CN117778275A

CN117778275A - 一种改善少弱精症的益生菌剂及其应用

Info

Publication number: CN117778275A
Application number: CN202410200292.7A
Authority: CN
Inventors: 方曙光; 董瑶; 邵雅纹; 闫明
Original assignee: WeCare Probiotics Co Ltd
Current assignee: WeCare Probiotics Co Ltd
Priority date: 2024-02-23
Filing date: 2024-02-23
Publication date: 2024-03-29

Abstract

本发明涉及一种改善少弱精症的益生菌剂及其应用，所述改善少弱精症的益生菌剂中的菌株包括长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株和鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa66菌株。两种菌株存在潜在的相互作用，能够相互配合，在改善精液数量和质量、促进睾丸生殖细胞生长与分化、减少精子的氧化应激反应的功效上协同增效，因此，该益生菌剂为改善少弱精症提供了新的策略。

Description

一种改善少弱精症的益生菌剂及其应用

技术领域

本发明属于益生菌技术领域，涉及一种改善少弱精症的益生菌剂及其应用。

背景技术

在全球范围内，不孕不育的发生率呈现逐年上升的趋势，其中少弱精子症是男性不育的主要原因之一。随着空气质量恶化、生活节奏加快以及压力增大，男性患少弱精子症的比例也在不断上升。男性不育症已成为一个全球性的生殖健康问题。少精子症和弱精子症的主要特征是精子数量和活动精子浓度的减少。然而，少弱精子症的确切发病机制尚未完全明确，治疗方法也相对有限。目前，少弱精子症的常规治疗方法包括手术疗法以及抗氧化剂和激素类药物的应用。但这些治疗手段存在一定的局限性和风险。例如，手术治疗可能带来感染和出血的风险，且成功率有限，需要一段时间的恢复。抗氧化剂虽然有助于改善精子质量，但其效果因人而异，过量使用可能导致副作用。激素治疗可能引起激素失衡和其他副作用，长期使用还可能对身体健康产生不利影响。

近年来，关于肠道菌群调节对繁殖能力的影响方面的研究取得了显著进展。研究表明，肠道菌群能显著改善小鼠的精子质量和精子生成，直接证实了肠道菌群与繁殖健康之间的密切联系。此外，研究发现补充益生菌能够改变肠道菌群的组成和功能，改善线粒体功能和氧化应激能力、肠道通透性和全身炎症状态，从而提高精子活力和精液的利用率。这些发现为改善男性少弱精症提供了新的见解和治疗靶点，为进一步研究肠道微生物群对男性生殖健康的影响奠定了基础。因此，开发益生菌补充剂，通过改善肠道菌群结构、调节性激素、提升机体的氧化防御能力，从而改善少弱精症，成为一种具有广阔市场应用前景的健康治疗方案。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种改善少弱精症的益生菌剂及其应用，具体提供一种改善少弱精症的益生菌剂及其在制备预防、缓解或治疗少精症或弱精症的药物中的应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种改善少弱精症的益生菌剂，所述改善少弱精症的益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC No.10452的长双歧杆菌Bifidobacterium longumBL21菌株和保藏编号为CGMCC No.24282的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa66菌株。

本发明开发了一种全新的益生菌复配方式，将长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株和鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa66菌株进行复配，发现两者存在潜在的相互作用，能够相互配合，在改善精液数量和质量、促进睾丸生殖细胞生长与分化、减少精子的氧化应激反应的功效上协同增效，在使用菌量一致的情况下，与单一的BL21菌株或单一的LRa66菌株相比，两种菌的复配在上述功效的发挥显著提高。因此，该益生菌剂为改善少弱精症提供了新的策略。由于长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株和鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa66菌株均为益生菌，因此其在用于制备相关功效产品时，安全性高，且不易产生抗性。

优选地，所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株与鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa66菌株的活菌数之比为1:10-10:1，例如1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、71、8:1、9:1、10:1等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

