CN103509741A

CN103509741A - 布劳特菌auh-jld56及其在牛蒡苷元转化中的应用

Info

Publication number: CN103509741A
Application number: CN201310368975.5A
Authority: CN
Inventors: 王秀伶; 刘明月; 于秀梅
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2013-08-22
Filing date: 2013-08-22
Publication date: 2014-01-15
Anticipated expiration: 2033-08-22
Also published as: CN103509741B

Abstract

本发明公开了一种布劳特菌AUH-JLD56及其在牛蒡苷元转化中的应用，属于细菌技术领域。布劳特菌（Blautiasp.）AUH-JLD56，保藏号为CGMCCNo.8032。其应用包括下述步骤：（1）菌株AUH-JLD56的培养；（2）底物牛蒡苷元粗品与菌株AUH-JLD56共培养及代谢产物的分离纯化。本发明的菌株能将中药牛蒡子中的牛蒡苷元粗品高效转化为3′-去甲基-牛蒡苷元，解决了3′-去甲基-牛蒡苷元资源缺乏的问题，为牛蒡子中药理活性物质微生物代谢产物的研究和开发奠定了基础。

Description

布劳特菌AUH-JLD56及其在牛蒡苷元转化中的应用

技术领域

本发明涉及细菌技术领域。

背景技术

牛蒡子（Actium lappa）为菊科草本植物牛蒡的干燥成熟果实，在我国古代医药典籍中多有记载，具有疏散风热、宣肺透疹、消肿解毒等功效，临床上则主要用于治疗急性咽喉肿痛、风热感冒、喉源性咳嗽和出疹性疾病等，迄今已有几千年的使用史。由于牛蒡子毒副作用低，临床应用中尚未见有不良反应的报告，因此，对牛蒡子中药理活性物质的研究和挖掘已成为国内外研究热点。木质素和挥发油是牛蒡子中的标志性化合物，目前已从牛蒡子中分离得到17种木质素类化合物，其中牛蒡苷（Arctiin，简称AT）是含量最高的木质素成分之一。研究表明，AT在酸性条件下或在人肠道微生物菌群产生的葡萄糖苷酶作用下，可被水解为牛蒡苷元（Arctigenin，简称AG），AG具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒以及免疫调节活性，对肝细胞等具有保护作用（中草药，39（3）:467-470, 2008）。

牛蒡苷元被人体或其他动物摄入体内后可被寄居在肠道的微生物菌群转化为不同代谢产物。早在1992年，日本学者Mitsuhiko Nose等（Planta Medicine, 58(6):520-523, 1992）利用小鼠肠道菌群转化牛蒡苷元时曾检测到3′-位脱去甲基的牛蒡苷元代谢产物，即3′-去甲基-牛蒡苷元（3′-desmethylarctigenin，简称3′-DMAG），由于代谢产物3′-DMAG 从未在天然牛蒡子提取物被检出报道，故推测是小鼠肠道菌群将AG转化为3′-DMAG。2007年，日本学者 Masao Hattori等从人新鲜粪样中分离了一株能将底物AG同时代谢为 7种不同代谢产物的真细菌属菌株Eubacteriumsp. ARC-2（Biological and Pharmaceutical Bulletin,30（5）: 904-911, 2007），仅从高效液相色谱所出峰的峰面积来看，产物4（即4′-O-methyl-dihydroxyenterolactone）和产物7（即3′′-desmethylarctigenin）最高，产物1（即 dihydroxyenterolactone）的峰面积也较高，产物3′-DMAG为高效液相色谱图Fig.2中的峰6。但从通过硅胶柱后获得物质质量来看，产物1（63毫克）和产物4（63.5毫克）的量最多。因此，代谢产物3′-DMAG因合成量较低，根本无法通过菌株ARC-2转化底物牛蒡苷元来大量获得。对于产物3′-DMAG而言，迄今国内外尚未见能将底物牛蒡苷元只转化为3′-DMAG的报道；有关化合物3′-DMAG的化学合成虽在2011年有过报道，但反应需要有恶臭和强刺激性的物质吡啶来合成（辽宁中医药大学学报, 13（4）:30-33, 2011），合成过程对人体健康危害较大，且化学合成所需成本较高，基于此原因，目前国内外市场尚无3′-DMAG销售。由于化合物3′-DMAG资源匮乏，有关其生理活性方面研究报道较少，目前仅一篇文献报道3′-DMAG除具有与AG相似的抗炎活性外，还表现出不同于AG的一些生理功能，如相同浓度下3′-DMAG对雌激素受体的亲和力明显强于AG（Molecules, 18: 1122-1127, 2013）。随着3′-DMAG生理功能研究的不断深入，今后极有可能将3′-DMAG开发为不同于目前牛蒡子药效的其他新药。

