CN105462899A - 一种具有缓解pfos毒害功能的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有缓解PFOS毒害功能的植物乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明的植物乳杆菌CCFM737具有耐酸性，在体外对PFOS有良好的耐受能力和吸附能力，能改善PFOS暴露小鼠的血液指标、炎症因子水平和肝脏氧化指标。所述的植物乳杆菌CCFM737用于具有缓解PFOS毒害作用功能的药物组合物与发酵剂，具有非常广泛的应用前景。

Description

一种具有缓解PFOS毒害功能的植物乳杆菌及其应用
【技术领域】
本发明属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种具有缓解PFOS毒害功能的植物乳杆菌及其应用，本发明还涉及所述植物乳杆菌的用途。
【背景技术】
全氟辛烷磺酸(Perfluorooctanesulphonate，PFOS)是众多全氟化合物家族中的代表性物质之一，因其具有良好的理化特性，自从20世纪50年代工业化生产以来，它被广泛用于皮棉制品、地毯防污剂、机械润滑剂、液压油、涂料、制冷剂、表面活性剂、纸制品、表面处理剂、泡沫灭火剂、农药和杀虫剂、医药品和化妆品等生产过程，还大量使用于半导体等电子产品生产过程和化学镀膜领域。数百种全氟化工产品在环境中或在生物体内的最终降解产物之一为PFOS。由于具有稳定的化学性质，PFOS在环境中很难被降解，从而造成其长期的稳定存在，而一旦进入生物体，这些化合物的就很难被排出或者分解。研究表明，PFOS在人体内的半衰期为5.4年。PFOS除了具有疏水性之外还具有疏油的特性。因此，其进入生物体内，不易在脂肪中富集，而是更易与蛋白结合存在于血液、肝脏等组织器官中。与此同时，PFOS的高稳定性使得其在生物体内不断积累，具有生物富集性及其沿食物链的生物放大效应。因其在生物体内的高浓度分布，PFOS对动物和人类健康的潜在影响引起了人们的广泛关注，目前己有许多毒理学实验表明，该类化合物暴露水生生物和哺乳动物将导致多系统的毒性效应，包括肝脏毒性、免疫毒性、生殖和发育毒性以及神经毒性等，甚至有可能诱发肝脏、翠丸、胰脏和乳腺癌变等。已有调查表明PFOS污染已经几乎遍及全球。2001年，PFOS被美国环保署列入持久性污染物黑名单；2009年5月，PFOS被正式被列入《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》。我国属PFOS生产和销售历史较短的国家，但在近些年里发展势头迅猛，许多很具规模的全氟化合物生产企业发展迅速，目前还没有有机氟化合物的替代产品。
作为一种新兴污染物，PFOS的相关研究尚处在起步阶段，目前研究主要集中在环境介质中污染状况的调查分析及毒性研究，关于PFOS的治理研究主要集中在吸附和降解2种方式。而对于由PFOS中毒引起的各种生理病症,目前主要研究其毒性机理，尚没有开发有效的药物来治疗其带来的毒性损伤。但是PFOS的蓄积毒性和中毒症状引起了越来越多的关注，因此寻找一种新的干预或治疗方法显得十分必要。乳酸菌是一类能够使碳水化合物发酵并产生乳酸的细菌的统称，广泛存在于自然发酵乳制品、发酵植物食品，如泡菜、酸菜、青贮饲料以及人肠道中。长期科学研究结果表明，以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，其主要生理功能有：防治乳糖不耐症、恢复人体肠道内菌群平衡维护人体健康、抗肿瘤和预防癌症作用、控制人体内毒素水平、抗氧化作用、保护肝脏并增强肝脏的解毒等功能。乳酸菌作为一种食品级的微生物，不像螯合剂有严重的毒副作用，且已有诸多报道表明其在体外、体内对重金属等污染物具有较好的吸附作用，很有潜力成为具有吸附PFOS，保护机体避免PFOS造成损伤的新型保健食品。因此，筛选出一种对PFOS具备优良耐受和吸附能力以及具有强抗氧化能力的乳酸菌，并且证明它们在动物模型中具有良好的缓解PFOS毒性损伤作用，同时研制这些乳酸菌实际的用途就显得十分必要。本发明试图进一步地挖掘益生菌的功能，开发具有更高保健价值的乳酸菌，为利用膳食策略缓解由PFOS导致的中毒效应开辟出新的途径和解决方案。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CCFM737。
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种乳酸菌，利用形态特征、培养性状和生理生化特征等微生物学特性对该乳酸菌鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CCFM737,该菌株已于2015年10月8日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.11472。
所述的植物乳杆菌CCFM737具有下述性质：
⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH2.5环境下存活良好；
⑵在体外含有PFOS的培养基中培养，对PFOS有良好的耐受能力；
⑶在体外含有PFOS的水溶液中孵育，对PFOS有良好的吸附能力；
⑷具有缓解PFOS暴露小鼠中毒症状，改善PFOS暴露小鼠肝损伤程度的作用。
所述的植物乳杆菌CCFM737在制备缓解PFOS中毒的药物组合物与/或发酵剂中的应用也属于本发明要求保护的范围。
根据本发明的一种优选实施方式，所述的药物组合物是由植物乳杆菌CCFM737菌剂与在药学上可接受的载体组成的。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的植物乳杆菌CCFM737菌剂是将含有所述植物乳杆菌CCFM737的菌液通过常规冷冻干燥工艺制备或其它方法制备所得到的粉剂，它含有106CFU/g以上的活性植物乳杆菌CCFM737。
根据本发明的另一种优选实施方式，在药学上可接受的载体是一种或多种选自在药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂或矫味剂的载体。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的药物组合物是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵剂是通过下述制备步骤得到的：
A、培养基的制备：使用以所述培养基总重量计87.7％水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，这样得到所述的培养基；
B、保护剂的制备：使用水与保护剂原料混合制备得到含有100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/LL-谷氨酸钠的保护剂；
C、将植物乳杆菌CCFM737菌种按照以所述培养基的重量计1-5％接种量接种到在温度110-120℃下灭菌8-12min的所述培养基中，在温度37℃下培养18h，用pH7.2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述保护剂重悬达到浓度1010CFU/ml；接着，让该悬浮液在温度37℃下预培养60min，再进行冷冻干燥得到所述的发酵剂。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CCFM737，该菌株已于2015年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类学命名为植物乳杆菌Lactobacillusplantarum，其保藏号为CGMCCNo.11472，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明人根据下述筛选标准，通过大量筛选实验与分析验证，从我国传统食品，例如泡菜，发酵奶酒中筛选出的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CCFM737具有下述性质:
⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH2.5环境下存活良好；
⑵在体外含有PFOS的培养基中培养，对PFOS有较好的耐受能力；
⑶在体外含有PFOS的水溶液中孵育，对PFOS有良好的吸附能力；
⑷具有缓解PFOS暴露小鼠中毒症状，改善PFOS暴露小鼠肝损伤程度的作用。
下面将详细描述这些实验与分析认证结果。
1、具有耐酸性，在pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH2.5环境下存活良好
将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CCFM737接种于MRS培养基(例如青岛海博生物技术有限公司的产品)中，在温度37℃下培养18h，再经MRS培养液传代培养2～3次后，以1％的接种量分别接种于不同pH值(3.0-9.0)的MRS液体培养基中，在温度37℃下培养18h，测定初始和培养结束后的OD600值，利用这个值测量在细菌培养液中的细胞浓度，从而估计细菌的生长情况。OD600值是采用分光光度法在波长600nm处测定的细菌培养液的吸光值，它通常用于表示在细菌培养液中细胞浓度，以确定液体培养物中细菌的生长情况。
试验结果证明植物乳杆菌CCFM737在pH3.0-9.0的环境中生长良好，因此得以进行后续实验。采用与前面所述的同样培养方式，用1.0mLpH7.2PBS(磷酸盐缓冲液)清洗菌体两次，再用1.0mLpH7.2磷酸盐缓冲液重悬，其重悬乳杆菌菌体与9.0mLpH2.5人工胃液混合，然后在温度37℃下进行培养，分别在开始(0h)和3h时取样，用MRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是在该培养液中在第3h时的活菌数对数值与在第0h时活菌数对数值之比，以％表示。本发明筛选存活率在80％以上的菌株进行后续研究。
