CN115232774B - 一种医用细胞CMU-pb-7及其在制备抗氧化药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种医用细胞CMU‑pb‑7及其在制备抗氧化药物中的应用，属于生物技术领域。本发明公开的一种医用细胞CMU‑pb‑7为一株新分离筛选出的鼠李糖乳杆菌，保藏编号为CCTCCNO：M2022220。本发明的医用细胞CMU‑pb‑7在高脂小鼠体内可增强肝脏组织的抗氧化能力，降低氧化应激水平，缓解肝脏脂肪病变，以及可调节肠道内的氧化应激水平，缓解回肠的氧化损伤。本发明公开的医用细胞CMU‑pb‑7在抗氧化药物制备方面有较大的潜在应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种医用细胞CMU-pb-7及其在制备抗氧化药物中的应用。
背景技术
人类的饮食结构直接与健康相关，合理健康的饮食能形成稳定的肠道微生态，能够增强机体免疫功能，加强体内代谢产物和氧自由基的清除。长期的高脂饮食会导致肠道微生态紊乱，影响机体的正常代谢，使细胞代谢产生过多的活性氧自由基，诱发氧化应激反应，减弱机体的抗氧化功能，进而引起各种代谢性相关疾病。
医用细胞主要包括功能性益生菌、免疫细胞、间充质干细胞等。益生菌(Probiotics)是当前医用细胞研究的热点，益生菌是一类对人体健康有益的活性微生物，当摄入足够数量后能在宿主肠道中定植，调节肠道微生态平衡，促进生理代谢，发挥益生作用。目前，医用细胞型的益生菌主要包括乳杆菌属、双歧杆菌属、酵母属等。乳杆菌属的益生菌在临床应用中越来越广泛，鼠李糖乳杆菌是常见乳杆菌之一，具有调节肠道菌群、提高机体免疫力等功能。
因此，提供一种医用细胞CMU-pb-7及其在制备抗氧化药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种医用细胞CMU-pb-7及其在制备抗氧化药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种医用细胞CMU-pb-7，即鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CMU-pb-7，其保藏编号为CCTCC NO：M 2022220，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2022年03月09日，分类命名为鼠李糖乳杆菌CMU-pb-7Lactobacillus rhamnosus CMU-pb-7。
进一步，所述的医用细胞CMU-pb-7在制备抗氧化药物中的应用。
本发明的医用细胞CMU-pb-7在高脂小鼠体内可增强肝脏组织的抗氧化能力，降低氧化应激水平，缓解肝脏脂肪病变，以及可调节肠道内的氧化应激水平，缓解回肠的氧化损伤。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种医用细胞CMU-pb-7及其在制备抗氧化药物中的应用，医用细胞CMU-pb-7是一株来源于本实验室前期从健康人粪便中分离的鼠李糖乳杆菌；CMU-pb-7能够制备成抗氧化的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明医用细胞CMU-pb-7在MRS琼脂平板上的菌落形态；
图2附图为本发明医用细胞CMU-pb-7在厌氧血琼脂平板上的菌落形态；
图3附图为本发明医用细胞CMU-pb-7革兰染色镜下形态，1000倍镜；
图4附图为本发明医用细胞CMU-pb-7对高脂饮食小鼠模型的GSH水平检测结果图；
图5附图为本发明医用细胞CMU-pb-7对高脂饮食小鼠模型的CAT水平检测结果图；
图6附图为本发明医用细胞CMU-pb-7对高脂饮食小鼠模型的T-AOC水平检测结果图；
图7附图为本发明医用细胞CMU-pb-7对高脂饮食小鼠模型的MDA水平检测结果图；
图8附图为本发明医用细胞CMU-pb-7对高脂饮食小鼠模型的肝脏组织形态学观察结果图；