基于BL21菌株与LRa66菌株的潜在相互作用关系，本发明还发现当两种菌株以上述特定的活菌数配比进行复合时，其在改善精液数量和质量、促进睾丸生殖细胞生长与分化、减少精子的氧化应激反应的功效上更加显著。

优选地，在所述益生菌剂中，活菌总数不低于1×10⁶ CFU/mL或1×10⁶ CFU/g，例如1×10⁶CFU/mL（CFU/g）、5×10⁶CFU/mL（CFU/g）、1×10⁷CFU/mL（CFU/g）、5×10⁷CFU/mL（CFU/g）、1×10⁸CFU/mL（CFU/g）、1×10⁹CFU/mL（CFU/g）、1×10¹⁰CFU/mL（CFU/g）等；该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。

本发明所涉及的益生菌剂的剂型不受限制，包括最常用的冻干粉剂，或进一步制得的胶囊剂、片剂或颗粒剂。其中冻干粉剂示例性地可以采用如下方法制得：

将BL21菌株与LRa66菌株分别接种于培养基中进行培养，得到培养液；培养液离心，得到菌体；菌体用冻干保护剂重悬，得到重悬液；重悬液冻干，即得，然后按比例将二者复配。

优选地，所述培养基包括MRS培养基。

优选地，所述MRS培养基以浓度计包括：蛋白胨8-12 g/L、牛肉膏8-12 g/L、葡萄糖15-25 g/L、乙酸钠1-3 g/L、酵母粉3-7 g/L、柠檬酸氢二铵1-3 g/L、K₂PO₄·3H₂O 2-3 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.05-0.2 g/L、MnSO₄ 0.01-0.1 g/L、吐温80 0.5-2 mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.1-1 g/L。

优选地，所述冻干采用真空冷冻法。

优选地，所述益生菌剂还包括冻干保护剂和/或辅助添加剂。

优选地，所述冻干保护剂包括脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述辅助添加剂包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。

第二方面，本发明提供根据第一方面所述的改善少弱精症的益生菌剂在制备预防、缓解或治疗少精症或弱精症的药物中的应用。

优选地，所述药物中还包括辅料。

优选地，所述辅料包括赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

附图说明

图1是各组小鼠的精子总活力的统计结果图；

图2是各组小鼠的精子密度的统计结果图；

图3是各组小鼠的精子直线速度的统计结果图；

图4是各组小鼠的精子尾部跳动交叉频率的统计结果图；

图5是各组小鼠的精子运动的直线率的统计结果图；

图6是各组小鼠的精子运动的线性比例的统计结果图；

图7是各组小鼠的血清睾酮水平的统计结果图；

图8是各组小鼠的促卵泡生成素水平的统计结果图；

图9是各组小鼠的促黄体生成素水平的统计结果图；

图10是各组小鼠的睾丸组织中丙二醛水平的统计结果图；

图11是各组小鼠的睾丸组织中超氧化物歧化酶水平的统计结果图；

图12是各组小鼠的睾丸组织中谷胱甘肽水平的统计结果图。

本发明所涉及的长双歧杆菌BL21菌株的分类命名为长双歧杆菌Bifidobacterium longum，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2015年01月27日，保藏编号为CGMCC No. 10452，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明所涉及的鼠李糖乳杆菌LRa66菌株的分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年01月10日，保藏编号为CGMCC No. 24282，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述内容中涉及的蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乙酸钠、酵母粉、柠檬酸氢二铵、K₂PO₄·3H₂O、MgSO₄·7H₂O、MnSO₄、吐温80和半胱氨酸盐酸盐购自国药集团化学试剂有限公司；SPF级雄性6周龄C57BL/6J小鼠和6周龄SD大鼠、高脂及普通饲料购自上海斯莱克公司。

下述实施例中涉及的培养基配方如下：

MRS培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K₂PO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄ 0.05g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。

