CN113337552B - 一种基于发酵废菌渣交互回用的ε-聚赖氨酸-纳他霉素协同生产方法 - Google Patents

一种基于发酵废菌渣交互回用的ε-聚赖氨酸-纳他霉素协同生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于发酵废菌渣交互回用的ε‑聚赖氨酸‑纳他霉素协同生产方法，利用纳他霉素发酵废菌体提取诱导物，在ε‑聚赖氨酸发酵中添加以诱导ε‑聚赖氨酸大量合成；同时，将ε‑聚赖氨酸废菌体进行提取，其提取物添加到纳他霉素发酵中以诱导纳他霉素大量合成。本方法有助于将纳他霉素和ε‑聚赖氨酸的废菌体进行资源化利用，并具有促进两种产物合成的功效，在纳他霉素和ε‑聚赖氨酸工业化生产中具有重要的实践意义，尤其是在具备纳他霉素、乳酸链球菌素、ε‑聚赖氨酸3种生物防腐剂生产线的企业生产中具有较大的应用价值。

Description

一种基于发酵废菌渣交互回用的ε-聚赖氨酸-纳他霉素协同 生产方法
技术领域
本发明涉及一种基于发酵废菌渣交互回用的ε-聚赖氨酸-纳他霉素协同生产方法，属于工业生物技术领域。
背景技术
现有微生物源防腐剂主要有纳他霉素、乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸三种，为提高产品覆盖度，增强集成优势，较多生产厂家同时建设了以上3种生物防腐剂的生产线。这3种生物防腐剂中的两种(纳他霉素和ε-聚赖氨酸)均由链霉菌属合成，其中纳他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌剂，其对霉菌、酵母生长的强烈抑制效果；ε-聚赖氨酸是一种同型氨基酸阳离子聚合物，其对革兰氏阳性、阴性细菌、酵母、霉菌生长抑制作用显著。此两类物质均具有较高的安全性，被美国FDA认定为GRAS化合物，在我国也被卫计委批准在食品中作为防腐剂使用，具有较大的社会需求和经济价值。
纳他霉素主要由褐黄孢链霉菌经液态深层发酵合成，其产物不溶于水，离心后与菌体共存于沉淀中。沉淀常采用甲醇水溶液提取以获得纳他霉素溶液，后续经旋转蒸发、吸附等流程制得纯品。沉淀(发酵渣)在提取过产物后即弃去，无法得到进一步利用。ε-聚赖氨酸主要由小白链霉菌经液态发酵合成，其产物水溶性强，存在于清液中，后续主要采用离子交换法进行提取，而其废菌体常常作为废弃物直接丢弃，造成浪费和环境污染。
发明内容
为对纳他霉素和ε-聚赖氨酸生产中的废菌渣进行资源化高值利用，并进一步强化相应产物的发酵水平，本发明提供了一种基于发酵废菌渣交互回用的ε-聚赖氨酸-纳他霉素协同生产方法。本发明对ε-聚赖氨酸发酵废菌渣进行提取，将提取液加入纳他霉素发酵中促进纳他霉素合成；纳他霉素发酵废菌渣同样经提取后，将提取液加入ε-聚赖氨酸发酵中促进ε-聚赖氨酸合成。
本课题组的前期研究发现，小白链霉菌菌体中存在促进纳他霉素合成的诱导物，反过来，褐黄孢链霉菌菌体中存在促进ε-聚赖氨酸合成的诱导物。本发明基于上述发现，开发出一种基于发酵废菌渣交互回用的ε-聚赖氨酸-纳他霉素协同生产方法，即利用纳他霉素发酵废菌体提取诱导物，在ε-聚赖氨酸发酵中添加以诱导ε-聚赖氨酸大量合成；同时，将ε-聚赖氨酸废菌体进行提取，其提取物添加到纳他霉素发酵中以诱导纳他霉素大量合成。本方法有助于将纳他霉素和ε-聚赖氨酸的废菌体进行资源化利用，并具有促进两种产物合成的功效，在纳他霉素和ε-聚赖氨酸工业化生产中具有重要的实践意义，尤其是在具备纳他霉素、乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸3种生物防腐剂生产线的企业生产中具有较大的应用价值。
本发明基于发酵废菌渣交互回用的ε-聚赖氨酸-纳他霉素协同生产方法，包括如下步骤：
步骤1：纳他霉素发酵废菌渣的提取
