態の防止にも有用である。したがって、特定の実施形態において、プロバイオティクス組成物は、乳児に関係する状態の防止に使用するためのものである。

いくつかの実施形態において、乳児に関係する関連状態は、クローン病、多発性硬化症、紅斑性狼瘡、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、肥満、インスリン抵抗性（前糖尿病）、糖尿病、過敏性腸症候群、セリアック病、早期炎症性腸疾患、限定されないが、食物アレルギー／過敏症、喘息、アトピー性皮膚炎若しくはアレルギー性鼻結膜炎などのアレルギー反応／過敏症、非アルコール性脂肪肝疾患、自閉症スペクトラム障害、統合失調症及びうつ病からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、乳児に関係する関連状態は、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、関節リウマチ、非食物アレルギー／過敏症、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻結膜炎、インスリン抵抗性（前糖尿病）、糖尿病、肥満、非アルコール性脂肪肝疾患、自閉症スペクトラム障害、統合失調症及びうつ病からなる群から選択される。

特に、乳児に関係する関連状態は、自閉症スペクトラム障害、非食物アレルギー／過敏症、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻結膜炎、インスリン抵抗性（前糖尿病）、糖尿病、脂肪肝疾患及び肥満からなる群から選択される。

より特定の実施形態において、関連状態は、早産に関係し、アレルギーである。別の実施形態において、関連状態は、抗生物質を投与される乳児に関係し、アレルギー性鼻結膜炎、アトピー性皮膚炎、小児期発症喘息、及び肥満を含むが、これらに限定されない群から選択される。別の実施形態において、関連状態は、帝王切開で生まれた乳児に関係し、アレルギー性鼻結膜炎、アトピー性皮膚炎及び喘息からなる群から選択される。別の実施形態において、関連状態は、調製粉乳を与えられた乳児に関係し、アトピー性皮膚炎である。

運動選手での使用
下痢、けいれん、嘔吐、吐き気及び胃痛などの胃腸障害の症状は、高い強度のトレーニング及び競技中の運動選手によく見られる。運動中の熱ストレス及び酸化的損傷は、腸上皮細胞のタイトジャンクションタンパク質を破壊し、管腔内毒素に対する透過性亢進をもたらす。長時間の激しい運動は、深部体温上昇及び腸管透過性亢進に関係する。そのため、運動誘発性高体温症の程度は、腸の透過性亢進に直接関連し、身体パフォーマンスに影響を与え、重症の場合には熱中症を誘発する可能性のある全身性炎症を引き起こし得る。

本明細書に記載のプロバイオティクス組成物の投与は、運動選手において運動誘発性リーキーガットに対抗し、腸管バリア機能の完全性を改善し、胃腸障害を低下させ、高温下での運動中のパフォーマンスを改善し得る。

したがって、特定の実施形態において、対象は運動選手である。特定の実施形態において、腸管バリア機能障害（例えば、腸管透過性亢進）及び関連状態は、高い強度の身体活動に関係する。

いくつかの実施形態において、本発明のプロバイオティクス組成物は、腸管バリア機能障害（例えば、腸管透過性亢進）及び関連状態、又は下痢、けいれん、嘔吐、吐き気、胃痛、特定の栄養素の吸収の変化、全身性炎症（身体パフォーマンスに影響を及ぼし得る）及び、重症の場合には熱中症からなる群から選択される症状、合併症及び／又は後遺症を処置する方法に使用するためのものである。

高齢者での使用
老化プロセスは、腸内細菌叢の組成の自然な変化、低悪性度の慢性炎症、及び腸管透過性亢進に関連し、これらのイベントは全て関連付けられる。腸内細菌叢の変化には、腸上皮透過性亢進、その後の腸内細菌とその代謝産物の漏出、及び結果としての炎症が含まれる。さらに、局所的な炎症は、微生物叢の変化によって直接調節することもできる。

したがって、特定の実施形態において、対象は、高齢者又は虚弱者である。特定の実施形態において、腸管バリア機能障害（例えば、腸管透過性亢進）及び関連状態は、老化に関係する。

特に、老化に関係する腸管バリア機能障害（例えば、腸管透過性亢進）及び関連状態は、便秘、下痢、サルコペニア、フレイル、再発性クロストリジウム・ディフィシル下痢、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、がん及び悪液質、及びより特には、サルコペニア、フレイル、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、慢性心不全、免疫老化、及び脳卒中からなる群から選択される。

組成物を含む製品形態
この節の実施形態は、本発明による全ての組成物、すなわち、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株を含むプロバイオティクス組成物、ＨＭＯを含む組成物及びその両方を含む組成物にも言及する。

医薬品形態
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、カプセル剤、散剤、懸濁剤、錠剤、局所クリーム又は軟膏などの医薬品形態である。

用語「医薬品形態」は、少なくとも薬学的（栄養補助食品として又は獣医学的ともいう）許容される賦形剤と共に、活性成分、この場合、本明細書に記載の菌株又は組成物を含む任意の組成物を含むその最も広い意味で理解される。用語「医薬品形態」は、薬物に限定されるものではなく、例えば、医薬組成物、栄養補助組成物又は獣医学組成物を含む。医薬品形態は、製品の規制当局の承認ルート及び国によって異なる名前を採用することができる。

栄養補助組成物は、例えば、栄養補助食品又はダイエットサプリとして命名することもできる。栄養補助組成物は、食事を補うことが意図され、通常、普通の食事では摂取されない、又は十分な量で消費されない可能性のある栄養素又は有益な成分を提供する食品に通常使用される化合物から作られた調製物又は製品として理解される。栄養補助組成物は通常、「店頭」、つまり処方箋なしで販売されている。

いくつかの実施形態において、組成物は、菌株が唯一の活性剤であるか、又は１以上の他の活性剤と混合され、及び／又は薬学的／栄養補助食品として／獣医学的に許容される賦形剤と混合される医薬品形態として製剤化される。特に、追加の活性剤又は複数の活性剤は、本発明の組成物を形成する菌株に拮抗しない他のプロバイオティクス細菌である。製剤に応じて、菌株は、精製細菌として、細菌培養物として、細菌培養の一部として、後処置された細菌培養物として、及び単独で、又は適切な担体若しくは成分と共に添加されてもよい。組成物に添加される他の活性成分の例は、フラクトオリゴ糖（例えば、イヌリン）、ガラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、アラビノキシランオリゴ糖、ペクチン、ベータグルカン、ヒトミルクオリゴ糖（例えば、ラクト－Ｎ－テトラオース）又は部分加水分解グアーガムなどのプレバイオティクスである。

用語「薬学的／栄養補助食品として／獣医学的に許容される」は、当技術分野で認識されており、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激性、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症なしに、合理的な恩恵／リスク比に見合った、対象（例えば、ヒト又は動物）の組織と接触させて使用するのに適する賦形剤、化合物、材料、組成物、担体、ビヒクル及び／又は剤形を含む。各担体、賦形剤などは、製剤の他の成分と適合するという意味で「許容され」なければならない。適切な担体、賦形剤などは、標準的な薬学／栄養学／獣医学のテキストに見出すことができる。

そのため、本発明のいくつかの実施形態は、上記の少なくとも薬学的／栄養学的／獣医学的に許容される賦形剤と共に、本明細書に記載の組成物を含む、医薬組成物、栄養補助組成物、及び獣医学組成物に関する。

薬学的／栄養補助食品として／獣医学的に許容される賦形剤又は担体として機能し得る材料のいくつかの非限定的な例としては、ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖類；コーンスターチ及び馬鈴薯でんぷんなどのデンプン；セルロース、及びカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのその誘導体；粉末トラガント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバター及び坐剤ワックス；ピーナッツ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油などの油類；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール類；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル類；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリーの水；等張生理食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；又はリン酸緩衝溶液が挙げられる。

賦形剤は、限定されないが、充填剤／希釈剤／増量剤、結合剤、接着防止剤、崩壊剤、コーティング剤、固化防止剤、酸化防止剤、滑沢剤、甘味料、香料、着色料、又は界面活性剤を含む群から選択される。

