BR9812117B1 - Proteína pesticida isolada e processo de controle de peste de coleóptero - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNA PESTICIDA ISOLADA E PROCESSO DE CONTROLE DE PESTE DE CO- LEÓPTERO".

DESCRIÇÃO

Fundamentos da Invenção Insetos e outras pragas custam bilhões de dólares anualmente para os fazendeiros em perdas na colheita na despesa para manter estas pragas sob controle. Estas perdas causadas por pragas nos ambientes de produção agrícola incluem o decréscimo no rendimento da colheita, qualida- de reduzida da colheita e custos aumentados da colheita.

Os coleópteros são um grupo importante de pragas agrícolas que causa uma grande quantidade de danos a cada ano. Os exemplos de pragas coleópteras incluem o gorgulho da alfafa e o verme da raiz do milho. O gorgulho da alfafa, Hypera postiça e o gorgulho da alfafa e- gípcia intimamente relacionado, Hypera brunneipennis, são as pragas de inseto mais importantes do cultivo da alfafa nos Estados Unidos, com 117 milhões de ares (2,9 milhões de acres) infestados em 1984. É gasta uma soma anual de 20 milhões de dólares para controlar estas pragas. O gorgu- lho da alfafa egípcia é a espécie predominante no sudoeste dos EUA, onde sofre entorpecimento (isto é, hibernação) durante os meses quentes do ve- rão. Em todas as outras considerações, é idêntico ao gorgulho da alfafa, que predomina em todo o resto dos EUA. O estágio larval é o mais danificador no ciclo de vida do gorgu- lho. Se alimentando das extremidades em crescimento da planta da alfafa, as larvas causam a esqueletização das folhas, interrupção, crescimento re- duzido da planta e, finalmente, reduções no rendimento. As infestações gra- ves podem arruinar toda uma operação de corte do feno. Os adultos, tam- bém consumidores de folhas, causam danificação adicional mas menos sig- nificante.

Aproximadamente 376 milhões de ares (9,3 milhões de acres) de milho dos EUA são infestados por um complexo de espécies de verme da raiz de milho a cada ano. O complexo de espécies de verme da raiz de mi- Iho inclui o verme da raiz de milho do norte, Diabrotida barben: o verme da raiz de milho do sul, D. undecimpunctata howardi e o verme da raiz de milho do oeste, D. virgifera virgifera. As larvas que habitam o solo destas espécies de Diabrotica se alimentam da raiz da planta de milho, causando alojamen- to. O alojamento eventualmente reduz o rendimento do milho e freqüente- mente resulta na morte da planta. Alimentando-se das barbas de milho, os besouros adultos reduzem polinização e, portanto, afetam prejudicialmente o rendimento do milho por planta. Em adição, os membros do gênero Dia- brotica atacam as colheitas de curcubitáceas (pepinos, melões, abóbora, etc) e muitos vegetais e plantações de campo na produção comercial assim como as que são cultivadas em jardins domésticos. O controle do verme da raiz de milho foi parcialmente realizado por métodos de cultivo, tais como a rotação da colheita e a aplicação de al- tos níveis de fosfato para estimular o crescimento de um sistema adventício de raiz. Em adição, uma característica de período de diapausa de dois anos de emergência (ou "overwintering") dos vermes da raiz de milho do Norte está interrompendo a rotação da colheita em algumas áreas. Entretanto, os inseticidas químicos se baseiam fortemente na mesma para garantir o nível desejado de controle. Os inseticidas são aplicados sobre ou incorporados ao solo. O problema principal associado com o uso de inseticidas químicos é o desenvolvimento de resistência entre as populações de insetos tratadas.

Um valor superior a $250 milhões de inseticidas é aplicado anu- almente para controlar os vermes da raiz de milho só nos Estados Unidos.

Mesmo com o uso de inseticida, os vermes da raiz causam um dano de va- lor superior a $750 milhões na colheita a cada ano, tornando-os a espécie mais grave de praga de inseto no Meio-Oeste. O dano às plantas causados por nematodos é também um pro- blema econômico predominante e grave. Os nematodos causam um dano muito espalhado e grave em muitas espécies de planta. Muitos gêneros de nematodos são conhecidos como os causadores de tais danos. Os nemato- dos parasitas de planta incluem os membros do Filo Nematoda, Ordens Tylenchida e Dorylaimida. Na Ordem Tylenchia, os nematodos parasitas de planta são encontrados em duas Super Famílias: Tylenchoidea e Cricone- matoidea. Há mais de 100.000 espécies descritas de nematodos.

