CN101285046A - 一种诱变菌株白色链霉菌TUST2及利用该诱变菌株生产ε-聚赖氨酸及其盐的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种诱变菌株白色链霉菌TUST2及利用该诱变菌株生产ε－聚赖氨酸及其盐的方法，该菌株是从我国海南省土壤中筛选出的ε－聚赖氨酸的生产菌株白色链霉菌TUST1的基础上利用紫外诱变、紫外和化学诱变相结合，以及N离子注入诱变等手段选育出高产ε－聚赖氨酸的诱变菌株；该菌株对10mg/ml或更高浓度的S－(2－氨基乙基)－L－半胱氨酸具有抗性，并在优化条件下产酸量在10～30g/L；发酵液经离心除去菌体后，经硅藻土过滤得到澄清滤液，通过弱酸型离子交换树脂得到ε－聚赖氨酸粗产品，后经超滤纯化得到ε－聚赖氨酸及其盐，其分子量分布为4000～6500Da。

Description

一种诱变菌株白色链霉菌TUST2及利用该诱变菌株生产ε-聚赖氨酸及其盐的方法

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种大量产生ε-聚赖氨酸的诱变菌株白色链霉菌TUST2及利用该诱变菌株TUST2采用发酵法生产ε-聚赖氨酸及其盐的方法。

背景技术

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine，简称ε-PL)是由微生物合成的L-赖氨酸同聚物，由ε-氨基与α-羧基通过肽键连接而成。ε-聚赖氨酸具有抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒的活性，是一种性能优良的生物防腐剂，广泛应用于化妆品、基因载体、药物包被、电子材料和环保材料等方面。

现有技术中发酵生产ε-PL的方法，已知有一种方法(审结日本专利公开59-20359)，包括在培养基中培养小白链霉菌lysinopolymerus亚种346-D(FERM P-3834)，该菌株为从自然界分离的产ε-PL菌株，属于链霉菌属，然后从培养基中分离和纯化ε-PL。还有另一种已知方法(审结日本专利公开3-42070或审结日本专利公开3-78998)，包括对小白链霉菌lysinopolymerus亚种346-D进行诱变处理，使其转化为对L-赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸具有抗性的突变体，在培养基中培养所得突变体，即小白链霉菌lysinopolymerus亚种11011A-1(FERM BP-1109)，然后从培养基中分离和纯化ε-PL。1989年日本Chisso公司利用白色链霉菌实现了产业化生产。然而，就ε-PL产量和葡萄糖转化效率而言，仍不能令人满意。因此，筛选具有更高产量的ε-PL生产菌株具有重要的意义。

发明人经过大量研究分析，通过筛选新的具有更高产酸能力的生产菌株，发现了对浓度为10mg/ml或更高的ε-聚赖氨酸具有耐受性的菌株可能高产ε-聚赖氨酸；同时发现了对浓度为10mg/ml或更高的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)具有抗性的突变体可能是具有大量生成ε-PL能力的菌株，该菌株在培养基中进行好气培养可大量产生ε-PL。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种与常规ε-PL生产菌株相比其ε-PL生成能力更高并由此能够有效提高ε-PL产率的诱变菌株白色链霉菌TUST2；

本发明另一个目的是提供一种利用该诱变菌株白色链霉菌TUST2采用发酵法大量廉价生产ε-PL及其盐的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种大量产生ε-聚赖氨酸的诱变菌株白色链霉菌TUST2，其特征在于：该诱变菌株白色链霉菌TUST2已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.1986，保藏日期为2007年03月23日。

而且，所述的诱变菌株TUST2是将添加ε-聚赖氨酸的富集培养基从海南岛土壤中筛选出高产ε-聚赖氨酸的生产菌株白色链霉菌TUST1为出发菌株经诱变处理后获得的，其对10mg/ml或更高浓度的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸具有抗性。

而且，所述的诱变处理的方法是：

(1).在ε-聚赖氨酸的生产菌株TUST1孢子悬液内加入硫酸二乙酯，使该菌株孢子与其接触10分钟～2小时；

(2).然后使该菌株接受100～1000J/cm²紫外线辐射处理；

(3).再用5-溴尿嘧啶等化学品处理该菌株；

(4).进行N离子注入或其它常规化学或物理诱变处理；

(5).将诱变处理后的菌株接种于固体培养基上，该培养基含10mg/ml或更高浓度的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、2mg/ml甘氨酸，筛选培养基中生长的菌株，即得到高产诱变菌株TUST2。

