CN112501037A - 一种在石头上促进药用石斛种子萌发形成幼苗的菌株及方法 - Google Patents

一种在石头上促进药用石斛种子萌发形成幼苗的菌株及方法 Download PDF

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吴益花
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    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N1/14Fungi; Culture media therefor

Abstract

本发明提供了一种在石头上促进药用石斛种子萌发形成幼苗的菌株及方法,所述的菌株为蜡壳耳目真菌菌株;拉丁名Sebacinales sp.LQ;保藏单位:中国典型培养物保藏中心;保藏编号:CCTCC NO:M 2019744;保藏时间:2019年9月23日;保藏地址:中国湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学。本发明所述的适用于岩石培育药用曲茎石斛共生种苗具体为在石头上萌发。本发明不占用耕地、充分利用零散石头资源的同时,方便后期的管理,形成集低投入、高品质、观赏与经济效益于一体的石生药用石斛种植新模式。

Description

一种在石头上促进药用石斛种子萌发形成幼苗的菌株及方法
技术领域
本发明属于药用石斛野外种植技术领域,具体是涉及一种在石头上促进药用石斛种子萌发形成幼苗的菌株及方法。
背景技术
石斛属(Dendrobium)为兰科第二大属,全球约有1500多种,我国约80种,其中近40种具有药用价值。曲茎石斛(Dendrobium flexicaule)是石斛属植物中比较名贵的药材品种,上可追溯至唐代《太上肘后玉经方》(公元825年),迄今已有1191年的历史。曲茎石斛分布于石斛属分布区的最北缘,已达北纬34°24′,集中分布于渝东、川东北、鄂西、鄂北、豫西、陕南等秦巴山区。生境独特,通常附生于悬崖峭壁之岩石上,坡向多为坐南朝北。过去人们以采集野生资源为主,留下“悬崖绝壁采金钗”、“金钗猎人”、“财富与冒险的故事”等一系列民间传奇。秦巴山区特别是陕西的多个县市亦将“秦巴金钗”列为地方特产或道地药材,并称其为“还魂草”。但是长期以来,曲茎石斛完全靠野生供药,野生资源已非常稀少。因其药用价值高,近年来备受关注,已被列入《中国药用石斛图志》、《河南省重点保护植物名录》。由于对其的研究缺乏,目前尚无自然条件下成功培育共生种苗的范例,亟待加强保护和利用研究。
发明内容
由于兰科植物种子本身的生物学特性:种子非常细小仅有发育不完全的胚,在自然条件下种子萌发需要依靠特定的共生真菌来获取营养物质。因此获得促进种子萌发的有效共生真菌是进行珍稀濒危兰科植物保护的第一步,也是开展生态栽培的关键环节。本发明已获得促使曲茎石斛种子萌发形成幼苗的有效共生真菌,将真菌制成菌粉混匀种子,放入纸质茶包袋制成可自然栽培的共生种苗培育袋,并创新方法充分利用岩石资源开展生态栽培,从种子萌发至发育到成年植株都在原生境,符合消费者对道地药材、绿色健康产品的要求,便于产业栽培的应用和推广;同时对濒危药用石斛资源的保护和可持续利用具有重要的应用价值。
本发明的目的在于针对现有技术的不足,提供一种适用于岩石培育药用曲茎石斛共生种苗的方法,以简化育苗过程、降低成本、在纯自然状态下培育出高品质种苗。
本发明的目的还在所述方法适用于一切石生药用石斛共生种苗的繁育。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
