CN114574406A - 鼠李糖乳杆菌菌株wka55及其在制备防治酒精性肝损伤制品方面的用途与产品 - Google Patents
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Abstract
本发明“鼠李糖乳杆菌菌株WKA55及其在制备防治酒精性肝损伤制品方面的用途与产品”属于微生物技术领域。本发明提供保藏编号为CCTCC NO:M 2022191的鼠李糖乳杆菌WKA55（Lacticaseibacillus rhamnosus）及其在预防和/或治疗酒精性肝损伤方面的应用，并通过实验证实鼠李糖乳杆菌WKA55具有较强自由基的清除能力，可以协助机体清除过量自由基，提升抗氧化能力，减少肝损伤。同时具有较强的肠上皮细胞黏附能力，改善肠道屏障功能。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及鼠李糖乳杆菌菌株WKA55及其在制备防治酒精性肝损伤制品方面的用途与产品。
背景技术
酒精性肝损伤也被称为酒精性肝病，由于长期饮酒或大量饮酒造成了肝脏损伤，引发肝脏病变。酒精性肝病是常见的肝脏疾病，主要症状表现为，酒精性脂肪肝、肝炎、肝纤维化，肝硬化，更为严重者会恶化成为肝癌。调查人员黄顺玲等对湖南省流行病学临床调查研究发现酒精性肝病率为4.36%，其中酒精性肝硬化为0.68%，酒精性肝炎为1.5%。多项研究表明，酒精性肝病与人均酒精消耗量有关。
随着我国经济的高速发展，人们的社交活动大量增加，饮食结构也发生了巨大改变，酒精的消耗量逐年增加。据统计，中国饮酒人数已达3亿多人，由酒精导致的肝脏性损伤疾病逐年上升，据WHO报告显示，2016年酒精造成的死亡人数占到了全球死亡人数的5.3%，达300万人，严重威胁到了人们的生命健康。因此，对酒精性肝病的研究也引起了人们的重视，目前，对酒精性肝病的主要治疗方式是戒酒和药物治疗。药物治疗见效慢，副作用大，反而加重了肝脏的负担；而戒酒对轻度肝病患者有明显地改善作用，重度患者则会出现病情反复，缓解周期较长。因此，寻找一种能代替药物来防治或治疗酒精性肝损伤的生物制品显得很有意义，由于益生菌生理功能的特殊性，具有刺激机体免疫力提升，抗氧化，改善肠道屏障等功能，为治疗酒精性肝病打开了新思路。
目前已经公开的文献或专利中，例如CN111004752B提供了一株耐乙醇植物乳杆菌及其在发酵食品中的应用，主要应用于酒类和醋类酿造生产提高产品的口感，增加酒类风味；CN111249371A提供的是一种解救护肝的组合物，属于组合产品，未能明确真正有效作用的成分。因此，需要一种既能在高浓度乙醇条件下生长，又能预防和/或治疗酒精性肝损伤，同时改善肠道屏障的微生物及含有它们的产品。
发明内容
基于本领域现有技术存在的上述不足和需求，本发明的目的在于一种既能在高浓度乙醇条件下生长的菌株及其在预防和/或治疗酒精性肝损伤方面的应用。
本发明的技术方案如下：
一株鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）菌株WKA55，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO: M 2022191。
保藏编号为CCTCC NO: M 2022191的鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）菌株WKA55在制备防治酒精性肝损伤制品和/或制备抗氧化制品和/或制备改善肠道屏障功能制品方面的用途。
所述防治酒精性肝损伤包括：改善肝脏的肿胀状态，抑制肝功能损伤，改善体内脂肪代谢障碍；
优选地，所述抗氧化指：清除羟基自由基和/或DPPH；
优选地，所述改善肠道屏障功能指：提高HT-29细胞黏附能力、或在肠上皮细胞中良好定植。
所述抑制肝功能损伤指：降低ALT和AST水平；
优选地，所述改善肝脏的肿胀状态指：降低肝指数值；
优选地，所述改善体内脂肪代谢障碍指：降低肝脏中甘油三酯TG和总胆固醇T-CHO含量。
一种防治酒精性肝损伤的制品，其特征在于，包括活性成分；所述活性成分包括保藏编号为CCTCC NO: M 2022191的鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）菌株WKA55。
所述的一种防治酒精性肝损伤的制品还包括：辅料；
优选地，所述辅料选自药用辅料或食用辅料；
优选地，所述制品选自食品或药品；
优选地，所述食品为保健食品；
所述药品的剂型选自：粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