图9附图为本发明医用细胞CMU-pb-7对高脂饮食小鼠模型回肠组织形态学观察结果图；
图10附图为本发明医用细胞CMU-pb-7对高脂饮食小鼠模型回肠组织病理切片HE染色结果图；
图11附图为本发明医用细胞CMU-pb-7对高脂饮食小鼠肝脏指数影响结果图；
图12附图为本发明医用细胞CMU-pb-7对高脂饮食小鼠回肠组织学损伤评分结果图；
其中，*，P<0.05；**，P<0.01，***，P<0.001；****，P<0.0001。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 CMU-pb-7的分离、培养及鉴定
(1)样本来源
选取健康人作为志愿者。选取人群需满足取样前两周正常饮食，无肠道疾病史，无抗生素服用史。取样为当天晨便，收集新鲜样本后立即使用南京法迈特公司的智能微生物分离系统进行粪菌分离。分离完成后收集粗提粪菌液，加入含40％甘油的MRS肉汤培养基作为冻存保护液冻存于-80℃超低温冰箱中备用。
(2)CMU-pb-7的分离
从-80℃冰箱中取出冻存的粗提粪菌液，在9mL的生理盐水中加入1mL的粗提粪菌液，充分混匀，梯度稀释至浓度为10-3～10-7。吸取各个浓度菌液100μL，分别涂布于MRS琼脂培养基、TPY琼脂培养基及M17琼脂培养基，37℃厌氧条件培养48h-72h。初步根据菌落特征，挑选单个菌落形态呈圆形，表面光滑，边缘整齐，奶油白色，且散发奶油味的菌落在上述对应琼脂培养基上进行分区划线纯培养。
(3)CMU-pb-7培养特性
取CMU-pb-7菌株单个菌落，分别接种于MRS琼脂平板和厌氧血琼脂平板，37℃厌氧条件培养48h；观察MRS平板以及厌氧血琼脂平板上菌落特征，结果见图1-图2；结果显示，CMU-pb-7为兼性厌氧菌，在MRS平板和厌氧血琼脂平板上菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，奶油白色，且散发奶油味，且在厌氧血琼脂平板上无溶血现象。
(4)CMU-pb-7的生化鉴定
CMU-pb-7的生化鉴定采用法国梅里埃生物公司的API 50CHL细菌生化鉴定系统进行鉴定。按照API 50CHL鉴定试剂条说明书进行严格操作，得到菌株的反应结果用API鉴定软件进行分析，鉴定结果为鼠李糖乳杆菌，鉴定率99.9％，T值0.3。CMU-pb-7生化反应结果见表1。
表1 CMU-pb-7生化反应结果
其中，0号管为空白对照管。
(5)CMU-pb-7的革兰染色菌体形态
挑取MRS琼脂平板上的CMU-pb-7的单个菌落，于载有10μL无菌生理盐水的玻片上涂片，待其干燥后，酒精灯外焰固定，冷却后进行革兰染色，油镜下观察菌体形态，结果见图3；结果显示，CMU-pb-7为菌体呈紫色、短杆状，单个、成对或短链排列的革兰氏阳性菌。
实施例2高脂饮食小鼠模型的建立
选取24只6～8周龄，体质量19～21g SPF级雄性C57BL/6小鼠24只。随机分为3组，每组8只，分别为对照组(normal diet，ND)：普通饲料(厂家：北京科澳协力饲料有限公司，名称：大小鼠生长繁殖饲料)+0.2mL生理盐水灌胃；模型组(high-fat diet，HFD)：高脂饲料(厂家：江苏省协同医药生物工程有限责任公司，名称：60％脂肪供能高脂饲料，货号：XTHF60)+0.2mL生理盐水灌胃；HFD+CMU-pb-7组：高脂饲料+0.2mL的1x109CFU/mL CMU-pb-7灌胃。每天固定时间对各组小鼠灌胃处理。持续灌胃9周后，经眼球取血后颈椎脱臼处死小鼠，留取小鼠肝脏，回肠等标本用于后续检测与分析。
实施例3高脂饮食小鼠的抗氧化指标评估
(1)高脂饮食小鼠肝脏抗氧化因子检测
