CN116555043A - 一种可防治辣椒疫病的白色链霉菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可防治辣椒疫病的白色链霉菌XJC2‑1，于2022年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.25981，还涉及所述白色链霉菌XJC2‑1在辣椒疫病中的应用。本发明的白色链霉菌XJC2‑1菌株，在平板上对多种植物病原菌有很强的抑制作用，其制备的抗辣椒疫病药剂浇灌的植株，在接种辣椒疫霉游动孢子后，病情指数远低于对照组。此外，该菌株可与多种化学药剂混配使用，并产生协同效应。本发明的菌株是从土壤分离获得，与自然生态具有天然的和谐相融性，与化学农药相比对土壤生态无毒副作用、无残留。因此，在病害的生物防治实践中具有潜在的商业开发和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及作物病害防治领域，更特别地，涉及一种可防治辣椒疫病的白色链霉菌及其应用。
背景技术
辣椒是人们喜爱的日常蔬菜和食品调料，在生活中扮演不可或缺的角色。在我国丰富精湛的烹饪技艺加持下，辣椒备受喜爱。我国是辣椒种植大国，在全国范围内均有种植。然而辣椒的实际生产面临诸多威胁，其中辣椒疫病(Pepper phytophthora b l ight)成为制约辣椒产量的重要病害之一。
辣椒疫病是由卵菌门霜霉目疫霉属的辣椒疫霉(Phytophthora capsici)引起的一种毁灭性的土传病害，是生产上较难防治的病害之一。其病原菌寄主广泛，能对茄科、葫芦科作物、洋葱、橡胶树、芦荟属、菜豆属等造成危害，在我国辣椒种植区发生普遍。此外，辣椒疫病可发生在苗期，成株期，果期的任一阶段，且可侵染辣椒各个部位，引起根、冠、果腐和叶斑。辣椒生长期高温高湿的气候为辣椒疫霉的侵染创造了有利条件，辣椒疫霉菌在温暖高湿的条件下发展迅速，危害尤其严重，导致不可恢复性整株萎蔫，导致辣椒结果严重减少，给辣椒种植户带来了巨大的经济损失。
目前对辣椒疫病的控制仍然以化学药剂为主，其操作较为简便并且成本较低，但化学杀菌剂的使用容易导致病原菌抗药性增强、环境污染等严重后果。
随着科学研究的进一步深入开展，发现在克服植物病害的抗药性、减少化学杀菌剂对环境的污染、生态的破坏及农副产品中化学农药的残留方面，生防微生物具有独特的优势。据报道，一些放线菌的发酵滤液中存在具有抑制植物病原真菌生长的活性物质，包括酶类、氨基酸、抗生素和糖蛋白等。利用生防菌的次生代谢产物制备的生物农药，具有无污染、无残留、不易使有害生物产生抗药性、与环境相容性高、对人畜安全等特点。因此，大力开展生物防治研究是农业可持续发展的重要途径，具有重要的生产实际意义。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种可防治根肿病的白色链霉菌，于2022年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.25981。
本发明还提供了上述白色链霉菌在防治辣椒疫病中的应用。
本发明还提供了一种防治辣椒疫病的方法，包括将上述的白色链霉菌培养产物施用于作物种植的土中的步骤。
在一个具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：
S1：培养所述白色链霉菌，制备白色链霉菌发酵液；
S2：将所述白色链霉菌发酵液制备成抗辣椒疫病药剂；
S3：将所述抗辣椒疫病药剂施用于所述作物种植的土中。
在一个具体实施方案中，S1中，所述白色链霉菌在高氏一号培养基中培养。
在一个具体实施方案中，S1包括以下步骤：
S11：将所述白色链霉菌接种于高氏一号液体培养基中培养；
S12：于28℃、180rpm的条件下培养5天，得到所述白色链霉菌发酵液。
在一个具体实施方案中，S2中，包括将所述白色链霉菌发酵液去除细胞，得到白色链霉菌发酵滤液的步骤。
优选地，S2中还包括将所述白色链霉菌发酵滤液与抗辣椒疫病的化学药剂混配的步骤。
在一个具体实施方案中，S3中，将所述抗辣椒疫病药剂对所述作物进行定期灌根处理。
在一个具体实施方案中，每两次灌根处理之间的时间间隔为3天。