将纳他霉素发酵液(取自纳他霉素分批发酵，约60-70h；或补料分批发酵，约96-120h)以3000-4500rpm离心10-15min，下层菌渣用去离子水以离心分离的方式洗涤3次，湿菌体称重，此后以终浓度75％乙醇水溶液浸泡过夜，并置于研钵中研磨，研磨液于3000-4500rpm离心10-15min，下方沉淀用去离子水洗涤1遍后用70％甲醇提取纳他霉素，上清液置于旋转蒸发仪中蒸馏回收溶剂，蒸馏浓缩液置于烘箱中60℃干燥，以1g湿菌渣对应3mL去离子水复溶提取物，制得纳他霉素发酵废菌渣提取液；
步骤2：添加纳他霉素废菌渣提取液的ε-聚赖氨酸发酵
2a、ε-聚赖氨酸发酵种子培养
将小白链霉菌IFO14147接种于固体贝塔纳培养基上，于28℃恒温培养箱中培养10天，直至长出灰色孢子；用接种环挑取2环孢子置于装液量60mL的500mLM3G培养基摇瓶中，于30℃恒温振荡培养箱中200rpm培养1天；
2b、ε-聚赖氨酸发酵
5L发酵罐采用2组6平直叶涡轮搅拌桨，按M3G培养基配方配置液态培养基，发酵罐中液态培养基的装液量为3L，通气量为1vvm，转速设定为200-800rpm，通过增加转速的方式将整个发酵过程的溶解氧控制在30％以上，当发酵液pH自由下降到4.0时，采用外源流加12.5％氨水调控发酵液pH为4.0；发酵罐灭菌采用离位灭菌形式，于121℃高温灭菌20min，待培养基冷却到30℃后，将2a获得的成熟发酵种子以8％的接种量接于液态培养基中进行发酵；在发酵24h时，外源一次性添加终浓度为44g的纳他霉素发酵湿废渣/L培养基的提取物，此后继续发酵；在发酵48h时，开始外源流加60％葡萄糖，以维持发酵罐中糖浓度范围为5-15g/L，直至发酵结束。
步骤3：ε-聚赖氨酸发酵废渣的提取
将ε-聚赖氨酸发酵液(取自ε-聚赖氨酸分批发酵，约42-60h；或补料分批发酵，约168-204h)以3000-4500rpm离心10-15min，下层菌渣用去离子水以离心分离的方式洗涤3次，湿菌体称重，此后以终浓度75％乙醇水溶液浸泡过夜，并置于研钵中研磨，研磨液于3000-4500rpm离心10-15min，上清液置于旋转蒸发仪中蒸馏回收溶剂，蒸馏浓缩液置于烘箱中60℃干燥，以1g湿菌渣对应3mL去离子水复溶提取物，制得ε-聚赖氨酸发酵废菌渣提取液；
步骤4：添加ε-聚赖氨酸发酵废菌渣提取液的纳他霉素发酵
4a、纳他霉素发酵种子培养
将褐黄孢链霉菌ATCC 13326接种于固体贝塔纳培养基上，于28℃恒温培养箱中培养10天，直至长出褐黄色孢子；用接种环挑取3环孢子置于装液量60mL的500mL液体种子培养基摇瓶中，于28℃恒温振荡培养箱中220rpm培养2天；
4b、纳他霉素发酵
5L发酵罐采用2组6平直叶涡轮搅拌桨，按纳他霉素发酵培养基配方配置液态培养基，发酵罐中液态培养基的装液量设定为3L，通气量为1vvm，转速设定为200-800rpm，通过增加转速的方式将整个发酵过程的溶解氧控制在30％以上，发酵液pH采用氢氧化钠调控至pH7.0；发酵罐灭菌采用离位灭菌形式，于121℃高温灭菌20min，待培养基冷却到29℃后，按8％的接种量接种4a获得的成熟种子液进行发酵；发酵24h时，外源添加终浓度为5gε-聚赖氨酸发酵湿废渣/L培养基的提取物，此后继续发酵；发酵48h时，开始外源流加60％葡萄糖，以维持发酵罐中糖浓度范围为5-15g/L，直至发酵结束。
与传统纳他霉素、ε-聚赖氨酸液态发酵相比，本发明所示的基于发酵废菌渣交互回用的ε-聚赖氨酸-纳他霉素协同生产方法能够将纳他霉素、ε-聚赖氨酸发酵中的废菌渣进行资源化高值利用，其效果是显著提高纳他霉素和ε-聚赖氨酸各自的发酵产量、生产强度，在纳他霉素和ε-聚赖氨酸工业化生产中具有重要的实践意义，尤其是在同时具备纳他霉素、乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸3种生物防腐剂生产线的企业生产中具有较大的应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例，可以更好地理解本发明。实施例所描述的具体的提取液添加量、添加时间等工艺条件以及结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权力要求书中所详细描述的本发明。