一种在石头上促进药用石斛种子萌发形成幼苗的菌株,所述的菌株为蜡壳耳目真菌菌株;拉丁名Sebacinales sp. LQ;保藏单位:中国典型培养物保藏中心;保藏编号:CCTCC NO:M 2019744;保藏时间:2019年9月 23日;保藏地址:中国湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学。
本发明所述的菌株针对促进的药用石斛为曲茎石斛;拉丁名:Dendrobium flexicaule
本发明所述菌株在石头上促进药用石斛种子萌发形成幼苗具体为所述的蜡壳耳目真菌菌株与药用石斛:曲茎石斛混合物在石头上萌发。
上述菌株在石头上促进药用石斛种子萌发形成幼苗的方法,该方法包括以下步骤:
1、采集成熟未开裂的曲茎石斛果荚,进行表面消毒处理后低温保存备用;
2、真菌粉的制作:
2.1培养基的制作:以锥形瓶50%体积的量将PDA液体培养基装瓶,封口后装入灭菌锅,于121℃,115KPa条件下灭菌20min备用;
2.2 将活化培养3—10天的蜡壳耳目真菌菌株(Sebacinales sp. LQ)CCTCC NO:M2019744接种于备用的PDA液体培养基,于23—28℃,120—200rpm条件下发酵培养5—10天;
2.3 用纱布过滤发酵液获取菌丝体,用无菌水冲洗菌丝体3—5次并沥水以去除残留的葡萄糖,将菌丝体和1—20倍质量的琼脂放入匀浆机打碎成粉;
2.4 将打碎好的粉末置于烘箱内25—35℃条件下烘干0.5—4小时,获得真菌粉;
3、共生种苗培育袋的制作
3.1取一个曲茎石斛果荚中10%—100%的种子与500g真菌粉混匀后,分装入纸袋,每个纸袋内装0.1—0.5g的菌粉种子混合物;
3.2每个纸袋内再装入0.1—1g干苔藓碎屑,得到共生种苗培育袋。
4、石头上培育共生种苗
4.1选择规格大小介于6×7cm—30×40cm的石头备用;
4.2先将共生种苗培育袋用清水浸泡至吸水饱和,然后放置在处理好的石头上,用普通保鲜膜缠绕1—2圈,每个石头根据大小放置1—5个共生种苗培育袋;
4.3用牙签刺穿保鲜膜和共生种苗培育袋表面形成均匀的小孔,使种子在萌发过程中透气保湿;且后期种子萌发及发育成幼苗时可突破小孔长出叶子;
4.4待幼苗长出2片及以上的叶,生根贴于石头上时,可将保鲜膜撕开。
以下为优选的技术参数:
步骤2.2中,发酵培养条件优选28℃,200rpm,10天。
步骤2.3中,将菌丝体和3倍质量的琼脂放入匀浆机打碎成粉。
步骤2.4中,优选30℃条件下烘干2小时。
步骤3.1中,称取0.0206g曲茎石斛的种子与50g菌粉混匀后,称取0.2g菌粉种子混合物分装入55×62mm的小号纸质茶包袋,以控制每个茶包袋的种子数量为10颗。
步骤3.2中,将智利水苔干苔藓用粉碎机打碎,每个纸袋内再装入0.3g的碎屑,得到共生种苗培育袋。
步骤4.1中,选择规格大小介于6×7cm—20×25cm的石头,拔除石头上的杂草,除去生长比较茂盛的苔藓,仅保留少数比较矮小或零星有苔藓即可;同时清理石头表面的泥土,利于曲茎石斛种子萌发初期即可附着于石头上。
步骤4.2中,每个石头根据大小放置1—5个共生种苗培育袋;用保鲜膜缠绕2圈使袋子紧贴于石头表面。
步骤4.3中,每个混合播种包扎10—15个小孔,孔间距5mm。
步骤4.4中,根据幼苗的生长情况撕开保鲜膜,当幼苗的根段完全附生于石头上时,可将保鲜膜全部去除;否则以2—4cm2的开口度撕开保鲜膜。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