充填剤は、限定されないが、イヌリン、オリゴフルクトース、ペクチン、変性ペクチン、結晶セルロース、ラクトース、デンプン、マルトデキストリン、サッカロース、グルコース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、非結晶ソルビトール、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム、他の不活性な無機及び有機の薬理学的に許容される充填剤、及びこれらの物質の混合物を含む群から選択される。経口懸濁液の剤形では、充填剤又は希釈剤は、植物油、オレイン酸、オレイルアルコール、液体ポリエチレングリコール、他の薬理学的に許容される不活性液体、又はこれらの物質の混合物を含む群から選択される。

結合剤は、例えば、錠剤中の成分を共に保持するため、錠剤及び顆粒が必要な機械的強度で確実に形成できるようにするため、及び低活性用量の錠剤にボリュームを与えるために、固形剤形において使用される。錠剤のような固形剤形の結合剤は、ラクトース、スクロース、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）（トウモロコシ（ｍａｉｚｅ））デンプン、加工デンプン、結晶セルロース、変性セルロース（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）及びヒドロキシエチルセルロース）、他の水溶性セルロースエーテル、ポビドンとしても知られるポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール、ソルビトール、マルチトール、キシリトール及び二塩基性リン酸カルシウム；他の適切な薬理学的に許容される結合剤、又はこれらの物質の混合物である。

接着防止剤は、粉末（顆粒）とパンチ面との間の接着を低減し、錠剤パンチへの接着を防止するために使用される。また、錠剤間の接着を防止するためにも使用される。最も一般的に使用されるのはステアリン酸マグネシウムである。

錠剤及びカプセル剤のような固形剤形における崩壊剤及びスーパー崩壊剤として、限定されないが、以下の物質：架橋ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、及びホルムアルデヒド－カゼイン、他の適切な薬理学的に許容される崩壊剤及びスーパー崩壊剤、又はそれらの混合物が使用される。

錠剤及びカプセル充填用の顆粒剤などの固形剤形の場合のコーティングは、空気中の水分による劣化から成分を保護し、大きくて不快な味の錠剤を飲み込みやすくし、かつ／又は腸溶コーティングの場合には、胃液の強酸性媒体（ｐＨが約１）中を確実に無傷で通過させ、十二指腸若しくは回腸（小腸）での放出を可能にする。ほとんどのコーティングされた錠剤に関して、セルロースエーテルヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）フィルムコーティングが使用されている。時折、他のコーティング材料、例えば、合成ポリマー及びポリ酢酸フタル酸ビニル（ＰＶＡＰ）のような共重合体；アクリル酸メチル－メタクリル酸の共重合体；メタクリル酸メチル－メタクリル酸の共重合体；シェラック、トウモロコシタンパク質ゼイン又は他の多糖類；ワックス又は蜜蝋、ステアリン酸などのワックス様物質；セチルアルコール又はステアリルアルコールのような高級脂肪アルコール；固体パラフィン；モノステアリン酸グリセロール；ジステアリン酸グリセロール、又はそれらの組み合わせが使用される。カプセルは、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロースでコーティングされる。

腸溶コーティングは、薬物放出の速度を制御し、薬物が消化管のどこに放出されるかを決定する。腸溶コーティングに使用される材料は、脂肪酸、ワックス、シェラック、プラスチック、及び植物繊維、並びに他の上述のコーティングとの組み合わせを含む。

固化防止剤は、粉体又は顆粒状の材料に添加される添加剤であり、塊の形成（固化）を防止し、包装、輸送、及び消費を容易にするためのものである。錠剤、カプセル剤、又は散剤のような固形剤形の固化防止剤として、以下：ステアリン酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、他の薬理学的に許容される固化防止剤、又はそれらの混合物が使用される。

滑沢剤は、成分が凝集すること及び錠剤パンチ又はカプセル充填機に接着することを防止するために固形剤形、特に錠剤及びカプセルで使用され、また硬カプセルにも使用される。滑沢剤として、タルク又はシリカ、及び脂肪、例えば、植物性ステアリン、ステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸、及びそれらの混合物は、錠剤又は硬ゼラチンカプセルにおいて最も頻繁に使用される滑沢剤である。

甘味料は、特に固形剤形、例えば、チュアブル錠、並びに咳止めシロップのような液体剤形において、成分をより口当たりよくするために添加される。甘味料は、人工甘味料、天然甘味料又は合成甘味料又は半合成甘味料から選択でき；甘味料の非限定的な例は、アスパルテーム、アセスルファムカリウム、シクラメート、スクラロース、サッカリン、糖類又はそれらの任意の混合物である。

任意の剤形中で不快な味の活性成分を隠すために、香料を使用することができる。香味料は、天然（例えば、果実抽出物）又は人工のものであってよい。例えば、（１）苦い製品を改善するために、ミント、チェリー又はアニスを使用することができ；（２）塩辛い製品を改善するために、桃又はアプリコット又は甘草を使用でき；（３）酸っぱい製品を改善するために、ラズベリーを使用でき；及び（４）甘すぎる製品を改善するために、バニラを使用できる。

賦形剤のクラスからの補助物質を除き、本発明からの製剤は、薬学的に許容される化学形態のビタミンＤ（カルシフェロール）などのビタミン類、塩又は誘導体を；薬学的に及び栄養的に許容される化学形態のミネラル類；及びＬ－アミノ酸類を含むが、これらに限定されない他の薬理学的に活性な物質又は栄養物質を含有することができる。

それぞれの場合において、組成物の提示は、当業者が公知の手段によって使用される投与の種類に適合される。そのため、組成物は、溶液の形態又は任意の他の形態の臨床的に許容される投与の形態で、処置有効量で提示され得る。組成物を、そのため、錠剤、カプセル剤、散剤（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（フリーズドライ）又は空気乾燥から導出されるものなど）、顆粒、溶液、坐剤、ゲル又はマイクロスフェアなどの固体、半固体又は液体の調製物に製剤化することができる。特定の実施形態において、組成物は、液体形態又は固体形態での投与のために製剤化される。

特定の実施形態において、組成物は、錠剤、トローチ、菓子、咀嚼可能な錠剤、チューインガム、カプセル、サシェ、散剤、顆粒剤、コーティング粒子又はコーティング錠、錠剤、丸剤、トローチ、胃耐性錠剤及びカプセル、分散性ストリップ及びフィルムなどの固体形態である。より特には、組成物は、カプセル剤、散剤、錠剤、丸剤、トローチ剤、サシェ、又は顆粒の形態である。実施形態において、組成物は、溶液を形成するために水相と接触する粉末の形態である。水相は、イヌリンなどの繊維を含むことができる。２つの成分（粉末及び水相）を、別々のコンパートメント／容器に入れることができ、２つの成分を混合してその場で再構成する。

実施形態において、組成物は、ゼラチンカプセルの形態である。特定の実施形態において、組成物は、植物性カプセルの形態であり、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）を含む。

別の実施形態において、組成物は、経口液剤、滴剤、懸濁剤（例えば、油）、エマルジョン及びシロップ剤などの液体形態である。特に、組成物は滴剤の形態である。より特には、組成物は、油性滴剤の形態である。

いくつかの実施形態において、組成物は、単独で又は液体と混合して投与される油性懸濁液の形態である。油性懸濁液は、オリーブ油、トウモロコシ油、大豆油、亜麻仁油、ヒマワリ油又は米油などの少なくとも１種の食用油を含む。油は、少なくとも７０重量／重量％の量で存在する。特定の実施形態において、油性懸濁液はまた、乳化剤、安定剤又は固化防止剤である少なくとも１種の賦形剤の０．１～１５重量／重量％の量を含む。適切な薬剤は、二酸化ケイ素、シリカゲル、コロイダルシリカ、沈降シリカ、タルク、ケイ酸マグネシウム、レシチン、ペクチン、デンプン、加工デンプン、コンニャクガム、キサンタンガム、ジェランガム、カラギーナン、アルギン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール又はモノオレイン酸グリセロールなどの脂肪酸のモノグリセリド又はジグリセリド、並びにモノグリセリド又はジグリセリドのクエン酸エステルである。

特に、組成物は、油性懸濁液の形態、特に油性滴剤の形態の乳児用栄養補助食品の形態である。特定の実施形態において、油性懸濁液は、ヒマワリ油及び特に１重量％のコロイダルシリカ、並びに細菌細胞を含む。別の実施形態において、油性懸濁液は、ヒマワリ油並びにレシチン、脂肪酸のモノグリセリド又はジグリセリド、カラギーナン及びアルギン酸ナトリウムから選択される薬剤、並びに細菌細胞を含む。

