CN108285883A

CN108285883A - 一种植乳物杆菌GBE48及其应用以及α-葡萄糖苷酶活性抑制定量检测的方法

Info

Publication number: CN108285883A
Application number: CN201810102425.1A
Authority: CN
Inventors: 谢远红; 刘慧�; 张红星; 高秀芝; 熊利霞; 金君华
Original assignee: Beijing University of Agriculture
Current assignee: Beijing University of Agriculture
Priority date: 2018-02-01
Filing date: 2018-02-01
Publication date: 2018-07-17

Abstract

本发明提供了一种植物乳杆菌GBE48及其应用以及α‑葡萄糖苷酶活性抑制定量检测的方法。本发明植物乳杆菌GBE48(CGMCCNo.15130)具有较强的耐受胃肠道逆环境能力，并对α‑葡萄糖苷酶活性抑制率较高，是一种防治糖尿病的最有潜力菌株。同时，本发明方法通过对于实验反应体系的建立和优化，能够实现对不同菌株的α‑葡萄糖苷酶活性抑制的测定，并实现对植物乳杆菌来源的α‑葡萄糖苷酶抑制剂的筛选，填补了相关研究领域的空白。

Description

一种植乳物杆菌GBE48及其应用以及α-葡萄糖苷酶活性抑制定量检测的方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种植物乳杆菌GBE48及其应用以及α-葡萄糖苷酶活性抑制定量检测的方法。

背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是由于机体胰岛素分泌不足、或分泌胰岛素功能受损所引起的持续高血糖的代谢紊乱疾病，已成为公认危害人体健康的疾病，三多一少是其典型特征。目前，预防和治疗糖尿病的药物仍以化学药剂为主，由于化学药剂副作用大，因而也使得对安全、天然药物的研究成为热点。

微生物来源的酶抑制剂的筛选研究成为糖尿病防治领域新的研究热点，其中α-葡萄糖苷酶抑制剂已被第三次亚太地区糖尿病治疗药物指南推荐为降低餐后血糖的一线药物。酶抑制剂的筛选方法具有特异性强、筛选样品量大、简便、灵敏等优点，适用于各种益生乳酸菌发酵液的大量筛选与研究，可为糖尿病的防治提供有效方法。

目前现有提取α-葡萄糖苷酶抑制剂的专利方法，大多是直接以大麦、红茶、海洋褐藻、中药、甘草、荔枝、杨梅果肉、罗汉果、青稞麸皮、土大黄、猕猴桃根或田基黄、茶花粉、苍耳籽、松蒿、山萝花、冬凌草、矮生二裂叶委陵菜、大豆、辣椒叶、大叶补血草和夏枯草等植物为原料进行提取制备。

微生物来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂也有一定研究，大多来源于链酶菌属、芽孢杆菌属、游牧放线菌属和真菌。例如，现有技术CN105385619A所公开的《淡紫灰链霉菌及其用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法与应用》；现有技术CN105176860A所公开的《一种蜡样芽孢杆菌及其利用蜡样芽孢杆菌制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法》；现有技术CN101371869A所公开的《一种来源于纳豆的α-葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法》等。

然而，现有专利中，并没有对于产α-葡萄糖苷酶抑制剂菌株的筛选方法进行较为细致的研究。尽管国内有2篇相关的文献报道，例如吕嘉枥等人发表的《具有α-葡萄糖苷酶抑制性益生乳酸菌的筛选》和陈佩等人《1 株具有潜在降糖作用的益生菌的筛选》，但是这两篇文章都是关于α-葡萄糖苷酶抑制性益生乳酸菌的筛选，而有关植物乳杆菌来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂的测定方法，尤其对α-葡萄糖苷酶活性抑制试验反应体系的优化，现有技术中却没有相关的研究和报道。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种植物乳杆菌，所述的植物乳杆菌具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

本发明的第二目的在于提供一种所述的植物乳杆菌的应用。

本发明的第三目的在于提供一种α-葡萄糖苷酶活性抑制定量检测的方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，命名为GBE48，微生物保藏号为：CGMCC No.15130。

同时，本发明还提供了所述的植物乳杆菌在α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用；

和/或，所述的植物乳杆菌在制备糖尿病防治药物中的应用。

进一步的，本发明还提供了一种α-葡萄糖苷酶活性抑制定量检测的方法，所述方法包括如下步骤：

将待检测菌株活化后，制备待测菌株上清液；

在孔板中加入PNPG底物溶液和PBS缓冲液以及待测菌株上清液，混合反应后，加入α-葡萄糖苷酶溶液，继续反应，然后加入Na₂CO₃溶液终止反应，将反应液在波长405nm处测定吸光值，记为OD_A；

