CN103756926B - 一种能够缓解铜毒性的植物乳杆菌及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），于2013年9月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.8246，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明的植物乳杆菌具有耐酸性，在体外对铜离子有良好的耐受能力，能够耐受起始浓度为50mg/L的铜离子溶液，并且对铜离子有较强的吸附作用，能降低铜暴露小鼠肝脏、肾脏、脑中的铜含量，减轻铜暴露小鼠的病理症状与缓解小鼠肝损伤降低血清中AST、ALT含量的作用。所述的植物乳杆菌用于制备缓解铜毒性的药物组合物与发酵食品，具有非常广泛的应用前景。

Description

一种能够缓解铜毒性的植物乳杆菌及其用途

技术领域

本发明涉及一种植物乳杆菌及其用途，特别是一种能够缓解铜毒性的植物乳杆菌及其用途。

背景技术

铜是人体必需微量元素之一，广泛分布于生物组织中，大部分以有机复合物存在，很多是金属蛋白，以酶的形式起着功能作用；但是过量的铜会在人体内积累引起铜中毒，影响内脏器官和神经系统。随着工业的发展，铜锌矿的开采和冶炼、金属加工等愈加频繁，铜在水体和土壤中的含量逐年增加，造成植物的污染（如水稻和大麦生长不良，并污染粮食籽粒）和动物体内蓄积(如肝肾脏脑等),最终通过食物链在人体内蓄积。铜污染事件层出不穷，2010年7月3日，福建省杭紫金矿业紫金山铜矿湿法厂发生污水渗漏事故，约9100立方米的含铜酸水外渗引发汀江流域污染，仅棉花滩库区死鱼和鱼中毒约达378万斤，福建有关部门已认定此次污染属重大突发环境事件。2012年09月国家质检总局进出口食品安全局公布的进境不合格食品、化妆品信息中，福州世纪金花进出口有限公司进口的2.2吨赫伯望2008瑞帕设拉子干红葡萄酒在检测时铜含量严重超标，已被销毁，挡在国门之外。除此之外，也有相关报道提及科研人员通过定点调查研究发现，华南矿区周边鱼类重金属污染严重，其中鲢鱼的肝脏能积累铜超过1000ppm，也就是1000毫克/千克。而国家标准则规定鱼肉的食用标准是50毫克/千克。

过量的铜在人体内和蛋白质及酶等发生强烈的相互作用，使它们失去活性，也可能在人体的某些器官中累积，造成慢性中毒。当铜含量超过人体需要量的100～150倍时易引起中毒反应。铜中毒的临床表现为急性胃肠炎，中毒者口中有金属味，流涎、恶心、呕吐、上腹痛、腹泻，有时可有呕血和黑便；慢性者记忆力减退、注意力不集中、易激动，多发性神经炎、神经衰弱综合症、食欲不振、恶心呕吐、腹痛腹泻黄疸、肝肿大、肝功能异常等，对神经系统、肾脏的损害最为显著。

针对铜蓄积和铜中毒，寻找一种新的有效的干预或治疗方法显得十分必要。乳酸菌是一类能够使碳水化合物发酵并产生乳酸的细菌的统称，广泛存在于自然发酵乳制品、发酵植物食品，如泡菜、酸菜、青贮饲料以及人肠道中。长期科学研究结果表明，以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，其主要生理功能有：防治乳糖不耐症、恢复人体肠道内菌群平衡维护人体健康、抗肿瘤和预防癌症作用、控制人体内毒素水平、保护肝脏并增强肝脏的解毒等功能。乳酸菌作为一种食品级的微生物，不像金属螯合剂有严重的毒副作用,因此很有潜力成为具有缓解铜毒性功能的新型保健食品或药物。

目前涉及具有缓解铜中毒效应的乳酸菌专利申请文件不多，CN101252943A公开了一些植物乳杆菌，它用于促进哺乳动物吸收铁、锌、钙、镁离子。

因此，筛选出一种具有缓解铜毒性功能的乳酸菌，并且证明它们在动物模型中具有良好的缓解铜中毒作用，同时研制这些乳酸菌实际的用途就显得十分必要。探索乳酸菌在缓解铜毒性效应中的效果就可以进一步地挖掘益生菌的功能，开发具有更高保健价值的乳酸菌，为利用膳食策略缓解铜毒性效应开辟出新的途径和解决方案。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），于2013年9月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNO.8246，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