我国石斛属植物集中分布于北纬15°30′-25°12′之间,附生于树干或崖壁上,石头阻碍了耕地利用,却是石斛种植的优势。本发明在自然条件下,基于共生萌发技术的同时就地取材充分利用岩石资源,开展石生药用曲茎石斛共生种苗的培育。第一,共生种苗培育袋方便储存及运输,播种时仅需提前用水浸泡10分钟至吸水饱和,然后直接放置在石头上缠绕保鲜膜固定即可完成种子的原生境直播,具有成本低、操作简单、种苗成活率高等优点。第二,该方法对于多山多石的贫困山区而言既投入少又不占用耕地资源,还能充分利用岩石资源做出特色经济模式。相比于大棚种植昂贵的棚架、苗床、喷灌系统等基础设施的投入和日常管理成本,此方法便于大规模分散推广。第三,利用石头分散栽培,不仅可以就地取材将遍地分散的石头资源充分利用,同时小巧的石头方便搬运和管理。在日照强烈、温度高的季节,可灵活搬运至遮阴处;在寒冬时节则可搬运至室内顺利过冬;待种苗长大时可直接移栽至岩石缝中。此外,共生种苗培育袋与奇形怪状的石头组合,可形成完美的盆栽供观赏。第四,本方法在珍稀濒危兰科植物的回归、药用兰科植物的仿生态栽培、解决药用石斛栽培产业的种苗来源瓶颈问题等方面都具有巨大的推广价值。
保藏生物材料的说明:本发明的菌株,已于2019年9月 23日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏地址:湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学,保藏编号为:CCTCC NO:M2019744。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的详细说明,但实施例并不是对本发明技术方案的限定。
实施例l:
1、播种地的选择
在秦巴山区选择海拔700—1600米岩石资源丰富的地区作为播种地点,岩石类型为砂岩,年平均气温12—18℃,极端最高温度34 ℃以下,极端最低温度-10℃以上,无霜期200天以上,空气相对湿度60%以上,森林覆盖率50%以上。
2、播种载体的选择
2.1在多山多石的地区就地取材选择大小不等的砂岩,每个石头的尺寸介于6×7cm—20×25cm,以便于石头的搬运、管理及种子袋的固定。若是选择过大的石头,不仅不方便搬运,后期的管理也很费力,而且不利于种子袋的固定;
2.2选择好石头后需要拔除石头上的杂草,除去生长比较茂盛的苔藓,仅保留少数比较矮小或零星有苔藓即可;同时清理石头表面的泥土,利于曲茎石斛种子萌发初期即可附着于石头上。
3、曲茎石斛种质的获得与保存
采集野外自然结实并成熟但未开裂的曲茎石斛种子用75%的酒精棉球擦拭表面,再用无菌水冲洗后,干燥2天后收集入种子管中于-20℃低温保存备用。
4、真菌菌粉的制作
4.1培养基的制作:PDA液体培养基常规做法,适量。以每瓶150ml平均分装入60瓶300ml的三角瓶,封口后用报纸包裹瓶口,装入灭菌锅于121℃,115KPa条件下灭菌20min,备用;
4.2将活化培养7天的蜡壳耳目真菌菌株(Sebacinales sp. LQ)CCTCC NO:M2019744接种于备用的PDA液体培养基,于28℃,200rpm条件下发酵培养10天;
4.3用纱布过滤已培养的发酵液获取菌丝体并用无菌水冲洗菌丝体3—5次并沥水,以去除残留的葡萄糖。将菌丝体和3倍质量的琼脂放入匀浆机打碎制成菌粉;
4.4将菌粉均匀摆放在磁盘上,放置烘箱内于30℃条件下烘干2小时,得真菌菌粉备用。
5、共生种苗培育袋的制作
5.1常规TTC方法检测种子活力,以确认种子活力达90%以上;
5.2称取0.0206g曲茎石斛的种子与50g菌粉混匀后,称取0.2g菌粉种子混合物分装入55×62mm的小号纸质茶包袋,以控制每个茶包袋的种子数量为10颗;
5.3将智利水苔干苔藓用粉碎机打碎,每个纸袋内再装入0.3g的碎屑,得到共生种苗培育袋。
6、野外石头上播种共生种苗培育袋
6.1于2019年8月15日在重庆市罗田镇石寨堂开展播种实验。首先将共生种苗培育袋放入水中浸泡10min至袋内的水苔吸水饱和,其次将培育袋(根据石头大小放置1—5个)放置于处理好的石头表面,用保鲜膜缠绕2圈使袋子紧贴于石头表面,即完成播种过程;
