CN117070426A - 一种改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂及其应用，所述改善酒精性脂肪肝的益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC No.1.12734的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株和保藏编号为CGMCC No.23547的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp05菌株。本发明开发了一种全新的益生菌复配方式，将LRa05菌株和Lp05菌株进行复配，发现两者能够相互配合、相互促进，在改善酒精性脂肪肝病变的效果上协同增效。
Description
技术领域
本发明属于益生菌剂技术领域，涉及一种改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂及其应用，尤其涉及一种改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂及其在制备预防、缓解或治疗酒精性脂肪肝、慢性肝损伤、肝纤维化、肝硬化或肝癌的药物中的应用。
背景技术
酒精性脂肪肝（Alcoholic fatty liver disease，ALD）可导致慢性肝损伤，并增加ALD患者进展为肝纤维化、肝硬化和肝癌的风险。肠道是营养吸收的主要器官，含有约1014种微生物，肠道菌群在正常生理条件下是平衡的。超过90%的酒精被肠道吸收，并在肝脏代谢，过量饮酒会破坏肠道菌群的平衡，影响肠道的通透性，增加血液脂多糖的浓度。因此，ALD的发病机制与肠-肝轴失衡和肠源性内毒素血症有关。酒精及其代谢物乙醛能够破坏肠紧密连接，肠-肝轴的不平衡导致了炎症反应的产生。另外，肠道来源的脂多糖可以促进炎症反应，并最终引起肝损伤。
乳酸菌是益生菌的一种，是人体内的必需菌群之一，广泛存在于人体肠道中。乳酸菌的黏附性有利于维持肠道菌群结构，并更好地保护肠粘膜形态和代谢功能的完整性。乳酸菌在肠道菌群失调的预防和治疗中发挥的良好作用主要通过空间位阻作用实现。同时，益生乳酸菌在肠道中可产生较多的抑菌成分，如酸性物质、抗菌肽和生物酶等，因此可抑制病原菌活性。由于乳酸菌具有安全健康、无副作用、作为益生菌可在动物体内定植并发挥多种有益健康等优势，乳酸菌微生态制剂作为临床补充剂已被广泛应用。
目前没有特定的针对ALD的药物，治疗手段与其他类型的肝病类似。根据ALD的发病机制和临床途径，治疗ALD可选择抗炎细胞因子、抗氧化剂和改变肠道菌群。广泛应用的ALD治疗方案包括戒酒、抗TNF药物等生物制剂等一系列治疗，但这些治疗手段并不总能满足实际需求。因此开发更多的益生菌产品，用以改善酒精性脂肪肝是非常重要的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂及其应用，尤其提供一种改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂及其在制备预防、缓解或治疗酒精性脂肪肝、慢性肝损伤、肝纤维化、肝硬化或肝癌的药物中的应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂，所述改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC No.1.12734的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株和保藏编号为CGMCC No.23547的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp05菌株。
本发明创造性地开发了保藏编号为CGMCC No.1.12734的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株的药用新用途，其能够显著缓解酒精性脂肪肝和显著改善酒精性脂肪肝病变，还创造性地开发了一种全新的益生菌复配方式，将鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株和植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp05菌株进行复配，发现两者能够相互配合、相互促进，在改善酒精性脂肪肝病变的效果上协同增效，在使用菌量一致的情况下，与单一的LRa05菌株或单一的Lp05菌株相比，两种菌的复配在改善酒精性脂肪肝病变的功效上显著提高，具体表现在：（1）显著降低酒精性脂肪肝小鼠AST和ALT水平；（2）显著降低ALD小鼠肝脏和血清中TG（甘油三酯）含量；（3）显著提升ALD小鼠SOD（超氧化物歧化酶）水平，降低MDA（丙二醛）水平；（4）降低酒精性脂肪肝小鼠血清促炎细胞炎症因子：TNFɑ、IL1b和IL6水平；（5）显著降低ALD小鼠血清LPS含量，显著增加结肠中紧密连接蛋白Occludin、紧密连接蛋白ZO-1和紧密连接蛋白Claudin-1水平。
因此，该益生菌剂为治疗酒精性脂肪肝提供了新的策略，将其用于制备用于预防、缓解或治疗酒精性脂肪肝的产品具有很好的前景。另外，鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌均是益生菌，其在用于制备预防、缓解或治疗酒精性脂肪肝的相关产品时，安全性高，且不易产生抗性。
优选地，所述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株与植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp05菌株的活菌数之比为(1-10):1，例如1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