所述的植物乳杆菌CGMCC NO.8246具有下述性质：

⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH2.5环境下存活良好；

⑵在体外含铜培养基中培养，对铜离子有良好的耐受能力；

⑶在体外含铜水溶液中孵育，对铜离子有良好的吸附能力；

⑷具有降低铜暴露小鼠体内铜含量与缓解铜暴露小鼠铜毒性的作用。

所述植物乳杆菌CGMCC NO.8246在制备缓解铜毒性的药物组合物与发酵食品中的应用也为本发明要求保护的范围。

所述药物组合物是由植物乳杆菌CGMCC NO.8246菌剂及其它在药学上可接受的载体及辅料组成，植物乳杆菌CGMCC NO.8246中活性植物乳杆菌CGMCC NO.8246大于10⁶CFU/g。

其中，在药学上可接受的载体是一种或多种选自在药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂或矫味剂的载体。

所述药物组合物是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型。

在发酵食品是使用含有植物乳杆菌CGMCC NO.8246菌种也属于本发明要求保护的范围，发酵食品包括但不限于乳制品、豆制品与果蔬制品。

所述乳制品是牛奶、酸奶油或干酪；所述的豆制品是豆奶、豆豉或豆酱；所述的果蔬制品是黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。

上述的发酵剂可以通过下述制备步骤得到的：

A、培养基的制备：使用以所述培养基总重量计87.7%水将10%酶水解脱脂乳、0.5%葡萄糖、1.5%胰蛋白胨与0.3%酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，这样得到所述的培养基；

B、保护剂的制备：使用水与保护剂原料混合制备得到含有100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸钠的保护剂；

C、将植物乳杆菌CGMCC NO.8246菌种按照以所述培养基的重量计2-4%接种量接种到在温度110-120℃下灭菌8-12min的所述培养基中，在温度37℃下培养18h，用pH7.2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述保护剂重悬达到浓度10¹⁰CFU/mL；接着，让该悬浮液在温度37℃下预培养60min，再进行冷冻干燥得到所述的发酵剂。

下面将更详细地描述本发明。

本发明涉及一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），该菌菌株已于2013年9月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，其保藏号为8246。本发明人根据下述筛选标准，通过大量筛选实验与分析验证，从我国传统食品，例如泡菜，发酵奶酒中筛选出的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC NO.8246具有下述性质:

⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH2.5环境下存活良好；

⑵在体外含铜培养基中培养，对铜离子有较好的耐受能力；

⑶在体外含铜水溶液中孵育，对铜离子有良好的吸附能力；

⑷具有降低铜暴露小鼠体内铜含量与缓解铜暴露小鼠铜毒性的作用。下面将详细描述这些实验与分析认证结果。

1、具有耐酸性，在pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH2.5环境下存活良好

将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CGMCC NO.8246分别接种于MRS培养基（例如青岛海博生物技术有限公司的产品）中，在温度37℃下培养24h，再经MRS培养液传代培养2～3次后，取1mL植物乳杆菌CGMCC NO.8246培养液，分别接种于19mL不同pH值（3.0-9.0）的MRS液体培养基中，在温度37℃下培养24h，测定初始和培养结束后的OD600值，利用这个值测量在细菌培养液中的细胞浓度，从而估计细菌的生长情况。OD600值是采用分光光度法在波长600nm处测定的细菌培养液的吸光值，它通常用于表示在细菌培养液中细胞浓度，以确定液体培养物中细菌的生长情况。

实验结果证明植物乳杆菌CGMCC NO.8246在pH3.0-9.0的环境中生长良好，因此得以进行后续实验。采用与前面所述的同样培养方式，用1.0mL pH7.2PBS(磷酸盐缓冲液)清洗菌体两次，再用1.0mL pH7.2磷酸盐缓冲液重悬，其重悬乳杆菌菌体与9.0mL pH2.5人工胃液混合，然后在温度37℃下进行培养，分别在开始(0h)和3h时取样，用MRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是在该培养液中在第3h时的活菌数对数值与在第0h时活菌数对数值之比，以%表示。本发明筛选存活率在80%以上的菌株进行后续研究。

实验结果表明，植物乳杆菌CGMCC NO.8246在pH2.5的人工胃液环境中的存活率在90%以上。由此可见，植物乳杆菌CGMCC NO.8246具有耐酸性，在pH2.5的环境下存活良好。