Os pesticidas químicos forneceram um método eficaz de con- trole de praga; entretanto, o público ficou preocupado em relação a quanti- dades de produtos químicos residuais que poderiam ser encontrados no alimento, na água do solo e no ambiente. Novas restrições rigorosas sobre o uso de pesticidas e a eliminação de alguns pesticidas eficientes do mer- cado poderiam limitar as opções econômicas e eficazes para controlar pra- gas numerosas. Assim, há uma necessidade urgente para identificar méto- dos de controle de praga e composições que não são prejudiciais ao ambi- ente.

Os nematicidas utilizados rotineiramente para controlar os ne- matodos parasitas de plantas estão sendo rapidamente retirados do merca- do à medida em que aumenta a segurança ambiental. No ano 2001, Bro- meto de Metila, um esteio no controle de tais parasitas, não irá ser comerci- alizado durante muito tempo nos Estados Unidos. Dessa forma, são clara- mente necessários agentes de controle menos prejudiciais. O uso de pesticidas químicos para controlar o verme da raiz de milho e outras pragas coleópteras, assim como nematodos, tem várias des- vantagens. O uso de pesticidas freqüentemente origina preocupações com o ambiente tais como a contaminação do solo e com os suprimentos de água tanto da superfície quanto subterrâneos. O trabalho com pesticidas pode também colocar as pessoas que os aplicam em risco. O uso regular de pesticidas químicos para o controle de orga- nismos indesejados pode selecionar cepas resistentes a substâncias quími- cas. A resistência a substâncias químicas ocorre em muitas espécies de in- setos economicamente importantes e ocorreram também em nematodos de ovelhas, cabras e cavalos. O uso regular de toxinas químicas para controlar organismos indesejados pode selecionar cepas resistentes a drogas. Isto ocorreu em muitas espécies de insetos economicamente importantes e tam- bém ocorreu em nematodos de ovelhas, cabras e cavalos. Por exemplo, uma metodologia aceita para o controle de nematodos se focaliza na droga benzimidazol e seus congêneres. O uso destas drogas em uma larga escala levou a muitos casos de resistência entre as populações de nematodo (Prichard, R. K. e outros [1980] "The problem of anthelmintic resistence in nematodes," Austr. Vet. J. 56:239-251; Coles, G. C. [1986] "Anthelmintic re- sistence in sheep," Em Veterínary Clinics of North America: Food Animal Practice, Vol 2:423-432 [Herd, R. P., eds.] W. B. Saunders, New York). Há mais de 100.000 espécies de nematodos descritas. O desenvolvimento de resistência a pesticida necessita de uma pesquisa contínua para novos agentes de controle que possuam diferentes modos de ação.

Atualmente há uma necessidade para ter meios mais eficientes de controlar os muitos coleópteros e namatodos que causam dano conside- rável em hospedeiros e plantações suscetíveis. Vantajosamente, tais meios eficazes iriam empregar agentes biológicos específicos. O micróbio de solo Bacillus thuríngiensis (B.t.) é uma bactéria Gram-positiva formadora de esporo caracterizada por inclusões paraespo- rais de proteína cristalina. Estas inclusões frequentemente aparecem mi- croscopicamente como cristais formados distintivamente. As proteínas po- dem ser altamente tóxicas para as pragas e específicas em sua atividade tóxica. Cestos genes de toxina de B.t foram isolados e seqüênciados e fo- ram obtidos e aprovados para uso produtos de B.t. com base no DNA re- combinante. Em adição, com o uso de técnicas de engenharia genética, estão em desenvolvimento novas abordagens para distribuir estas endotoxi- nas de B.t. para os ambientes agrícolas, incluindo o uso de plantas geneti- camente engenheiradas com genes de endotoxina para resistência a inseto e o uso de células microbianas intactas estabilizadas como veículos de dis- tribuição da endotoxina B.t. (Gaertner, F. H., L. Kim [1988] TIBTECH 6:S4- S7). Assim, os genes isolados de endotoxina de B.t. estão se tornando co- mercialmente valiosos.