特に、例えば、カプセル剤、サシェ又はスティック、錠剤又は丸剤は、約１５０ｍｇ～約８０００ｍｇの重量を有する。より特には、カプセル剤は、約２００ｍｇ～約６００ｍｇの重量を有する。より特には、サシェ又はスティックは、約１．５ｇ～約６ｇの重量を有する。より特には、錠剤又は丸剤は、約４００ｍｇ～約１２００ｍｇの重量を有する。

特に、例えば、噴霧剤、油性滴剤（例えば、ヒマワリ油の滴剤）は、約３ｍｌ～約５０ｍｌの容量を有する。より特には、噴霧剤は、約５ｍｌ～約５０ｍｌの容量を有する。より特には、油性滴剤は、約３ｍｌ～約３０ｍｌの容量を有する。

本発明の製剤の調製に関して、これは当業者の範囲内であり、最終的な投薬製剤に依存する。例えば、限定されないが、最終剤形が、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、経口懸濁液などの経口固形剤形である場合には、製剤の固形剤形の調製プロセスは、（１）本発明の後処置プロバイオティクス細菌を含む活性成分（複数可）の有効量を、（２）１種以上の賦形剤と共に均質化して、均質な混合物を形成し、これを、例えば、要件に従って、ステアリン酸マグネシウム又は他の滑沢剤による潤滑化に供して、散剤の最終投与形態を生じることを含む。このような均質な粉末を、通常のゼラチンカプセルに充填するか、或いは、腸溶カプセルに充填する。錠剤の場合には、それらは、直接圧縮又は造粒によって製造される。第１の例では、活性成分と、無水ラクトース、非結晶ソルビトール、及び他のものなどの適切な賦形剤との均質な混合物を調製する。第２の例では、錠剤を、顆粒形態の混合物に加工する。顆粒は、適切な充填剤、結合剤、崩壊剤、及び少量の精製水を用いた製剤の活性成分の造粒プロセスによって調製される。このように調製された顆粒をふるいにかけ、含水率が１重量／重量％未満になるまで乾燥させる。

液体剤形（例えば、経口懸濁液）の調製プロセスに関して、これは、本発明の後処置プロバイオティクス細菌の有効量を含む製剤の活性成分（複数可）を、ヒマワリ油、大豆油又はオリーブ油のような様々な植物油；オレイン酸；オレイルアルコール；ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００又はＰＥＧ６００のような液体ポリエチレングリコールなどの不活性液体希釈剤（充填剤）；又は他の不活性な薬理学的に許容される液体中で均質化することを伴う。このプロセスはさらに、（１）蜜蝋、コロイド状二酸化ケイ素などのような懸濁安定剤の添加及び均質化による製剤の安定化；（２）甘味料の添加及び均質化による製剤の甘味化；（３）香料の添加及び均質化による製剤の風味付けを含む群から選択される１以上のプロセスによる均質な混合物の処置を伴う。

食品／栄養組成物
いくつかの実施形態において、組成物は、乳児用調製粉乳又は食品、ミルクベースの発酵製品（例えば、ヨーグルト、チーズ、カード）、植物ベースの発酵製品、パン、バー（例えば、エネルギーバー）、スプレッド、ビスケット、シロップ、飲料、ドレッシング、ソース、フィリング、スープ、アイスクリーム、油、ドレッシング又は菓子などの食品又は食用組成物の形態である。

用語「食品又は食用組成物」は、動物、特にヒトによって摂取され得る任意の提示形態の任意のタイプの製品を含むが、医薬品、栄養補助食品及び獣医学製品を除外する、その最も広い意味で、本明細書で使用される。

特に、組成物は、乳児用調製粉乳又は食品に含まれる。特に、組成物は飲料に含まれる。

他の食品の例としては、肉製品、チョコレートスプレッド、フィリング及びフロスティング、チョコレート、菓子、焼き菓子、ソース及びスープ、フルーツジュース並びにコーヒー用粉状ミルクが挙げられる。食品は、特にオートミール粥、乳酸発酵食品、レジスタントスターチ、食物繊維、炭水化物、タンパク質及びグリコシル化タンパク質などの担体材料を含む。特定の実施形態において、本発明の菌株は、カプセル化又はコーティングされる。特に、ミルクは、動物由来又は植物由来のいずれかであり得る。

実施形態において、食品又は食用組成物は、乳児栄養の分野で一般的に使用されるが、高齢者及び虚弱な群にも使用される栄養組成物である。

特定の実施形態において、本発明の組成物は、乳児用調製粉乳である。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、スターター乳児用調製粉乳、離乳食、乳児用シリアル組成物、フォローアップ調製粉乳又はグローイングアップミルク、又は栄養強化剤である。組成物は、離乳期前及び／又は離乳期中に使用することもできる。

一実施形態において、栄養組成物は、完全な栄養組成物、又は歳をとった人、高齢者若しくは虚弱者のためのサプリメントであり得る。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、例えば、高齢者、運動選手又は免疫不全の人のための水分補給溶液又は食事の維持若しくはサプリメントである。

本発明による組成物は、標的集団の栄養の必要量（例えば、カロリー必要量に関して、又はビタミン若しくはミネラル必要量に関して、タンパク質、脂質若しくは炭水化物の必要量に関して）の１００％又は大部分を提供する完成された組成物であり得る。或いは、本発明の組成物は、通常の食事に加えて消費されるサプリメントであり得る。しかし、その場合、組成物の用量及び全体的な消費量は、情動処理に対する特許請求される利点（例えば、カロリー負荷及び対象のカロリー必要量に比例して）を提供するように適合させる。

本発明の組成物の使用は、組成物がサプリメントであり、好ましくは、単位用量の形態（例えば、錠剤、カプセル剤、粉末のサシェなど）で提供される例を包含することができる。一実施形態において、組成物は、ヒトの母乳育児に対するサプリメントである。単位剤形は、許容される担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水中のエタノールの混合物、水及び油／水又は水／油エマルジョンなどのエマルジョン、並びに様々な湿潤剤又は賦形剤を含有することができる。担体及び賦形剤の例は、この明細書の上記で説明されている。

組成物は、例えば、水で希釈するか、又はミルク（例えば、ヒト母乳）と混合されるか、又は粉末として摂取することを意図する粉末組成物の形態であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、すぐに飲めるもの、又は水で希釈するか若しくはミルク（例えば、ヒトの母乳）と混合される液体形態である。

組成物は、すぐに供給できる液体の形態であり得るか、又は必要な量の水を添加することによってすぐに供給できる液体に再構成することができる液体濃縮物又は粉末状の調製粉乳であり得る。

投与
いくつかの実施形態において、組成物は、特定の時間間隔で単回投与又は反復投与で投与され、例えば、特定の日数の間、又は特定の投与スケジュールに従って毎日投与することができる。特に、組成物は、１０日～９０日の間投与される。より特には、１０日～６０日又は１５日～４５日、より特には３０日間投与される。

いくつかの実施形態において、組成物は、３日に１回から１日３回、特に１日１回投与される。

いくつかの実施形態において、組成物は、局所的及び／又は全身的効果を与えるために、経口投与、経腸投与、非経口投与、局所投与、眼投与、耳投与、経鼻投与、膣内又は頬腔内に投与することができる。特に、組成物は、経口投与される。実施形態において、本発明の組成物の単位用量は、錠剤、カプセル剤、又はペレット、又は散剤若しくは顆粒剤として、又は水性若しくは非水性液体中のゲル、ペースト、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、ボーラス、エレクチュアリー、若しくはスラリーなどの上記の任意の形態で経口投与される。

一実施形態において、組成物は、経腸投与される。経腸投与の方法は、経鼻胃管又は空腸管、経口、舌下及び直腸から栄養を与えることを含む。そのため、組成物の単位剤形は、高齢者又は虚弱者において、直腸坐剤、エアロゾルチューブ、経鼻胃管又は胃腸管若しくは胃への直接注入によって投与することもできる。

他の実施形態において、組成物は、経鼻吸入、経口スプレー又は鼻腔経路によって投与することができる。他の実施形態において、組成物は、経口滴剤の形態で投与することができる。