2、在体外含铜培养基中培养，对铜离子有良好的耐受能力

通过植物乳杆菌CGMCC NO.8246在不同铜含量培养基中的生长曲线可以研究其在体外对铜离子的耐受能力。在无菌条件下，向1L水中加入0.1965gCuSO₄·5H₂O，即得到浓度为50mg/L的铜离子水溶液。使用这种铜离子水溶液溶解MRS固体培养基干粉得到含50mg/L铜离子的MRS液体培养基。同样地，分别配制150mg/L、500mg/L铜离子浓度的MRS液体培养基。按照以含铜离子的MRS液体培养基重量计2%接种量将进入稳定期的植物乳杆菌CGMCCNO.8246菌液接入所述含铜离子的MRS液体培养基中。采用96孔板法，在其培养24h过程中，每20min测一次OD值，从而得到如附图1所示的植物乳杆菌CGMCC NO.8246生长曲线。

附图1的结果表明，本发明植物乳杆菌CGMCC NO.8246对铜离子的具有良好的耐受能力。

3、在体外含铜水溶液中孵育，对铜离子有良好的吸附能力

在无菌条件下，按照耐酸性（在pH3.0能够生长）的筛选标准，从我国传统食品，例如泡菜，发酵奶酒中筛选出16株乳酸菌，并对其进行了纯化和活化培养。将上述菌株转移至50mg/L铜溶液中，使菌体最终浓度达到1g/L。将含有上述菌株的样品在37℃下培养1h，使用Beckman离心机以6000r/min离心20min，再用无菌水洗涤、离心一次。分离除去上清液，向得到的菌体中加入纯硝酸，放入微波消解炉中消解20min，得到的消解液使用原子吸收光谱分析仪（Spectr AA220,Varian,USA）测定铜离子含量，以确定各菌株对铜离子的吸附能力。这些测定结果列于附图2中。

附图2清楚地表明，与其它试验菌株和对照菌株相比，本发明植物乳杆菌CGMCCNO.8246对铜离子的吸附量最大，因此，对铜离子具有良好的吸附能力。

4、对铜暴露小鼠具有缓解铜毒性的效应

取20-25g健康雄性C57小鼠60只，随机分为3组，每组含小鼠20只：阴性对照组，硫酸铜暴露模型对照组，植物乳杆菌CGMCC NO.8246干预组。实验0-4周，阴性空白对照组灌胃0.2mL脱脂乳；其余2组灌胃0.2mL铜浓度为10g/L硫酸铜。第一次灌胃结束1小时后，植物乳杆菌CGMCC NO.8246干预组灌喂0.2mL按本说明书实施例3制备的浓度2.0×10⁹CFU/mLCGMCC NO.8246脱脂乳悬液。实验结束后取血并处死小鼠，分别取肝、肾，脑在按照与前面所述的相同消化处理后，采用原子吸收分光光度法测定铜含量。这些测定结果列于附图3中。

通过对铜暴露染毒模型组及共同喂食铜及植物乳杆菌CGMCC NO.8246组小鼠体内肝脏、肾脏、脑中的铜含量，以及血清中AST、ALT的比较，发现本发明植物乳杆菌CGMCCNO.8246能够降低小鼠脑、肝脏、肾脏中的铜含量，缓解铜暴露小鼠铜毒性的作用。

在本发明中，术语“缓解铜毒性”应该理解是能够使机体内的铜中毒现象减轻或消失的过程，即使用含有本发明植物乳杆菌CGMCC NO.8246菌剂的药物组合物能够降低铜中毒小鼠的脑、肝脏、肾组织中的铜含量，减轻铜中毒小鼠的病理症状，降低小鼠血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶含量。

本发明的植物乳杆菌CGMCC NO.8246具有下述生物学特性：

菌体特征：呈革兰氏染色阳性，细胞杆状，菌体约0.5-1.0μm宽，2-4μm长，成单、成对或者成链，不形成芽孢，两端圆形。

菌落特征：在MRS培养基上形成明显的菌落，直径在0.3-2.0mm之间，圆形，边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素。

生长特性：该菌株的最低生长温度为20℃，最高生长温度为40℃，在温度30-37℃下生长最佳，最高和最低初始生长pH为9.0和2.5，最适生长初始pH为6.0；本发明植物乳杆菌CGMCC NO.8246菌株的延迟期相对较短，4h左右开始进入对数生长期，12h就达到稳定期。

16s rDNA分析：后发现与植物乳杆菌有97%同源性，命名为植物乳杆菌。

本发明还涉及所述的植物乳杆菌CGMCC NO.8246在制备缓解铜毒性的药物组合物与发酵食品中的用途。

所述的药物组合物是植物乳杆菌CGMCC NO.8246菌剂与在药学上可接受的载体组成的。

根据本发明，所述的植物乳杆菌CGMCC NO.8246菌剂是采用通常的冷冻干燥制备技术将含有所述的植物乳杆菌CGMCC NO.8246的菌液制成的冻干粉剂，或是采用其它方法如喷雾干燥法制备得到的粉剂。