同时，分别以：不含有α-葡萄糖苷酶但含有待测菌株上清液的体系 B，含有α-葡萄糖苷酶但不含有待测菌株上清液的体系C，以及不含有α -葡萄糖苷酶但含有待测菌株上清液的体系D为对照组，分别测定各组反应液在波长405nm处测定吸光值，分别记为OD_B、OD_C，以及OD_D；

然后，按照如下公式计算α-葡萄糖苷酶活性抑制率：α-葡萄糖苷酶活性抑制率＝[1-(OD_A-OD_B)/(OD_C-OD_D)]×100％；

其中，所述待测菌株包括本发明所述的植物乳杆菌。

优选的，本发明所述方法中，所述菌株活化包括如下步骤：将冷藏保存的菌株接入培养基中，然后在37℃下培养，活化三代后制备菌株上清液；

和/或，所述菌株上清液的制备包括如下步骤：将活化后的菌株接入培养基中培养，得到活菌数量大于1×10⁹的发酵液，然后离心收集上清液，无菌过滤后得到菌株上清液。

优选的，本发明所述方法中，所述PNPG底物溶液的浓度为1.5mmol/L，用量为50μL。

优选的，本发明所述方法中，PBS缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为6.8，用量为15μL。

优选的，本发明所述方法中，所述待测菌株上清液的用量为15μL。

优选的，本发明所述方法中，所述α-葡萄糖苷酶溶液的酶活力为 20U/mL，用量为70μL。

优选的，本发明所述方法中，所述混合反应的温度为37℃，时间为 10min；

和/或，所述继续反应的温度为37℃，时间为50min。

优选的，本发明所述方法中，所述Na₂CO₃溶液的浓度为0.1mol/L，用量为70μL。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明植物乳杆菌GBE48具有较强的耐受胃肠道逆环境能力，并对α-葡萄糖苷酶活性抑制率较高，可以成为防治糖尿病的最有潜力菌株；

(2)本发明检测方法能够高效、准确的实现不同菌株对于α-葡萄糖苷酶抑制活性的测试，从而能够有效的筛选出对于α-葡萄糖苷酶活性抑制率较高的菌株，填补了相关领域的空白。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为底物浓度对OD值影响实验结果图；

图2为α-葡萄糖苷酶对OD值影响实验结果图；

图3为反应时间对OD值影响实验结果图；

图4为终止液用量对OD值影响实验结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

有鉴于α-葡萄糖苷酶抑制剂对于糖尿病防治具有良好的效果作用，而目前并没有对微生物来源的对于α-葡萄糖苷酶活性抑制试验反应体系的深入研究，本发明特提供了一种α-葡萄糖苷酶活性抑制定量检测的方法。

具体的，本发明所述α-葡萄糖苷酶活性抑制定量检测的方法包括如下步骤：

(a)将待检测菌株活化：

优选的，此步骤中，待测菌株包括本发明所提供的植物乳杆菌GBE48，生物保藏号为CGMCC No.15130。

同时，为了进一步对其α-葡萄糖苷酶活性进行参考和比较，此步骤中还以商业菌鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillus rhamnosus GG, ATCC53103，购自于美国菌种保藏中心，又称美国模式菌种收集中心)作为阳性参照物；

将冷藏保存的菌株优选的按照3％的接入量，接入到5mL液体MRS培养基中，然后在37℃下培养，培养的时间优选的为18h，活化三代后用于制备菌株上清液。

(b)菌株上清液制备：

将活化后的菌株优选的按照3％的接入量，接入到10mL液体MRS培养基中，然后优选的在37℃下培养18h，得到活菌数量大于1×10⁹的发酵液，然后离心收集上清液，优选的以滤膜过滤，得到菌株上清液。

(c)反应体系

实验测试的反应体系优选的在CS016-0096孔板(每孔350μL)中进行，经过筛选和测试，反应体系的体积优选的确定为220μL；

(d)实验测试

在孔板中加入PNPG底物溶液和PBS缓冲液；优选的，所用PNPG为进口4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(货号：N1377－1G，购自美国sigma公司)；底物溶液的浓度优选的为1.5mmol/L，其用量优选的为50μL；

而所用PBS缓冲液优选的为pH为6.8，浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，其用量优选的为15μL；

然后，加入菌株上清液，其用量优选的控制在15μL，然后进行混合反应，混合反应的温度控制在37℃、时间控制在10min；

接着，加入α-葡萄糖苷酶溶液，所用α-葡萄糖苷酶优选的为进口商品酶(货号：G5003－1KU，购自美国sigma公司)，其用量优选的控制在 70μL，酶活力为20U/mL，继续混合反应，反应的温度优选的控制在37℃，反应的时间为50min；