Até razoavelmente recentemente, o uso comercial de pesticidas B.t. foi grandemente restrito a uma estreita faixa de pragas lepidópteras (lagarta). As preparações de esporos e cristais de B. thuríngiensis subesp. kurstaki foram utilizadas durante muitos anos como inseticidas comerciais para pragas lepidópteras. Por exemplo, o B. thuringiensis var. Abistakl HD-1 produz uma δ-endotoxina cristalina que é tóxica para as larvas de um núme- ro de insetos lepidópteros.

Nestes últimos anos, entretanto, pesquisadores descobriram pesticidas de B.t. com especificidades para uma faixa mais ampla de pra- gas. Por exemplo, outras espécies de B.t., denominadas israelenses e mor- rísoni {a.k.a. tenebrionis, a.k.a. B.t. M-7, a.k.a. B.t. San Diego), têm sido utili- zadas comercialmente para controlar insetos das ordens Díptera e Coleóp- tera, respectivamente (Gaertner, F. H. [1989] "Celiular Delivery Systems for Insecticidal Proteins: Living and Non-Living Microorganisms," em Controlled Delivery of Crop Protection Agents, R. M. Wilkins, ed., Taylore Francis, New York e Londres, 1990, pp. 245-255). Ver também Couch, T. L. (1980) "Mosquito Pathogenicity of Bacillus thuringiensis var. ísraelensis," Developments in Indus- trial Microbiology 22:61-76; e Beegle, C.C., (1978) "Use of Entomogenous Bac- téria in Agroecosystems," Developments in Industrial Microbiology 20:97-104.

Krieg, A., A.M. Huger, G.A. Langenbruch, W. Schnetter (1983) Z. ang. Ent. 96:500-508, descrevem Bacillus thuringiensis var. tenebrionis, que é relatada- mente ativo contra dois besouros na ordem Coleóptera. Estes são o besouro da batata do Colorado, Leptinotarsa decemlineata, e Agelastica alni.

Mais recentemente, novas subespécies de B.t. foram identifica- das e foram isolados os genes responsáveis pelas proteínas da 5- endotoxina (Hõfte, H., H.R. Whiteley [1989] Microbiological Reviews 52(2): 242-255). Hõfte e Whiteley classificaram os genes do cristal de proteína de B.t. em quatro classes principais. As classes eram Cryl (específica a Lepi- dóptera), Cryll (específica a Lepídóptera e Díptera), Crylll (específica a Co- leóptera) e CrylV (específica a Díptera). A descoberta de cepas especifica- mente tóxicas a outras pragas foi relatada (Feitelson, J.S., J. Payne, L. Kim [1992] Bio/Tecnology 10:271-275). A CryV foi proposta para designar uma classe de genes de toxina que são específicos a nematodos. Outras classes de genes de B.t. foram agora identificados.

Na nomenclatura de 1989 e no esquema de classificação de Hõfte e Whiteley para os cristais de proteína estavam baseados tanto na sequência de aminoácido deduzida quanto na faixa de hospedeiro da toxi- na. Este sistema estava adaptado para cobrir 14 tipos diferentes de genes de toxina que foram divididos em 5 classes principais. Como foram desco- bertos mais genes de toxina, esse sistema começou a se tornar impraticá- vel, à medida em foram descobertos genes com seqüências semelhantes que possuem especificidades inseticidas significativamente diferentes. O número de genes de cristais de proteína seqüênciados de Bacillus thuring/- ensis atualmente é de aproximadamente 50. Foi proposto um esquema da nomenclatura revisado que é baseado unicamente na identidade de amino- ácido (Crickmore e outros [1996] Society for Invertebrate Pathology, 29th Anual Meeting, lllrd International Colloquium on Bacillus thuringiensis, Uni- versidade de Córdoba, Córdoba, Espanha, 1-6 de setembro, resumo). O

"cry" mnemônico foi mantido para todos os genes de toxina exceto para cytA e cytB, que permaneceram como uma classe separada. Os números Roma- nos foram trocados por números Arábicos na classe primária e os parênte- ses da classe terciária foram removidos. Muitos dos nomes originais foram mantidos, com as exceções citadas, embora um número tenha sido reciassi- ficado. A clonagem e a expressão de um gene do cristal de proteína de B.t em Escheríchla coli foram descritos na literatura publicada (Schnepf, H.E., H.R. Whiteley (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2893-2897). A