发明内容

本发明提供一种布劳特菌（Blautia sp.）AUH-JLD56及其在牛蒡苷元转化中的应用，此菌株能将中药牛蒡子中的牛蒡苷元（AG）粗品高效转化为3′-DMAG，解决了3′-DMAG资源缺乏的问题，对3′-DMAG 药理活性及新药研发具有极大的推动作用。

本发明所采取的技术方案是：

一种布劳特菌（Blautia sp.）AUH-JLD56，保藏号为CGMCC No.8032。

布劳特菌Blautia sp. AUH-JLD56（KF374935）是从人粪样中分离得到的一株革兰氏阳性严格厌氧细菌菌株，该菌株在厌氧工作站内能将中药牛蒡子提取物的酸水解物粗品（即牛蒡苷元粗品）高效转化为3′-DMAG。有关3′-DMAG微生物生物合成途径如下所示：

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本发明中的布劳特菌Blautia sp. AUH-JLD56菌株（简称AUH-JLD56）已于2013年08月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏号为 CGMCC No.8032。该保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

布劳特菌Blautia sp. AUH-JLD56菌的分类学特征为：

菌落直径1.5~2.0 毫米，整体发黄白，不透明，菌落中部有凸起；菌落边缘较整齐，随培养时间延长菌落黄色加深；在BHI培养基中菌体为球形或椭球形；该菌株革兰氏染色呈阳性；

本发明还提供了菌株AUH-JLD56在牛蒡苷元转化中的应用，包括下述步骤：

（1）菌株AUH-JLD56的培养；

（2）底物牛蒡苷元粗品与菌株AUH-JLD56共培养；

（3）代谢产物的分离纯化。

其中，菌株AUH-JLD56的培养方法为：将低温冷冻保存的菌株AUH-JLD56融化并按15-20%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37℃下培养18-24小时；再以10-15%接种量将试管中的菌株AUH-JLD56重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基中，继续在厌氧工作站内培养18-24小时作为种子液；

底物牛蒡苷元粗品与菌株AUH-JLD56共培养方法为：

将菌株AUH-JLD56的种子液按10-15%接种量转接到BHI液体培养基中培养，然后加入牛蒡苷元粗品，使得牛蒡苷元在培养基中的浓度不超过3.0毫摩尔/升, 在厌氧工作站内培养2~3天，即可将底物牛蒡苷元粗品高效转化为3′-去甲基-牛蒡苷元；牛蒡苷元粗品中底物牛蒡苷元浓度为150-250毫摩尔/升。