下述实施例所涉及的长双歧杆菌BL21菌株的分类命名为长双歧杆菌Bifidobacterium longum，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2015年01月27日，保藏编号为CGMCC No. 10452，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

下述实施例所涉及的鼠李糖乳杆菌LRa66菌株的分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年01月10日，保藏编号为CGMCC No. 24282，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

下述涉及的菌悬液制备方法：将所需菌株接种于MRS液体培养基中，37℃下培养18h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2%（v/v）的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24 h，得到菌液；将菌液在4℃下5000rpm下离心10 min，过滤，得到菌体，使用PBS溶液重悬菌体，即得。

试验结果数据使用R语言的ggplot2进行统计分析，与MC组相比，***代表p<0.001，**代表p<0.01，*代表p<0.05，NS代表无显著差异。与CTL组相比，###代表p<0.001。

实施例

本实施例验证益生菌剂改善少弱精症的能力：

（1）试验动物：6周龄的SPF级C57BL/6J小鼠，平均体重20 g，将小鼠饲养于笼内，环境清洁安静，温度23-25℃，湿度60%。所有涉及小鼠的程序均符合上海市实验动物护理与相关动物实验中心提供的指导原则（许可证号2023082201）。

（2）动物分组：按上述小鼠适应性喂养1周后，将42只小鼠随机分为7组（每组6只）：正常对照组（CTL）、模型组（MC组）、经BL21菌株干预的小鼠组（BL21）、经LRa66菌株干预的小鼠组（LRa66）、经市售菌株ATCC53103干预的小鼠组（ATCC53103）、经BL21菌株和LRa66菌株联合干预的小鼠组（BL21+ LRa66，两株菌的活菌数比例2:1，记为P1组）、经BL21菌株和市售菌株ATCC53103联合干预的小鼠组（BL21+ ATCC53103，两株菌的活菌数比例2:1，记为P2组）。

（3）动物建模及干预方法：造模方法参照文献（DOI：10.1007/s12011-023-03815-9）中公开的方法进行，使用雷公藤多甙（TG）诱导小鼠少弱精症，各组小鼠饲喂情况如下：

CTL组：正常饲喂+无菌水灌胃，连续5周；

MC组：使用40mg/kg/天的TG溶于无菌水后口服灌胃，连续4周，第5周无菌水灌胃；

BL21组：使用40mg/kg/天的TG溶于无菌水后口服灌胃+BL21菌液1×10⁹CFU/天，连续4周，第5周等体积灌胃BL21菌液1×10⁹CFU/天；

LRa66组：使用40mg/kg/天的TG溶于无菌水后口服灌胃+ LRa66菌液1×10⁹CFU/天，连续4周，第5周等体积灌胃LRa66菌液1×10⁹CFU/天；

ATCC53103组：使用40mg/kg/天的TG溶于无菌水后口服灌胃+ ATCC53103菌液1×10⁹CFU/天，连续4周，第5周等体积灌胃ATCC53103菌液1×10⁹CFU/天；

P1组：使用40mg/kg/天的TG溶于无菌水后口服灌胃+ P1复合菌液总菌量1×10⁹CFU/天，连续4周，第5周等体积灌胃P1复合菌液总菌量1×10⁹CFU/天；

P2组：使用40mg/kg/天的TG溶于无菌水后口服灌胃+ P2复合菌液总菌量1×10⁹CFU/天，连续4周，第5周等体积灌胃P2复合菌液总菌量1×10⁹CFU/天。

（4）指标分析：

（4.1）小鼠精子质量检测：腹腔注射0.3%戊巴比妥钠麻醉小鼠，麻醉后立即取出左侧附睾尾部，从小鼠附睾尾部获取精液样本，并将其转移到含有M2培养基（Sigma，M7167）的容器中。样本随后在37℃水浴孵育15 min，以释放精子。随后将样本过滤并用额外的0.5 mL生理盐水稀释，取20 μL稀释液滴于载玻片上，使用精液分析仪（TOXIVOS II）对样本进行分析，以评估精子的数量、活力、运动性、形态和密度。对于精子计数（密度），取过滤并稀释后的精子悬液0.5 mL置于10 mL EP管中，加入0.5 mL 0.5% NaHCO₃固定液，吹打均匀后，取20μL稀释液滴于血球计数板上进行计数。