Patente U.S. 4.448.885 e a Patente U.S. 4.467.036 ambas descrevem a ex- pressão de cristal de proteína de B.t. em E. coli. As Patentes U.S. 4.990.332; 5.039.523; 5.126.133; 5.164.180; 5.169.629; e 5.286.485 estão entre aquelas que descrevem as toxinas de B.t. que possuem atividade contra lepidópteras. As Patentes U.S. 4.797.276 e 4.853.331 descrevem o S. thuringiensis cepa tenebríonis que pode ser utilizado para controlar as pragas coleópteras em vários ambien- tes. A Patente U.S. N° 4.918.006 descreve as toxinas de B.t. que possuem atividade contra dípteras.

Foi publicado um pequeno número de artigos de pesquisa sobre os efeitos de delta endotoxinas de espécies de B. thuringiensis na variabili- dade de ovos de nematodos. Bottjer, Bone e Gill, ([1986] Experimental Pa- rasitology 60:239-244) relataram que B.t. kurstaki e B.t. israelensis eram tó- xicos in vitro para ovos de nematodos Trichostrongylus colubriformis. Em adição, 28 outras cepas de B.t foram testadas com toxicidades amplamente variáveis. Ignoffo e Dropkin ([1977] J. Kans. Entomol. Soc. 50:394-398) re- lataram que a toxina termoestável do Bacillus thuringiensis (beta exotoxina) era ativa contra um nematodo de vida livra, Panagrellus redivivus (Goodney); um nematodo parasita de planta, Meloidogyne incógnita (Chítwood); e um nematodo que se alimenta de fungo, Aphelenchus avena (Bastien). A beta exotoxina é um agente citotóxico generalizado com pouca ou nenhuma especificidade. Também, Ciordia e Bizzell ([1961] Jour. ofPa- rasitology 47:41 [resumo]) forneceram um relatório preliminar sobre os efei- tos do B. thuringiensis sobre alguns nematodos de gado. A Patente U.S. N° 5.151.363 e a Patente U.S. N° 4.948.734 des- crevem certos isolados de B.t. que têm atividade contra nematodos. Outras Patentes U.S. que descrevem atividade contra nematodos incluem a 5.093.120; 5.236.843; 5.262.399; 5.270.448; 5.281.530; 5.322.932; 5,350.577; 5.426.049; e 5.439.881. Como um resultado de pesquisa exten- siva e investimento de recursos, foram concedidas outras patentes para no- vos isolados de B.t. e novos usos de isolados de B.t.. Ver Feitelson e outros, supra, para uma revisão. Entretanto, a descoberta de novos isolados de B.t. e novos usos de isolados de B.t conhecidos permanecem como uma técni- ca empírica imprevisível. São agora conhecidas algumas toxinas de Bacillus thuringiensis que são ativas contra o verme da raiz de milho e outros coleópteros. Por exemplo, a Patente U.S. N° 4.849.217 descreve vários isolados, incluindo PS52A1 e PS86A1, como possuindo atividade contra gorgulhos da alfafa. A

Patente U.S. N° 5.208.017 descreve PS86A1 como um possuindo atividade contra o verme da raiz de milho do Oeste. As Patentes U.S. N°s 5.427.786 e 5.186.934 descrevem cada uma isolados e toxinas de B.t. ativos contra co- leópteros. Está especificamente descrito nestas patentes o isolado conheci- do como PS86A1 e uma toxina ativa a coleóptero que pode ser obtida do mesmo conhecido como 86A1. A toxina 86A1 é também conhecida como Cry6A (CryVIA). A toxina Cry6A do tipo selvagem tem aproximadamente 54- 58 kDa.

Também é conhecida uma toxina Cry6B. Esta toxina pode ser obtida do isolado PS69D1. Sabe-se que as toxinas Cry6A e CryQB de tama- nho completo têm atividade contra nematodos. As Patentes U.S. a seguir descrevem, em parte, o isolado PS69D1 como possuindo atividade contra nematodos: 4.948.734; 5.093.120; 5.262.399; e 5.439.881.