代谢产物的分离纯化采用下述方法：

用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离制备3′-去甲基-牛蒡苷元。

其中，所述AUH-JLD56的分离培养包括下述步骤：

（1）人粪样的采集与培养

用已灭菌的棉签挑取新鲜粪便，放入1毫升新鲜BHI液体培养基中，置厌氧工作站内在37℃温度下培养24小时，作为筛选特定功能微生物菌株的微生物菌群；

（2）分离培养AUH-JLD56

①单一菌落式分离培养

用新鲜BHI液体培养基将事先在厌氧工作站内培养24小时的微生物菌群进行梯度稀释，分别稀释到浓度为10^–1，10^–2、10^–3、10^–4、10^–5、10^–6、10^–7、10^–8，再分别将100微升浓度分别为10^–5、10^–6、10^–7、10^–8的微生物菌群稀释液均匀涂在预先备好的BHI固体培养基上，将涂有微生物菌群稀释液的BHI固体培养基置于厌氧工作站内培养48小时后，分别从BHI固体培养基上挑取数十至数百个单菌落置BHI固体培养皿上，并对所挑取的单菌落进行随机编号；

②单菌落的混合培养及转化活性鉴定

将已编号的单菌落随机取10个为一组，将每组的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落接种到盛有1毫升BHI液体培养基的同一试管内，再分别加入0.1毫摩尔/升牛蒡苷元纯品，在厌氧工作站内培养2天，取100微升培养液并用1000微升乙酸乙酯进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC检测有无产物生成；

③特定功能微生物菌落的分离筛选

一旦某试管中培养物被检测出有产物生成，立即将接种到该试管中的事先已编号的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落，重新分别接种到10个盛有1 毫升BHI液体培养基的不同小试管中，再分别加入0.1毫摩尔/升的底物牛蒡苷元10微升，共同培养24小时后，取100微升培养液加入1000微升乙酸乙酯进行提取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC进行检测，最终确定出有转化活性的10个菌落的混合培养物中具有转化底物AG功能的单菌落；

牛蒡苷元（AG）纯品通过以下方法分离制备：

（1）牛蒡苷（AT）粗品的提取方法

从药店购买中药牛蒡子（产地：中国辽宁），将牛蒡子充分晾干后用粉碎机粉粹。称取粉碎后的牛蒡粉10 克加到250毫升三角瓶中，同时加入100毫升90%的甲醇水溶液（固液比为1：8），浸泡1小时后用超声波常温萃取15分钟，牛蒡子中的大部分牛蒡苷即被提取到甲醇水溶液中了，提取效果可用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）进行检测（见附图1）。HPLC检测条件为：色谱柱为Kromasil C₁₈反相色谱柱（4.6毫米×250毫米）；流动相为乙腈和水，具体为A液为10%乙腈水溶液加入0.1%乙酸，B液为90%乙腈水溶液同时加入0.1%乙酸；检测方法为：A:B = 60:40（v/v）流速为1毫升/分钟，检测波长为280纳米。

（2）牛蒡苷元粗品的制备方法

将上述溶解在甲醇水溶液中的粗提物用滤纸过滤后，加入与提取液体积比为（1:4）的1N 盐酸，在80℃水浴锅中保温2小时进行酸水解。水解结束后取出水浴锅中的三角瓶，等三角瓶内液体温度降至室温后用1N氢氧化钠进行中和，再加入等体积的乙酸乙酯进行萃取。乙酸乙酯被蒸干后所得物即为牛蒡苷元粗品。牛蒡子的甲醇水溶液提取物的酸水解的效果可用HPLC进行检测（见附图1），HPLC检测条件同上所述。

（3）牛蒡苷元纯品的制备方法

牛蒡子的甲醇水溶液提取物的酸水解产物分别在228纳米和279纳米处有最大紫外吸收（见附图2），这恰与牛蒡苷元标准品的紫外图谱相吻合；此外，在相同流动相和检测条件下，牛蒡子的甲醇水溶液提取物的酸水解产物与牛蒡苷元标准品的HPLC保留时间完全一致。因此，根据紫外吸收图谱和相同条件下的HPLC保留时间，将牛蒡子的甲醇水溶液提取物的酸水解产物鉴定为牛蒡苷元。为了对牛蒡子甲醇水溶液提取物的酸水解产物进行大量制备，我们用制备柱（8.0毫米×250毫米）在HPLC上进行分离，对水解产物峰进行收集，收集液用旋转蒸发仪蒸干。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