所述的植物乳杆菌CGMCC NO.8246菌剂含有10⁶CFU/g以上的活性植物乳杆菌CGMCCNO.8246。

植物乳杆菌CGMCC NO.8246含量测定方法是本技术领域的技术人员熟知的MRS平板菌落计数法。

在所述的药物组合物中，所述植物乳杆菌CGMCC NO.8246菌剂的量是所述药物组合物重量的15-35%，优选地是18-32%，更优选地是20-30%。

根据本发明，在药学上可接受的载体应该是指在药学领域中的常规药物载体，例如是一种或多种选自在药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂或矫味剂的载体。

根据本发明，所述的填充剂应该理解是用来增加片剂重量和体积而便于压片的辅料稀释剂；或者应该理解是用以吸收原料中多余液体成分的辅料吸收剂。

所述的填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸钙或微晶纤维素。

优选地，所述的填充剂选自淀粉、蔗糖或微晶纤维素。

更优选地，所述的填充剂选自淀粉或微晶纤维素。

根据本发明，所述的润湿剂应该理解是药物本身无粘性，但可润湿其药物原辅料并诱发其粘性而制成颗粒的液体。

所述的润湿剂选自水、乙醇、淀粉或糖浆。

优选地，所述的润湿剂选自水、乙醇或淀粉。

本发明使用润湿剂的量是以所述药物组合物总重量计0.1-3.0%。

根据本发明，所述的粘合剂应该理解是当原料药物本身无粘性或粘性不足时，需加入粘性物质以便于制粒，这种粘性物质称为粘合剂。

所述的粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮。

优选地，所述的粘合剂选自纤维素衍生物、明胶或聚乙烯吡咯烷酮。

更优选地，所述的粘合剂选自明胶或聚乙烯吡咯烷酮。

本发明使用粘合剂的量是以所述药物组合物总重量计0.5-5.0%。

根据本发明，所述的崩解剂应该理解是一种能够加入片剂中而促进其片剂在胃肠液中快速崩解成细小粒子的辅料。人们知道，片剂经过压缩后的硬度大，如果其中不含有可以促进崩解作用的辅料，它在胃肠道中崩解很慢，影响疗效。

所述的崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠。

优选地，所述的崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂或碳酸氢钠。

更优选地，所述的崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素或碳酸氢钠。

本发明使用崩解剂的量是以所述药物组合物总重量计5.0-15.0%。

根据本发明，所述的润滑剂应该理解是一种有利于提高片剂在制粒过程中的流动性，防止片剂材料粘附在制片机模子上，有利于片剂脱模的化学物质。

所述的润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇。

优选地，所述的润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇。

更优选地，所述的润滑剂选自滑石粉或硬脂酸钙。

本发明使用润滑剂的量是以所述药物组合物总重量计0.5-3.0%。

根据本发明，所述的矫味剂应该理解是在药品中用以改善或屏蔽药物不良气味和味道，使病人难以觉察药物强烈苦味或其它异味，例如辛辣、刺激等的药用辅料。

所述的矫味剂例如选自单糖浆、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬、茴香或薄荷油的芳香剂；海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素或羧甲基纤维素钠的胶浆剂；柠檬酸、酒石酸与碳酸氢钠混合物的泡腾剂。

优选地，所述的矫味剂选自单糖浆、蔗糖、橙皮糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬或薄荷油的芳香剂；海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶或羧甲基纤维素钠的胶浆剂；酒石酸与碳酸氢钠混合物的泡腾剂。

更优选地，所述的矫味剂选自蔗糖、橙皮糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬油芳香剂；海藻酸钠或阿拉伯胶的胶浆剂；酒石酸与碳酸氢钠混合物的泡腾剂。

本发明使用矫味剂的量是以所述药物组合物总重量计0.5%-2.0%。

本发明的植物乳杆菌CGMCC NO.8246菌剂可以与在药学上可接受的载体或赋形剂组合制成各种剂型，例如颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液，其中在药学上可接受的载体或赋形剂可以根据不同剂型进行选择，所使用的这些载体或赋形剂及其用量对于制药技术领域的普通技术人员都是容易确定的，也是显而易见的。

在本发明中，采用制药技术领域的普通技术人员熟知的普遍使用的方法和设备制备本发明药物颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。