实验结果表明，植物乳杆菌CCFM737在pH2.5的人工胃液环境中的存活率在90％以上。由此可见，植物乳杆菌CCFM737具有耐酸性，在pH2.5的环境下存活良好。
2、在体外含PFOS的培养基中培养，对PFOS具有良好的耐受能力
植物乳杆菌CCFM737对PFOS耐受能力通过最低抑制浓度(MIC)方法测定。配制100mg/L的PFOS溶液作为PFOS的母液，然后用孔径大小为0.22μm的无菌过滤器进行过滤。将除菌后的PFOS母液按比例添加于MRS琼脂培养基中混匀，使其终浓度分别为1.0，2.0，5.0，10，20，30，50mg/L，并分别浇注平板。将每个琼脂平板划分为四等份，各在每个分区各滴加10μL植物乳杆菌CCFM737菌悬液，每个PFOS浓度的平板做2个平行，并以不添加PFOS的琼脂平板作为空白对照。在37℃下培育48h后记录每个分区中滴加菌的生长情况。抑制菌株生长的最低PFOS浓度即为菌株的PFOSMIC。从而得到如附表1所示的植物乳杆菌CCFM737对PFOS的MIC值。
附表1的结果表明，本发明植物乳杆菌CCFM737对PFOS的具有良好的耐受能力。
3、在体外含PFOS的水溶液中孵育，对PFOS具有良好的吸附能力
菌体吸附：在无菌条件下，按照耐酸性(在pH3.0能够生长)的筛选标准，从我国传统食品，例如泡菜，发酵奶酒中筛选出10株乳酸菌。对这10株乳酸菌进行纯化和活化培养后，按1％(v/v)接种量接于MRS液体培养基，37℃培养20h。然后在10000r/min条件下离心20min，取沉淀用超纯水清洗后继续在10000r/min条件下离心20min，取沉淀得到活菌体细胞，即湿菌体。将湿菌体重悬在50mg/LPFOS溶液中，并使最终菌体浓度达到1g干菌体/L(将湿菌体重悬在不含PFOS的超纯水中作为空白对照)。使用0.1M的NaOH或HCl溶液将含菌液的PFOS溶液的pH迅速调整至3.0，添加少量的NaOH或HCl(小于0.5mL)其离子强度对PFOS吸附的影响可以忽略。随后将装有100mL样液的250mL锥形瓶置于37℃、150rpm摇床培养，6h后取样测定，2次平行试验取平均值。
717阴离子交换树脂吸附：在250mL锥形瓶中加入100mLPFOS溶液和定量717阴离子交换树脂，并使最终吸附剂浓度达到1g吸附剂/L，使用0.1M的NaOH或HCl溶液将含717阴离子交换树脂的PFOS溶液的pH迅速调整至3.0。将锥形瓶置于恒温摇床中在37℃、150rpm条件下进行吸附实验。6h时取少量上清液(0.1mL),并用0.22mm的水膜过滤，以期测定717阴离子交换树脂对PFOS的吸附能力。
PFOS吸附量的测定：吸附实验后，样液在10000r/min下离心20分钟，并用0.22μm的水膜过滤。PFOS的浓度用具有WatersSYNAPTMS系统的UPLC-MS测定，采用AcquityUPLCBEHC18柱(2.1×100mm,1.7μm，WatersCo.)，柱温35℃，进样量为1μL。用100％(v/v)的乙腈溶液(溶液A)和0.1％(v/v)甲酸水溶液(溶液B)作为洗脱液，进行梯度清洗，流速是0.3mL/min，进样量1μL。梯度洗脱条件如表2所示：
质谱条件：电离源为ESI源；MRM检测；MS+检测；Capillary(毛细管)：3.0kV；Conc(椎体)：40.00V；SourceTemperature(放射源温度)：120℃；Desolvation(去溶剂化)温度：400℃；ConcGasFlow：50L/h；DesolvationGasFlow：700L/h。气体流速为0.1mL/min；质荷比扫描范围：100-2000；扫面时间1s，间隔0.061s。结果用MassLynxV4.1(Waters公司)分析；在这项研究中，PFOS的检测限为：0.1-5.0ppm。根据吸附前后PFOS的浓度差异计算乳酸菌和717阴离子交换树脂分别对PFOS的吸附量。这些测定结果列于附图1中。
附图1清楚地表明，与其它试验菌株相比，本发明植物乳杆菌CCFM737对PFOS的吸附量最大，且其干重吸附率超过等质量717阴离子交换树脂的吸附率，因此，植物乳杆菌CCFM737对PFOS具有良好的吸附能力。
4、具有缓解PFOS暴露小鼠中毒症状的作用