本发明的反应器为250mL三角瓶、5L液态发酵罐两种。
具体操作步骤如下：
一、菌种：
纳他霉素产生菌为褐黄孢链霉菌ATCC 13326(StreptomycesgilvosporeusATCC13326)，购自美国模式培养物集存库(American type culture collection)。
ε-聚赖氨酸产生菌为小白链霉菌IFO14147(Streptomyces albulus IFO 14147，Streptomyces albulusCICC 11022)，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
二、培养基配方：
1、固体贝塔纳培养基(g/L)：葡萄糖10,酵母粉1,蛋白胨2,琼脂20,pH 7.5。
2、纳他霉素发酵种子培养基(g/L)：葡萄糖20,酵母粉6,大豆蛋白胨6,NaCl 5,pH7.5。
3、纳他霉素发酵培养基为(g/L)：葡萄糖80,酵母粉10,大豆蛋白胨20,NaCl 5,pH7.5。
4、M3G培养基(g/L)：葡萄糖60,酵母粉5,(NH4)2SO4 10,MgSO4·7H2O 0.5,K2HPO4·3H2O0.8,KH2PO4 1.36,FeSO4·7H2O 0.03,ZnSO4·7H2O 0.04,pH 6.8。
以上凡涉及到葡萄糖，均将葡萄糖与其他成分分开配制，121℃高温灭菌20min后再合并于同一体系培养基中。
三、实验步骤：
1、ε-聚赖氨酸发酵废渣的提取
将ε-聚赖氨酸发酵液以3000-4500rpm离心10-15min，下层菌渣用去离子水以离心分离的方式洗涤3次，湿菌体称重，此后以终浓度75％乙醇水溶液浸泡过夜，并置于研钵中研磨，研磨液于3000-4500rpm离心10-15min，上清液置于旋转蒸发仪中蒸馏回收溶剂，蒸馏浓缩液置于烘箱中60℃干燥，以1g湿菌渣对应3mL去离子水复溶提取物，制得ε-聚赖氨酸发酵废菌渣提取液；
2、纳他霉素发酵种子培养
将褐黄孢链霉菌ATCC 13326接种于固体贝塔纳培养基上，于28℃恒温培养箱中培养10天，直至长出褐黄色孢子；用接种环挑取3环孢子置于装液量60mL的500mL液体种子培养基摇瓶中，于28℃恒温振荡培养箱中220rpm培养2天；
3、纳他霉素三角瓶发酵优化ε-聚赖氨酸发酵废渣提取物添加量、添加时间
在250mL三角瓶中，按纳他霉素发酵培养基配方配置液态培养基，用8层纱布封口，于高温灭菌锅中115℃灭菌20min；将成熟的发酵种子以8％接种量接于以上发酵培养基，于29℃恒温振荡培养箱中220rpm培养3天，结束后测定发酵液中纳他霉素浓度，以高纳他霉素产量为主要指标，筛选最优的ε-聚赖氨酸发酵废渣提取物添加量、添加时间；
4、添加ε-聚赖氨酸发酵废渣提取物的纳他霉素5L发酵罐发酵
5L发酵罐采用2组6平直叶涡轮搅拌桨，发酵罐中装液量设定为3L，选用纳他霉素发酵培养基，通气量为1vvm，转速设定为200-800rpm，通过增加转速的方式将整个发酵过程的溶解氧控制在30％以上，发酵液pH采用氢氧化钠调控至pH7.0。发酵罐灭菌采用离位灭菌形式，于121℃高温灭菌20min，待培养基冷却到29℃后，接种8％的成熟种子液进行发酵。发酵到24h时，外源添加终浓度为5gε-聚赖氨酸发酵湿废渣/L培养基的提取物，此后继续发酵。在48h时，在48h时，开始外源流加60％葡萄糖，以维持发酵罐中糖浓度范围为5-15g/L，直至120h发酵结束。每隔12h取样测定纳他霉素浓度、菌体干重、残糖浓度；
5、纳他霉素发酵废渣的提取