基于LRa05菌株和Lp05菌株的潜在相互作用关系，本发明还发现当两种菌株以上述特定的活菌数配比进行复合时，其在改善酒精性脂肪肝病变方面的效果更加显著。
优选地，所述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株在益生菌剂中的活菌含量不低于1×109 CFU/g或1×109 CFU/mL，例如5×109 CFU/g、1×1010 CFU/g、5×1010 CFU/g、1×1011 CFU/g、5×1011 CFU/g、1×1012 CFU/g、5×1012 CFU/g、1×1013 CFU/g等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
本发明所涉及的益生菌剂的剂型不受限制，包括最常用的冻干粉剂，或进一步制得的胶囊剂、片剂或颗粒剂。其中冻干粉剂示例性地可以采用如下方法制得：
将LRa05菌株或Lp05菌株活化后，分别接种于培养基中进行培养，得到培养液；培养液离心，得到菌体；菌体用冻干保护剂重悬，得到重悬液；重悬液冻干，按配比混合，即得。
优选地，所述培养基包括MRS培养基。
优选地，所述MRS培养基以浓度计包括：蛋白胨8-12 g/L、牛肉膏8-12 g/L、葡萄糖15-25 g/L、乳糖10-20 g/L、酵母粉3-7 g/L、柠檬酸氢二铵1-3 g/L、K2PO4·3H2O 2-3 g/L、MgSO4·7H2O 0.05-0.2 g/L、MnSO4 0.01-0.1 g/L、吐温80 0.5-2 mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.1-1 g/L。
优选地，所述冻干采用真空冷冻法。
优选地，所述改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂中还包括保护剂。
优选地，所述保护剂包括脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂中还包括功能助剂。
优选地，所述功能助剂包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供根据第一方面所述的改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂在制备预防、缓解或治疗酒精性脂肪肝的药物中的应用。
第三方面，本发明提供根据第一方面所述的改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂在制备预防、缓解或治疗慢性肝损伤、肝纤维化、肝硬化或肝癌的药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明创造性地开发了鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株的药用新用途，其能够显著缓解酒精性脂肪肝和显著改善酒精性脂肪肝病变，还开发了一种全新的益生菌复配方式，将鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株和植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp05菌株进行复配，发现两者能够相互配合、相互促进，在改善酒精性脂肪肝病变的效果上协同增效，在使用菌量一致的情况下，与单一的LRa05菌株或单一的Lp05菌株相比，两种菌的复配在改善酒精性脂肪肝病变的功效上显著提高。
附图说明
图1是各组小鼠血清谷草转氨酶（AST）水平的统计结果图；
图2是各组小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）水平的统计结果图；
图3是各组小鼠肝脏中甘油三酯（TG）含量的统计结果图；
图4是各组小鼠血清中甘油三酯（TG）含量的统计结果图；
图5是各组小鼠结肠组织中超氧化物歧化酶（SOD）水平的统计结果图；
图6是各组小鼠结肠组织中丙二醛（MDA）水平的统计结果图；
图7是各组小鼠结肠组织中肿瘤坏死因子α（TNFα）水平的统计结果图；
图8是各组小鼠结肠组织中白介素1b（IL1b）水平的统计结果图；
图9是各组小鼠结肠组织中白介素6（IL6）水平的统计结果图；
图10是各组小鼠血清中脂多糖（LPS）水平的统计结果图；
图11是各组小鼠结肠组织中紧密连接蛋白Occludin水平的统计结果图；
图12是各组小鼠结肠组织中紧密连接蛋白ZO1水平的统计结果图；
图13是各组小鼠结肠组织中紧密连接蛋白Claudin水平的统计结果图；
图1-13中数据使用R语言（R 4.2.2）进行统计分析，使用ggplot2包进行作图，其中，柱状图上有不同字母的表示组间有显著差异（p<0.05）。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中涉及的蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乳糖、酵母粉、柠檬酸氢二铵、K2PO4·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4、吐温80和半胱氨酸盐酸盐购自国药集团化学试剂有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS培养基（g/L）：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖15g/L、乳糖15g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