取20-25g健康雄性C57BL/6J小鼠30只，随机分为3组：阴性对照组，PFOS暴露模型组与植物乳杆菌CCFM737干预组，每组含小鼠10只。试验第一天，阴性对照组与PFOS暴露模型组灌胃0.5mL脱脂乳；植物乳杆菌CCFM737干预组灌胃0.5mL按本说明书实施例3制备的浓度2.0×109CFU/mLCCFM737脱脂乳悬液。持续灌胃10天。第11天，阴性对照组灌胃0.5mL普通饮用水；PFOS暴露模型组和植物乳杆菌CCFM737干预组分别灌胃0.5mL0.4gPFOS/kgBW的PFOS溶液。在第11天灌胃结束24小时后处死所有小鼠，眼眶取血，血液在3,000g离心15min，血清用于测定小鼠的血液生化参数包括谷丙转氨酶(alanineaminotransferase,ALT)，谷草转氨酶(aspartateaminotransferase,AST)，碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)，γ-谷氨酰转移酶(gamma-glutamyltranspeptidase,γ-GT)。血清IL-2，IL-4，IL-6，TNF-β，IFN-γ采用双抗体夹心ELISA法操作，严格按照试剂说明书进行。肝脏匀浆后测定超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)，过氧化氢酶(catalase,CAT)，丙二醛(malondialdehyde,MDA)，谷胱甘肽(glutathione,GSH)和抗氧化能力(thetotalantioxidativecapacity,T-AOC)的水平。这些测定结果列于附图2，附图3和附图4中。
通过对PFOS暴露模型组及植物乳杆菌CCFM737组干预组小鼠血液学指标，炎症因子，以及肝脏氧化指标比较，发现本发明植物乳杆菌CCFM737能够恢复由PFOS摄入导致的小鼠血清中ALT，AST，ALP，γ-GT活性异常，恢复血清中IL-2，IL-4，IL-6，TNF-β，IFN-γ炎症因子水平，并且能部分恢复肝脏中氧化酶(SOD，CAT，GSH，T-AOC)以及MDA酶的活性，对PFOS造成的肝损伤起到了缓解作用。
本发明的植物乳杆菌CCFM737具有下述生物学特性：
菌体特征：呈革兰氏染色阳性杆状细菌，菌体约0.8-1.3μm宽，2-5μm长，不形成芽孢，两端呈钝圆形，参见附图5。
菌落特征：在MRS培养基上形成明显的菌落，直径在0.3-2.3mm之间，正面形态圆形,侧面形态呈突起状，边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素，参见附图6。
生长特性：该菌株的最低生长温度为12℃，最高生长温度为43℃，在温度30-37℃下生长最佳，最高和最低初始生长pH为9.0和2.5，最适生长初始pH为6.0；本发明植物乳杆菌CCFM737菌株的延迟期相对较短，4h左右开始进入对数生长期，16h就达到稳定期。
本发明植物乳杆菌保存方法：
所述植物乳杆菌CCFM737原始菌种在温度-75℃下以30％重量百分数的甘油悬液形式保存，或者在温度4℃下以冷冻干燥菌粉的形式保存备用。
本发明植物乳杆菌CCFM737培养方法与培养条件：在MRS培养基中在兼性厌氧条件与温度37℃的条件下培养18-36h即可使用。
本发明还涉及所述的植物乳杆菌CCFM737在制备具有缓解PFOS毒性损伤作用的药物组合物与发酵剂中的用途。
所述的药物组合物是植物乳杆菌CCFM737菌剂与在药学上可接受的载体组成的。
根据本发明，所述的植物乳杆菌CCFM737菌剂是采用通常的冷冻干燥制备技术将含有所述的植物乳杆菌的菌液制成的冻干粉剂，或是采用其它方法如喷雾干燥法制备得到的粉剂。
所述的植物乳杆菌CCFM737菌剂含有106CFU/mL以上的活性植物乳杆菌CCFM737。
植物乳杆菌CCFM737含量测定方法是本技术领域的技术人员熟知的MRS平板菌落计数法。
在所述的药物组合物中，所述植物乳杆菌CCFM737菌剂的量是所述药物组合物重量的15-35％，优选的是18-32％，更优选的是20-30％。
根据本发明，在药学上可接受的载体应该是指在药学领域中的常规药物载体，例如是一种或多种选自在药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂或矫味剂的载体。
根据本发明，所述的填充剂应该理解是用来增加片剂重量和体积而便于压片的辅料稀释剂；或者应该理解是用以吸收原料中多余液体成分的辅料吸收剂。
所述的填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸钙或微晶纤维素。
优选地，所述的填充剂选自淀粉、蔗糖或微晶纤维素。
更优选地，所述的填充剂选自淀粉或微晶纤维素。
根据本发明，所述的润湿剂应该理解是药物本身无粘性，但可润湿其药物原辅料并诱发其粘性而制成颗粒的液体。
所述的润湿剂选自水、乙醇、淀粉或糖浆。
优选地，所述的润湿剂选自水、乙醇或淀粉。
本发明使用润湿剂的量是以所述药物组合物总重量计0.1-3.0％。
根据本发明，所述的粘合剂应该理解是当原料药物本身无粘性或粘性不足时，需加入粘性物质以便于制粒，这种粘性物质称为粘合剂。
所述的粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮。
优选地，所述的粘合剂选自纤维素衍生物、明胶或聚乙烯吡咯烷酮。
更优选地，所述的粘合剂选自明胶或聚乙烯吡咯烷酮。
本发明使用粘合剂的量是以所述药物组合物总重量计0.5-5.0％。
根据本发明，所述的崩解剂应该理解是一种能够加入片剂中而促进其片剂在胃肠液中快速崩解成细小粒子的辅料。人们知道，片剂经过压缩后的硬度大，如果其中不含有可以促进崩解作用的辅料，它在胃肠道中崩解很慢，影响疗效。