各组的精子总活力（%）、精子密度（10⁶ mL）、精子直线速度（μm/s）、精子尾部跳动交叉频率（Hz）、精子运动的直线率（%）、精子运动的线性比例（%）的统计结果分别如图1、图2、图3、图4、图5、图6所示。由图可知，与CTL组比较，MC组小鼠精子总活力和数目明显下降，直线运动速度、精子尾部跳动交叉频率（反映精子尾部摆动的频率）、运动的直线率（关注精子从起点到终点的整体直线性）、精子运动的线性比例（衡量精子运动路径的曲折程度）均显著降低；与MC组比较，益生菌干预后能够改善小鼠精子质量和数量下降的情况，其中BL21干预组效果显著，差异具有统计学意义，其中BL21和LRa66复合组对提升精子动力学参数的效果更为显著。

（4.2）血清性激素水平检测：采用酶联免疫吸附测定（ELISA）技术，利用江苏酶免实业有限公司所提供的科研试剂盒，检测各组小鼠的血清睾酮（T）、促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）的水平。

统计结果分别如图7、图8和图9所示，由图可知，与CTL组比较，MC小鼠出现内分泌紊乱，其血清睾酮（T）水平显著降低，促卵泡生成素（FSH）和促黄体生成素（LH）水平显著升高。与MC小鼠相比，益生菌BL21治疗后显著增加了小鼠的血清睾酮水平，显著降低了促卵泡生成素和促黄体生成素水平，另外，BL21和LRa66复合组效果更为明显。

（4.3）小鼠睾丸氧化应激水平检测：取小鼠睾丸组织，在匀浆后当天进行检测，避免反复冻融降低酶活性。具体地，取适量生理盐水（浓度0.9%，温度约4℃），放入小鼠的睾丸组织，在冰水浴条件下制成10%的组织匀浆，将匀浆放置离心机，以3000r/min的转速离心10min，小心取上清液于试管内即得。利用江苏酶免实业有限公司所提供的科研试剂盒，按照说明书所示步骤检测睾丸组织中的丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）指标。

统计结果分别如图10、图11和图12所示，由图可知，与CTL组相比，MC组小鼠睾丸组织中丙二醛的表达水平显著升高，而超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的表达水平显著降低。与MC组小鼠相比，益生菌BL21干预后，小鼠睾丸中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽表达水平升高，丙二醛表达水平降低。结果表明，BL21可以调节少弱精症小鼠睾丸中抗氧化分子的表达水平，从而减少精子的氧化应激反应以提高精子密度。另外，我们发现复合益生菌组BL21+LRa66组的效果更为显著。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims

1.一种改善少弱精症的益生菌剂，其特征在于，所述改善少弱精症的益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC No.10452的长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株和保藏编号为CGMCC No.24282的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa66菌株；

所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株与鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa66菌株的活菌数之比为1:10-10:1。

2.根据权利要求1所述的改善少弱精症的益生菌剂，其特征在于，在所述益生菌剂中，活菌总数不低于1×10⁶ CFU/mL或1×10⁶ CFU/g。

3.根据权利要求1所述的改善少弱精症的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。

4.根据权利要求1所述的改善少弱精症的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂还包括冻干保护剂和/或辅助添加剂。

5.根据权利要求4所述的改善少弱精症的益生菌剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。

6.根据权利要求4所述的改善少弱精症的益生菌剂，其特征在于，所述辅助添加剂包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的改善少弱精症的益生菌剂在制备预防、缓解或治疗少精症或弱精症的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物中还包括辅料。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述辅料包括赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。