実施例
実施例１：ビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）のポリリン酸生合成能
１．１ 材料及び方法
１．１．１ 菌株及び培養条件
ｐｏｌｙＰを生合成する能力を１９株で評価した（表１）。菌株は、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）、他のビフィズス菌株、並びにラクトバチルス群及びサッカロミセス属に属する他の菌株を含んだ。菌株は、ＡＢ－Ｂｉｏｔｉｃｓ Ｓ．Ｌ．コレクション又は市販製品からの乳児及び成人のヒト常在細菌（ＨＲＢ）株と非ＨＲＢ株を含んだ。

解析は、以下の対照株を含んだ。ｐｏｌｙＰを生成することが知られているＬプランタルムＷＣＦＳ１（Ａｌｃａｎｔａｒａら ２０１４）及びＬ．パラカゼイＪＣＭ１１６３（Ｓａｉｋｉら ２０１６）；リン酸塩を除去できることが知られているＢ．ブレーベＪＣＭ１２７３、Ｂ．アドレセンティスＪＣＭ１２７５及びＢ．ロンガム亜種ロンガムＡＴＣＣ１５７０７（Ａｎａｎｄら ２０１９）；並びにｐｐｋ遺伝子を有することが知られているＢ．スカルドビＤＳＭＺ１３７３４（ＢＡＡ－７７３）（Ｑｉａｎら ２０１１）。

菌株を、適切な寒天プレートに接種することによって、表記のように市販品から単離した。培養後、単一コロニーを増殖させてグリセロールストックで保存し、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅及びサンガーシーケンシングにより種の同一性（ＩＤ）を確認した。対照株を培養コレクションから購入し、種の同一性を確認した。

ビフィズス菌株を、０．０５％システインを含むＭａｎ、Ｒｏｇｏｓａ ａｎｄ Ｓｈａｒｐｅ寒天（ＭＲＳ）（ＭＲＳｃｙｓ）中、３７℃の嫌気性条件下で前培養した。乳酸桿菌株をＭＲＳで３０℃の好気的条件下で前培養した。サッカロミセス・ブラウディＣＮＣＭ Ｉ－７５４をＹＰＤ培地で３７℃、好気性条件下で振とうしながら前培養した。

ｐｏｌｙＰ生成アッセイの場合、０．５％酵母抽出物、０．５％トリプトン、０．４％ Ｋ_２ＨＰＯ_４、０．５％ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．０２％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．００５％ ＭｎＳＯ_４、１ｍｌのＴｗｅｅｎ８０、０．０５％システイン、及び０．５％グルコースを含有する（１Ｌあたり、ｗ／ｖ）リンゴ酸酵素誘導（ＭＥＩ）培地を使用した（Ａｌｃａｎｔａｒａら ２０１４）。ＭＥＩで増殖できない株をＭＲＳｃｙｓで増殖させた。培養物をＯＤ（５９５ｎｍ）０．１で接種し、各菌株を上記に示した条件下で成長させた。ＯＤを１６時間測定することによって成長をモニターした。

表１．菌株の特徴付け。ＨＲＢ、ヒト常在性ビフィズス菌；ｎＨＲＢ、非ＨＲＢ；ＣＥＣＴ、スペインタイプカルチャーコレクション；ＤＳＭＺ、微生物及び細胞培養のドイツコレクション；ＡＴＣＣ、アメリカンタイプカルチャーコレクション。対照として分類される菌株は、ｐｏｌｙＰ代謝に関するいくつかの公開された証拠を有する。

１．１．２ ポリリン酸塩（ｐｏｌｙＰ）の定量化
ＰｏｌｙＰを、前述のように次亜塩素酸ナトリウムによる加水分解に対する耐性によって細胞から単離した（Ａｌｃａｎｔａｒａら ２０１４）。細胞を遠心分離により回収し、室温で４５分間穏やかに撹拌しながら、５％次亜塩素酸ナトリウム１ｍｌに溶解した。不溶性物質を１６,０００ｇ、４℃、５分間の遠心分離によりペレット化し、１ｍｌの１．５ＭのＮａＣｌプラス１ｍＭのＥＤＴＡで２回洗浄し、その間に１６,０００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。ｐｏｌｙＰをペレットから抽出し、１ｍｌの水で２回連続して洗浄し、その間に１６,０００ｇ、４℃、５分間の遠心分離工程を行った。プールした水抽出物中のＰｏｌｙＰを、０．１ＭのＮａＣｌ及び１容量のエタノールを添加し、続いて、氷上で１時間インキュベートすることにより沈殿させた。１６,０００ｇで１０分間遠心分離した後、ｐｏｌｙＰペレットを５０μＬの水に再懸濁した。

リン酸塩量を蛍光強度に関係させる検量線を作成し、菌株から抽出したｐｏｌｙＰを定量化した。第１の工程として、ポリリン酸塩生成対照株のラクチプランチバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）株ＷＣＦＳ１（Ａｌｃａｎｔａｒａら ２０１４）から単離したｐｏｌｙＰ試料の段階希釈液を調製した。第二に、希釈液を１容量の２ＭのＨＣｌで加水分解し、９５℃で１５分間インキュベートしてリン酸を放出させ、次いで、半分の容量の２ＭのＮａＯＨを添加して中和した。第三に、各希釈液から放出されたリン酸塩を、ＢＩＯＭＯＬ Ｇｒｅｅｎキット（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で製造業者の推奨に従って定量化した。並行して、各希釈液から放出されたリン酸塩を、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中、最終濃度１０μＭで４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を使用して染色し、蛍光計において励起波長４１５ｎｍ及び発光波長５５０ｎｍで蛍光を測定した。最後に、得られたリン酸塩値及び対応する蛍光値で検量線を作成した。

検量線を得た後、ＢＩＯＭＯＬ Ｇｒｅｅｎキットを使用することなく、試料からのｐｏｌｙＰ量を蛍光値に従って定量化することができる。したがって、菌株試料からのｐｏｌｙＰの定量化を、検量線を使用してＤＡＰＩ蛍光により間接的に測定した。最初に、抽出したｐｏｌｙＰを、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中、最終濃度１０μＭでＤＡＰＩを使用して、蛍光計において励起波長４１５ｎｍ及び発光波長５５０ｎｍでの蛍光により測定した。次いで、ｐｏｌｙＰの量を、検量線によりｎｍｏｌ単位のリン酸塩として計算した。生物学的反復実験を少なくとも３回実施した。

１．１．３ インシリコ解析によるｐｐｋ遺伝子の検出
ビフィズス菌及び乳酸桿菌種のｐｐｋ遺伝子の塩基配列を、それぞれ受託番号ＡＥ０１４２９５．３（バージョン３、更新日２０１４年１月３１日、Ｂ．ロンガムＮＣＣ２７０５のゲノム）及びＡＬ９３５２６３．２（バージョン２、更新日２０１５年２月２８日、Ｌ．プランタルムＷＣＦＳ１のゲノム）によってＮＣＢＩから検索し、試験ゲノムに対してＢＬＡＳＴ解析に供した。ビフィズス菌種において検出されたＰＰＫタンパク質のアミノ酸配列を整列させ、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用してツリーを構築した。

１．２． 結果
Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）のｐｏｌｙＰ生成能及びそれに関連する成長を、６つの異なる種に属する１２のビフィズス菌株、５種に属する６つの乳酸桿菌株及び１つの酵母株と比較した（表１）。

菌株をＭＥＩ又はＭＲＳｃｙｓに同じＯＤ（０．１）で接種し、１６時間成長させた。ＯＤをモニターし、ほとんどの菌株で有意な成長が観察された６時間及び１６時間でｐｏｌｙＰ形成を調べた（図１）。ＰｏｌｙＰ合成及びＯＤ値は、菌株間で大きく変動した（図１、図２及び表２）。

一般に、ビフィズス菌は乳酸桿菌株よりも高いｐｏｌｙＰ形成能を示した。Ｌ．プランタルム２９９ｖ、Ｌ．ブレビスＫＡＢＰ－０５２（ＣＥＣＴ７８４０）、Ｌ．ラムノサスＧＧ、Ｌ．ロイテリＤＳＭ１７９３８及びＳ．ブラウディＣＮＣＭ Ｉ－７５４細胞によって生成されたＰｏｌｙＰレベルは非常に低かった（１６時間の時点で２ｎｍｏｌ未満）。