所述的崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠。
优选地，所述的崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂或碳酸氢钠。
更优选地，所述的崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素或碳酸氢钠。
本发明使用崩解剂的量是以所述药物组合物总重量计5.0-15.0％。
根据本发明，所述的润滑剂应该理解是一种有利于提高片剂在制粒过程中的流动性，防止片剂材料粘附在制片机模子上，有利于片剂脱模的化学物质。
所述的润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇。
优选地，所述的润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇。
更优选地，所述的润滑剂选自滑石粉或硬脂酸钙。
本发明使用润滑剂的量是以所述药物组合物总重量计0.5-3.0％。
根据本发明，所述的矫味剂应该理解是在药品中用以改善或屏蔽药物不良气味和味道，使病人难以觉察药物强烈苦味或其它异味，例如辛辣、刺激等的药用辅料。
所述的矫味剂例如选自单糖浆、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬、茴香或薄荷油的芳香剂；海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素或羧甲基纤维素钠的胶浆剂；柠檬酸、酒石酸与碳酸氢钠混合物的泡腾剂。
优选地，所述的矫味剂选自单糖浆、蔗糖、橙皮糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬或薄荷油的芳香剂；海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶或羧甲基纤维素钠的胶浆剂；酒石酸与碳酸氢钠混合物的泡腾剂。
更优选地，所述的矫味剂选自蔗糖、橙皮糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬油芳香剂；海藻酸钠或阿拉伯胶的胶浆剂；酒石酸与碳酸氢钠混合物的泡腾剂。
本发明使用矫味剂的量是以所述药物组合物总重量计0.5％-2.0％。
本发明的植物乳杆菌CCFM737菌剂可以与在药学上可接受的载体或赋形剂组合制成各种剂型，例如颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液，其中在药学上可接受的载体或赋形剂可以根据不同剂型进行选择，所使用的这些载体或赋形剂及其用量对于制药技术领域的普通技术人员都是容易确定的，也是显而易见的。
在本发明中，采用制药技术领域的普通技术人员熟知的普遍使用的方法和设备制备本发明药物颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
所述的“剂型”一般应该理解是适用于人的单剂量药物形式，单个剂型含有为达到所需药量的预定活性物质，例如本发明的植物乳杆菌CCFM737菌剂。
在本发明中，所述的发酵剂是将植物乳杆菌CCFM737菌种重悬于保护剂并通过冷冻干燥后得到的活体菌粉。
所述发酵剂的制备方法如下：
A、培养基的制备：使用以所述培养基总重量计87.7％水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，这样得到所述的培养基；
B、保护剂的制备：使用水与保护剂原料制备得到含有100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/LL-谷氨酸钠的保护剂；
C、植物乳杆菌CCFM737按照以所述培养基的重量计2-4％接种量接种到在温度110-120℃下灭菌8-12min的所述培养基中，然后在温度37℃下培养18h，用pH7.2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述保护剂重悬达到浓度1010CFU/ml；接着，让该悬浮液在温度37℃下预培养60min，再采用冻干法制成所述的发酵剂。
本发明的植物乳杆菌CCFM737具有耐酸性，在体外对PFOS有良好的耐受和吸附能力，可缓解小鼠PFOS暴露导致的毒性损伤。所述的植物乳杆菌CCFM737可用于制备具有缓解PFOS毒性损伤功能的药物组合物与发酵剂，具有非常广泛的应用前景。
【附图说明】
图1是10株乳酸菌和717阴离子交换树脂对PFOS的吸附情况比较。
其中：CCFM737,CCFM240和CCFM241为植物乳杆菌；CCFM14为罗伊氏乳杆菌；CCFM419为发酵乳杆菌；CCFM15为加氏乳杆菌；CCFM29和CCFM4为保加利亚乳杆菌；CCFM136为高加索酸奶乳杆菌。CCFM6为嗜酸乳杆菌；CCFM5为干酪乳杆菌；717树脂为717阴离子交换树脂。