所述的“剂型”一般应该理解是适用于人的单剂量药物形式，单个剂型含有为达到所需药量的预定活性物质，例如本发明的植物乳杆菌CGMCC NO.8246菌剂。

在本发明中，所述的发酵食品是使用含有植物乳杆菌CGMCC NO.8246菌种的发酵剂生产的乳制品、豆制品与果蔬制品。。

所述发酵剂的制备方法如下：

A、培养基的制备：使用以所述培养基总重量计87.7%水将10%酶水解脱脂乳、0.5%葡萄糖、1.5%胰蛋白胨与0.3%酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，这样得到所述的培养基；

B、保护剂的制备：使用水与保护剂原料制备得到含有100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸钠的保护剂；

C、植物乳杆菌CGMCC NO.8246按照以所述培养基的重量计2-4%接种量接种到在温度110-120℃下灭菌8-12min的所述培养基中，然后在温度37℃下培养18h，用pH7.2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述保护剂重悬达到浓度10¹⁰CFU/mL；接着，让该悬浮液在温度37℃下预培养60min，再采用冻干法制成所述的发酵剂。

所述的乳制品是牛奶、酸奶油或干酪。

在本发明中，所述的牛奶应该理解是牛乳、马乳或还原乳。所述的还原乳是用以还原乳总重量计10-15%奶粉与85-90%软化水配制的。所述的奶粉是目前市场上广泛销售的产品。

所述的酸奶油是稀奶油经乳酸菌发酵制成的奶油。酸奶油比甜奶油有更多的优越性，香味更浓郁，奶油产量也更高；另外由于乳酸菌的代谢活动抑制了有害微生物，所以消毒杀菌后再次污染微生物的风险也较低。

所述的干酪是由牛奶经发酵制成的一种营养价值很高的食品。

所述的豆制品是豆奶、豆豉或豆酱。它们都是我国的传统食品或调味品。

所述的果蔬制品是黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。

在生产乳制品、豆制品与果蔬制品时，按照下述方法使用本发明的植物乳杆菌CGMCC NO.8246菌剂发酵剂：

通常，在生产乳制品、豆制品和果蔬制品的常规生产过程中，把本发明的植物乳杆菌CGMCC NO.8246菌剂发酵剂按照常规使用量接种到待处理的原料中，在能够使所述植物乳杆菌CGMCC NO.8246繁殖的温度、压力下进行发酵或存活，其代谢产物使发酵制品具有一定的酸度、香味等优异特性，同时使产品延长了保藏时间，改善了产品营养价值和消化性。

本发明的植物乳杆菌CGMCC NO.8246具有耐酸性，在体外对铜离子有良好的耐受能力，能够耐受起始浓度为500mg/L的铜离子溶液。并且对铜离子有较强的吸附作用，可降低小鼠肝脏、肾脏、脑中的铜含量，并能显著改善小鼠损伤指标，缓解铜中毒小鼠的病理症状。所述的植物乳杆菌CGMCC NO.8246用于制备缓解铜中毒的药物组合物与发酵食品，具有非常广泛的应用前景。

附图说明

图1是植物乳杆菌CGMCC NO.8246于含起始浓度为50mg/L,150mg/L,500mg/L的铜离子培养基中的生长曲线；

图2是植物乳杆菌CGMCC NO.8246对铜离子的吸附情况。

其中：菌株18即为本专利菌株CGMCC NO.8246，它与菌株14、ST-3为植物乳杆菌；NFM4为保加利亚乳杆菌；24为干酪乳杆菌；Z7、LGG、LR为鼠李糖乳杆菌；双歧为两歧双歧杆菌；L.hel、13为瑞氏乳杆菌；2-3为德氏乳杆菌；La为嗜酸乳杆菌；N39、N38、N32均为分离自发酵奶酒的乳酸菌。

图3是植物乳杆菌CGMCC NO.8246对铜暴露小鼠肝脏，肾脏，脑中铜水平的降低作用。

具体实施方式

实施例1：植物乳杆菌CGMCC NO.8246对铜离子的耐受能力实验

在无菌条件下，向1L水中加入0.1965gCuSO₄·5H₂O，得到50mg/L的铜离子水溶液。使用这种铜离子水溶液溶解MRS培养基固体配料，得到含50mg/L铜离子的MRS液体培养基。MRS培养基是本技术领域的技术人员熟知的培养基，它含有蛋白胨鱼粉、酵母浸膏、葡萄糖、醋酸钠、柠檬酸二铵、吐温80、硫酸镁、硫酸锰，pH6.2～6.4。