ビフィズス菌では、全ての菌株がある程度の量のｐｏｌｙＰを生成することができた。しかし、Ｂ．ビフィダムＡＢＰ６７１、Ｂ．ブレーベＡＢＰ７３４、Ｂ．ブレーベＭ１６－Ｖ及びＢ．スカルドビＢＡＡ－７７３は、最低量を生成した（１６時間で２５ｎｍｏｌ未満、図２及び表２）。この結果は、ビフィズス菌におけるｐｏｌｙＰ合成が、乳酸桿菌で以前に観察されたように、異なる菌株間で大きく変動したことを示した。

６時間及び１６時間の時点でのｐｏｌｙＰ生成を比較すると、Ｂ．スカルドビとＢ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）を除く全てのＢ．ロンガム株は、１６時間よりも６時間でより高いｐｏｌｙＰ値を示した（図２及び表２）。残りの菌株は１６時間でより多くのｐｏｌｙＰを生成したが、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）は両方の時点で類似の量を生成した。したがって、ビフィズス菌のｐｏｌｙＰ生成は成長曲線に沿って変動し、この成長に関係する変動は株にも依存すると結論付けることができ、増殖曲線に沿って２以上の時点を分析することの重要性を強調している。

特に、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）は、６時間で高いｐｏｌｙＰ生成能を示した（表２）。驚くべきことに、１６時間でＢ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）もまた、最高のｐｏｌｙＰ形成能を示した。興味深いことに、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２は、この挙動を示す唯一のＢ．ロンガム株であり、培養期間に関係なく高いｐｏｌｙＰ生成が観察された。これに対して、他のｐｏｌｙＰ生成株は、培養期間が短いとき（例えば、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＡＴＣＣ１５７０７）又は培養期間が長いとき（例えば、Ｂ．アニマリスＢＢ１２）に限って生成能を示した。そのため、ｐｏｌｙＰを一定に生成できることは、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）菌株のさらなる利点を表す。

特筆すべきは、Ｂ．アドレセンティスＪＣＭ１２７５とは異なり、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）はｐｏｌｙＰを生成しながら増殖することができたことである。加えて、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）は、さらに成長することができた他の株よりも多くのｐｏｌｙＰを生成した。このことは、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）が、ポストバイオティクス分子ｐｏｌｙＰの効率的な生成によって有益な効果を引き出しながら、腸内で増殖及び生着する能力が最も高いことを証明する。

さらに、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）は、ｐｐｋを発現することが知られているＢ．スカルドビＢＡＡ－７７３よりも、６時間で１４０倍多くの（１．６対２３０．９ｎｍｏｌ、表２）ｐｏｌｙＰを生成することができた（Ｑｉａｎら、２０１１）。Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）は、ＰｏｌｙＰを生成することが知られているＬ．プランタルムＷＣＦＳ１の１８倍多くの(１２．７対２３０．９ｎｍｏｌ、表２）ＰｏｌｙＰを生成することができた。

表２．本研究で６時間及び１６時間で分析した菌株のＰｏｌｙＰ定量化（ｎｍｏｌ）及び成長（ＯＤ_５５０）。ｐｐｋ、ポリリン酸キナーゼ遺伝子；ＮＡ、該当なし。

加えて、試験中の菌株の利用可能なゲノムの中でｐｐｋ遺伝子の存在をＢＬＡＳＴにより評価した（表２及び３）。表現型の結果と一致して、ｐｐｋ配列が、試験した全てのビフィズス菌と一部の乳酸桿菌ゲノムで見出された。しかし、菌株間でのｐｏｌｙＰ生成の差異を考慮すると、データは、制御機構が菌株間で異なることを裏付けている。実際、細菌におけるｐｏｌｙＰ生合成は、転写後及び／又は翻訳後レベルで制御されるように思われる。

表３．ＢＬＡＳＴによる利用可能なゲノム中のｐｐｋ遺伝子の同定。ＮＤ：検出されず。

ビフィズス菌株のｐｐｋ配列間で観察された差異を考慮して、それらのアミノ酸配列を整列させ、ツリーを構築した。結果から、ビフィズス菌ＰＰＫが２つのクレードに分類され得ることが示され（図３）、一方はＢ．アニマリス及びΒ．アドレセンティス株を含み、他方はＢ．スカルドビ、Ｂ．ロンガム及びＢ．ブレーベ株を含む。

実施例２：最終製品中のビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）の安定性
プロバイオティクス製品の安定性は、製造及び保管の工業プロセス、並びにプロバイオティクス株の本質的な特性を含むいくつかの要因に依存する。

工業プロセスは、生成及び保管中の菌株の生存率の低下を低減するように最適化されている。加えて、製造業者は、製品の保管期間中の喪失に対抗するために、高用量のプロバイオティクス細菌から始める傾向がある。しかし、ビフィズス菌は自然に耐気性が低減するため、他のプロバイオティクス種と比較して、製品の保管期間を延長した際に、安定性の維持がより困難となる。

この試験では、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）の最終製品における安定性を試験した。

２．１ 材料及び方法
Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）の最終製品を、活性成分（最小１０^９コロニー形成単位、ｃｆｕ）、ヒマワリ油（最大１０ｍＬ）及びＤＬ－アルファトコフェロール（４ｍｇ）を含有するマトリックス中で製剤化した。製品は琥珀色のガラスボトルに梱包し、ゾーンＩＩ条件（２５℃、相対湿度（ＲＨ）６０％）で保管した。

活性成分（プロバイオティクス株）の量を、利用可能なガイドラインに従って、推奨されるｃｆｕ／用量を満たすように選択した。

菌株の安定性を、生成後０、１、３及び６ヶ月でＩＳＯ ２９９８１に従ってプレートカウントによってｃｆｕを測定することによって調べた。結果をログ（ｃｆｕ）で表した。傾向線を得て、１２ヶ月の時点で予測されるｃｆｕを推定した。０ヶ月と１２ヶ月の間のｃｆｕを比較した倍数低減及び対数低減を計算した。

２．２結果
図４は、最終製品中に経時的（０～６ヶ月）に見出された生きているＢ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）及び予測される傾向線を示す。１２ヶ月でｌｏｇ（ｃｆｕ）を９．０１と推定した。この結果から、１２ヶ月にわたって３倍の低下（すなわち、約０．５対数の喪失）が明らかになり、製品の安定性が良好であることが示された。したがって、製造時の３倍の過剰量は、１２ヶ月の時点で生きている細菌の１０^９ｃｆｕを確保するのに十分である。

実施例３：ビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）のさらなるプロバイオティクス特性
３．１ 材料及び方法
Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）の胃腸状態に抵抗し、腸上皮に接着し、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を利用する能力の特徴付けを行った。Ｌ．ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）及びＢ．ロンガム亜種ロンガムＡＴＣＣ１５７０７を、表記のように対照として使用した。乳酸桿菌株を、ＭＲＳで３７℃の嫌気性条件で通常通りに成長させた。ＭＲＳに０．１％（ｗ／ｖ）システイン－ＨＣｌ（ＭＲＳｃｙｓ）を添加したこと以外は同じ条件で、ビフィズス菌株を成長させた。

菌株を、模擬胃液（１Ｌ当たり：ＮａＣｌ ７．３ｇ、ＫＣｌ ０．５２ｇ、ＮａＨＣＯ_３ ３．７８ｇ及びペプシン３ｇ）に、及び１８０分間、０．３％（ｗ／ｖ）の胆汁塩を含有する培地に、ｐＨ２．３で３０分間及びｐＨ３で９０分間曝露することにより、胃ストレス抵抗性及び胆汁塩生存率を調べた。増殖性の細菌を、インキュベーション時間の前後に段階希釈及び計数法により計数した。市販のプロバイオティクス株Ｌ．ラムノサスＧＧを参照として使用した。

腸上皮への接着を、Ｃａｃｏ－２腸上皮細胞を使用してインビトロで調べた。細菌懸濁液を、Ｃａｃｏ－２単層（細胞対プロバイオティクスの感染多重度（ＭＯＩ）１：５で）及び対照としてのＣａｃｏ－２細胞を含まないウェルに添加した。３７℃で１時間インキュベーションした後に、培地を除去し、細胞を剥離させ、懸濁液を回収した。得られた懸濁液中の細菌を、段階希釈及びプレートカウントにより計数した。対照ウェルの培地中の細菌も定量化した。４７～５５の接着率で知られるＢ．ロンガム亜種ロンガムＡＴＣＣ１５７０７を品質管理のために使用した。