本发明的白色链霉菌XJC2-1菌株，在平板上对多种植物病原菌有很强的抑制作用，其制备的抗辣椒疫病药剂浇灌的植株，在接种辣椒疫霉游动孢子后，病情指数远低于对照组。此外，该菌株可与多种化学药剂混配使用，并产生协同效应。本发明的菌株是从土壤分离获得，与自然生态具有天然的和谐相融性，与化学农药相比对土壤生态无毒副作用、无残留。因此，在病害的生物防治实践中具有潜在的商业开发和应用价值。
生物材料保藏
本发明纯化的白色链霉菌XJC2-1于2022年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.25981。
附图说明
图1为白色链霉菌XJC2-1的平板形态照片；
图2为白色链霉菌XJC2-1的单菌落形态照片；
图3为白色链霉菌XJC2-1的孢子链及气生菌丝显微照片；
图4示出了白色链霉菌XJC2-1对辣椒疫霉菌丝的抑制作用；
图5示出了白色链霉菌XJC2-1和烯酰吗啉对辣椒疫霉孢子囊形成的影响；
图6示出了白色链霉菌XJC2-1对辣椒疫病的预防盆栽试验；
图7示出了白色链霉菌XJC2-1与烯酰吗啉混配药剂对辣椒疫病的预防盆栽试验。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1、白色链霉菌XJC2-1的白色链霉菌鉴定与保藏
本团队从贵州省松桃县的健康辣椒大田采集根系土壤分离获得的多个菌株经初筛和复筛,分离出一株菌株XJC2-1，经过活体盆栽试验防效测试，确定该菌株对辣椒疫病有较好防治作用。
将菌株XJC2-1在高氏一号培养平板上于28℃下培养5-7d，得到平板形态照片如图1所示，单菌落照片如图2所示，孢子链及气生菌丝如图3所示。
提取菌株的基因组DNA，以细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,SEQI D NO:1，)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGACGACTT-3’,SEQ ID NO:2)。以菌株XJC2-1的基因组DNA为模板，PCR扩增后经电泳检测，测序，得到16S rDNA序列如SEQ I D NO:3所示。将所得的序列结果在NCBI中进行Bl ast比对，选取相关菌株的16SrDNA序列(长1287bp)，使用MEGA 7.0软件的邻近法(Neighbor-Joi n i ng)进行进化树构建，结合形态学特征鉴定该菌株属于白色链霉菌(Streptomyces albus)。
将上述菌株于2022年10月28日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号：CGMCC No.25981。
2.白色链霉菌XJC2-1防治病原菌
2.1白色链霉菌XJC2-1对病原菌的抑菌性
用5mm无菌打孔器在生长旺盛的辣椒疫霉菌边缘打下菌饼，将辣椒疫霉菌饼接于直径为90mm的PDA培养皿中央，以辣椒疫霉菌饼为中心，用接种环蘸取待测拮抗菌接种于PDA培养基上，在距离菌饼2.5cm两侧画2cm长平行直线，每个放线菌株重复3皿，观察菌落形态，并对菌丝进行扫描电镜观察。
结果如图4所示，XJC2-1菌株对辣椒疫霉菌丝具有很强的抑制作用。扫描电镜结果显示XJC2-1对辣椒疫霉菌丝产生了抑制，受到XJC2-1抑制的辣椒疫霉菌丝，菌丝畸形易断裂、扭曲变形、生长稀疏、粗细不均、顶端膨大；对照辣椒疫霉菌丝光滑、生长正常、菌丝生长茂盛、无破裂、无畸形。
2.2.XJC2-1菌株对辣椒疫霉孢子囊形成和游动孢子释放的抑制
将两粒直径5mm的生防菌菌饼，接入装有100mL液体高氏一号培养基的300mL三角瓶中，置于28℃180r/mi n恒温摇床振荡培养5天即为发酵液，用0.22μm的细菌过滤器过滤，所得滤液为发酵滤液。从生长3天的辣椒疫霉平板边缘打取5mm的菌饼，置于无菌的直径90mm培养皿中，V8培养液15mL，使培养液淹没菌饼，只加V8培养液的作为对照，25℃黑暗培养2天，倒掉V8汁，用无菌水漂洗3次后，加入已制备生防菌发酵滤液15mL，每个处理3次重复，加入相应溶液为对照，25℃光照培养1天。将菌丝置于10×10倍镜下统计孢子囊的数量，每皿检测3个视野，每处理3次重复。按下列公式计算不同生防菌发酵滤液对孢子囊形成的抑制率，分析其对辣椒疫霉孢子囊形成的影响。