以与前面描述的同样方式配制含有50mg/L、150mg/L与500mg/L铜离子浓度的MRS液体培养基。将进入稳定期的植物乳杆菌CGMCC NO.8246按照以含铜的MRS液体培养基重量计2%接种量接种于所述的含铜MRS液体培养基中，在37℃条件下进行培养，用96孔板法每20min测一次OD值，持续24h，得到如附图1所示的植物乳杆菌CGMCC NO.8246生长曲线。另外，将1mL所述的菌液接入不含铜的MRS液体培养基中，在同样条件下进行培养，其结果作为空白对照结果，这些试验结果也列于附图1中。

由附图1可以看出，在50mg/L、150mg/L与500mg/L铜离子浓度下，植物乳杆菌CGMCCNO.8246在24h内生长量与空白对照组接近吻合，因此，其结果表明植物乳杆菌CGMCCNO.8246对铜离子具有良好的耐受能力。

实施例2：植物乳杆菌CGMCC NO.8246对铜离子的吸附能力实验

按照耐酸性（在pH3.0环境中能够生长）的筛选标准，从我国传统食品，例如泡菜，发酵奶酒中筛选出16株乳酸菌，将这16株乳酸菌在无菌条件下进行纯化和活化，纯化和活化时乳酸菌使用MRS培养基。得到的菌体转移到装有50mg/L铜离子浓度溶液的容器中，而空白组则转移到去离子水中。根据菌体质量确定蓝盖瓶中液体的体积，使菌体的最终浓度达到1g/L。将以上样品于温度37℃下培养2h。使用Beckman离心机以转速6000r/min离心20min，再用无菌水洗涤、离心一次。分离除去上清液，向得到的菌体中加入纯硝酸，放入微波消解炉中消解20min，得到的消解液使用原子吸收光谱分析仪（Spectr AA220,Varian,USA）测定铜离子含量，以确定不同菌株吸附铜离子的能力。

其试验结果如附图2所示。由附图2可以看出，不同的菌种对铜离子的吸附能力差异较大。其中植物乳杆菌CGMCC NO.8246的吸附能力最强，可吸附19700μg/g铜离子。

实施例3：植物乳杆菌CGMCC NO.8246灌喂小鼠的耐受剂量实验

将植物乳杆菌CGMCC NO.8246冻干菌粉重悬于脱脂乳粉中，制成浓度为2.0×10⁹CFU/mL的悬液。取约20g健康雄性C57小鼠10只，每日给予该浓度悬液灌胃一次，观察一周，记录死亡和体重情况。

这些试验结果列于表1中。这些结果表明，喂食浓度2.0×10⁹CFU/mL的植物乳杆菌CGMCC NO.8246未对小鼠造成明显影响，体重明显上升，无死亡现象产生。小鼠外观无明显病理症状。

表1：喂食浓度2.0×10⁹CFU/mL的植物乳杆菌CGMCC NO.8246对小鼠体重的变化情况

注：-：小鼠无死亡

实施例4：植物乳杆菌CGMCC NO.8246对铜暴露小鼠体内铜水平的降低作用

取20-25g健康雄性C57小鼠60只，随机分为3组，每组含小鼠20只：阴性对照组，硫酸铜暴露模型对照组，植物乳杆菌CGMCC NO.8246干预组。实验0-4周，阴性空白对照组灌胃0.2mL脱脂乳；其余2组灌胃0.2mL铜浓度为10g/L硫酸铜。第一次灌胃结束1小时后，植物乳杆菌CGMCC NO.8246干预组灌喂0.2mL按本说明书实施例3制备的浓度2.0×10⁹CFU/mLCGMCC NO.8246脱脂乳悬液。实验结束后取血并处死小鼠，分别取肝、肾，脑在按照与前面所述的相同消化处理后，采用如前所述的原子吸收分光光度法测定铜含量。

这些测定结果列于附图3中。由附图3可以看出，本发明的植物乳杆菌CGMCC NO.8246干预组中小鼠肝脏、肾脏、脑中的铜含量均比阴性对照组高，但均低于铜模型对照组。这说明植物乳杆菌CGMCC NO.8246干预确实具有降低铜暴露小鼠体内铜含量的作用。

实施例5：植物乳杆菌CGMCC NO.8246对铜中毒导致血清中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）含量升高的的缓解作用