将纳他霉素发酵液以3000-4500rpm离心10-15min，下层菌渣用去离子水以离心分离的方式洗涤3次，湿菌体称重，此后以终浓度75％乙醇水溶液浸泡过夜，并置于研钵中研磨，研磨液于3000-4500rpm离心10-15min，下方沉淀用去离子水洗涤1遍后用70％甲醇提取纳他霉素，上清液置于旋转蒸发仪中蒸馏回收溶剂，蒸馏浓缩液置于烘箱中60℃干燥，以1g湿菌渣对应3mL去离子水复溶提取物，制得纳他霉素发酵废菌渣提取液；
6、ε-聚赖氨酸发酵种子培养
将小白链霉菌IFO14147接种于固体贝塔纳培养基上，于28℃恒温培养箱中培养10天，直至长出灰色孢子；用接种环挑取2环孢子置于装液量60mL的500mLM3G培养基摇瓶中，于30℃恒温振荡培养箱中200rpm培养1天；
7、ε-聚赖氨酸三角瓶发酵优化纳他霉素发酵废渣提取物添加量、添加时间
在250mL三角瓶中，按M3G培养基配方配置液态培养基，用8层纱布封口，于高温灭菌锅中115℃灭菌20min；将成熟的发酵种子以8％接种量接于以上发酵培养基，于30℃恒温振荡培养箱中200rpm培养至24h，后添加终浓度20g/L pH4.0柠檬酸钠缓冲液并继续发酵至48h，结束后测定发酵液中ε-聚赖氨酸浓度，以高ε-聚赖氨酸产量为主要指标，筛选最优的纳他霉素发酵废渣提取物添加量、添加时间；
8、添加纳他霉素发酵废渣提取物的ε-聚赖氨酸5L发酵罐发酵
5L发酵罐采用2组6平直叶涡轮搅拌桨，发酵罐中装液量设定为3L，选用M3G培养基，通气量为1vvm，转速设定为200-800rpm，通过增加转速的方式将整个发酵过程的溶解氧控制在30％以上，当发酵液pH自由下降到4.0时，采用外源流加12.5％氨水调控发酵液pH为4.0。发酵罐灭菌采用离位灭菌形式，于121℃高温灭菌20min，待培养基冷却到30℃后，接种8％的成熟种子液进行发酵。发酵到24h时，外源一次性添加终浓度为44g纳他霉素发酵湿废渣/L培养基的提取物，此后继续发酵。在48h时，开始外源流加60％葡萄糖，以维持发酵罐中糖浓度范围为5-15g/L，直至168h发酵结束。每隔12h取样测定ε-聚赖氨酸浓度、菌体干重、残糖浓度；
9、产物的提取与检测
检测用发酵液预处理：取10毫升发酵液，4500rpm离心10min，上清液用于测定残糖浓度(和ε-聚赖氨酸浓度)，沉淀用于测定菌体干重。
发酵液中纳他霉素浓度检测：将1mL发酵液与9mL甲醇混合，于超声波清洗器中振荡提取20min，4500g离心10min，上清液过0.45μm的有机滤膜后，采用HPLC进行浓度检测。使用C18色谱柱，流动相设定为甲醇-水混合液(甲醇60％，水40％)，柱温控制为25℃，进样量10μL。
发酵液中ε-聚赖氨酸浓度检测：ε-聚赖氨酸浓度采用甲基橙法测定，即用0.7mMpH 7.0磷酸钠缓冲液将发酵上清液适当稀释，取2mL稀释液与2mL 1mM甲基橙溶液进行反应，混合液在30℃条件下反应30min后4,500×g离心15min。上清经上述磷酸缓冲液稀释20倍后在465nm处测定吸光度，并参照预先制备得到的吸光度与ε-聚赖氨酸标准品对应的标准曲线计算得到ε-聚赖氨酸的浓度。
发酵液中葡萄糖检测：采用HPLC法测定，即采用高效液相色谱仪(Dionex,U-3000,USA)测定发酵上清液中的葡萄糖浓度。硬件配置：有机酸柱(BIO-RAD,Aminex HPX-87H 300×7.8mm,USA)及示差检测器(Shodex,RI-101,Japan)。样品物质由5mM H2SO4流动相载负，以0.6mL/min流速通过柱温为60℃的有机酸分析柱，所分离得到的各组分分别由示差检测器测定其含量。
菌体干重检测：采用滤纸差量测重法。菌体沉淀加蒸馏水洗涤两次，用预先105℃烘干并称重的滤纸进行抽滤，之后滤纸置于105℃烘干至恒重后称重，计算前后重量差值。
实施例1：纳他霉素、ε-聚赖氨酸发酵废菌渣资源化提取