用V8培养液在25℃培养了2天的辣椒疫霉，倒掉V8汁，无菌水漂洗3次后，加上无菌水，淹没菌丝丛，光照培养1天后，倒掉无菌水，加入20mL生防菌发酵滤液，以加入等量高氏一号液体培养基为对照，置于4℃冰箱低温处理30mi n，取出后于25℃恒温培养箱放置2h，在10×10倍镜下观察游动孢子释放情况。完全释放的标准以孢子囊中的游动孢子全部游出而成为空壳，每皿随机检测3个视野，每处理3个重复，每个视野观察约50个孢子囊，以平均值为测定结果，计算孢子囊释放游动孢子释放率，评价不同生防菌发酵滤液对孢子囊释放游动孢子的抑制效果。以此测定XJC2-1菌株对辣椒疫霉的抑制作用。
结果如图5所示，在含菌株XJC2-1发酵滤液的培养液中，与对照比较，病原菌辣椒疫霉孢子囊形成和游动孢子释放受到很强的抑制作用。
2.3菌株XJC2-1盆栽控病效果
将两粒直径5mm的生防菌菌饼，接入装有100mL液体高氏一号培养基的300mL三角瓶中，置于28℃180r/mi n恒温摇床振荡培养5天即为发酵液，用0.22μm的细菌过滤器过滤，所得滤液为发酵滤液。在辣椒4叶期开始浇灌XJC2-1发酵液，每株浇灌5mL，每隔3天施加一次。最后一次浇灌XJC2-1发酵滤液后7天，用玻璃棒在距离辣椒幼苗根部约1mL处插孔，轻微伤根，使用移液枪抽取配好的游动孢子悬浮液注入孔中，每株接种1mL，每处理接种20株，重复3次，对照组接种清水，放入25℃温室培养，7天后的按照下列分级标准调查发病情况，确定XJC2-1菌株对辣椒疫病盆栽上的控制效果。结果如图6所示，XJC2-1发酵滤液浇灌3次后，再接种辣椒疫霉游动孢子，7天后统计病情指数，结果表明经菌株XJC2-1发酵滤液处理的植株的病情指数为15.30，对照组病情指数为87.05，对照组萎蔫和枯死量比处理组明显大很多，XJC2-1发酵滤液对辣椒疫病具有很强的控制作用。
3.菌株XJC2-1与化学药剂相容性测定
1)含药平板筛选
采用室内药剂毒力测定已筛选出的对辣椒疫霉具有较好抑制作用的化学药剂的EC50值为参考及设置浓度500μg/mL，同室内药剂筛选一样，将烯酰吗啉、氟啶胺、氟吡菌胺、甲霜灵等原药溶解，配制为各药剂对辣椒疫霉的EC50、500μg/mL。在高氏一号培养基冷却至50℃左右，混合倒板，每个浓度重复3次。对照为不加药剂的高氏一号培养基。待平板表面的水干后，吸取100μL于28℃，180r/mi n振荡培养5天的链霉菌XJC2-1均匀涂布在各个含药平板上，于28℃培养箱内培养5天，观察并记录XJC2-1生长情况。
2)含药培养液培养
在100mL三角瓶中将化学药剂与液体高氏一号混合，浓度500μg/mL，每个浓度重复3瓶，对照为不加药剂的液体高氏一号。接入XJC2-1菌饼，于28℃，180r/mi n中振荡培养5天后，振荡均匀，取100mL涂布于高氏一号固体培养基上，置于28℃培养箱内培养5天，观察并记录XJC2-1生长情况。
3)含药无菌水培养
在100mL三角瓶中将化学药剂与无菌水混合，浓度为500μg/mL，每个浓度重复三瓶，对照为不加药剂的无菌水。接入XJC2-1菌饼，于28℃，180r/mi n中振荡培养5天后，振荡均匀，吸取100mL涂布高氏一号固体培养基上，28℃培养箱内培养5天，观察并记录XJC2-1生长情况。
结果如表1-3所示，XJC2-1在含烯酰吗啉、氟吡菌胺、甲霜灵的平板、培养液、无菌水中均可以正常存活，表明XJC2-1不受烯酰吗啉、氟吡菌胺、甲霜灵抑制，与3种药剂相容。通过平板对峙法检验，经含烯酰吗啉、氟吡菌胺、甲霜灵的无菌水培养的XJC2-1，对辣椒疫霉仍具有较强的拮抗效果；而XJC2-1在含氟啶胺的平板、培养液、无菌水中均不能存活，表明XJC2-1与氟啶胺不相容。
表1菌株XJC2-1在供试药剂含药平板上菌体生长情况
表2菌株XJC2-1在含药高氏一号培养液培养后菌体生长情况
表3菌株XJC2-1在含药无菌水培养后菌体生长情况
4.菌株XJC2-1与烯酰吗啉协同抑制辣椒疫霉
4.1菌株XJC2-1与烯酰吗啉混配对辣椒疫霉的影响