下述实施例所涉及的鼠李糖乳杆菌命名为LRa05菌株，其分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年7月20日，保藏编号为CGMCC No.1.12734，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述实施例所涉及的鼠李糖乳杆菌命名为LRa01菌株，其分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年1月10日，保藏编号为CGMCC No.24281，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述实施例所涉及的植物乳杆菌命名为Lp05菌株，其分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年10月9日，保藏编号为CGMCC No.23547，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述实施例所涉及的植物乳杆菌命名为Lp90菌株，其分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2015年01月27日，保藏编号为CGMCC No.10453，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述实施例中涉及的菌悬液：将所需菌株接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2%（v/v）的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24h，得到菌液；将菌液在6000g下离心10min，使用PBS重悬菌体，即得。
试验动物为SPF级雄性C57BL/6小鼠，小鼠饲料购自上海斯莱克公司；测定TNFα、IL1b、IL6水平用购自上海酶联生物科技有限公司的ELISA试剂盒；测定超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平用购自南京建成生物工程公司的检测试剂盒；测定血清谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）和甘油三酯（TG）浓度采用全自动血液生化测定仪测量。
实施例
本实施例探究鼠李糖乳杆菌LRa05菌株和/或植物乳杆菌Lp05菌株对酒精性脂肪肝小鼠血清AST和ALT、血清和肝脏甘油三酯、氧化应激标志物含量、血清促炎细胞因子和肠道通透性的影响：
（1）动物分组：
将70只8周龄成年雄性C57BL/6小鼠(22±2 g)随机分为7组，每组10只，分别为正常对照组（CTL组），酒精性脂肪肝模型组（ALD组），鼠李糖乳酪杆菌LRa05干预组（LRa05组），植物乳植杆菌Lp05干预组（Lp05组），鼠李糖乳酪杆菌LRa05和植物乳植杆菌Lp05联合干预组（LRa05+Lp05组），鼠李糖乳酪杆菌LRa01和植物乳植杆菌Lp05联合干预组（LRa01+Lp05组），鼠李糖乳酪杆菌LRa05和植物乳植杆菌Lp90联合干预组（LRa05+Lp90组）。所有小鼠均无特定病原体。将小鼠单独饲养于笼内，环境清洁安静，温度23-25℃，湿度50-70%。各组小鼠在实验期间自由获得食物和水。
（2）建立酒精性脂肪肝小鼠模型及干预方法：
C57BL/6小鼠先进行7天的液体饲料适应性喂养。然后，CTL组喂食Lieber-DeCarli液体饮食，ALD组、LRa05组、Lp05组、LRa05+Lp05组、LRa01+Lp05组、LRa05+Lp90组喂食含有4% (w/v)乙醇的Lieber-DeCarli液体饲料。此外，LRa05组以1×109CFU/只给予LRa05菌悬液灌胃，Lp05组以1×109CFU/只给予Lp05菌悬液灌胃，LRa05+Lp05组给予LRa05菌悬液和Lp05菌悬液各5×108CFU/只灌胃，LRa01+Lp05组给予LRa01菌悬液和Lp05菌悬液各5×108CFU/只灌胃，LRa05+Lp90组给予LRa05菌悬液和Lp90菌悬液各5×108CFU/只灌胃，ALD组和CTL组给予蒸馏水（10mL/kg）灌胃。蒸馏水和益生菌菌悬液每天口服一次，连续6周。
（3）检测样本采集：
实验结束时，所有小鼠用10%腹膜内注射水合氯醛(2mL/kg)麻醉并脱颈，采集血样、肝脏和结肠组织，其中肝脏和结肠组织做如下预处理：肝脏或结肠加入生理盐水中，然后匀浆，得到10%肝脏或结肠匀浆。将匀浆离心10 min（5,000 g，4℃）以获得上清液。
（4）对酒精性脂肪肝小鼠血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶的影响：
使用全自动血液生化测定仪测量小鼠血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶的浓度，结果分别如图1和图2所示，由图可知，与CTL组相比，ALD组小鼠血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平显著升高，说明酒精暴露显著增加小鼠肝脏损伤，与ALD组相比，LRa05干预后，小鼠血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平显著降低。另外，LRa05+Lp05联合干预组的效果显著高于单菌株。
（5）对酒精性脂肪肝小鼠血清甘油三酯和肝脏组织甘油三酯的影响：