本发明提供的菌株AUH-JLD56能将中药牛蒡子中的牛蒡苷元（AG）粗品高效转化为3′-DMAG，解决了3′-DMAG资源缺乏的问题，对3′-DMAG 药理活性及新药研发具有极大的推动作用。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1 为本发明中牛蒡子提取物和牛蒡子提取物酸水解产物的高效液相色谱图；

图2为牛蒡子提取物酸水解产物的紫外吸收图谱；

图3为本发明实施例1中菌株AUH-JLD56转化底物牛蒡苷元的高效液相色谱图；

图4为底物牛蒡苷元和牛蒡苷元代谢产物的紫外吸收图谱；

图5为牛蒡苷元代谢产物的质谱图；

图6为厌氧菌株AUH-JLD56对底物牛蒡苷元粗品的转化动态曲线；

图7为厌氧菌株AUH-JLD56对不同浓度底物牛蒡苷元转化能力比较；

图8为不同浓度底物牛蒡苷元及其代谢产物3′-DMAG体外清除DPPH自由基能力比较。

具体实施方式

实施例1

1.菌株AUH-JLD56的分离培养

（1）人粪样的采集与培养

用已灭菌的棉签挑取人新鲜粪便，放入1毫升新鲜BHI液体培养基中，置厌氧工作站内在37℃温度下培养24小时，作为筛选特定功能微生物菌株的微生物菌群；

（2）分离培养菌株AUH-JLD56

①单一菌落式分离培养

②单菌落的混合培养及转化活性鉴定

③特定功能微生物菌落的分离筛选

一旦某试管中培养物被检测出有产物生成，立即将接种到该试管中的事先已编号的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落，重新分别接种到10个盛有1 毫升BHI液体培养基的不同小试管中，再分别加入0.1毫摩尔/升的底物牛蒡苷元10微升，共同培养24小时后，取100微升培养液加入1000微升乙酸乙酯进行提取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC进行检测，最终确定出有转化活性的10个菌落的混合培养物中具有转化底物牛蒡苷元功能的单菌落；

2.菌株AUH-JLD56的纯化培养、菌种鉴定与保藏

（1）单菌落的纯化培养

将筛选出的单一功能微生物菌落在BHI固体培养基上划线培养，长出单菌落后，再对长出的单菌落进行划线，重复至少3次以上，确保长出的单菌落形态一致。将纯化后的单菌落接种到1毫升BHI液体培养基中，培养24小时取菌液100微升，加入到盛有500微升事先已灭菌的脱脂奶粉的冻存管中，混匀后在其表面加2毫米厚事先已灭菌的液体石蜡，再将其保藏在-70℃的超低温冰箱中，对低温保藏的功能微生物菌株定期进行复壮培养和转化活性测定。

（2）对分离出的特定功能微生物菌株进行菌种鉴定

以单一功能微生物菌株菌体总DNA为模板，以通用引物27F/1492R（27F:

5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3′）为引物对16S rDNA序列进行PCR扩增，PCR扩增产物送交上海生工生物工程有限公司进行DNA测序，测序结果经BLAST比对与GenBank数据库其他菌株进行相似性分析，该单一功能微生物菌株的16S rDNA序列与韦氏布劳特菌Blautia wexlerae的相似性高达99%，因此，将该转化菌株初步确定为布劳特菌属菌株。将该功能微生物菌株菌株命名为AUH-JLD56，并将其16S rDNA序列上交NCBI基因库，得到该菌株注册号（Accession Number）KF374935。

3.菌株AUH-JLD56在牛蒡苷元转化中的应用

（1）菌株AUH-JLD56的培养

将–70℃低温保存的人肠道分离菌株AUH-JLD56冻融后，按20%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37℃下培养18小时后试管中菌液呈絮状混浊。再以10%接种量将试管中已长混浊的菌株AUH-JLD56重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基的塑料离心管中，继续在厌氧工作站内培养24小时作为种子液；