一种抗氧化制品，其特征在于，包括活性成分；所述活性成分包括保藏编号为CCTCC NO: M 2022191的鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）菌株WKA55。
所述的一种抗氧化制品还包括：辅料；
优选地，所述辅料选自药用辅料或食用辅料；
优选地，所述制品选自食品或药品；
优选地，所述食品为保健食品。
一种改善肠道屏障功能制品，其特征在于，包括活性成分；所述活性成分包括保藏编号为CCTCC NO: M 2022191的鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）菌株WKA55。
所述的一种改善肠道屏障功能制品还包括：辅料；
优选地，所述辅料选自药用辅料或食用辅料；
优选地，所述制品选自食品或药品；
优选地，所述食品为保健食品。
在一些国家或地区的专利法允许的情形下，本发明还请求保护保藏编号为CCTCCNO: M 2022191的鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）WKA55在防治酒精性肝损伤和/或抗氧化和/或改善肠道屏障功能方面的用途。
本发明从自然条件筛选到的400余株鼠李糖乳杆菌中选出耐乙醇的菌株10株，通过不同乙醇浓度的比较选出耐乙醇能力较高的鼠李糖乳杆菌WKA55，将其保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC中国武汉武汉大学）。
所述鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）菌株WKA55经测序分析其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
所述鼠李糖乳杆菌WKA55具体形态特征如下：
菌体特征为：革兰氏染色阳性，细胞呈杆状，光学显微镜观察菌体有序排列。
菌落特征为：在MRS固体培养基上菌落呈乳白色，凸起，表面光滑，湿润，边缘整齐。
另一方面，本发明实施例提供了一种利用高通量筛选仪Growth Profiler 960筛选耐乙醇的鼠李糖乳杆菌的筛选方法,得到一株耐乙醇浓度21%的鼠李糖乳杆菌WKA55。
同时，所述鼠李糖乳杆菌WKA55具有较强的胃液和肠液耐受能力，在pH2.5的人工胃液下处理3h，其存活率达到92.10%，人工肠液处理3h，其存活率可达96.57%。
进一步地，所述鼠李糖乳杆菌WKA55具有较强的羟基自由基的清除能力，表明其具有一定的抗氧化能力。
所述鼠李糖乳杆菌WKA55对常见的15种抗生素敏感，对环丙沙星中度敏感，表明鼠李糖乳杆菌WKA55是不耐药的安全益生菌。
所述鼠李糖乳杆菌WKA55在细胞黏附实验中，对HT-29的黏附能力达到13.7，表明其在肠道的定植能力较强，能有效改善肠道屏障功能。
所述鼠李糖乳杆菌WKA55在进入饮酒者机体后，不受乙醇的限制在体内发挥益生功效，能有效降低机体内乙醇含量，预防酒精性肝损伤，对肝脏起到保护作用。
所述鼠李糖乳杆菌WKA55在预防和/或治疗酒精性肝损伤产品中的应用包括药品和食品，进一步地所述食品包含但不限于一般食品或保健品，例如固体饮料、发酵乳制品、果蔬制品、食醋或低度酒；所述药品包含但不限于颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊、口服液等。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的鼠李糖乳杆菌WKA55（Lacticaseibacillus rhamnosus）已经被证实耐乙醇浓度达到21%，在21%乙醇浓度条件下处理20h，菌液依然能在固体平板上生长良好。同时鼠李糖乳杆菌WKA55（Lacticaseibacillus rhamnosus）具有较强的耐胃酸耐胆盐能力，在进入机体后依然能保持较高活性。另一方面，所述鼠李糖乳杆菌WKA55具有较强自由基的清除能力，协助机体清除过量自由基，提升抗氧化能力，减少肝损伤。更进一步地，所述菌株具有较强的肠上皮细胞黏附能力，改善肠道屏障功能。而且，本发明所述鼠李糖乳杆菌对常见抗生素敏感，是一株安全有效的益生菌。该菌株具有优良的益生特性和显著功效，将其应用到各类食品或药品领域中具有巨大的应用前景。
本发明鼠李糖乳杆菌WKA55（Lacticaseibacillus rhamnosus）的保藏信息如下：
保藏编号：CCTCC NO: M 2022191；