取小鼠肝组织0.1g加入1mL预冷裂解液(索莱宝)，组织匀浆，4℃，10000r/min，离心5min，收集上清液。使用还原性谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒、过氧化氢(CAT)活性检测试剂盒和总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒分别测定肝脏组织中抗氧化因子水平，使用丙二醛(MDA)检测试剂盒测定肝脏脂质过氧化水平。结果见图4-图7，结果表明：与ND组相比，HFD组肝脏T-AOC，GSH和CAT水平显著降低，MDA水平增高(P<0.05)，提示肝脏组织抗氧化能力降低；而与HFD组相比，HFD+CMU-pb-7组GSH、CAT和T-AOC水平显著增加，MDA水平降低(P<0.05)。提示CMU-pb-7可提高肝脏组织抗氧化能力，降低氧化应激水平，保护肝脏组织。
(2)高脂饮食小鼠肝脏形态学观察
解剖小鼠后，取肝脏用PBS冲洗干净，肉眼观察小鼠肝脏的体积、硬度，光滑度，脂肪变情况，并拍照记录。结果见图8，结果表明：与ND相比，HFD组小鼠肝脏体积变大，质地较硬，切面油腻，有脂肪变。而与HFD相比，HFD+CMU-pb-7组鼠肝脏体积较小，质地柔软，切面光滑，无脂肪变。提示CMU-pb-7可提高肝脏组织抗氧化能力，缓解脂肪变。
(3)高脂饮食小鼠回肠形态学观察
解剖小鼠后，取回肠用PBS冲洗干净，肉眼观察小鼠回肠的长度，组织粘连和肿胀情况，并拍照记录。结果见图9，结果表明：与ND相比，HFD组小鼠回肠长度缩短，组织粘连，有肿胀现象。而与HFD相比，HFD+CMU-pb-7组鼠肝回肠长度较长，无组织粘连，无明显肿胀现象。提示CMU-pb-7可缓解回肠受损。
(4)高脂饮食小鼠回肠组织HE染色
①取各组小鼠回肠组织用4％甲醛溶液固定，经石蜡包埋并切片。②石蜡切片放入烤箱中60℃1h，二甲苯浸泡5min；再分别浸泡于无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇3min；然后用流水冲洗，甩干。③苏木素染色5min后，用流水冲洗，1％盐酸酒精分化，再次用流水冲洗；伊红染色1min。再分别浸泡于75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、无水乙醇溶液1min，放入烤箱中60℃5min，用中性树脂封片。④显微镜下观察并拍照。光学显微镜下观察比较各组小鼠回肠组织病理学改变，结果见图10，结果显示：ND组小鼠的回肠组织结构完整；HFD组可见小鼠的回肠组织肠壁结构缺损、肠绒毛断裂、缺失，上皮细胞脱落，炎症细胞浸润，回肠组织损伤严重；HFD+CMU-pb-7组小鼠的回肠组织肠壁结构完整，肠绒毛无断裂、缺失，上皮细胞完整无脱落，炎症细胞浸润减少，回肠组织损伤缓解。提示CMU-pb-7可调节肠道内的氧化应激水平，缓解回肠组织的氧化损伤。
(5)高脂饮食小鼠肝脏指数检测
解剖前称小鼠的质量记为M2，解剖后称小鼠的肝脏组织质量为M1，称量完成后计算小鼠的肝脏指数，肝脏指数＝M1/M2。结果见图11，结果显示：与ND相比，HFD组小鼠肝脏指数增加(P<0.05)；与HFD组相比，HFD+CMU-pb-7组小鼠肝脏指数下降(P<0.05)，提示CMU-pb-7可缓解小鼠肝脏体积，质量的改变。
(6)高脂饮食小鼠回肠组织学损伤评分
回肠组织学损伤评分：0分，正常肠黏膜；1分，肠黏膜顶端上皮下轻度水肿、毛细血管扩张充血；2分，肠黏膜上皮细胞与固有层间隙增大；3分，肠黏膜部分固有层顶端裸露、上皮细胞脱落；4分，黏膜固有层裸露或腺上皮结构消失、毛细血管扩张充血，可能伴随固有层炎细胞侵润；5分，肠黏膜出血、溃疡，固有层崩解。评估结果见图12，结果显示：HFD+CMU-pb-7组小鼠回肠组织损伤程度评分显著低于HFD组，提示CMU-pb-7能缓解高脂饮食小鼠回肠组织的氧化损伤。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (2)
1.一种医用细胞CMU-pb-7，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：M 2022220。
2.权利要求1所述的医用细胞CMU-pb-7在制备抗氧化药物中的应用。
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