采用共培养法将1粒直径为5mm的辣椒疫霉菌丝块移接在50mLPDB培养液中，分别加入1至2粒XJC2-1菌饼，以加等量无菌水的PDB培养液为对照，每个处理3次重复，28℃180r/mi n振荡培养5天后，取出菌球，在备好的无菌水里清洗，置于滤纸上，将菌球滤纸放入70℃烘箱烘干至重量不再变化时称重。
结果如图7所示，随着烯酰吗啉浓度的提高，对辣椒疫霉菌丝的抑制也越强。链霉菌XJC2-1与辣椒疫霉共培养，对辣椒疫霉具有更强的抑制作用，当仅有1粒链霉菌XJC2-1菌饼时，对辣椒菌丝干重的影响就已经与0.3μg/mL，04μg/mL的烯酰吗啉单剂抑制作用相当；混配时XJC2-1*2(注：数字代表菌饼数)的抑制效果与XJC2-1*1无显著差异。综上，XJC2-1与烯酰吗啉混配对辣椒疫霉菌丝抑制强于烯酰吗啉单剂、单独施加XJC2-1发酵滤液。
4.2XJC2-1发酵滤液与烯酰吗啉混配防治辣椒疫病盆栽试验
将烯酰吗啉与菌株XJC2-1发酵滤液原液配制为三种处理液：A，烯酰吗啉1，3，5，8，10μg/mL的浓度梯度；B，链霉菌XJC2-1发酵滤液原液；C，烯酰吗啉1，3，5，8，10μg/mL+链霉菌XJC2-1发酵滤液原液。在灌根时，A处理液每株施加10mL；B处理液每株施加10mL；C处理液的烯酰吗啉施加5mL，链霉菌XJC2-1发酵滤液5mL。总共浇灌3次，最后一次浇灌后7天，接种辣椒疫霉游动孢子，7天后统计病情指数。
结果如表4所示，链霉菌XJC2-1发酵原液的防效为40.18％。烯酰吗啉单剂在1、3、5、8和10μg/mL预防效果为3.85％～71.53％。XJC2-1发酵原液与烯酰吗啉1、3、5、8和10μg/mL的协同防效为41.18～75.25％，混配的防效明显高于单剂，并且随着烯酰吗啉浓度的增加，混配防效也在提高。综合评价，当XJC2-1发酵滤液与烯酰吗啉浓度为8μg/mL时混配并减半施用的预防效果最好。
表4菌株XJC2-1与烯酰吗啉混配防治辣椒疫病的防治效果
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种可防治辣椒疫病的白色链霉菌(Streptomyces albus)，其特征在于，2022年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.25981。
2.权利要求1所述的白色链霉菌在防治辣椒疫病中的应用。
3.一种防治辣椒疫病的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的白色链霉菌培养产物施用于作物种植的土中的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：培养所述白色链霉菌，制备白色链霉菌发酵液；
S2：将所述白色链霉菌发酵液制备成抗辣椒疫病药剂；
S3：将所述抗辣椒疫病药剂施用于所述作物种植的土中。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S1中，所述白色链霉菌在高氏一号培养基中培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S1包括以下步骤：
S11：将所述白色链霉菌接种于高氏一号液体培养基中培养；
S12：于28℃、180rpm的条件下培养5天，得到所述白色链霉菌发酵液。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S2中，包括将所述白色链霉菌发酵液去除细胞，得到白色链霉菌发酵滤液的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，S2中还包括将所述白色链霉菌发酵滤液与抗辣椒疫病的化学药剂混配的步骤。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S3中，将所述抗辣椒疫病药剂对所述作物进行定期灌根处理。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，每两次灌根处理之间的时间间隔为3天。
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