分类命名： Lacticaseibacillus rhamnosus；
保藏日期：2022年03月04日；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
保藏地址：中国、武汉、武汉大学。
附图说明
图1为本发明实验例1测试的不同浓度乙醇条件下WKA55菌株生长曲线，图中A9、B9、C9、D9、E9、F9分别表示乙醇浓度为0%，7%，12%，16%，19%，21%。
图2为本发明实验例1测试的不同浓度乙醇条件下LGG菌株生长曲线，图中A11、B11、C11、D11、E11、F11分别表示乙醇浓度为0%，7%，12%，16%，19%，21%；其中，D11、E11和F11三个乙醇浓度下的生长曲线的折线图走势比较接近，在图中显示的效果为三条折线重叠，这说明LGG菌株在乙醇浓度分别为16%，19%，21%的情况下基本不生长。
图1和图2的纵坐标均为可表征菌株生长活性的OD值，横坐标为培养时间（min）。
图3为本发明实验例1测试的不同浓度乙醇处理20h后WKA55菌液在平板生长情况。
图4 为本发明实验例6统计的鼠李糖乳杆菌WKA55清除自由基能力。
图5为本发明实验例6统计的不同组别小鼠肝指数。
图6为本发明实验例6测量的不同组别小鼠的血清转氨酶。
图7 为本发明实验例6计算的不同组别小鼠的肝脏脂肪含量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
生物材料的来源
本发明实施例使用的鼠李糖乳杆菌WKA55（Lacticaseibacillus rhamnosus）保藏编号为CCTCC NO: M 2022191。HT-29细胞购自中国典型培养物保藏中心。
实验例1使用的MRS培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母浸膏5 g、葡萄糖20 g、K2HPO4 2 g、柠檬酸钠2 g、Mg SO4·7H2O 0.2 g、乙酸钠5.0 g、MnSO4·4H2O 0.2 g，吐温801mL，1 000 mL蒸馏水。121 ℃灭菌20 min。
实验例4-8使用的小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
如无特殊说明，本发明实施例和实验例中使用的各类试剂耗材均可商购获得，相关实验步骤均为本领域常见操作，具有本领域技术人员可常规理解的技术含义。
实施例1、本发明的鼠李糖乳杆菌WKA55（Lacticaseibacillus rhamnosus）
本组实施例提供一株鼠李糖乳杆菌WKA55（Lacticaseibacillus rhamnosus），其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO: M 2022191。
任何人培养、扩繁、发酵、生产、制备、或利用保藏编号为CCTCC NO: M 2022191的鼠李糖乳杆菌WKA55预防和/或治疗酒精性肝损伤或使用保藏编号为CCTCC NO: M 2022191的鼠李糖乳杆菌WKA55预防和/或治疗酒精性肝损伤的保健品/药品/食品的行为均落入本发明的保护范围。
在具体的实施例中，所述鼠李糖乳杆菌WKA55（Lacticaseibacillus rhamnosus）16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在具体的实施例中，所述耐酸是指鼠李糖乳杆菌WKA55（Lacticaseibacillusrhamnosus）在PH2.5条件下活菌数存活率高达92.10%。
在具体的实施例中，所述耐乙醇指采用浓度不大于21%的乙醇处理20h后的菌液接种至MRS固体培养基培养48h后，菌体仍然能生长良好。
在一些实施例中，所述的鼠李糖乳杆菌WKA55（Lacticaseibacillus rhamnosus）为活菌或灭活菌或该菌株的衍生物。
实施例2、本发明菌株鼠李糖乳杆菌WKA55（Lacticaseibacillus rhamnosus）在预防和/或治疗酒精性肝损伤方面的用途
本组实施例提供鼠李糖乳杆菌WKA55（Lacticaseibacillus rhamnosus）在预防和/或治疗酒精性肝损伤方面的用途；
在具体的实施例中，所述预防和/或治疗酒精性肝损伤包括抗氧化，改善肝脏的肿胀状态，抑制肝功能损伤，改善体内脂肪代谢障碍；
在更具体的实施例中，所述抗氧化指清除羟基自由基、清除DPPH；
在更具体的实施例中，所述抑制肝功能损伤指降低了ALT和AST指标；