取20-25g健康雄性C57小鼠60只，随机分为3组，每组含小鼠20只：阴性对照组，硫酸铜暴露模型对照组，植物乳杆菌CGMCC NO.8246干预组。实验0-4周，阴性空白对照组灌胃0.2mL脱脂乳；其余2组灌胃0.2mL铜浓度为10g/L硫酸铜。第一次灌胃结束1小时后，植物乳杆菌CGMCC NO.8246干预组灌喂0.2mL按本说明书实施例3制备的浓度2.0×10⁹CFU/mL脱脂乳悬液。

实验结束后采用摘除眼球法处死小鼠，取血清，采用Ellmam的传统方法（Tissue sulfhydrylgroups."Archives of biochemistry and biophysics82(1):70-77.）及南京建成试剂盒来测定谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）含量。

其试验结果列于下表2。

表2：本发明植物乳杆菌CGMCC NO.8246对铜中毒导致血清中AST、ALT含量升高的的缓解作用

由表2可以看到本发明植物乳杆菌CGMCC NO.8246干预组的小鼠血清中,AST和ALT的含量都低于铜模型对照组，但高于空白对照组。谷草转氨酶主要存在于肝细胞线粒体内，当肝脏发生严重坏死或破坏时，才能引起谷草转氨酶的显著升高。谷丙转氨酶主要存在于肝细胞浆内，被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。如表1所示，相比于空白对照组，铜模型组的谷草转氨酶浓度和谷丙转氨酶浓度都出现明显升高，说明铜毒性确实造成了小鼠体内的肝损伤。而相比于铜模型组，本发明植物乳杆菌CGMCC NO.8246干预组中的谷草转氨酶浓度和谷丙转氨酶含量显著降低，说明本发明植物乳杆菌CGMCC NO.8246的治疗确实能降低铜中毒小鼠血清中AST、ALT的含量，缓解了铜毒性造成的肝损伤影响。

以上动物实验表明，本发明植物乳杆菌CGMCC NO.8246能够显著降低小鼠各器官中的铜含量，减轻小鼠的肝损伤，有效缓解小鼠体内铜毒性效应。

应用实施例1：利用本发明植物乳杆菌CGMCC NO.8246制造含该菌的牛乳

将原料乳脱脂奶在95℃热杀菌20min，然后冷却至4℃，再加入在本发明书描述的植物乳杆菌CGMCC NO.8246发酵剂，使其浓度达到10⁶CFU/mL以上，在4℃下冷藏保存，于是得到含本发明植物乳杆菌活菌CGMCC NO.8246的牛乳。

应用实施例2：利用本发明植物乳杆菌CGMCC NO.8246制造含该菌的豆奶

采用软水浸泡大豆，在温度80℃下浸泡2h，再去除大豆皮。接着，沥去浸泡水，再加沸水磨浆，并在高于80℃的温度条件下保温12min。得到的浆料用150目筛网过滤，接着进行离心分离，得到的离心液即为粗豆奶，再将它加热到温度140-150℃，然后将热粗豆奶迅速导入真空冷却室进行抽真空，所述粗豆奶中的异味物质随着水蒸汽迅速排出。经过真空脱气后，将其温度降至约37℃，再接入本发明的植物乳杆菌CGMCC NO.8246工作发酵剂，使其浓度达到10⁶CFU/mL以上，在温度4℃下冷藏保存，于是得到含本发明植物乳杆菌活菌CGMCC NO.8246的豆奶。

应用实施例3：利用本发明植物乳杆菌CGMCC NO.8246制造含该菌的果蔬饮料

选用新鲜蔬菜洗净后榨汁，接着进行高温瞬间灭菌，在温度140℃下高温热杀菌2秒后，立即降温到温度约37℃，再接入本发明制备的植物乳杆菌CGMCC NO.8246菌剂发酵剂，使其浓度达到10⁶CFU/mL以上，在温度4℃下冷藏保存，于是得到含本发明植物乳杆菌CGMCCNO.8246活菌的果蔬饮料。

应用实施例4：制备含有本发明植物乳杆菌CGMCC NO.8246的胶囊制品

将本发明的植物乳杆菌CGMCC NO.8246在MRS培养基中培养24h，在温度4℃与4000r/min的条件下离心20min，用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗两次，使用脱脂乳重悬菌体使最终菌体浓度达到1×10¹⁰～3×10¹⁰CFU/mL。将菌悬液加入到3%的海藻酸钠溶液中，充分搅拌，使得细胞均匀地分散于海藻酸钠溶液中，然后将此混合液挤压到2%的氯化钙溶液中形成胶粒，静止固化30min，过滤收集胶粒，将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48h，得到含本发明植物乳杆菌CGMCC NO.8246的粉剂，把这种粉剂装入到在目前市场上销售的药用胶囊中，得到所述的胶囊制品。