Uma fórmula genérica para a sequência de aminoácido das to- xinas CryVI foi descrita em WO 92/19739, que também mostra que a toxina de tamanho completo tem atividade contra nematodos. Os isolados PS52A1 e PS69D1 são descrito nestas. As Patentes U.S. Nos 5.262.159 e 5.468.636 também descrevem uma fórmula genérica para toxinas que possuem ativi- dade contra afídeos.

Embora fosse sabido que a toxina Cry6A inibe o crescimento de certos coleópteros, não era previamente sabido que esta toxina pudesse ser ativada por truncamento para fornecer uma toxina que fosse letal para co- leópteros, tais como o verme da raiz de milho do oeste. Em adição, não há sugestão de que a Cry6A truncada fosse ativa contra nematodos. São conhecidos na técnica alguns exemplos anteriores de trun- camentos em outras toxinas de B.t. Por exemplo, as toxinas P2 (Cry2) {Nicholles, E.N., W. Ahmad, D.J. Ellar [1989] J. Bact. 171:5141-5147) exis- tem como proteínas de 61-63 kDa. A proteólise retira 5 kDa, deixando pro- teínas de 56-58 kDa. Entretanto, a toxicidade ou permanecia inalterada ou era pior por um fator de 10. Além disso, estas proteínas não compartilham homologia significante com as toxinas Cry6. Outros artigos que abordam certos aspectos da atividade e/ou função de porções de toxinas de B.t. in- cluem Adang, M.J., M.J. Staver, T.A. Rocheleau e outros (1985) Gene 36:289-300; Wakibo, H„ K.C. Raymond, L.A. Bulla, Jr. (1986) DNA 5:305- 314 (Medlíne 863000920); Schnepf, H.E., H.R. Whiteley (1985) J. Biol.

Chem. 260:6273-6280; Patente U.S. N° 5.468.636; Patente U.S. N° 5.236.843; e EP 0462721. O uso de truncamento para obter toxinas Cry6A ativadas como descrito abaixo é completamente novo na técnica de B.t.

Breve Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a materiais e métodos úteis no con- trole de pragas e, particularmente, pragas de planta. Especificamente, a pre- sente invenção fornece novas toxinas truncadas de B.t. úteis para o controle de pragas de coleópteros, incluindo o verme da raiz de milho. A presente invenção fornece ainda toxinas úteis para o controle de nematodos. A presente invenção fornece ainda seqüências de nucleotídeos que codificam estas proteínas.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, foi desco- berto que as formas truncadas de toxinas Cry6A de B.t. são particularmente ativas contra o verme da raiz de milho. As toxinas truncadas descritas aqui podem ser também utilizadas para controlar nematodos. Aqui está especifi- camente exemplificada uma toxina c/y6A truncada que tem aminoácidos re- movidos do N-terminai e do C-terminal e tem aproximadamente 40-50 kDa.

Em uma modalidade preferida, as toxinas da presente invenção são produ- zidas por genes que codificam as proteínas truncadas altamente ativas.

Como descrito aqui, as toxinas truncadas da presente invenção podem tam- bém ser obtidas através de tratamento de sobrenadantes de cultura de B.t. e/ou por crescimento de culturas de B.t. sob condições apropriadas para re- sultar na produção de toxinas ativas como um resultado de efeitos vantajo- sos de proteases. Semelhantemente, a proteína expressa por um hospedei- ro recombinante pode ser tratada para obter a toxina truncada.

Em uma modalidade preferida, os genes descritos aqui que co- dificam toxinas pesticidas são utilizados para transformar plantas a fim de conferir resistência a praga nas ditas plantas. Tal transformação de plantas pode ser executada utilizando técnicas bem conhecidas pelos versados na técnica e envolveríam tipicamente a modificação do gene para otimizar a expressão da toxina truncada em plantas. A presente invenção refere-se também ao uso de todas ou parte das toxinas truncadas e genes na produção de proteínas de fusão e de ge- nes de fusão. A Figura 1 faz uma comparação amínoácido por aminoácido entre 86A1 e 69D1.

Breve Descrição das Seqüências SEQ ID N° 1 é a seqüência de nucleotídeo de um gene cry6A de tamanho completo. SEQ ID N° 2 é a seqüência de aminoácido de uma toxina CryQk de tamanho completo. SEQ ID N° 3 é uma seqüência de gene otimizado de planta de tamanho completo para o gene cry6A/86A1. SEQ ID N° 4 é a seqüência de aminoácido de tamanho completo codificada pela SEQ ID N° 3. SEQ ID N° 5 é a seqüência do gene truncado R443.