在更具体的实施例中，所述改善肝脏的肿胀状态指降低肝指数值；
在更具体的实施例中，所述改善体内脂肪代谢障碍指降低肝脏中甘油三酯TG和总胆固醇T-CHO含量。
在一些实施例中，所述预防和/或治疗酒精性肝损伤还包括改善肠道屏障功能。
在具体的实施例中，所述改善肠道屏障功能指：提高HT-29细胞黏附能力、或在肠上皮细胞中良好定植。
实施例3、本发明的一种预防和/或治疗酒精性肝损伤的保健品/药品/食品
本组实施例提供一种预防和/或治疗酒精性肝损伤的保健品/药品/食品，其活性成分包括保藏编号为CCTCC NO: M 2022191的鼠李糖乳杆菌WKA55（Lacticaseibacillus rhamnosus）。
在具体的实施例中，所述食品包括一般食品、保健食品；
在更具体的实施例中，所述食品选自：益生菌固体饮料、冲泡饮料、压片糖果、休闲零食、软糖、调制乳粉、发酵制品、发酵饮料、发酵乳、豆制品、果蔬制品。
在更具体的实施例中，所述药品/保健品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
本领域技术人员可根据实际生产需要，结合食品/药品领域生产工艺的常规技术手段或基本常识（例如，《食品生产概论》、《食品与食品生产百科全书》、《食品加工技术》、《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等），对食用辅料或药用辅料进行常规选择或调整，进而制成不同的剂型、不同存储条件、不同保质期的药物或食品，这对于本领域技术人员而言无技术障碍，是可以并容易做到的。
实施例4、本发明的抗氧化制品
本组实施例提供一种抗氧化制品。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述抗氧化制品包括活性成分；所述活性成分包括保藏编号为CCTCC NO: M 2022191的鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）菌株WKA55。
在进一步的实施例中，所述的一种抗氧化制品还包括：辅料；
优选地，所述辅料选自药用辅料或食用辅料；
优选地，所述制品选自食品或药品；
优选地，所述食品为保健食品。
在更具体的实施例中，所述抗氧化指清除羟基自由基、清除DPPH。
实施例5、本发明的改善肠道屏障功能制品
本组实施例提供一种改善肠道屏障功能制品。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述改善肠道屏障功能制品包括活性成分；所述活性成分包括保藏编号为CCTCC NO:M 2022191的鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）菌株WKA55。
在进一步的实施例中，所述的一种改善肠道屏障功能制品还包括：辅料；
优选地，所述辅料选自药用辅料或食用辅料；
优选地，所述制品选自食品或药品；
优选地，所述食品为保健食品。
在具体的实施例中，所述改善肠道屏障功能指：提高HT-29细胞黏附能力、或在肠上皮细胞中良好定植。
实施例6、本发明WKA55菌株的适应症用途
本组实施例提供保护保藏编号为CCTCC NO: M 2022191的鼠李糖乳杆菌WKA55（Lacticaseibacillus rhamnosus）在防治酒精性肝损伤和/或抗氧化和/或改善肠道屏障功能方面的用途。
在一些实施例中，所述防治酒精性肝损伤包括：改善肝脏的肿胀状态，抑制肝功能损伤，改善体内脂肪代谢障碍；
在另一些实施例中，所述抗氧化指：清除羟基自由基和/或DPPH；
在某些实施例中，所述改善肠道屏障功能指：提高HT-29细胞黏附能力、或在肠上皮细胞中良好定植。
在具体的实施例中，所述抑制肝功能损伤指：降低ALT和AST水平；
优选地，所述改善肝脏的肿胀状态指：降低肝指数值；
优选地，所述改善体内脂肪代谢障碍指：降低肝脏中甘油三酯TG和总胆固醇T-CHO含量。
实验例1、耐乙醇鼠李糖乳杆菌WKA55的筛选
将从自然条件下筛选到的400株鼠李糖乳杆菌进行耐乙醇能力的筛选，将保存至-80℃的甘油管菌种取出解冻，按3%接种量接种至MRS 液体培养基37℃培养15-18h进行一代活化，连续活化三代后，接种至含7%无水乙醇的MRS液体培养基中，通过高通量筛选仪GP960的筛选，根据乙醇条件下的生长速度挑选出耐受度排前十的菌株。对排前十的菌株进行不同浓度乙醇的耐受考察，将活化好的菌株接种在乙醇浓度为0%，7%，12%，16%，19%，21%的MRS液体培养基中培养18~24h，观察菌株的生长活性。将在不同乙醇浓度培养20h的菌液分别滴加20μL至MRS固体平板培养基上，培养48h观察菌落生长情况。其中乙醇耐受表现最好的一株命名为WKA55，并将其送保藏。鼠李糖乳杆菌WKA55的保藏信息如下：