反应后，加入Na₂CO₃溶液终止反应，Na₂CO₃溶液的浓度控制在 0.1mol/L，其用量为70μL。

终止反应后，将反应液在波长405nm处测定吸光值，记为OD_A；

由于吸光值与对硝基酚的游离量成正比，并与α-葡萄糖苷酶活性抑制率成反比，因而，可以通过吸光值的测量，计算得出菌株对于α-葡萄糖苷酶活性抑制率。

在以底物、菌株、α-葡萄糖苷酶等为原料作为实验组，并进行如上实验测试的同时，本发明中还分别以：不含有α-葡萄糖苷酶但含有待测菌株上清液的体系B，含有α-葡萄糖苷酶但不含有待测菌株上清液的体系C，以及不含有α-葡萄糖苷酶但含有待测菌株上清液的体系D为对照组；

对照组实验参照如上实验组的实验条件、步骤，但对照组中缺少了部分原料的使用和/或相应的步骤操作，例如B组中在试验过程中就不添加α-葡萄糖苷酶，但是仍然包含继续反应的步骤；而C组中则不必包含菌株活化和菌株上清液制备的步骤，但仍然需要对底物进行加热处理；同样的，D组中则在加入底物和缓冲液后，只需进行加热反应和最后终止液的加入，无需额外的操作；

然后，分别测定各组反应液在波长405nm处测定吸光值，分别记为 OD_B、OD_C，以及OD_D；

按照如下公式计算α-葡萄糖苷酶活性抑制率：α-葡萄糖苷酶活性抑制率＝[1-(OD_A-OD_B)/(OD_C-OD_D)]×100％。

而通过对于实验反应体系的建立和优化，能够实现对于不同菌株对于α-葡萄糖苷酶活性抑制的测定，并实现对于菌株的筛选。

实验例1α-葡萄糖苷酶活性抑制试验反应体系建立和优化

1、菌株来源

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GBE48(分离自广西巴马县酸浆米粉)，于2017年12月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCCNo.15130；鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG,ATCC53103)(简称LGG)，购自于美国菌种保藏中心，又称美国模式菌种收集中心。

2、菌株活化

将冻存于-80℃的1株植物乳杆菌GBE48和1株鼠李糖乳杆菌LGG甘油管分别按3％接入5mL液体MRS培养基中，37℃培养18h，活化三代后用于后续试验。

3、菌株上清液制备

发酵上清处理：将上述活化好的培养物按3％接入10mL液体MRS培养基中，37℃培养18h后，得到>10⁹CFU/mL活菌数量的发酵液，在4℃下以 6000r/min离心10min，收集上清，以0.22μm滤膜过滤发酵上清液，得到菌株上清液。

4、α-葡萄糖苷酶抑制性试验反应体系

本发明优化α-葡萄糖苷酶抑制性试验反应体系均在CS016-0096孔板 (每孔350μL)中进行，使用BioTek酶标仪ELx808测定OD值，从而确定适宜反应体系，确定反应体系为220μL。

5、底物浓度影响

以pH6.8、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液将浓度为20mmol/L的 1mLPNPG底物稀释为以下梯度：20、15、10、5、2.5、2、1.5、1、0.5、0.25、 0.2、0.15、0.1、0.05、0.025mmol/L，体系中其它条件暂定为：不同浓度梯度PNPG为50μL，pH 6.8、0.1mol/L磷酸盐缓冲液60μL，37℃反应 10min,然后加入20U/mLα-葡萄糖苷酶溶液50μL，再反应30min后，加入0.1mol/L的Na₂CO₃溶液60μL终止反应，在405nm下测其OD值，测定结果如图1所示。

由图1的测定结果可知，不同底物浓度所对应的OD值有两个平台期，对应浓度分别为1.5～2.5mmol/L和5～20mmol/L，推测其原因可能是反应时间不够造成的，由于后者OD值过大，影响后续酶活抑制率计算的置信度，综合OD值和用量，选择1.5mmol/L为较适的PNPG底物浓度。

6、酶液用量影响

将反应底物浓度确定为1.5mmol/L，整个反应总体系为220μL，加入浓度为1.5mmol/L的PNPG底物溶液50μL，分别依次加入pH 6.8、0.1mol/L 磷酸盐缓冲液100、90、80、70、60、50、40、30、20、10μL(补齐总反应体系为220μL)，在37℃反应10min，再分别依次加入酶活力20U/mLα- 葡萄糖苷酶溶液的酶液用量分别为：10、20、30、40、50、60、70、80、 90、60μL，37℃反应30min后加入0.1mol/L的Na₂CO₃溶液60μL终止反应，于405nm下测其OD值，测定结果如图2所示。