应用实施例5：使用本发明植物乳杆菌CGMCC NO.8246制备用于生产乳制品、豆制品以及果蔬制品的发酵剂

将植物乳杆菌CGMCC NO.8246按照以所述培养基重量计3%接种量接种于115℃温度下灭菌10min的培养基中，该培养基由以该培养基总重量计10%酶水解脱脂乳、0.5%葡萄糖、1.5%胰蛋白胨、0.3%酵母浸膏和余量水组成，pH6.8。然后，让接种植物乳杆菌CGMCCNO.8246的培养基在温度37℃下培养18h，用pH7.2磷酸盐缓冲液清洗两次，再用保护剂重悬达到浓度10¹⁰CFU/mL。所述的保护剂含有100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖与10g/L L-谷氨酸钠。

接着，让该悬浮液在温度37℃下预培养60min，再进行冷冻干燥，得到所述的乳制品、豆制品以及果蔬制品的发酵剂。

应用实施例6：利用本发明植物乳杆菌CGMCC NO.8246制备发酵乳

鲜奶加糖溶解后，在温度65℃与20MPa条件下进行均质，然后在温度95℃下保温杀菌5min，再将温度降到35℃，加入本发明植物乳杆菌CGMCC NO.8246、商业干粉发酵剂保加利亚乳杆菌和商业干粉发酵剂嗜热链球菌组成的混合菌，它们的质量比例为l:1:1，所述混合菌的接种量为鲜奶重量的0.03％，混匀，在温度35℃下保温发酵，凝乳后，在温度4℃下冷藏24h，得到所述的发酵乳。

应用实施例7：利用本发明植物乳杆菌CGMCC NO.8246制备片剂

分别称取采用冷冻干燥方法制备的本发明植物乳杆菌CGMCC NO.8246菌粉制剂25.7重量份、淀粉55.0重量份、纤维素衍生物4.5重量份、羧甲基淀粉钠12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份与水1.0重量份，混合，采用常规方法制成湿颗粒，然后使用例如中南制药机械厂生产的压片机进行压片，然后使用例如青州市益康中药机械有限公司生产的小型药物干燥机中进行干燥，再包装得到本发明的片剂。

Claims (10)

1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，于2013年9月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.8246，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.权利要求1所述植物乳杆菌在制备缓解铜毒性的药物组合物与发酵食品中的应用。

3.权利要求2所述的应用，其特征在于所述药物组合物是由植物乳杆菌CGMCC NO.8246菌剂及其它在药学上可接受的载体及辅料组成。

4.权利要求3所述的应用，其特征在于所述植物乳杆菌CGMCC NO.8246菌剂中活性植物乳杆菌CGMCC NO.8246大于10⁶CFU/g。

5.权利要求4所述的应用，其特征在于所述植物乳杆菌CGMCC NO.8246菌剂的制备方法是将含有所述植物乳杆菌CGMCC NO.8246的菌液通过常规冷冻干燥工艺制备得到粉剂，它含有10⁶CFU/g以上的活性植物乳杆菌CGMCC NO.8246。

6.根据权利要求3-5任一所述的应用，其特征在于在药学上可接受的载体是一种或多种选自在药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂或矫味剂。

7.根据权利要求3-5任一所述的应用，其特征在于所述的药物组合物是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述发酵食品是使用含有植物乳杆菌CGMCCNO.8246的发酵剂生产的乳制品、豆制品或果蔬制品。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的发酵剂是通过下述制备步骤得到的：

A、培养基的制备：使用以所述培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，这样得到所述的培养基；

B、保护剂的制备：使用水与保护剂原料混合制备得到含有100g/L脱脂奶粉、30ml/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸钠的保护剂；

C、植物乳杆菌CGMCC NO.8246菌种按照以所述培养基的重量计2-4％接种量接种到在温度110-120℃下灭菌8-12min的所述培养基中，然后在温度37℃下培养18h，用pH7.2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述的保护剂重悬达到浓度10¹⁰CFU/ml，得到悬浮液；接着，让该悬浮液在温度37℃下预培养60min，再进行冷冻干燥得到所述的发酵剂。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的乳制品是牛奶、酸奶油或干酪；所述的豆制品是豆奶、豆豉或豆酱；所述的果蔬制品是黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。