图2是植物乳杆菌CCFM737对PFOS暴露导致的小鼠血清ALT，AST，ALP，γ-GT活性异常的恢复作用；a,b,a’,b’A,B,A’,B’表示不同字母所代表的组别都存在显著性差异(p<0.05)。
图3是植物乳杆菌CCFM737对PFOS暴露导致的小鼠肝脏中氧化酶(SOD，CAT，GSH，T-AOC)以及MDA酶的活性异常的缓解作用；不同字母所代表的组别都存在显著性差异(p<0.05)。
图4是植物乳杆菌CCFM737对PFOS暴露导致的小鼠血清炎症因子IL-2，IL-4，IL-6，TNF-β，IFN-γ水平异常的恢复作用；不同字母所代表的组别都存在显著性差异(p<0.05)。
图5是植物乳杆菌CCFM737的菌体形态(1000×)。
图6是植物乳杆菌CCFM737的菌落形态。
【具体实施方式】
实施例1：植物乳杆菌CCFM737对PFOS的耐受能力实验
植物乳杆菌CCFM737对PFOS耐受能力通过最低抑制浓度(MIC)方法测定。配制100mg/L的PFOS溶液作为PFOS的母液，然后用孔径大小为0.22μm的无菌过滤器进行过滤。将除菌后的PFOS母液按比例添加于MRS琼脂培养基中混匀，使其终浓度分别为1.0，2.0，5.0，10，20，30，50mg/L，并分别浇注平板。将每个琼脂平板划分为四等份，各在每个分区各滴加10μL植物乳杆菌CCFM737菌悬液，每个PFOS浓度的平板做2个平行，并以不添加PFOS的琼脂平板作为空白对照。在37℃下培育48h后记录每个分区中滴加菌的生长情况。抑制菌株生长的最低PFOS浓度即为菌株的PFOSMIC。从而得到如附表1所示的植物乳杆菌CCFM737对PFOS的MIC值。由附表1可以看出，本发明植物乳杆菌CCFM737对PFOS的具有良好的耐受能力。
表1PFOS对植物乳杆菌CCFM737的最低抑制浓度(MIC)
实施例2：植物乳杆菌CCFM737对PFOS的吸附能力实验
在体外含PFOS水溶液中孵育，对PFOS有良好的吸附能力
菌体吸附：在无菌条件下，按照耐酸性(在pH3.0能够生长)的筛选标准，从我国传统食品，例如泡菜，发酵奶酒中筛选出10株乳酸菌。对这10株乳酸菌进行纯化和活化培养后，按1％(v/v)接种量接于MRS液体培养基，37℃培养20h。然后在10000r/min条件下离心20min，取沉淀用超纯水清洗后继续在10000r/min条件下离心20min，取沉淀得到活菌体细胞，即湿菌体。将湿菌体重悬在50mg/LPFOS溶液中，并使最终菌体浓度达到1g干菌体/L(将湿菌体重悬在不含PFOS的超纯水中作为空白对照)。使用0.1M的NaOH或HCl溶液将含菌液的PFOS溶液的pH迅速调整至3.0，添加少量的NaOH或HCl(小于0.5mL)其离子强度对PFOS吸附的影响可以忽略。随后将装有100mL样液的250mL锥形瓶置于37℃、150rpm摇床培养，6h后取样测定，2次平行试验取平均值。
717阴离子交换树脂吸附：在250mL锥形瓶中加入100mLPFOS溶液和定量717阴离子交换树脂，并使最终吸附剂浓度达到1g吸附剂/L，使用0.1M的NaOH或HCl溶液将含717阴离子交换树脂的PFOS溶液的pH迅速调整至3.0。将锥形瓶置于恒温摇床中在37℃、150rpm条件下进行吸附实验。6h时取少量上清液(0.1mL),并用0.22mm的水膜过滤，以期测定717阴离子交换树脂对PFOS的吸附能力。
PFOS吸附量的测定：
吸附实验后，样液在10000r/min下离心20分钟，并用0.22μm的水膜过滤。PFOS的浓度用具有WatersSYNAPTMS系统的UPLC-MS测定，采用AcquityUPLCBEHC18柱(2.1×100mm,1.7μm，WatersCo.)，柱温35℃，进样量为1μL。用100％(v/v)的乙腈溶液(溶液A)和0.1％(v/v)甲酸水溶液(溶液B)作为洗脱液，进行梯度清洗，流速是0.3mL/min，进样量1μL。梯度洗脱条件如表2所示：
表2梯度洗脱条件
质谱条件：电离源为ESI源；MRM检测；MS+检测；Capillary(毛细管)：3.0kV；Conc(椎体)：40.00V；SourceTemperature(放射源温度)：120℃；Desolvation(去溶剂化)温度：400℃；ConcGasFlow：50L/h；DesolvationGasFlow：700L/h。气体流速为0.1mL/min；质荷比扫描范围：100-2000；扫面时间1s，间隔0.061s。结果用MassLynxV4.1(Waters公司)分析；在这项研究中，PFOS的检测限为：0.1-5.0ppm。根据吸附前后PFOS的浓度差异计算乳酸菌和717阴离子交换树脂分别对PFOS的吸附量。这些测定结果列于附图1中。
附图1清楚地表明，与其它试验菌株相比，本发明植物乳杆菌CCFM737对PFOS的吸附量最大，且其干重吸附率超过等质量717阴离子交换树脂的吸附率，因此，植物乳杆菌CCFM737对PFOS具有良好的吸附能力。