一种大量产生ε-聚赖氨酸的诱变菌株白色链霉菌TUST2采用发酵法生产ε-聚赖氨酸及其盐的方法，其生产方法是：

将TUST2菌株在含有碳源、氮源及无机盐的培养基中，在25～37℃下通气培养，在优化条件下其ε-聚赖氨酸的产量为10～30g/L。其发酵液离心除去菌体后，经硅藻土过滤得到澄清滤液，再通过离子交换树脂得到ε-聚赖氨酸粗产品，后经超滤膜纯化得到ε-聚赖氨酸及其盐，其分子量分布为4000～6500Da。

而且，所述的诱变菌株TUST2在培养基中的碳源为葡萄糖、甘油、甘露醇、山梨醇和柠檬酸钠的其中之一。

而且，所述的诱变菌株TUST2在培养基中可利用的氮源为有机氮源牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、玉米浆，也可采用无机氮源(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl、NH₄NO₃，上述氮源可以单独使用也可以复合使用。

而且，所述的离子交换树脂为弱酸性阳离子交换树脂，所用的超滤膜为聚砜超滤膜。

本发明的优点和有益效果：

1.本发明的诱变菌株TUST2与常规ε-PL生产菌株相比，其ε-PL生成能力更高，并由此能够有效提高ε-PL产率。

2.利用该诱变菌株TUST2可大量廉价生产ε-PL及其盐。

附图说明

图1为本发明的诱变菌株TUST1的菌丝照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

首先需要说明的是：

1.大量产生ε-聚赖氨酸的诱变菌株白色链霉菌TUST2已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.1986，保藏日期为2007年03月23日。

2.本发明的诱变菌株TUST2是将添加ε-聚赖氨酸的富集培养基从海南岛土壤中筛选出高产ε-聚赖氨酸的生产菌株TUST1为出发菌株经诱变处理后获得的，其对浓度为10mg/ml或更高的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸具有抗性。

3.用于本发明的AEC是L-赖氨酸的结构类似物(类似物)，其与L-赖氨酸在结构上的区别仅在于4位上硫原子取代了碳原子。向培养基中加入AEC导致微生物生长的抑制，与甘氨酸一起使用时，生长抑制更为明显和强烈。

4.“诱变处理”在本文中是指引起属于链霉菌属、能产生ε-PL的微生物(菌株)突变的处理，从而获得对浓度为10mg/ml或更高的AEC具有抗性的诱变菌株。诱变处理方法的实例包括加入硫酸二乙酯(DES)，使菌株孢子悬液与DES接触10分钟～2小时的方法；使菌株接受100～1000J/cm²紫外线辐射处理的方法；用5-溴尿嘧啶等化学品处理菌株的方法；N离子注入和其它常规化学或物理诱变处理方法。

经诱变处理菌株的筛选方法为将诱变处理后的菌株接种于固体培养基上，每毫升培养基中含10mg或更高浓度的AEC、含2mg/ml甘氨酸，收集在培养基中生长的菌株并进行筛选。

下面具体叙述本实施例：

一、从土壤中筛选出的产生ε-PL的菌株TUST1。

以下描述菌株TUST1的菌学特性。

1.形态特征：

TUST1菌丝发育良好，无特殊结构分化，气生菌丝形成长孢子链，孢子丝波曲，孢子椭圆形，大小较均匀，呈链状生成气生菌丝的孢子梗(参见图1照片)。

2.培养特征：

30℃培养7～10天，观察菌株在下列各种培养基上的特征。

表1  TUST1菌株的培养特征

3.生理生化性质：

(1)培养温度：在25～37℃。最适温度为30℃。

(2)明胶液化、淀粉水解、牛奶胨化：阳性。

(3)牛奶凝固：阳性。

(4)纤维素利用：阴性。

(5)H₂S生成：阴性。

(6)几丁质酶产生：阴性。

(7)色素产生：无。

4.可以利用的碳源：

葡萄糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、棉籽糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇、柠檬酸钠、肌醇和乳糖其中之一。

5.可利用的氮源：

有机氮源牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、玉米浆等，也可采用无机氮源(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl、NH₄NO₃等。