将经168h补料分批发酵获得的ε-聚赖氨酸发酵液进行固液分离，菌渣部分用去离子水洗涤洗涤3次，洗涤液并入发酵上清液用于提取ε-聚赖氨酸，湿菌体称重，此后以终浓度75％乙醇水溶液浸泡并研磨，静置过夜，研磨液于3000-4500rpm离心10-15min，上清液置于旋转蒸发仪中蒸馏回收溶剂，蒸馏浓缩液置于烘箱中60℃干燥，以1g湿菌渣对应3mL去离子水复溶提取物，制得ε-聚赖氨酸发酵废菌渣提取液；
将经120h补料分批发酵获得的纳他霉素发酵液以3000-4500rpm离心10-15min，下层菌渣-纳他霉素混合物用去离子水以离心分离的方式洗涤3次，湿菌体称重，此后以终浓度75％乙醇水溶液浸泡过夜，并置于研钵中研磨，研磨液于3000-4500rpm离心10-15min，下方沉淀用去离子水洗涤1遍后用70％甲醇提取纳他霉素，上清液置于旋转蒸发仪中蒸馏回收溶剂，蒸馏浓缩液置于烘箱中60℃干燥，以1g湿菌渣对应3mL去离子水复溶提取物，制得纳他霉素发酵废菌渣提取液。
实施例2：纳他霉素三角瓶发酵优化ε-聚赖氨酸发酵废菌渣提取液的添加条件
在250mL三角瓶中，按纳他霉素发酵培养基配方配置液态培养基，用8层纱布封口，于高温灭菌锅中115℃灭菌20min；将成熟的发酵种子以8％接种量接于以上发酵培养基，于29℃恒温振荡培养箱中220rpm培养3天，结束后测定发酵液中纳他霉素浓度。
分别在发酵0、12、18、24、30、36、42、48h添加终浓度为5gε-聚赖氨酸发酵湿废渣/L培养基的提取物，考察最终纳他霉素的产量，结果如下：对照(以去离子水代替提取液)0.6g/L，0h 0.7g/L，12h 0.7g/L，18h 1.1g/L，24h 1.4g/L，30h 1.3g/L，36h 1.0g/L，42h0.8g/L，48h 0.6g/L。由此可知，在24h添加ε-聚赖氨酸发酵湿废渣提取物最优。
分别在发酵24h添加终浓度为1、5、10、20、40、60、80、100gε-聚赖氨酸发酵湿废渣/L培养基的提取物，考察最终纳他霉素的产量，结果如下：对照(以去离子水代替提取液)0.6g/L，1gε-聚赖氨酸发酵湿废渣/L培养基的提取物0.8g/L；5gε-聚赖氨酸发酵湿废渣/L培养基的提取物1.4g/L；10gε-聚赖氨酸发酵湿废渣/L培养基的提取物1.2g/L；20gε-聚赖氨酸发酵湿废渣/L培养基的提取物0.9g/L；40gε-聚赖氨酸发酵湿废渣/L培养基的提取物0.7g/L；60gε-聚赖氨酸发酵湿废渣/L培养基的提取物0.6g/L；80gε-聚赖氨酸发酵湿废渣/L培养基的提取物0.6g/L；100gε-聚赖氨酸发酵湿废渣/L培养基的提取物0.6g/L。由此可知，添加终浓度为5gε-聚赖氨酸发酵湿废渣/L培养基量最优。
实施例3：添加ε-聚赖氨酸发酵废菌渣提取液的纳他霉素5L发酵罐补料分批发酵
5L发酵罐采用2组6平直叶涡轮搅拌桨，发酵罐中装液量设定为3L，选用纳他霉素发酵培养基，通气量为1vvm，转速设定为200-800rpm，通过增加转速的方式将整个发酵过程的溶解氧控制在30％以上，发酵液pH采用氢氧化钠调控至pH7.0。发酵罐灭菌采用离位灭菌形式，于121℃高温灭菌20min，待培养基冷却到29℃后，接种8％的成熟种子液进行发酵。发酵到24h时，外源添加终浓度为5gε-聚赖氨酸发酵湿废渣/L培养基的提取物，此后继续发酵。在48h时，开始外源流加60％葡萄糖，以维持发酵罐中糖浓度范围为5-15g/L，直至120h发酵结束。每隔12h取样测定纳他霉素浓度、菌体干重、残糖浓度。最终，其纳他霉素浓度为3.1g/L，较对照(添加等体积去离子水)1.6g/L产量提升93.75％。
实施例4：ε-聚赖氨酸三角瓶发酵优化纳他霉素发酵废菌渣提取液的添加条件