（2）底物牛蒡苷元粗品与菌株AUH-JLD56共培养

在厌氧工作站内将上述事先培养好的菌株AUH-JLD56的种子液按10%接种量转接到盛有液体培养基的三角瓶内培养，同时加入200毫摩尔/升的牛蒡苷元粗品, 使得培养基中牛蒡苷元浓度为3.0毫摩尔/升，在厌氧工作站内培养3天，菌株AUH-JLD56可将底物牛蒡苷元粗品转化为3′-DMAG。

（3）用HPLC检测底物牛蒡苷元粗品被菌株AUH-JLD56的转化情况

从上述三角瓶中培养物100微升至1.5毫升EP管中，加1000微升乙酸乙酯进行萃取，静置离心后取出上层乙酸乙酯800微升，在离心浓缩仪中蒸干后加入800微升100%甲醇溶液，经HPLC检测底物转化情况（见附图3）。

（4）代谢产物的分离纯化

经HPLC检测如果底物转化良好，用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，用干净三角瓶收集代谢产物3′-DMAG。

实施例2

菌株AUH-JLD56的分离方法同实施例1，菌株AUH-JLD56在牛蒡苷元转化中的应用包括下述步骤：

（1）菌株AUH-JLD56的培养

将–70℃低温保存的人肠道分离菌株AUH-JLD56冻融后，按15%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37℃下培养20小时后试管中菌液呈絮状混浊。再以15%接种量将试管中已长混浊的菌株AUH-JLD56重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基的塑料离心管中，继续在厌氧工作站内培养18小时作为种子液；

（2）底物牛蒡苷元粗品与菌株AUH-JLD56共培养

在厌氧工作站内将上述事先培养好的菌株AUH-JLD56的种子液按15%接种量转接到盛有液体培养基的三角瓶内培养，同时加入150毫摩尔/升的牛蒡苷元粗品, 使得培养基中牛蒡苷元浓度为2.0毫摩尔/升，在厌氧工作站内培养2.5天，菌株AUH-JLD56可将底物牛蒡苷元粗品转化为3′-DMAG。

（3）用HPLC检测底物牛蒡苷元粗品被菌株AUH-JLD56的转化情况

从上述三角瓶中培养物100微升至1.5毫升EP管中，加1000微升乙酸乙酯进行萃取，静置离心后取出上层乙酸乙酯800微升，在离心浓缩仪中蒸干后加入800微升100%甲醇溶液，经HPLC检测底物转化情况。

（4）代谢产物的分离纯化

实施例3

（1）菌株AUH-JLD56的培养

将–70℃低温保存的人肠道分离菌株AUH-JLD56冻融后，按18%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37℃下培养24小时后试管中菌液呈絮状混浊。再以13%接种量将试管中已长混浊的菌株AUH-JLD56重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基的塑料离心管中，继续在厌氧工作站内培养20小时作为种子液；

（2）底物牛蒡苷元粗品与菌株AUH-JLD56共培养

在厌氧工作站内将上述事先培养好的菌株AUH-JLD56的种子液按12%接种量转接到盛有液体培养基的三角瓶内培养，同时加入250毫摩尔/升的牛蒡苷元粗品, 使得培养基中牛蒡苷元浓度为1.0毫摩尔/升，在厌氧工作站内培养2天，菌株AUH-JLD56可将底物牛蒡苷元粗品转化为3′-DMAG。