SEQ ID N° 6 é a seqüência de aminoácido codificada pela SEQ ID N° 5. SEQ ID N° 7 é a seqüência do gene R390 truncado otimizado de planta. SEQ ID N° 8 é a seqüência de proteína truncada codificada pela SEQ ID N° 7. SEQ ID N° 9 é a seqüência de nucleotídeo de um gene cry6B/69D1 de tamanho completo. SEQ ID N° 10 é a seqüência de aminoácido de uma toxina Cry6B/69D1 de tamanho completo.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção refere-se a materiais e métodos para o con- trole de pragas. Em modalidades específicas, a presente invenção refere-se a toxinas de B.t. truncadas que possuem atividade contra pragas coleópte- ras. A presente invenção fornece também toxinas úteis no controle de nema- todos. A presente invenção refere-se ainda a novos genes que codificam estas toxinas pesticidas. Em uma modalidade particularmente preferida, os materiais e métodos descritos aqui podem ser utilizados para controlar o verme da raiz de milho.

Os isolados úteis de acordo com a presente invenção estão dis- poníveis para os versados na técnica devido a depósitos descritos em vári- as Patente U.S., incluindo a Patente U.S. N° 5.427,786; 5.186.934; e 5.273.746. Ver também pedido de patente internacional PCT número WO 93/04587. Os micróbios PS86A1 (NRRL B-18400, depositado em 16 de agosto, 1988) e MR506 são descritos nestas patentes. O isolado PS69D1 (NRRL B-18247, depositado em 28 de julho, 1987) foi descrito em várias Patentes U.S. incluindo: 4.948.734; 5.093.120; 5.262.399; e 5.439.881. O isolado PS86A1 de B.t. produz uma toxina de aproximada- mente 55 kDa referida como a toxina 86A1 ou 86A1 (a). Esta toxina é uma toxina Cry6A. O gene que codifica esta toxina foi clonado no isolado MR506 de Bacitlus thuríngiensis, que também expressa a toxina CryQA.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, a toxina Cry6A de aproximadamente 55 kDa expressa pelos isolados PS86A1 e MR506 de B.t. é truncada para fornecer uma toxina de aproximadamente 45 kDa que possui alta atividade biológica contra coleópteros. Este tipo de to- xina truncada é referida aqui como a toxina Cry6A truncada. Vantajosa- mente, foi descoberto que esta toxina truncada é particularmente ativa con- tra o verme da raiz de milho. Esta toxina truncada tem preferencialmente aminoácidos removidos do N-terminal e do C-terminal para fornecer as for- mas truncadas ativas. Entretanto, as toxinas truncadas ativadas de acordo com a presente invenção podem também ser obtidas por remoção de ami- noácidos do N-terminal, somente, ou do C-terminal, somente.

Como descrito aqui, a remoção dos aminoácidos para fornecer a forma ativa truncada pode ser executada utilizando uma variedade de técni- cas. Em uma modalidade preferida, o gene é modificado para codificar a forma ativa da toxina. Alternativamente, as toxinas truncadas da presente invenção podem ser obtidas por tratamento de culturas de B.t. ou por cres- cimento de culturas sob as condições apropriadas tais como divagem da proteína com proteases endógenas em sua forma altamente ativa.

Foi descoberto que a remoção de porções do N-terminal e do C- terminal da toxina 86A1 de 55 kDa resulta em uma ativação vantajosa desta toxina que aumentou a potência de sua atividade. A remoção dos aminoáci- dos pode ser executada por tratamento com tripsina, preferenciaimente, ou com uma outra enzima apropriada, ou mistura de enzima, tal como Pronase, quimiotripsina ou proteases endógenas em caldos de cultura de B.t. A con- centração de tripsina, o tempo de incubação e a temperatura são condições interdependentes e poderíam ser variadas por um versado na técnica para obter o produto fina! de digestão desejado. Outros fragmentos biologica- mente ativos podem ser obtidos pelos versados na técnica utilizando os en- sinamentos fornecidos aqui. Os fragmentos que possuem terminais amino e/ou carboxiia semelhantes ao que foi identificado acima iriam também mostrar atividade inseticida melhorada.