保藏编号：CCTCC NO: M 2022191；
分类命名：Lacticaseibacillus rhamnosus；
保藏日期：2022年03月04日；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
保藏地址：中国、武汉、武汉大学。
WKA55菌株与LGG菌株的乙醇耐受试验结果分别如图1和图2所示，曲线A、B、C、D、E、F分别表示乙醇浓度0%，7%，12%，16%，19%，21%条件下菌株的生长曲线，随着乙醇浓度的增加，菌株生长速率随之降低，对比两个菌株的生长曲线，鼠李糖乳杆菌WKA55在乙醇条件下生长速率显著高于LGG。从图3可以看出，鼠李糖乳杆菌WKA55在不同浓度乙醇条件下处理20h后，将菌液转接至MRS固体培养基培养48h，结果显示，21%的乙醇浓度处理20h，菌株依然具有活性且菌体能生长良好，再次表明WKA55菌株有较高的乙醇耐受能力。
实验例2、鼠李糖乳杆菌WKA55对人工胃液和人工肠液的耐受性测试
模拟人工胃液：配制PBS溶液，加入0.3%胃蛋白酶，用1mol/L HCL调节pH值至2.5，充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。
模拟人工肠液：配制PBS溶液，加入0.1%胰蛋白酶和0.3%的牛胆粉，用0.1mol/LNaOH调节pH值至8.0，充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。
鼠李糖乳杆菌WKA55在MRS液体培养基中37℃过夜培养，活化培养2代。将活化后的鼠李糖乳杆菌菌液离心，弃上清，收集菌体，调整菌液浓度至108CFU/mL。取1mL菌体悬液离心，收集菌体后，分别接入1mL配制好的pH2.5的模拟人工胃液和pH8.0的模拟人工肠液中混匀，37℃恒温孵育，同时分别取0h和3h的消化液检测活菌数，计算存活率，结果见表1。其中，菌株存活率（%）= Nt / N0×100%，式中N0表示菌株0h的活菌数（CFU/mL），Nt表示菌株3h的活菌数（CFU/mL）。
表1. 模拟人工胃液和人工肠液试验数据表
实验结果如表1所示，在胃液pH 2.5条件下37℃孵育3h后，鼠李糖乳杆菌WKA55活菌数存活率高达92.10%，在模拟人工肠液中37℃孵育3h后，存活率高达96.57%。表明鼠李糖乳杆菌WKA55具有较强的耐受胃液和人工肠液的能力，进入机体后能有效发挥益生功效，起到调节肠道菌群平衡和提升机体免疫力的作用。
实验例3、鼠李糖乳杆菌WKA55的羟基自由基和DPPH的清除能力
1. 将0.8mL的样品（活菌数控制为109CUF/mL浓度）加入到1mL 0.2mmol/L新鲜配制的DPPH-无水乙醇溶液中，混匀，在黑暗中避光室温反应30min，10000r/min离心2min，取上清液在517nm波长处测定吸光值，记为As。空白组以等体积无水乙醇替换DPPH溶液测量吸光值，记为Ab；对照组以等体积蒸馏水（或PBS）替换样品溶液测量吸光值，记为Ac。
DPPH自由基清除率（%）=[1-（As-Ab）/Ac]×100
其中，As为样品组吸光值；Ac为对照组吸光值（蒸馏水替代样品）；Ab为空白组吸光值（无水乙醇替代DPPH）
2.将1mL 2.5mM 1,10-邻菲罗啉（Sigma， USA）、1mL PBS（pH 7.4）、1mL样品（分别为IC和CFE）和1mL 2.5mM FeSO4混匀。加入1mL 20mM的H2O2，37℃恒温水浴反应1.5h，在536nm波长处测定其吸光度AS；用1mL蒸馏水代替1mL H2O2测定其吸光度A0；用1mL蒸馏水代替1mL样品测定其吸光度A1。
羟自由基清除能力（%）=（As-A1）/（A0-A1）×100
其中，AS 是样品的吸光度；A1表示控制溶液的吸光度，含1,10-邻菲罗琳、FeSO4和过氧化氢，不含样品；A0表示空白溶液的吸光度，不含样品和H2O2。
结果如图4所示，可以看出鼠李糖乳杆菌WKA55羟自由基清除率达到了49.3%，DPPH自由基清除率达到了43.5%，表明其具有较强的抗氧化能力。
实验例4、鼠李糖乳杆菌WKA55抗生素敏感性实验
将待测菌在MRS固体平板上划线活化后，制备菌悬液并调整菌悬液浓度为108CFU/mL，取100μL菌悬液加入MRS固体平板上，用无菌棉签将菌液均匀涂布在平板上，贴上抗生素药敏片，以无抗生素的纸片为空白对照。置于厌氧条件下，37℃正置培养，24h后用直尺测量菌株对抗生素敏感性直径，结果见表2。