（3）用HPLC检测底物牛蒡苷元粗品被菌株AUH-JLD56的转化情况

（4）代谢产物的分离纯化

对制备的代谢产物3′-DMAG进行结构鉴定，鉴定方法及鉴定结果如下：

将收集的代谢产物峰蒸干后，在分析型高效液相色谱仪上测定其纯度，再分别测定代谢产物的紫外吸收谱、质谱、核磁共振氢谱和碳谱。结果表明，该代谢产物分别在227纳米和280纳米处有最大紫外吸收（见附图4），质谱测定结果表明，该代谢产物分子量为358（见附图5），这恰好与3′-DMAG分子式C₂₀H₂₂O₆相吻合。根据产物的紫外吸收图谱和分子量可将其初步鉴定为3′-DMAG。为进一步准确解析该代谢产物的化学结构，我们分别测定了纯化后代谢产物的核磁共振氢谱（¹H-NMR）和碳谱（¹³C-NMR）。通过谱图解析，并与文献报道中的3′-DMAG的核磁共振氢谱和碳谱进行对比分析（Biological and Pharmaceutical Bulletin,30（5）: 904-911, 2007），最终将该代谢产物准确鉴定为3′-DMAG。代谢产物的¹H-NMR和¹³C-NMR结果如下：

¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz,): δ2.46-2.64(4H,m, H-2,3,7"), 2.85(2H, d, J=5.5Hz, H-7′), 3.81-3.84(6H, s, -OCH₃*2), 3.88(1H, dd, J=8.54, 7.6Hz, H-4),4.13(1H, dd, J=8.54, 7.8Hz, H-4), 6.48(1H, d, J=1.94Hz, H-2′′), 6.51(1H, dd, J=8.19, 1.94, H-6′), 6.57(1H, dd, J=8.19, 1.94Hz, H-6′′), 6.66(1H, d, J=1.94Hz, H-2′), 6.75 (1H, d, J=8.19Hz, H-5′), 6.77(1H, d, J=8.19Hz, H-5′′)

¹³C NMR (CDCl₃, 400MHz): δ179.9(C1), 149.0(C-3′′), 147.8(C-4′′), 144.0(C-3′), 142.9(C-4′), 130.0(C-1′′), 129.9(C-1′), 121.7(C-6′), 120.7(C-6′′), 116.1 (C-2′), 115.2(C-5′), 111.8(C-2′′), 111.4(C-5′′), 71.8(C-4), 46.6(C-2), 40.9(C-3)，34.0(C-7′)，55.9(-Me), 55.8 (-Me)

分析菌株AUH-JLD56对底物牛蒡苷元粗品转化动态和转化能力，并对产物3′-DMAG与底物牛蒡苷元纯品对DPPH自由基体外清除能力进行比较：

1、菌株AUH-JLD56对底物牛蒡苷元粗品的转化动态

为了解菌株AUH-JLD56转化底物牛蒡苷元的速度，以便确定最佳转化时间，我们对菌株AUH-JLD56转化底物牛蒡苷元粗品的转化动态进行了测定，具体方法如下：

将事先培养好的种子液（培养方法同上所述）按10%接种量接种到盛有100毫升液体培养基的250毫升三角瓶内培养，同时加入200 毫摩尔/升的牛蒡苷元粗品0.2 毫升，在厌氧工作站内培养0小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、24小时后分别取培养物100微升，用1000微升的乙酸乙酯萃取，取萃取液800微升，萃取液蒸干后加入100微升100%甲醇溶液，并用HPLC检测底物被转化情况，根据不同培养时间底物和产物浓度绘制菌株转化动态（见图6），由图6可知，底物加入12小时后即有90.5%左右产物3′-DMAG被生成，继续培养16 小时后，所加入的底物牛蒡苷元有96.3%被转化为3′-DMAG, 第24小时产物量基本不再上升。