ＨＭＯの分解能を、唯一の炭素源としてＨＭＯラクト－Ｎ－テトラオース（１％）を有するＭＲＳで菌株を成長させることによって試験した。グルコース１％を有するＭＲＳを陽性対照として使用した。炭素源を含まないＭＲＳを陰性対照として使用した。増殖を２４時間モニターした。

Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）ゲノム配列をＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑから得て、読み取り情報をアセンブルし、注釈を付けた。ゲノム内でアドヘシン、バクテリオシン、ＨＭＯ分解酵素及び胆汁塩加水分解酵素などの目的遺伝子をＢＬＡＳＴにより検索した。

３．２ 結果
ｐＨ緩衝剤を使用しない速い胃内通過（ｐＨ２．３で３０分間）及びｐＨ緩衝剤を使用した遅い食後消化（ｐＨ３で９０分間）をシミュレートすることによって、胃の状態に対する耐性を評価した。Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）並びに周知のプロバイオティクス株Ｌ．ラムノサスＧＧは、ｐＨ２．３及びｐＨ３での胃でのチャレンジにおいて１ｌｏｇ ｃｆｕ／ｍＬ未満の喪失を示した（表４）。加えて、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）は胆汁塩に対して高い耐性を示し、喪失は０．５ログｃｆｕ／ｍＬ未満で、Ｌ．ラムノサスＧＧと同レベルであった。さらに、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）のゲノムに、胆汁塩加水分解酵素をコードするｂｓｈ遺伝子１コピーが見出され、この菌株が消化管に十分に適合していることが確認された。

表４．胃ストレス及び胆汁塩に対する耐性及び腸上皮への接着。提示される値は、ログｃｆｕ／ｍＬの平均値と標準偏差、又はログｃｆｕ／ｍＬの％である。Ｌ．ラムノサスＧＧ及びＢ．ロンガム亜種ロンガムＡＴＣＣ１５７０７を対照として使用した。ＮＡ、当なし。

Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）は、７０．８％の接着能で腸上皮に接着することが確認された（表４）。この菌株は、中等度接着性の対照株Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＡＴＣＣ１５７０７（５１．２％）よりも多く接着した。ゲノム解析により、この菌株はいくつかの接着タンパク質とドメインを十分に備えていることが確認された。ヒト組織への細菌の接着は、有効な細菌生着の前提条件であり、これは、持続的な健康上の恩恵効果を達成するための望ましい形質である。

Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）は、唯一の炭素源としてＨＭＯラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）の存在下で成長することができた（図５）。ゲノムは、ラクト－Ｎ－ビオシダーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、アルファ－ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼを含むＨＭＯ分解遺伝子を保有することが確認された。そのため、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）によるＨＭＯの利用が、表現型及び遺伝子型で確認され、乳児の腸に十分に適合していることが証明された。

加えて、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）ゲノムは、炭水化物活性酵素（ＣＡＺｙ）をコードする他の遺伝子を保有しており、様々なヒトの食べ物に由来する基質などの広範囲の複合基質を分解する能力があることが示唆される。Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）は、多用途の炭水化物代謝を有すると思われる。

さらなる解析から、ランチペプチドＢ、セルピン、及びアドヘシンをコードする遺伝子の存在が示された。ランチペプチドＢ（ランティバイオティクス）は、Ｂ．ロンガム株が生成するクラスＩバクテリオシンであり、ある範囲のグラム陰性及びグラム陽性病原菌に対して強力な抗菌活性を示す。セルピン（セリンプロテアーゼ阻害剤由来）は、ヒト好中球及び膵臓エラスターゼ（プロテアーゼ）を選択的に不活性化し、抗炎症作用をもたらし、腸の恒常性の維持に寄与する。

全体として、Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＫＡＢＰ－０４２（ＣＥＣＴ７８９４）のインビトロ及びインシリコ分析により、この菌株のプロバイオティクス特性が確認され、これがＨＭＯを分解する能力を有することから、乳児の腸を含むヒトの消化管に十分に適合することを示している。

実施例４：腸管バリアの保護におけるＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４由来のｐｏｌｙＰの効果
ｐｏｌｙＰのポストバイオティクス効果は、腸の恒常性の維持及び腸のバリア機能の保護におけるｐｏｌｙＰの役割に関係する。作用機序の１つは、腸細胞における細胞保護因子である熱ショックタンパク質ＨＳＰ２７の誘導である（Ａｌｃａｎｔａｒａら、２０１８）。

Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４が生成するｐｏｌｙＰがバリアの完全性及び腸管透過性に影響を与えるか否かを調べた。加えて、その効果がＨＳＰ２７生成に関係するか、それともタイトジャンクションタンパク質を含む他のバリア完全性マーカーの誘導に関係するかも調べた。

４．１． 材料及び方法
４．１．１ Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４試料の調製とｐｏｌｙＰ生成の定量化
Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４を、ＭＥＩ培地及び低リン酸（ＬＰ）培地で増殖させた。後者の培地は、ＭＥＩと同じ組成であるが、ｐｏｌｙＰ前駆体（Ｋ_２ＨＰＯ_４及びＫＨ_２ＰＯ_４）を添加していないため、この菌株は大量のｐｏｌｙＰを生成できない。１６時間成長させた後、培養物を遠心分離し、上清を回収し、濾過し、中性ｐＨに調整した。ＰｏｌｙＰの量を、実施例１に記載したように測定した。

４．１．２． バリアの完全性及び透過性の評価
Ｃａｃｏ－２細胞単層の完全性を、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定することによって評価し、傍細胞輸送マーカーのルシファーイエローの見かけの透過係数（Ｐａｐｐ）によって透過性を評価した。

Ｃａｃｏ－２細胞を、頂端（上）及び基底外側（下）の区画を有する多孔質膜インサートに播種した。最少必須培地（Ｍｅｄｉｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）（ＭＥＭ）を両方の区画に添加した。細胞を、ＭＥＩ培地及びＬＰ培地中で成長させたＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４の上清で処置した。追加の細胞を、ＭＥＭ、非発酵ＭＥＩ及びＬＰ培地で処置し、対照として使用した。

７２時間の処置後、ＴＥＥＲ及び透過性を決定した。ＴＥＥＲを、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）ＥＲＳ電圧電流計で測定した。透過性アッセイのために、ルシファーイエローを頂端区画に添加した。１５分、３０分、４５分、６０分、９０分及び１２０分で、基底外側区画からアリコートを採取し、輸送されたルシファーイエローの蛍光を蛍光マイクロプレートリーダーで４８５／５２０ｎｍの励起／発光波長で測定した。

４．１．３． ＨＳＰ２７生成の定量化
ＨＳＰ２７の生成を、Ａｌｃａｎｔａｒａら、２０１８による記載にいくつかの修正を加えて、ウェスタンブロットアッセイによってコンフルエントのＣａｃｏ－２腸上皮細胞で調べた。細菌上清を細胞培養に添加し、１６時間インキュベーションを進行させた。ＭＥＩ培地及びＬＰ培地を対照として使用した。ＨＳＰ２７を回収するために、細胞をＳＤＳ－ＰＡＧＥで溶解し、５分間煮沸した。タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離し、次いで、ナイロンメンブレンに転写した（ブロット）。ブロットを、ウサギポリクローナル抗ＨＳＰ２７血清又はマウスモノクローナル抗βアクチン抗体（正規化に使用されるタンパク質）とインキュベートした。洗浄後、それぞれの二次抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギＩｇＧ及び抗マウスＩｇＧを使用した。ブロット画像を捕捉し、Ｉｍａｇｉｎ６８０システムでタンパク質を定量化した。

４．１．４． タイトジャンクションタンパク質をコードする遺伝子の発現
Ｃａｃｏ－２細胞を、ＭＥＩ培地及びＬＰ培地で成長させたＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４の上清に１６時間曝露した。次いで、細胞を回収し、ＴＲＩＺＯＬ試薬でＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キットを使用してＲＮＡから得た。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）反応を、製造業者が指定した条件でＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを使用して行った。タイトジャンクションタンパク質である閉鎖帯－１（ＺＯ１）、ジャンクション接着タンパク質－１（ＪＡＭ１）及びオクルディンの発現を定量化した。１８Ｓ ｒＲＮＡ及びＧＡＤＰＨ遺伝子の発現を正規化のために使用した。