测量小鼠血清甘油三酯和肝脏组织甘油三酯的浓度，结果分别如图3和图4所示，由图可知，与CTL组相比，ALD组小鼠肝脏和血清甘油三酯显著升高，与ALD组相比，LRa05干预后，小鼠肝脏和血清甘油三酯水平显著降低。另外，LRa05+Lp05联合干预组的效果显著高于单菌株。
（6）氧化应激标志物的检测：
通过南京建成生物工程公司的检测试剂盒测定各组小鼠结肠匀浆上清液的超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平，结果分别如图5和图6所示，由图可知，与CTL组相比，ALD组显著降低了酒精性脂肪肝小鼠的超氧化物歧化酶水平，提高了丙二醛水平。酒精性脂肪肝小鼠给予鼠李糖乳酪杆菌LRa05干预后，超氧化物歧化酶水平明显升高，丙二醛水平明显降低。另外，LRa05+Lp05联合干预组的效果显著优于单菌株。
（7）血清促炎细胞因子的影响：
采用ELISA试剂盒（武汉纯度生物技术有限公司）按照试剂盒说明书检测各组小鼠血清中炎症介质的水平，结果分别如图7、图8、图9所示，由图可知，与CTL组相比，ALD组小鼠血清肿瘤坏死因子α、白介素1b和白介素6水平明显升高，差异有统计学意义。与ALD组比较，鼠李糖乳酪杆菌LRa05干预组小鼠血清肿瘤坏死因子α、白介素1b和白介素6水平降低，差异具有统计学意义。另外，LRa05+Lp05联合干预组的效果显著优于单菌株。
通常，炎性细胞因子在肠黏膜屏障损伤过程中起作用，炎症反应使细胞间通透性增加，从而破坏肠黏膜屏障，加重肠道炎症。给予鼠李糖乳酪杆菌LRa05和/或Lp05干预后，可以降低促炎细胞因子血清肿瘤坏死因子α、白介素1b和白介素6的生成。这表明鼠李糖乳酪杆菌LRa05和Lp05可以抑制炎症，从而起到治疗酒精性脂肪肝的作用。
（8）对肠道通透性的影响：
为了研究肠屏障完整性，采用ELISA法测定了各组小鼠血清脂多糖（LPS）水平，结果如图10所示，由图可知，与CTL组小鼠相比，酒精暴露显著增加血清脂多糖水平，而LRa05组和LRa05+Lp05组小鼠血清脂多糖水平较ALD组显著降低，表明LRa05或与Lp05的联用可以防止酒精诱导的肠道通透性增加。
另外，采用ELISA法检测各组小鼠结肠中紧密连接蛋白claudin，紧密连接蛋白occulin和紧密连接蛋白ZO1的水平，结果分别如图11、图12、图13所示，由图可知，与CTL组小鼠相比，ALD组小鼠结肠中紧密连接蛋白claudin，紧密连接蛋白occulin和紧密连接蛋白ZO1的显著降低，LRa05组和LRa05+Lp05组小鼠的紧密连接蛋白claudin，紧密连接蛋白occulin和紧密连接蛋白ZO1表达明显高于ALD组，提示LRa05或与Lp05的联用增加了肠道紧密连接蛋白的表达，这些数据表明LRa05或与Lp05的联用通过增强紧密连接蛋白的表达来改善肠屏障功能。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂，其特征在于，所述改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC No.1.12734的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株和保藏编号为CGMCC No.23547的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp05菌株。
2.根据权利要求1所述的改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株与植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp05菌株的活菌数之比为(1-10):1。
3.根据权利要求1所述的改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株在益生菌剂中的活菌含量不低于1×109 CFU/g或1×109 CFU/mL。
4.根据权利要求1所述的改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
5.根据权利要求1所述的改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂，其特征在于，所述改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂中还包括保护剂。
6.根据权利要求5所述的改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂，其特征在于，所述保护剂包括脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。
7.根据权利要求1所述的改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂，其特征在于，所述改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂中还包括功能助剂。
8.根据权利要求7所述的改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂，其特征在于，所述功能助剂包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂在制备预防、缓解或治疗酒精性脂肪肝的药物中的应用。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的改善酒精性脂肪肝病变的益生菌剂在制备预防、缓解或治疗慢性肝损伤、肝纤维化、肝硬化或肝癌的药物中的应用。
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