表2.鼠李糖乳杆菌WKA55对抗生素敏感性数据（mm）
实验结果如表2所示，鼠李糖乳杆菌WKA55对常见的15种抗生素敏感，对环丙沙星中度敏感，表明鼠李糖乳杆菌WKA55是不耐药的安全益生菌。
实验例5、鼠李糖乳杆菌WKA55细胞黏附实验
采用体外细胞培养法测定实验菌株的细胞黏附能力。
菌液准备：将实验菌株按2%接种量接种至MRS液体培养基中活化2代，37℃，培养15h~18h。取培养好的目标菌株菌液，6000 r/min 室温离心 5 min 收集菌体，并用无菌PBS 洗涤两次，最后重悬于 DMEM 培养基，并调节菌体浓度至 108CFU/mL待用。
细胞制备：将HT-29细胞分别接种至添加了 10%（v/v）胎牛血清的 DMEM 培养基中，转移至 12 孔细胞培养板，细胞添加量为每孔1mL的2.4×105cell/mL的细胞， 5% CO2、37℃恒温培养，培养48h后换液培养，24h后获得单细胞层备用。
共同培养：备好的HT-29细胞的单细胞层吸去培养基，加入 PBS 缓冲液漂洗2次，吸去缓冲液，再加入制备好的菌悬液 1 mL/孔，混匀后，5% CO2、37℃共孵育 2 h；将处理后的混合液小心移去培养上清，加入无菌 PBS 漂洗 3~5 次以除去未黏附的细菌；加入胰酶细胞消化液消化，以使细胞从细胞培养板孔壁上脱离下来，收集溶液即为样品，将收集的样品进行梯度稀释和活菌计数。
黏附率、黏附能力按如下公式计算：
黏附能力（CFU/cells）=黏附在细胞上的的菌数（CFU）/孔中的细胞数
黏附率（%）=黏附在细胞上的的菌数（CFU）/加入孔中的总菌数x100%
表3. 黏附能力对比
结果如表3所示，鼠李糖乳杆菌WKA55对细胞HT-29的黏附能力达到了13.7，而LGG的黏附能力为7.3，表明鼠李糖乳杆菌WKA55在肠上皮细胞中有良好的定植能力，能有效改善肠道屏障功能。本领域公知，HT-29代表的是肠上皮细胞，用粘附能力或粘附率可代表益生菌定植肠道上皮细胞的能力；粘附能力数值越高表明每个细胞上黏附的益生菌越多，表明益生菌在肠道的定植能力越好。黏附率表示黏附在细胞上的细菌数和加入的总菌数（包括黏附在细胞的细菌和游离未粘附的细菌）的比值，同样总菌数不变的情况下，粘附在细胞上的细菌越多，粘附率越高，细菌在肠上皮细胞的黏附能力越强。
实验例6、鼠李糖乳杆菌WKA55改善酒精引起的肝损伤的小鼠实验
1. 鼠李糖乳杆菌WKA55菌液用0.85%生理盐水重悬为2x109CFU/mL，灌胃小鼠时使用。
2. 酒精肝损伤小鼠模型建立：选40只C57BL/6 雄性小鼠，体重18-20g，同室分笼饲养。动物饲养室温度 23±2℃，湿度 50%±10%，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下适应饲养3~5天后随机分组。随机分4组，每组10 只，分别为空白组、酒精组、WKA55干预组、LGG干预组。空白组每天2次灌胃生理盐水，酒精组每天2次灌胃42%酒精，益生菌干预组每天除灌胃2次酒精外，再加两次益生菌灌胃，实验持续4周，每天记录小鼠的进食量，每周记录小鼠的体重并收集粪便。
3. 样品采集：血液样本：取小鼠眼球血于4℃静置2h后离心取上清放置-80℃保存。组织样本：解剖初死后的小鼠摘取肝脏组织，称重记录。剖分的肝脏组织置于2ml无菌EP管中放-80℃保存。
结果如图5所示，经过益生菌的干预小鼠的肝指数显著低于酒精组的肝指数，而肝指数显示了肝脏的健康状态，酒精的摄入破坏了肝脏的组织结构，造成肝脏肿大，而益生菌的干预降低了肝指数值，改善了肝脏的肿胀状态。
当肝脏受损时，细胞内转氨酶进入血液，引起血液中谷草转氨酶AST和谷丙转氨酶ALT的升高，因此ALT和AST的活性是酒精导致肝损伤的标志，而从图6中可以看出酒精灌胃后小鼠血液中ALT和AST明显增高，而益生菌干预显著降低了ALT和AST指标，表明鼠李糖乳杆菌WKA55对酒精引起的肝损伤具有保护作用。
同时，酒精过量摄入时，引起体内脂肪代谢障碍，导致脂肪在肝细胞堆积形成脂肪肝。通常情况下，甘油三酯TG和总胆固醇T-CHO的含量反应了肝脏损伤的程度。从图7可以看出，鼠李糖乳杆菌WKA55的干预显著降低了酒精对肝脏中TG和T-CHO指标，说明鼠李糖乳杆菌WKA55具有降脂护肝的作用。
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品