在250mL三角瓶中，按M3G培养基配方配置液态培养基，用8层纱布封口，于高温灭菌锅中115℃灭菌20min；将成熟的发酵种子以8％接种量接于以上发酵培养基，于30℃恒温振荡培养箱中200rpm培养至24h，后添加终浓度20g/L pH4.0柠檬酸钠缓冲液并继续发酵至48h，结束后测定发酵液中ε-聚赖氨酸浓度。
分别在发酵0、12、18、24、30、36h添加终浓度为20g纳他霉素发酵湿废渣/L培养基的提取物，并加入终浓度20g/L pH4.0柠檬酸钠缓冲液，考察最终ε-聚赖氨酸的产量，结果如下：对照(以去离子水代替提取液)0.5g/L，其ε-聚赖氨酸产量分别为，0.90g/L(0h)，0.95g/L(6h)，0.99g/L(12h)，1.27g/L(18h)，1.61g/L(24h)，1.37g/L(30h)，1.01g/L(36h)，0.82g/L(42h)。由此可知，在24h添加ε-聚赖氨酸发酵湿废渣提取物最优。
分别在发酵24h添加终浓度为22、44、66、88、110g纳他霉素发酵湿废渣/L培养基的提取物，并加入终浓度20g/L pH4.0柠檬酸钠缓冲液，考察最终ε-聚赖氨酸的产量，结果如下：对照(以去离子水代替提取液)0.5g/L；22g纳他霉素发酵湿废渣/L培养基的提取物1.48g/L；44g纳他霉素发酵湿废渣/L培养基的提取物1.62g/L；66g纳他霉素发酵湿废渣/L培养基的提取物1.61g/L；88g纳他霉素发酵湿废渣/L培养基的提取物1.58g/L；110g纳他霉素发酵湿废渣/L培养基的提取物1.57g/L。由此可知，添加终浓度为44g纳他霉素发酵湿废渣/L培养基量最优。
实施例5：添加纳他霉素发酵废菌渣提取液的ε-聚赖氨酸5L发酵罐补料分批发酵
5L发酵罐采用2组6平直叶涡轮搅拌桨，发酵罐中装液量设定为3L，选用M3G培养基，通气量为1vvm，转速设定为200-800rpm，通过增加转速的方式将整个发酵过程的溶解氧控制在30％以上，当发酵液pH自由下降到4.0时，采用外源流加12.5％氨水调控发酵液pH为4.0。发酵罐灭菌采用离位灭菌形式，于121℃高温灭菌20min，待培养基冷却到30℃后，接种8％的成熟种子液进行发酵。发酵到24h时，外源一次性添加终浓度为44g纳他霉素发酵湿废渣/L培养基的提取物，此后继续发酵。在48h时，开始外源流加60％葡萄糖，以维持发酵罐中糖浓度范围为5-15g/L，直至168h发酵结束。每隔12h取样测定ε-聚赖氨酸浓度、菌体干重、残糖浓度。最终，获得ε-聚赖氨酸45.87g/L，较对照(添加与提取液等体积无菌水)22.14g/L提升107.18％。

Claims (7)

1.一种基于发酵废菌渣交互回用的ε-聚赖氨酸-纳他霉素协同生产方法，其特征在于：
利用纳他霉素发酵废菌体提取诱导物，在ε-聚赖氨酸发酵中添加以诱导ε-聚赖氨酸大量合成；同时，将ε-聚赖氨酸废菌体进行提取，其提取物添加到纳他霉素发酵中以诱导纳他霉素大量合成；包括如下步骤：
步骤1：纳他霉素发酵废菌渣的提取
将纳他霉素发酵液离心，下层菌渣用去离子水以离心分离的方式洗涤，湿菌体称重，此后以终浓度75%乙醇水溶液浸泡8-12h，并置于研钵中研磨，研磨液离心，下方沉淀用去离子水洗涤后用70%甲醇提取纳他霉素，上清液置于旋转蒸发仪中蒸馏回收溶剂，蒸馏浓缩液置于烘箱中干燥，以1g湿菌渣对应3mL去离子水复溶提取物，制得纳他霉素发酵废菌渣提取液；
步骤2：添加纳他霉素废菌渣提取液的ε-聚赖氨酸发酵
2a、ε-聚赖氨酸发酵种子培养
将小白链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，于28℃恒温培养箱中培养10天，直至长出灰色孢子；用接种环挑取2环孢子置于装液量60mL的500mLM3G培养基摇瓶中，于30℃恒温振荡培养箱中200rpm培养1天；
2b、ε-聚赖氨酸发酵