由图2的测试结果可知，当酶液量达到70μL时，反应完全，所以选择70μL为较适的酶液用量。

7、反应时间影响

根据5和6得出反应体系中较适宜的底物浓度和酶液用量结果基础上，整个反应总体系为220μL，加入浓度为1.5mmol/L的PNPG底物溶液50μL，调整pH 6.8、0.1mol/L磷酸盐缓冲液加入量为40μL(补齐总反应体系为 220μL)，再加入酶活力20U/mLα-葡萄糖苷酶溶液70μL，于37℃分别反应5、10、20、30、40、50、60min后，加0.1mol/L的Na₂CO₃溶液60μL 终止反应，于405nm下测其OD值，测定结果如图3所示。

由图3测定结果可知，当反应时间到50min时，反应完全，所以选择 50min作为较适的反应时间。

8、终止液量影响

反应顺序不变按照5、6和7中确定的适宜条件进行反应，整个反应总体系为220μL，加入浓度为1.5mmol/L的PNPG底物溶液50μL，分别调整 pH 6.8、0.1mol/L磷酸缓冲液加入量为70、60、50、40、30、20、10、0μL(补齐总反应体系为220μL)，再加入酶活力20U/mLα-葡萄糖苷酶溶液70μL，于37℃反应50min，再将0.1mol/L的Na₂CO₃终止反应液量分别调整为：30、40、50、60、70、80、90、100μL，在405nm下测其OD值，测定结果如图 4。

图4可知，当终止液Na₂CO₃用量为70μL时，OD值不再增加，停止反应，所以选择70μL为较适的终止液用量。

9、样品量影响

在确定5、6、7、8操作步骤的较优反应体系后，将LGG菌株发酵上清液的加入量调整到5、10、15、20μL，测试该株菌在不同上清液加入量时可以使OD值在以上反应体系中达到可置信区间，酶活抑制率的置信区间如表1所示。

表1样品量影响

样品用量/μL	α-葡萄糖苷酶活性抑制率/％
		5	98.09
10	28.50
		15	56.51
20	95.44

由表1可见，不同上清液量获得不同的酶活抑制率，当发酵上清液用量为15μL时，酶活抑制率为56.51％，置于30％-60％区间最具有置信性。

综上所述，确定优化的α-葡萄糖苷酶抑制性试验反应体系为：每孔中反应总体系为220μL，1.5mmol/L的PNPG底物溶液50μL，pH 6.8、0.1mol/L 的磷酸盐缓冲液15μL，活菌数>10⁹CFU/mL的发酵上清液用量15μL，酶活力为20U/mL的α-葡萄糖苷酶用量为70μL，于37℃反应时间50min，0.1mmol/L的反应终止液Na₂CO₃用量70μL。

实验例2植物乳杆菌GBE48对α-葡萄糖苷酶活性抑制率的测定

每孔中反应总体系为220μL，在50μL、1.5mmol/L的PNPG底物溶液和pH 6.8、0.1mol/L的15μL磷酸盐缓冲液中，加入15μL待测菌株的发酵上清液，将混合物于37℃反应10min后，再加入70μL的酶活力为20U/m L的α-葡萄糖苷酶溶液，于37℃继续反应50min后，加入 0.1mol/L的Na₂CO₃溶液70μL终止反应。将反应液于405nm处测其吸光值。吸光值大小与对硝基酚的游离量成正比，并与α-葡萄糖苷酶活性抑制率成反比。

反应体系中采用pH 6.8、0.1mol/L的15μL磷酸盐缓冲液作为α- 葡萄糖苷酶溶液及待测样品的空白对照，采用以下公式计算样品的酶活抑制率，测定结果见表2所示。

酶活抑制率(％)＝[1-(A-B)/(C-D)]×100％；

式中：A为含有α-葡萄糖苷酶溶液及待测样品的测定吸光值；B为不含α-葡萄糖苷酶溶液但含待测样品的测定吸光值；C为含有α-葡萄糖苷酶溶液但不含样品的测定吸光值；D为不含α-葡萄糖苷酶溶液及待测样品的测定吸光值。