４．２ 結果
最初に、ＭＥＩ培地中で成長させた上清中のｐｏｌｙＰ量は、ＬＰ培地で成長させた上清中のｐｏｌｙＰ量よりも高かった（表５）。注目すべきことに、ＭＥＩ中の量は、同じ培地中の実施例１で定量化した量よりも低かった。しかし、実施例１では、ｐｏｌｙＰは細胞内で測定されるが、実施例４では、ｐｏｌｙＰは細胞外で測定される。ここでは、腸内の状態を模倣するために細胞外生成、すなわち、腸管バリアと接触する細胞外ｐｏｌｙＰを調べた。

表５．高リン酸（ＭＥＩ培地）又は低リン酸（ＬＰ培地）条件下で１６時間成長させたＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４の上清中のＰｏｌｙＰ量（ｎｍｏｌ）。各条件における増殖（ＯＤ_５５０）を示す。

二区画系におけるＣａｃｏ－２単層の実験から、高濃度のｐｏｌｙＰを有するＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４の上清（すなわち、ＭＥＩ培地での培養物からの）に頂端を曝露すると、ｐｏｌｙＰ量が低い上清及び対照の上清と比較して、より高いＴＥＥＲ（細胞バリアのより大きな抵抗の指標）を示すことが示された。頂端から基底外側区画へのルシファーイエローの流れを測定する実験からも、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４に由来する高ｐｏｌｙＰ濃度が、低ｐｏｌｙＰ上清及び対照と比較して化合物の透過性を顕著に低下させることが示された（図６に示す）。これらの結果は、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４が生成するｐｏｌｙＰが、腸管透過性を妨げるより強力な機能的バリアを促進することを示している。重要なことに、上清中のｐｏｌｙＰの量が細胞内よりも低かったにもかかわらず、その効果は有意であり、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４が生成する少量のｐｏｌｙＰでもバリアの完全性に有益な効果を有するために十分であることを示唆している。

腸上皮細胞におけるＨＳＰ２７生成のウェスタンブロット解析により、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４が生成した高濃度のｐｏｌｙＰを有する（すなわち、ＭＥＩ培地中の培養物からの）上清は、低濃度のｐｏｌｙＰを有する培養物からの（すなわち、ＬＰ培地中の培養物からの）上清と比較して、有意により高いＨＳＰ２７生成を誘導することが示された。加えて、異なるｐｏｌｙＰ量を有する異なる試料を使用して、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４の上清におけるＨＳＰ２７発現とｐｏｌｙＰ濃度との間にも相関が観察された（図７に示す）。これらの結果は、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４がｐｏｌｙＰの合成を通じてＨＳＰ２７の生成に影響を与えることができ、したがって、この菌株が腸上皮の保護効果を有することを示している。

さらに、バリア完全性の維持に重要なタイトジャンクションタンパク質ＺＯ１、ＪＡＭ１及びオクルディンの発現は、低ｐｏｌｙＰ量の上清と比較して、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４の上清中の高ｐｏｌｙＰ量の存在によって誘導された（図８に示す）。

全体として、これらの結果から、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４株が、ｐｏｌｙＰの生成を経て、細胞保護タンパク質ＨＳＰ２７及びタイトジャンクションタンパク質の生成の誘導によって、バリアの完全性を高め、腸管透過性を低減することができることが確認される。したがって、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４は、腸管バリアの恒常性に正の効果をもたらす。

実施例５：Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４のＰｏｌｙＰ生成能力における母乳のＨＭＯラクト－Ｎ－テトラオース及びポリアミン類の効果
Ｂ．ロンガムは、天然にはヒトの母乳及び乳児の腸に見出される。ヒトのミルクは、ある量のリン酸塩（ｐｏｌｙＰの基質）を含有する。Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４が母乳の存在下でｐｏｌｙＰを生成できるか否かを調べた。加えて、他の細菌におけるいくつかの証拠から、ポリアミン及び炭素源がｐｏｌｙＰ代謝に影響を及ぼし得ることが示唆された（Ａｎａｎｄら、２０１９）。母乳はポリアミン及び炭水化物ＨＭＯを含有するため、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４が利用するポリアミン及びＨＭＯラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）が（実施例３で確認したように）、試験株においてｐｏｌｙＰ生合成に影響を及ぼし得るか否かを試験した。

５．１． 材料及び方法
Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４は、ｉ）母乳（１体積／体積％）；ｉｉ）ＬＮＴ（１重量／体積％）；ｉｉｉ）母乳中に見出される量のポリアミン類：プトレシン、スペルミジン及びスペルミンをそれぞれ７０．０、４２４．２及び６１０．０ １０ｎｍｏｌ／ｄｌとグルコース（０．５重量／体積％）；並びにｉｖ）陽性対照としてのグルコース（０．５重量／体積％）を補給したグルコースを含まないＭＥＩ培地で成長させた。成長（ＯＤ_５５０）及びｐｏｌｙＰ生成を、６時間及び１６時間インキュベーション後に決定した。

５．２ 結果
母乳の存在下（唯一の炭素源としての母乳中に存在する糖類と共に）でのＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４の成長の分析から、菌株が低ＯＤにしか達しないにもかかわらず、６時間で、依然としてある程度の量のＰｏｌｙＰを生成できることが示された。ＬＮＴを唯一の炭素源とした場合の成長は、６時間で、対照条件での成長よりも低かった（ＯＤ１．８対２．９）。しかし、この株は、より多くの量のｐｏｌｙＰを生成した（１１７．０対１１０．２）。加えて、ｐｏｌｙＰは、対照と比較してＬＮＴ中により長い間残存した（１６時間で１４５．０対７０．２）。グルコースを含むＭＥＩ培地中のポリアミン類の存在は、成長にもｐｏｌｙＰ生成にも影響を及ぼさなかった（表６及び図９参照）。

表６．異なる条件下でインキュベートしたＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４培養物の６時間及び１６時間でのＰｏｌｙＰ定量化（ｎｍｏｌ）及び成長（ＯＤ_５５０）

結論として、これらの結果から、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４が母乳の存在下でｐｏｌｙＰを生成でき、ＨＭＯ ＬＮＴがｐｏｌｙＰの生合成を高めることが示され、試験株におけるｐｏｌｙＰ代謝のＬＮＴ依存的調節が示唆される。重要なことに、ＨＭＯとｐｏｌｙＰの相互作用が示されたのはこれが初めてであり、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４の補給が、例えば乳児において有し得る有益な役割を強調する。

実施例６：２ＦＬを利用するビフィズス菌とＢ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４との栄養共生
Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４が、例えば、ヒトのミルク又はヒトの腸に存在する他のビフィズス菌の栄養共生により、ＨＭＯ ２’－ＦＬで増殖できるか否かを調べた。

６．１． 材料及び方法
Ｂ．ビフィダムＢｂ０１（ＣＥＣＴ３０６４６）を、唯一の炭素源として２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）（４重量／体積％）を有するＭＲＳ培地で４８時間成長させた。上清を回収し、濾過して細胞を除去した。上清を、炭素源を含まない新鮮なＭＲＳ培地と混合した（１：１）。Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４をこの混合物中で２４時間成長させ、ＯＤをモニターした。

６．２． 結果
Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４は、２’－ＦＬによって培養したＢ．ビフィダムＢｂ０１（ＣＥＣＴ３０６４６）の上清の存在下で、ＯＤ０．５に達するまで成長することができた（図１０）。この結果から、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４が２’－ＦＬを利用する他のビフィズス菌の食糧になり得ることが実証される。そのため、実施例３（図５）の結果と合わせて、Ｂ．ロンガムＣＥＣＴ７８９４は、母乳中の２つの最も豊富なＨＭＯ（ＬＮＴと２’－ＦＬ）の存在下で成長することができる。

Claims (16)