上述氮源可以单独使用也可以复合使用。

二、以高产菌株TUST1为出发菌株通过诱变处理筛选出的诱变菌株TUST2。

获得本发明对高浓度AEC具有抗性的菌株的说明性实例如下：

1.诱变菌株的获得

(1).紫外诱变。

(2).化学诱变。

(3).化学诱变和紫外诱变相结合。

(4).N离子注入诱变。

产ε-PL菌株白色链霉菌TUST1菌株诱变后，其孢子悬浮在tris-马来酸缓冲液(pH6.0)中，所得孢子通过离心分离收集，用磷酸缓冲液(0.05M，pH7.0)洗涤，在液体营养培养基(葡萄糖1.0％，牛肉膏0.1％，蛋白胨0.2％，酵母粉0.2％，KH₂PO₄ 0.136％，K₂HPO₄ 0.08％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，FeSO₄·7H₂O 0.003％，ZnSO₄·7H₂O 0.004％)中温育过夜。然后离心收集细胞，用磷酸缓冲液(0.05M，pH7.0)洗涤，在含有10mg/ml AEC和2mg/ml甘氨酸的固体培养基(葡萄糖5％，硫酸铵1％，K₂HPO₄ 0.08％，KH₂PO₄ 0.136％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，ZnSO₄·7H₂O 0.004％，FeSO₄·7H₂O 0.003％，pH6.8，琼脂1.5％；其中％表示g/dl％)中铺平板，30℃温育3～4天。收集形成的菌落，评价所得的对高浓度AEC具有抗性的菌株的ε-PL产率。结果，筛选出高产菌株TUST2。

对高浓度AEC具有抗性的诱变菌株对AEC的抗性如下评价。

将诱变菌株和亲本菌株接种至基本琼脂培养基(如上述)中，培养基中加入AEC的浓度如下表2所示，甘氨酸的浓度为2mg/ml，30℃温育2～7天，肉眼观察生长情况，结果示于表2。

表2 TUST1和TUST2对AEC的抗性

注释：+有生长±少生长-无生长

本发明的诱变菌株对高浓度AEC具有抗性，在这方面，其可与亲本菌株明确地区分。

2.以下描述诱变菌株TUST2的特性。

(1)形态特征：

TUST2菌丝发育良好，气生菌丝形成长孢子链，孢子丝波曲，孢子椭圆形，大小较均匀，呈链状生成气生菌丝的孢子梗。

(2)培养特征：

30℃培养7～10天，观察菌株在下列各种培养基上的特征。

表3TUST2菌株的培养特征

(3)生理生化性质：

①.培养温度：在25～37℃。最适温度为30℃。

②.明胶液化、淀粉水解、牛奶胨化：阳性。

③.牛奶凝固：阳性。

④.纤维素利用：阴性。

⑤.H₂S生成：阳性。

⑥.几丁质酶产生：阴性。

⑦.色素产生：无。

(4)可利用的碳源：

葡萄糖、甘油、甘露醇、山梨醇和柠檬酸钠的其中之一。

(5)可利用的氮源：

有机氮源牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、玉米浆等；也可采用无机氮源(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl、NH₄NO₃等。

上述氮源可以单独使用也可以复合使用。

(6)16S rDNA序列分析：

以GenBank数据库中收录的链霉菌16S rDNA保守区为模板，设计PCR引物对(GCGGCGTGCTTAACACAT和GCTTCTTCCCTGCTGAAAGAG)，特异性扩增16S rDNA的γ可变区。菌株TUST2的PCR扩增产物经测序后，长度为411bp，序列如下：

>TUST2 gamma_variable_region_16S_rRNA_seq 411bp

GCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCGGCTTCGGTCG

GGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCA

CCCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACACGG

GGTCGCATGATCTCCGTGTGGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCC

GCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGAC

GGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACAC

GGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGG

CGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGG

TTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGC

将所测序列与GenBank数据库中收录的链霉菌16S rDNA序列进行比较，构建基于16S rDNAγ可变区的系统发育树。结果表明：菌株TUST2与白色链霉菌属菌株同源性很高。此外，在核糖体数据库Ribosomal DatabaseProject II进行16S rDNA序列比对分析，结果相同。最后，结合形态、细胞化学成分及16S rDNA序列分析的系统发育研究结果，可以将菌株TUST2的分类地位确定为白色链霉菌。

三、诱变菌株TUST2培养生产ε-聚赖氨酸及其盐

利用诱变菌株TUST2制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法，是将诱变菌株TUST2接种至斜面培养基培养4～7天，之后在含有碳源、氮源的培养基上25～37℃培养，最后由培养基中分离和纯化形成和积累的ε-PL。只要其中含有适量碳源、氮源、无机物和其它营养素，任何培养基均可使用。至于碳源，优先选择葡糖糖。加入的量优选为1～5％(％表示g/dl％)。氮源中优选硫酸铵。优选加入的氮源的量为0.2～2％(％表示g/dl％)。培养时，可连续加入碳源和氮源。无机物的实例包括磷酸根离子、钾离子、钠离子、镁离子，锌离子、铁离子和硫酸根等离子。