6.3待共生种苗培育袋播种完成后,用牙签刺穿保鲜膜和袋子表面形成10—15个均匀的小孔,使种子在萌发过程中透气保湿;且后期种子萌发及发育成幼苗时,可突破小孔长出叶子,更接近于种子的自然萌发状态;
6.4后期根据幼苗的生长情况撕开保鲜膜,当幼苗的根段完全附生于石头上时,可将保鲜膜全部去除;否则以2—4cm2的开口度撕开保鲜膜。
7、数据分析
7.1根据实验需要设置2组处理,播种300袋共生种苗培育袋作为实验组;同时播种40袋不含真菌粉,仅由种子、琼脂粉和苔藓组成的培育袋作为对照组。
7.2播种后90天分别随机抽取30袋检测种子萌发情况,记录种子萌发及形成原球茎的时间;播种后11个月进行第二次统计,记录种子萌发率、原球茎形成率及幼苗率。种子萌发情况检测和数据统计分析:统计4个阶段,即种子未萌发、种子萌发(种胚膨大并产生根状物)、原球茎形成和发育(种胚膨大突破种皮至出现原生分生组织)、幼苗分化和发育阶段(长出第一片叶片及后续生长)的量,计算出种子萌发率(G)、原球茎形成率(C)以及幼苗率(K)。G=mean (g/t)±SD,C=mean (c/t)±SD,K=mean(k/t)±SD;其中,g为每种处理下的各培养皿中萌发的种子数;c为每种处理下的各培养皿中形成原球茎的种子数(原球茎与幼苗之和);k为每种处理下的各培养皿中处于各萌发阶段的幼苗数量;t为各培养皿中播种的种子数;SD为标准差。
从表中可知,播种90天以后,种子萌发率达到64%;时隔将近一年,幼苗率已达45%,很好地体现了用此方法进行原生境共生种苗的培育是可行的。目前曲茎石斛的种植主要由部分石斛企业开展组培育苗进行大棚集约化栽培,大棚种植不仅基础设施投入巨大、种植技术要求高,产品的安全性和道地性也受到质疑。中药资源的“道地性”已成为当今消费者衡量药材品质的重要标准,消费者在“道地药材”、“原生态产品”、“野生的才是最好的”这一消费观念的影响下,愿意出更高的价格购买野生石斛。因此生态栽培已被业界认为是石斛产业发展的方向,但是目前的生态栽培主要是将非共生萌发(无菌萌发)幼苗移植到树干或石头上,由于无菌苗移植到自然界中,生长缓慢,抗病原微生物能力差,存活率较低,同时由于很难与后接触的真菌建立共生关系而导致后继生长严重受阻。已有研究表明,石生石斛比树生石斛好,但是在石头上开展石斛的生态栽培,难度大且成活率难以保证。而本发明的方法是将种苗培育包放置在大大小小的石头上,自种子萌发开始就和真菌建立关系,且生根阶段就已经完全附生于岩石上,成活率高。不占用耕地、充分利用零散石头资源的同时,方便后期的管理,形成集低投入、高品质、观赏价值与经济效益于一体的石生药用石斛种植新模式。
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例(本发明的技术方案故实施例不能穷举,本发明所记载的保护范围以本发明的技术方案要点范围为准),方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出,上述实施例不以任何方式限制本发明,对于本领域的技术人员来说,凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准,说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种在石头上促进药用石斛种子萌发形成幼苗的菌株,其特征在于,所述的菌株为蜡壳耳目真菌菌株;拉丁名Sebacinalessp.LQ;保藏单位:中国典型培养物保藏中心;保藏编号:CCTCC NO:M 2019744;保藏时间:2019年9月 23日;保藏地址:中国湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学。
2.根据权利要求1所述的菌株,其特征在于,所述的菌株针对促进的药用石斛为曲茎石斛;拉丁名:Dendrobium flexicaule