2、菌株AUH-JLD56对不同浓度底物牛蒡苷元粗品最大转化能力测定

将菌株AUH-JLD56分别与不同浓度的牛蒡苷元粗品在厌氧工作站内共同培养3天，然后用等体积乙酸乙酯对培养物进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇溶液，并用HPLC检测底物牛蒡苷元粗品被转化情况，牛蒡苷元粗品浓度依据牛蒡苷元粗品中牛蒡苷元峰面积值及牛蒡苷元纯品的标准曲线进行计算。结果表明，当底物牛蒡苷元浓度为不超过2.4毫摩尔/升时，菌株AUH-JLD56对不同浓度的底物牛蒡苷元平均转化率（转化率=产物浓度/（剩余底物浓度+产物浓度）×100%）均为95%以上，如菌株AUH-JLD56对浓度分别为0.6毫摩尔/升、1.2毫摩尔/升和2.4毫摩尔/升的牛蒡苷元粗品的平均转化率分别为98.1%、97.40%和96.5%；当底物浓度增至3.6毫摩尔/升时，菌株AUH-JLD56对底物牛蒡苷元粗品的转化效率有所降低，平均转化率为90.5%；而当所加入的底物浓度为4.0毫摩尔/升时，菌株AUH-JLD56对底物牛蒡苷元粗品转化能力急剧下降，平均转化率仅为54.4%（见附图7）。

3、产物3′-DMAG与底物牛蒡苷元纯品对DPPH自由基体外清除能力比较

分别将底物牛蒡苷元纯品与产物3′-DMAG纯品配制为10毫摩尔/升的母液，然后依次稀释为以下浓度：0.5毫摩尔/升、0.1毫摩尔/升、0.05毫摩尔/升和0.025毫摩尔/升，分别测定不同浓度下底物和产物对二苯代苦味酰基自由基（1,1-Diphenyl- 2-Picrylhydrazyl，即DPPH）的体外清除能力。结果表明，当浓度范围在0.025~0.1毫摩尔/升时，相同浓度下产物3′-DMAG对DPPH自由基清除能力均极显著高于底物AG（p<0.01）；而当浓度为0.5毫摩尔/升时，产物3′-DMAG与底物AG对DPPH自由基的清除率均为95%以上，但产物与底物的清除率差异不显著（见附图8），推测造成这种现象的原因可能是，因底物或产物浓度过大，造成体系中DPPH自由基量不足，既体系中化合物已经过饱和所致。

Claims

1.一种布劳特菌（Blautia sp.）AUH-JLD56，保藏号为CGMCC No.8032。

2.根据权利要求１所述的布劳特菌AUH-JLD56在牛蒡苷元转化中的应用，其特征在于包括下述步骤：

（1）菌株AUH-JLD56的培养；

（2）底物牛蒡苷元粗品与菌株AUH-JLD56共培养；

（3）代谢产物的分离纯化。

3.根据权利要求2所述的布劳特菌AUH-JLD56在牛蒡苷元转化中的应用，其特征在于所述菌株AUH-JLD56的培养方法为：将低温冷冻保存的菌株AUH-JLD56融化并按15-20%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37℃下培养18-24小时；再以10-15%接种量将试管中的菌株AUH-JLD56重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基中，继续在厌氧工作站内培养18-24小时作为种子液。

4.根据权利要求2所述的布劳特菌AUH-JLD56在牛蒡苷元转化中的应用，其特征在于所述底物牛蒡苷元粗品与菌株AUH-JLD56共培养方法为：将菌株AUH-JLD56的种子液按10-15%接种量转接到BHI液体培养基中培养，然后加入牛蒡苷元粗品，使得牛蒡苷元在培养基中的浓度不超过3.0毫摩尔/升, 在厌氧工作站内培养2~3天，即可将底物牛蒡苷元粗品高效转化为3′-去甲基-牛蒡苷元。

5.根据权利要求4所述的布劳特菌AUH-JLD56在牛蒡苷元转化中的应用，其特征在于所述牛蒡苷元粗品中底物牛蒡苷元浓度为150-250毫摩尔/升。

6.根据权利要求2所述的布劳特菌AUH-JLD56在牛蒡苷元转化中的应用，其特征在于所述代谢产物的分离纯化方法为：用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离制备3′-去甲基-牛蒡苷元。