1. 対象における腸管透過性亢進及び関連状態の処置に使用するための、ブダペスト条約に基づきスペインタイプカルチャーコレクション（ＣＥＣＴ）に受託番号ＣＥＣＴ７８９４で寄託されたビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム株、又はその派生細菌株を含むプロバイオティクス組成物であって、
   前記腸管透過性亢進の処置がポリリン酸塩を生成することによるものであり、
   前記派生細菌株が、
   （ａ）対応する寄託株のゲノムと少なくとも９９％の平均ヌクレオチド同一性ＡＮＩを有するゲノムを有し；及び
   （ｂ）前記対応する寄託株のポリリン酸塩生成能を保持し、
   前記関連状態が、腸以外の状態である、
   プロバイオティクス組成物。
2. 前記腸以外の関連状態が、免疫障害又は疾患、代謝性又は心血管の障害又は疾患、神経又は精神の障害又は疾患である、請求項１に記載の使用のためのプロバイオティクス組成物。
3. 前記関連状態が、肥満、糖尿病、インスリン抵抗性、非アルコール性脂肪肝疾患、肝硬変、非食物アレルギー／過敏症、免疫老化、多発性硬化症、関節リウマチ、紅斑性狼瘡、サルコペニア、喘息、アレルギー性鼻結膜炎、アトピー性皮膚炎、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、高血圧、慢性心不全、脳卒中、自閉症スペクトラム障害、統合失調症及びうつ病からなる群から選択される、請求項２に記載の使用のためのプロバイオティクス組成物。
4. 少なくとも１種のヒトミルクオリゴ糖をさらに含む、請求項１～３のいずれかに記載の使用のためのプロバイオティクス組成物。
5. 前記腸管透過性亢進及び関連状態が、早産、老化、高い強度の身体活動、バランスのとれていない食事、感染、薬物処置及び／又はストレスに関係する、請求項１～４のいずれかに記載の使用のためのプロバイオティクス組成物。
6. 前記対象がヒトであり、前記ヒトが、高齢者、早産児、乳児、運動選手、及び虚弱者からなる群から選択される、請求項１～５のいずれかに記載の使用のためのプロバイオティクス組成物。
7. 前記乳児が、早産児、虚弱乳児、出生時体重以下で生まれた乳児、子宮内発育遅延の乳児対象、帝王切開で生まれた乳児、抗生物質を投与された乳児、調製粉乳で育てられた乳児又は母乳で育てられた乳児からなる群から選択される、請求項６に記載の使用のためのプロバイオティクス組成物。
8. 前記派生細菌株が、前記対応する寄託菌株のゲノムと少なくとも９９．５％の平均ヌクレオチド同一性を有するゲノムを有する、請求項１～７のいずれかに記載の使用のためのプロバイオティクス組成物。
9. 前記ビフィドバクテリウム・ロンガム・亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４株又はその派生細菌株のポリリン酸塩の生成が、以下の工程：
   （ａ）ＯＤ０．１で接種した菌株を、０．５％酵母エキス、０．５％トリプトン、０．４％ Ｋ_２ＨＰＯ_４、０．５％ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．０２％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．００５％ ＭｎＳＯ_４、１ｍｌのＴｗｅｅｎ ８０、０．０５％システイン、及び０.５％グルコースを含むリンゴ酸酵素誘導培地中、３７℃、嫌気性条件下で培養する工程；
   （ｂ）遠心分離により細胞を回収し、室温で４５分間穏やかに攪拌しながら５％次亜塩素酸ナトリウム１ｍｌに溶解する工程；
   （ｃ）不溶性材料を１６,０００ｇ、４℃で５分間遠心分離してペレットを得て、１ｍｌの１．５ＭのＮａＣｌプラス１ｍＭのＥＤＴＡで２回洗浄し、その間に１６,０００ｇ、４℃で５分間遠心分離する工程；
   （ｄ）１ｍｌの水で２回連続して洗浄し、その間に１６,０００ｇ、４℃で５分間遠心分離して、ペレットからポリリン酸塩を抽出する工程；
   （ｅ）０．１ＭのＮａＣｌ及び１容量のエタノールを添加することにより、プールした水抽出物中のポリリン酸塩を沈殿させ、続いて氷上で１時間インキュベートする工程；
   （ｆ）１６,０００ｇで１０分間遠心分離し、ポリリン酸ペレットを５０μＬの水に再懸濁する工程；
   （ｇ）工程：
   ｉ．対照株のラクトバチルス・プランタルムＷＣＦＳ１から単離したポリリン酸塩の試料の段階希釈液を２ＭのＨＣｌの１容量で加水分解し、９５℃で１５分間インキュベートする工程；
   ｉｉ．２ＭのＮａＯＨの半分容量を添加して希釈液を中和する工程；
   ｉｉｉ．放出されたリン酸塩をＢＩＯＭＯＬ Ｇｒｅｅｎキットで測定し、各希釈液中のリン酸塩の量を得る工程；
   ｉｖ．放出されたリン酸塩を、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中１０μＭの最終濃度で４’,６－ジアミジノ－２－フェニルインドール、ＤＡＰＩを用いて、蛍光計で励起波長４１５ｎｍ及び発光波長５５０ｎｍで蛍光により測定し、各希釈液の蛍光値を得る工程；並びに
   ｖ．（ｉｉｉ）で得たリン酸塩値及び（ｉｖ）で得た対応する蛍光値を用いて検量線を作成する工程
   に従って、ポリリン酸塩由来のリン酸塩の量を蛍光強度に関係させる検量線を作成する工程；及び
   （ｈ）工程（ｆ）の再懸濁画分からポリリン酸塩を定量化する工程であって：
   １）リン酸塩を、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中１０μＭの最終濃度でＤＡＰＩを用いて、蛍光計で励起波長４１５ｎｍ及び発光波長５５０ｎｍで蛍光により測定する工程；
   ２）検量線によりポリリン酸塩の量を計算する工程；及び
   ３）ポリリン酸塩値をｎｍｏｌリン酸塩として表記する工程
   によって、前記ポリリン酸塩生成を６時間及び／又は１６時間培養時に決定した場合に、対照株のポリリン酸塩の生成よりも多い、請求項１～８のいずれかに記載の使用のためのプロバイオティクス組成物。
10. Ｂ．ロンガム亜種ロンガムＣＥＣＴ７８９４又はその派生細菌株の前記ポリリン酸塩生成が、６時間で、前記対照株Ｌ．プランタルムＷＣＦＳ１のポリリン酸塩生成よりも少なくとも１０倍高く、１６時間で高く、前記対照株Ｌ．プランタルムＷＣＦＳ１のポリリン酸塩生成と前記対照株によるポリリン酸塩のレベルが、１６時間で存在しない、請求項９に記載の使用のためのプロバイオティクス組成物。
11. 受託番号ＣＥＣＴ７８９４で寄託されたビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム株を含む、請求項１～１０のいずれかに記載の使用のためのプロバイオティクス組成物。
12. （ｉ）ブダペスト条約に基づきスペインタイプカルチャーコレクションＣＥＣＴに受託番号ＣＥＣＴ７８９４で寄託されたビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム株、又はその派生細菌株であって、
    （ａ）前記対応する寄託株のゲノムと少なくとも９９％の平均ヌクレオチド同一性ＡＮＩを有するゲノムを有し；及び
    （ｂ）前記対応する寄託株のポリリン酸塩生成能を保持する
    派生細菌株を含むプロバイオティクス組成物と、
    （ｉｉ）少なくとも１種のヒトミルクオリゴ糖
    とを含む組み合わせであって、同時、別々又は逐次投与のために構成される組み合わせ。
13. 前記ヒトミルクオリゴ糖が、フコシル化オリゴ糖、シアリル化オリゴ糖、Ｎ－アセチルラクトサミン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の組み合わせ。
14. ２’－フコシルラクトース及び／又はラクト－Ｎ－テトラオースを含む、請求項１３に記載の組み合わせ。
15. ビフィズス菌株、特に、Ｂ．ビフィダムＣＥＣＴ３０６４６をさらに含む、請求項１２～１４のいずれかに記載の組み合わせ。
16. 前記腸管透過性亢進の処置がポリリン酸塩を生成することによるものであり、前記関連状態が、免疫障害又は疾患、代謝性又は心血管の障害又は疾患、神経又は精神の障害又は疾患、及び胃腸障害又は疾患からなる群から選択される、対象における腸管透過性亢進及び関連状態の処置に使用するための、請求項１２～１５のいずれかに記載の組み合わせ。

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