在好气条件下振荡培养、搅拌培养或其它方法培养。培养温度为25～37℃。培养基的pH接近中性(pH 6.8)，但开始培养后pH会降低。当pH降低到4时，加入碱维持pH为4。加入的碱优选为氨水，但氢氧化钠、氢氧化钾或其它碱也可使用，通常1～7天后ε-PL在培养基中积累。发酵液离心分离菌体，硅藻土过滤得到澄清滤液，通过弱酸型离子交换树脂得到ε-聚赖氨酸粗产品，后经超滤膜纯化得到ε-聚赖氨酸及其盐，分子量分布为4000～6500Da。

本发明制备的ε-聚赖氨酸及其盐具有如下理化性质：

(1)本产品溶于水、盐酸，微溶于乙醇，不溶于乙醚、乙酸乙酯等有机溶剂；

(2)对茚三酮反应呈阳性，用6N HCl水解后对茚三酮呈阳性。

(3)6N HCl水解后，用纸层析和薄层层析检测，发现其水解液呈单一的氨基酸——赖氨酸，表明本产品为赖氨酸的高分子聚合物。

(4)采用液态核磁共振和固态核磁共振分析，鉴定了产品的结构为ε-型结构，由一个L-赖氨酸的ε-NH₂与另一个L-赖氨酸的α-COOH形成的肽键连接而聚合成的高分子ε-聚赖氨酸。

(5)通过SDS-PAGE电泳测出ε-PL分子量为4000～6500Da。

Claims (7)

1. 一种大量产生ε-聚赖氨酸的诱变菌株白色链霉菌TUST2，其特征在于：该诱变菌株白色链霉菌TUST2已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.1986，保藏日期为2007年03月23日。

2. 根据权利要求1所述的一种大量产生ε-聚赖氨酸的诱变菌株白色链霉菌TUST2，其特征在于：所述的诱变菌株TUST2是将添加ε-聚赖氨酸的富集培养基从海南岛土壤中筛选出高产ε-聚赖氨酸的生产菌株白色链霉菌TUST1为出发菌株经诱变处理后获得的，其对10mg/ml或更高浓度的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸具有抗性。

3. 根据权利要求2所述的一种大量产生ε-聚赖氨酸的诱变菌株白色链霉菌TUST2，其特征在于：所述的诱变处理的方法是：

(1).在ε-聚赖氨酸的生产菌株TUST1孢子悬液内加入硫酸二乙酯，使该菌株孢子与其接触10分钟～2小时；

(2).然后使该菌株接受100～1000J/cm²紫外线辐射处理；

(3).再用5-溴尿嘧啶等化学品处理该菌株；

(4).进行N离子注入或其它常规化学或物理诱变处理；

(5).将诱变处理后的菌株接种于固体培养基上，该培养基含10mg/ml或更高浓度的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸、2mg/ml甘氨酸，筛选培养基中生长的菌株，即得到高产诱变菌株TUST2。

4. 一种如权利要求1所述的一种大量产生ε-聚赖氨酸的诱变菌株白色链霉菌TUST2采用发酵法生产ε-聚赖氨酸及其盐的方法，其特征在于：其生产方法是：

将TUST2菌株在含有碳源、氮源及无机盐的培养基中，在25～37℃下通气培养，在优化条件下其ε-聚赖氨酸的产量为10～30g/L。其发酵液离心除去菌体后，经硅藻土过滤得到澄清滤液，再通过离子交换树脂得到ε-聚赖氨酸粗产品，后经超滤膜纯化得到ε-聚赖氨酸及其盐，其分子量分布为4000～6500Da。

5. 根据权利要求4所述的一种大量产生ε-聚赖氨酸的诱变菌株白色链霉菌TUST2采用发酵法生产ε-聚赖氨酸及其盐的方法，其特征在于：所述的诱变菌株TUST2在培养基中的碳源为葡萄糖、甘油、甘露醇、山梨醇和柠檬酸钠的其中之一。

6. 根据权利要求4所述的一种大量产生ε-聚赖氨酸的诱变菌株白色链霉菌TUST2采用发酵法生产ε-聚赖氨酸及其盐的方法，其特征在于：所述的诱变菌株TUST2在培养基中可利用的氮源为有机氮源牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、玉米浆，也可采用无机氮源(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl、NH₄NO₃，上述氮源可以单独使用也可以复合使用。

7. 根据权利要求4所述的一种大量产生ε-聚赖氨酸的诱变菌株白色链霉菌TUST2采用发酵法生产ε-聚赖氨酸及其盐的方法，其特征在于：所述的离子交换树脂为弱酸性阳离子交换树脂，所用的超滤膜为聚砜超滤膜。

Images