表2植物乳杆菌GBE48对α-葡萄糖苷酶活性抑制率结果

菌株名称	α-葡萄糖苷酶活性抑制率/％
		植物乳杆菌GBE48	56.91±0.08*
鼠李糖乳杆菌LGG	53.26±0.11

注：植物乳杆菌与LGG相比，有显著性差异(P<0.05)。

由表2对照检测结果可知，与鼠李糖乳杆菌LGG相比，植物乳杆菌GBE48 对α-葡萄糖苷酶活性抑制率有显著性提高(P<0.05)，比鼠李糖乳杆菌LGG 对α-葡萄糖苷酶活性抑制率提高了6.85％，表明植物乳杆菌GBE48可以成为防治糖尿病的最有潜力菌株。

实验例3植物乳杆菌GBE48耐胃肠道逆环境试验

制备人工模拟胃液：NaCl 0.20％、胃蛋白酶(酶活力为250U/mg，购自美国sigma公司，货号：P7000-25G)0.30％，HCl调pH至2.5，过滤除菌备用。

人工模拟肠液：将胰蛋白酶(酶活力为1655U/mg，购自美国sigma公司，货号：93615-5G)溶于pH 8.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中使其终浓度为 1g/L，加入0.3％的牛胆盐，经0.22μm滤膜过滤后制备成模拟肠液。

将37℃、培养2株菌(植物乳杆菌植物亚种和鼠李糖乳杆菌)10mLMRS 培养液各3支，每组重复3次，经6000r/min离心10min，弃掉上清液，用 0.85％生理盐水10mL离心洗涤(离心条件同上)后，分别悬浮于1mL模拟胃液中，混匀后将其放置于37℃培养，0h和3h后分别取2支进行活菌计数。另取其中1支培养3h后模拟胃液，经6000r/min离心10min，弃掉上清液，加入至9mL模拟肠液中，混匀后于37℃培养，分别于8h进行活菌计数，用MRS固体培养基37℃培养48h，测定结果如表3所示。植物乳杆菌植物亚种和鼠李糖乳杆菌菌株的存活率用以下公式计算，测定结果如表4所示。

存活率(％)＝[log N₁/log N₀]×100

式中：N₁—经过模拟胃肠液处理之后的乳酸菌活菌数(CFU/mL)；N₀—未处理前乳酸菌的活菌数(CFU/mL)；

表3植物乳杆菌GBE48耐胃肠道逆环境试验活菌数结果

表4植物乳杆菌GBE48耐胃肠道逆环境试验存活率

由表3和表4对照试验检测结果可知，植物乳杆菌GBE48菌株在pH 8.0 的模拟肠液中可存活8h，且活菌数能达到10⁶CFU/mL，显示其可以在肠道中发挥保健功效。此外，植物乳杆菌GBE48与LGG相比，胃肠道逆环境的存活率相差不大，表明植物乳杆菌GBE48具有较强的耐受肠道逆环境能力。

由如上实验例2、3的实验结果也可以得知的是，植物乳杆菌GBE48具有较强的耐受肠道逆环境能力，并对α-葡萄糖苷酶活性抑制率较高，是一种防治糖尿病的最有潜力菌株。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，命名为GBE48，微生物保藏号为：CGMCC No.15130。

2.权利要求1所述的植物乳杆菌在α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用；

和/或，权利要求1所述的植物乳杆菌在制备糖尿病防治药物中的应用。

3.一种α-葡萄糖苷酶活性抑制定量检测的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

将待检测菌株活化后，制备待测菌株上清液；

同时，分别以：不含有α-葡萄糖苷酶但含有待测菌株上清液的体系B，含有α-葡萄糖苷酶但不含有待测菌株上清液的体系C，以及不含有α-葡萄糖苷酶但含有待测菌株上清液的体系D为对照组，分别测定各组反应液在波长405nm处测定吸光值，分别记为OD_B、OD_C，以及OD_D；

其中，所述待测菌株包括权利要求1所述的植物乳杆菌。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述菌株活化包括如下步骤：

将冷藏保存的菌株接入培养基中，然后在37℃下培养，活化三代后制备菌株上清液；

和/或，所述菌株上清液的制备包括如下步骤：

将活化后的菌株接入培养基中培养，得到活菌数量大于1×10⁹的发酵液，然后离心收集上清液，无菌过滤后得到菌株上清液。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PNPG底物溶液的浓度为1.5mmol/L，用量为50μL。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PBS缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为6.8，用量为15μL。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述待测菌株上清液的用量为15μL。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述α-葡萄糖苷酶溶液的酶活力为20U/mL，用量为70μL。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述混合反应的温度为37℃，时间为10min；

和/或，所述继续反应的温度为37℃，时间为50min。

10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Na₂CO₃溶液的浓度为0.1mol/L，用量为70μL。