实施例3：植物乳杆菌CCFM737灌喂小鼠的耐受剂量实验
将植物乳杆菌CCFM737冻干菌粉重悬于脱脂乳中，制成浓度为5.0×109cfu/mL的悬液。取约20-25g健康雄性C57BL/6J小鼠10只，每日给予该浓度悬液灌胃一次，观察一周，记录死亡和体重情况。
这些试验结果列于附表3中。这些结果表明，喂食浓度5.0×109cfu/mL的植物乳杆菌CCFM737未对小鼠造成明显影响，体重明显上升，无死亡现象产生。小鼠外观无明显病理症状。
表3喂食植物乳杆菌CCFM737对小鼠体重及存活率的影响
注：-：小鼠无死亡
实施例4：植物乳杆菌CCFM737对PFOS暴露小鼠血液指标的恢复作用
取20-25g健康雄性C57BL/6J小鼠30只，随机分为3组，每组含小鼠10只：阴性对照组，PFOS暴露模型组与植物乳杆菌CCFM737干预组。试验第一天，阴性对照组与PFOS暴露模型组灌胃0.5mL脱脂乳；植物乳杆菌CCFM737干预组灌胃0.5mL按本说明书实施例3制备的浓度2.0×109CFU/mLCCFM737脱脂乳悬液。持续灌胃10天。第11天，阴性对照组灌胃0.5mL普通饮用水；PFOS暴露模型组和植物乳杆菌CCFM737干预组分别灌胃0.5mL0.4gPFOS/kgBW的PFOS溶液。在第11天灌胃结束24小时后处死所有小鼠，眼眶取血后血液在3,000g离心15min，血清用于测定小鼠的血液生化参数包括谷丙转氨酶(alanineaminotransferase,ALT),谷草转氨酶(aspartateaminotransferase,AST),碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP),γ-谷氨酰转移酶(gamma-glutamyltranspeptidase,γ-GT)，结果列于附图2中。炎症因子IL-2，IL-4，IL-6，TNF-β，IFN-γ这些测定结果列于附图3中。
通过对PFOS暴露模型组及植物乳杆菌CCFM737干预组小鼠血液学指标比较，发现本发明植物乳杆菌CCFM737能够缓解由PFOS摄入导致的小鼠血清中ALT，AST，ALP，γ-GT活性异常，对PFOS造成的肝损伤起到了缓解作用。通过炎症因子IL-2，IL-4，IL-6，TNF-β，IFN-γ的测定表明，植物乳杆菌CCFM737能够部分恢复小鼠血清炎症因子IL-2，IL-4，IL-6，TNF-β，IFN-γ的水平，表明植物乳杆菌CCFM737对PFOS造成的炎症反应起到了缓解作用。
实施例5：植物乳杆菌CCFM737是通过降低氧化应激水平减轻PFOS毒害作用
取20-25g健康雄性C57BL/6J小鼠30只，随机分为3组，每组含小鼠10只：阴性对照组，PFOS暴露模型组与植物乳杆菌CCFM737干预组。试验第一天，阴性对照组与PFOS暴露模型对照组灌胃0.5mL脱脂乳；植物乳杆菌CCFM737干预组灌胃0.5mL按本说明书实施例3制备的浓度2.0×109CFU/mLCCFM737脱脂乳悬液。持续灌胃10天。第11天，阴性对照组灌胃0.5mL普通饮用水；PFOS暴露模型组和植物乳杆菌CCFM737干预组分别灌胃0.5mL0.4gPFOS/kgBW的PFOS溶液。在第11天灌胃结束24小时后处死所有小鼠，肝脏匀浆后测定超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD),过氧化氢酶(catalase,CAT),丙二醛(malondialdehyde,MDA),谷胱甘肽(glutathione,GSH)and中抗氧化能力(thetotalantioxidativecapacity,T-AOC)的水平。这些测定结果列于附图4中。
通过对PFOS暴露模型组及植物乳杆菌CCFM737干预组小鼠肝脏氧化指标比较，发现本发明植物乳杆菌CCFM737能够部分恢复小鼠肝脏中SOD，CAT，GSH，T-AOC以及MDA酶的活性，肝脏是PFOS的主要靶器官，而氧化应激是PFOS引起毒性损伤的重要机理，植物乳杆菌CCFM737通过吸附PFOS缓解由PFOS引起的氧化应激，对PFOS造成的肝损伤起到了缓解作用。
以上这些动物实验表明，本发明植物乳杆菌CCFM737能够通过吸附PFOS，抗氧化，起到缓解小鼠PFOS毒性损伤的作用。
应用实施例1：使用本发明植物乳杆菌CCFM738制备发酵剂
按照下述步骤制备发酵剂：
A、培养基的制备：使用以所述培养基总重量计87.7％水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，这样得到所述的培养基；所述的酶水解脱脂乳、葡萄糖、胰蛋白胨与酵母浸膏都是目前市场上销售的产品。
B、保护剂的制备：使用水与保护剂原料制备得到含有100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/LL-谷氨酸钠的保护剂。