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<223> 鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）菌株WKA55的16S
rDNA序列
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gcttgcatct tgatttaatt ttgaacgagt ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc 60
tgcccttaag tgggggataa catttggaaa cagatgctaa taccgcataa atccaagaac 120
cgcatggttc ttggctgaaa gatggcgtaa gctatcgctt ttggatggac ccgcggcgta 180
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Claims (10)
1.一株鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）菌株WKA55，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO: M 2022191。
2.保藏编号为CCTCC NO: M 2022191的鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）菌株WKA55在制备防治酒精性肝损伤制品和/或制备抗氧化制品和/或制备改善肠道屏障功能制品方面的用途。
3.根据权利要求2所述的保藏编号为CCTCC NO: M 2022191的鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）菌株WKA55在制备防治酒精性肝损伤制品和/或制备抗氧化制品和/或制备改善肠道屏障功能制品方面的用途，其特征在于，所述防治酒精性肝损伤包括：改善肝脏的肿胀状态，抑制肝功能损伤，改善体内脂肪代谢障碍；
和/或，所述抗氧化指：清除羟基自由基和/或DPPH；
和/或，所述改善肠道屏障功能指：提高HT-29细胞黏附能力、或在肠上皮细胞中良好定植。
4.根据权利要求3所述的保藏编号为CCTCC NO: M 2022191的鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）菌株WKA55在制备防治酒精性肝损伤制品和/或制备抗氧化制品和/或制备改善肠道屏障功能制品方面的用途，其特征在于，所述抑制肝功能损伤指：降低ALT和AST水平；
和/或，所述改善肝脏的肿胀状态指：降低肝指数值；
和/或，所述改善体内脂肪代谢障碍指：降低肝脏中甘油三酯TG和总胆固醇T-CHO含量。
5.一种防治酒精性肝损伤的制品，其特征在于，包括活性成分；所述活性成分包括保藏编号为CCTCC NO: M 2022191的鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）菌株WKA55。
6.根据权利要求5所述的一种防治酒精性肝损伤的制品，其特征在于，还包括：辅料；
和/或，所述辅料选自药用辅料或食用辅料；
和/或，所述制品选自保健食品或药品；
所述药品的剂型选自：粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
7.一种抗氧化制品，其特征在于，包括活性成分；所述活性成分包括保藏编号为CCTCCNO: M 2022191的鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）菌株WKA55。
8.根据权利要求7所述的一种抗氧化制品，其特征在于，还包括：辅料；
和/或，所述辅料选自药用辅料或食用辅料；
和/或，所述制品选自保健食品或药品；
和/或，所述食品为保健食品。
9.一种改善肠道屏障功能制品，其特征在于，包括活性成分；所述活性成分包括保藏编号为CCTCC NO: M 2022191的鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）菌株WKA55。
10.根据权利要求9所述的一种改善肠道屏障功能制品，其特征在于，还包括：辅料；
和/或，所述辅料选自药用辅料或食用辅料；
和/或，所述制品选自保健食品或药品。
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