3.根据权利要求1所述的菌株,其特征在于,所述菌株在石头上促进药用石斛种子萌发形成幼苗具体为所述的蜡壳耳目真菌菌株与药用石斛:曲茎石斛混合物在石头上萌发。
4.如权利要求1所述菌株在石头上促进药用石斛种子萌发形成幼苗的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
真菌粉的制作:
1)培养基的制作:以锥形瓶50%体积的量将PDA液体培养基装瓶,封口后装入灭菌锅,于121℃,115KPa条件下灭菌20min备用;
2)将活化培养3—10天的蜡壳耳目真菌菌株(Sebacinales sp.LQ)CCTCC NO:M2019744接种于备用的PDA液体培养基,于23—28℃,120—200rpm条件下发酵培养5—10天;
3)用纱布过滤发酵液获取菌丝体,用无菌水冲洗菌丝体3—5次并沥水以去除残留的葡萄糖,将菌丝体和1—20倍质量的琼脂放入匀浆机打碎成粉;
4)将打碎好的粉末置于烘箱内25—35℃条件下烘干0.5—4小时,获得真菌粉。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
共生种苗培育袋的制作:
1)取一个曲茎石斛果荚中10%—100%的种子与500g真菌粉混匀后,分装入纸袋,每个纸袋内装0.1—0.5g的菌粉种子混合物;
2)每个纸袋内再装入0.1—1g干苔藓碎屑,得到共生种苗培育袋。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
石头上培育共生种苗:
1)选择规格大小介于6×7cm—30×40cm的石头备用;
2)先将共生种苗培育袋用清水浸泡至吸水饱和,然后放置在处理好的石头上,用普通保鲜膜缠绕1—2圈,每个石头根据大小放置1—5个共生种苗培育袋;
3)用牙签刺穿保鲜膜和共生种苗培育袋表面形成均匀的小孔,保证种子在萌发过程中透气保湿;保证后期种子萌发及发育成幼苗时可突破小孔长出叶子;
4)待幼苗长出2片及以上的叶,生根贴于石头上时,将保鲜膜撕开。
7.如权利要求5所述的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
在共生种苗培育袋的制作步骤之前,设置以下预处理步骤:
采集成熟未开裂的曲茎石斛果荚,进行表面消毒处理后低温保存备用。
8.如权利要求4所述的方法,其特征在于,真菌粉的制作步骤中:
步骤2)中,发酵培养条件优选28℃,200rpm,10天;
步骤3)中,将菌丝体和3倍质量的琼脂放入匀浆机打碎成粉;
步骤4)中,优选30℃条件下烘干2小时。
9.如权利要求5所述的方法,其特征在于,共生种苗培育袋的制作中:
步骤1)中,称取0.0206g曲茎石斛的种子与50g菌粉混匀后,称取0.2g菌粉种子混合物分装入55×62mm的小号纸质茶包袋,以控制每个茶包袋的种子数量为10颗;
步骤2)中,将智利水苔干苔藓用粉碎机打碎,每个纸袋内再装入0.3g的碎屑,得到共生种苗培育袋。
10.如权利要求6所述的方法,其特征在于,石头上培育共生种苗步骤中:
步骤1)中,选择规格大小介于6×7cm—20×25cm的石头,拔除石头上的杂草,除去生长比较茂盛的苔藓,仅保留少数比较矮小或零星有苔藓即可;同时清理石头表面的泥土,利于曲茎石斛种子萌发初期即可附着于石头上;
步骤2)中,每个石头根据大小放置1—5个共生种苗培育袋;用保鲜膜缠绕2圈使袋子紧贴于石头表面;
步骤3)中,每个混合播种包扎10—15个小孔,孔间距5mm;
步骤4)中,根据幼苗的生长情况撕开保鲜膜,当幼苗的根段完全附生于石头上时,将保鲜膜全部去除;否则以2—4cm2的开口度撕开保鲜膜。
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