C、植物乳杆菌CCFM737按照以所述培养基的重量计3％接种量接种到在温度110-120℃下灭菌8-12min的所述培养基中，然后在温度37℃下培养18h，用pH7.2磷酸盐缓冲液清洗3次，用所述保护剂重悬达到浓度1010CFU/ml；接着，让该悬浮液在温度37℃下预培养60min，再采用冻干法制成所述的发酵剂。
应用实施例2：制备含有本发明植物乳杆菌CCFM737的胶囊制品
将本发明的植物乳杆菌CCFM737在MRS培养基中培养24h，在温度4℃与4000r/min的条件下离心20min，用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗两次，使用脱脂乳重悬菌体使最终菌体浓度达到2×1010CFU/mL。将菌悬液加入到3重量％海藻酸钠溶液中，充分搅拌，使得细胞均匀地分散于海藻酸钠溶液中，然后将此混合液挤压到2重量％氯化钙溶液中形成胶粒，静止固化30min，过滤收集胶粒，将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48h，得到含本发明植物乳杆菌CCFM737的粉剂，把这种粉剂装入到在目前市场上销售的药用胶囊中，得到所述的胶囊制品。
应用实施例3：利用本发明植物乳杆菌CCFM737制备片剂
分别称取采用冷冻干燥方法制备的本发明植物乳杆菌CCFM737菌粉制剂25.7重量份、淀粉55.0重量份、纤维素衍生物4.5重量份、羧甲基淀粉钠12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份与水1.0重量份，混合，采用常规方法制成湿颗粒，然后使用中南制药机械厂生产的压片机进行压片，然后使用青州市益康中药机械有限公司生产的小型药物干燥机中进行干燥，再包装得到本发明的片剂。

Claims (8)

1.一种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CCFM737，该菌株已于2015年10月8日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.11472。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌CCFM737，其特征在于它具有下述性质：
⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH2.5环境下存活良好；
⑵在体外含有PFOS的培养基中培养，对PFOS有良好的耐受能力；
⑶在体外含有PFOS的水溶液中孵育，对PFOS有良好的吸附能力；
⑷具有缓解PFOS暴露小鼠中毒症状，改善PFOS暴露小鼠肝损伤程度的作用。
3.根据权利要求1所述的植物乳杆菌CCFM737在制备具有缓解PFOS毒害功能的药物组合物与/或发酵剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的药物组合物是由植物乳杆菌CCFM737菌剂与在药学上可接受的载体组成的。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述的植物乳杆菌CCFM737菌剂是将含有所述植物乳杆菌CCFM737的菌液通过常规冷冻干燥工艺制备或其它工艺制备所得到的粉剂，它含有106CFU/g以上的活性植物乳杆菌CCFM737。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于在药学上可接受的载体是一种或多种选自在药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂或矫味剂的载体。
7.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于所述的药物组合物是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型。
8.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的发酵剂是通过下述制备步骤得到的：
A、培养基的制备：使用以所述培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，这样得到所述的培养基；
B、保护剂的制备：使用水与保护剂原料混合制备得到含有100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/LL-谷氨酸钠的保护剂；
C、植物乳杆菌CCFM737菌种按照以所述培养基的重量计1-5％接种量接种到在温度110-120℃下灭菌8-12min的所述培养基中，然后在温度37℃下培养18h，用pH7.2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述的保护剂重悬达到浓度1010CFU/ml；接着，让该悬浮液在温度37℃下预培养60min，再进行冷冻干燥得到所述的发酵剂。
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