5L发酵罐采用2组6平直叶涡轮搅拌桨，按M3G培养基配方配制液态培养基，发酵罐中液态培养基的装液量为3L，通气量为1vvm，转速设定为200-800rpm，当发酵液pH自由下降到4.0时，采用外源流加12.5%氨水调控发酵液pH为4.0；发酵罐灭菌采用离位灭菌形式，于121℃高温灭菌20min，待培养基冷却到30℃后，将2a获得的成熟发酵种子以8%的接种量接于液态培养基中进行发酵；在发酵过程中，添加步骤1获得的纳他霉素发酵废菌渣提取液，继续发酵；在发酵48h时，开始外源流加60%葡萄糖，以维持发酵罐中糖浓度范围为5-15g/L，直至发酵结束；
步骤3：ε-聚赖氨酸发酵废渣的提取
将ε-聚赖氨酸发酵液离心，下层菌渣用去离子水以离心分离的方式洗涤，湿菌体称重，此后以终浓度75%乙醇水溶液浸泡8-12h，并置于研钵中研磨，研磨液离心，上清液置于旋转蒸发仪中蒸馏回收溶剂，蒸馏浓缩液置于烘箱中干燥，以1g湿菌渣对应3mL去离子水复溶提取物，制得ε-聚赖氨酸发酵废菌渣提取液；
步骤4：添加ε-聚赖氨酸发酵废菌渣提取液的纳他霉素发酵
4a、纳他霉素发酵种子培养
将褐黄孢链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，于28℃恒温培养箱中培养10天，直至长出褐黄色孢子；用接种环挑取3环孢子置于装液量60mL的500mL液体种子培养基摇瓶中，于28℃恒温振荡培养箱中220rpm培养2天；
4b、纳他霉素发酵
5L发酵罐采用2组6平直叶涡轮搅拌桨，按纳他霉素发酵培养基配方配制液态培养基，发酵罐中液态培养基的装液量设定为3L，通气量为1vvm，转速设定为200-800rpm，发酵液pH采用氢氧化钠调控至pH7.0；发酵罐灭菌采用离位灭菌形式，于121℃高温灭菌20min，待培养基冷却到29℃后，按8%的接种量接种4a获得的成熟种子液进行发酵；在发酵过程中，外源添加步骤3获得的ε-聚赖氨酸发酵废菌渣提取液，继续发酵；在发酵48h时，开始外源流加60%葡萄糖，以维持发酵罐中糖浓度范围为5-15g/L，直至发酵结束；
所述固体贝塔纳培养基的配方为：葡萄糖10 g/L，酵母粉1 g/L，蛋白胨2 g/L，琼脂20g/L，pH 7.5；
所述M3G培养基的配方为：葡萄糖60 g/L，酵母粉5 g/L，(NH4)2SO4 10 g/L，MgSO4·7H2O0.5 g/L，K2HPO4·3H2O 0.8 g/L，KH2PO4 1.36 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，ZnSO4·7H2O0.04 g/L，pH 6.8。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤2b中，通过增加转速的方式将整个发酵过程的溶解氧控制在30%以上。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤2b中，在发酵24h时，外源一次性添加纳他霉素发酵废菌渣提取液，继续发酵。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
在发酵24h时，外源一次性添加终浓度为44g的纳他霉素发酵废菌渣/L培养基的提取物，继续发酵。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤4b中，通过增加转速的方式将整个发酵过程的溶解氧控制在30%以上。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤4b中，在发酵24h时，外源添加ε-聚赖氨酸发酵废菌渣提取液，继续发酵。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
在发酵24h时，外源添加终浓度为5g的ε-聚赖氨酸发酵废菌渣/L培养基的提取物，继续发酵。
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