Como os versados da técnica que possuem o benefício desta descrição iriam reconhecer rapidamente, os meios específicos utilizados para crescer a cultura de B.t. podem ser modificados para alcançar ativação ótima da toxina B.t. Por exemplo, a densidade celular pode ser modulada pelo ajuste ou modificação do meio de cultura. Além disso, os meios que possuem proteases neste caso podem ser utilizados para melhorar a ativa- ção das toxinas de B.t.

As toxinas de B.t. de tamanho completo de aproximadamente 55 kDa podem ser expressas e então convertidas em formas altamente ativas através da adição de reagentes apropriados e/ou por crescimento das cultu- ras sob condições que resultam no truncamento das proteínas através da ação casual de proteases endógenas. Em uma modalidade alternativa, a toxina de tamanho completo pode sofrer outras modificações para fornecer a forma ativa da toxina. O ajuste da solubilização da toxina, assim como ou- tras condições de reação, tais como pH, força iônica ou potencial redox po- dem ser utilizados para efetuar a modificação desejada da toxina de tama- nho completo para fornecer uma forma ativa.

Um hospedeiro recombinante que pode ser utilizado para obter a toxina truncada da presente invenção é o MR506. A toxina truncada da presente invenção pode ser obtida por tratamento da δ-endotoxina cristalina da cepa MR506 de Bacillus thuringiensis com uma protease de serina tal como a tripsina bovina em um pH alcalino e preferencial mente na ausência de β-mercaptoetanol. A presente invenção também refere-se ao uso de todas ou parte das toxinas truncadas e genes na produção de proteínas de fusão e genes de fusão.

Genes e toxinas. Os genes e toxinas úteis de acordo com a pre- sente invenção incluem não apenas as sequências especificamente exem- plificadas mas também sequências mais curtas e variantes, mutantes e proteínas de fusão que mantêm a atividade pesticida característica das toxi- nas especificamente exemplificadas aqui. Como utilizado aqui, os termos "variantes" ou "variações" de genes referem-se a seqüências de nucleotí- deos que codificam as mesmas toxinas ou que codificam toxinas equivalen- tes que possuem atividade pesticida. Como utilizado aqui, o termo "toxinas equivalentes" refere-se a toxinas que possuem atividade biológica igual ou essencialmente igual contra as pragas alvo como as toxinas exemplificadas.

Deveria ser evidente a um versado nesta técnica que genes que codificam toxinas ativas podem ser identificados e obtidos através de vários meios. Os genes específicos exemplificados aqui podem ser obtidos de isolados depositados em um banco de cultura como descrito acima. Estes genes ou porções ou variantes dos mesmos, podem também ser sintetica- mente construídos, por exemplo, pelo uso de um sintetizador de gene. As variações de genes podem ser facilmente construídas utilizando técnicas padronizadas para produzir mutações pontuais. Além disso, os fragmentos destes genes podem ser feitos utilizando exonucleases ou endonucleases comercialmente disponíveis de acordo com procedimentos padronizados. Por exemplo, enzimas tais como Bal31 ou mutagênese sítio direcionada podem ser utilizadas para cortar sistematicamente os nucleotídeos das extremidades des- tes genes. Ainda, os genes que codificam fragmentos ativos podem ser obtidos utilizando uma variedade de enzimas de restrição. As proteases podem ser uti- lizadas para obter diretamente fragmentos ativos destas toxinas.

As toxinas equivalentes e/ou genes que codificam estas toxinas equivalentes podem ser derivados de isolados de B.t e/ou de bibliotecas de DNA utilizando os ensinamentos fornecidos aqui. Há um número de méto- dos para obtenção das toxinas pesticidas da presente invenção. Por exem- plo, os anticorpos para as toxinas pesticidas descritos e reivindicados aqui podem ser utilizados para identificar e isolar outras toxinas de uma mistura de proteínas. Especificamente, podem ser produzidos anticorpos para as porções das toxinas que são mais constantes e mais distintas de outras to- xinas de B.t. Estes anticorpos podem então ser utilizados para identificar especificamente toxinas equivalentes com a atividade característica por imunoprecipitação, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) ou "Western blotting". Os anticorpos para as toxinas descritas aqui ou para to- xinas equivalentes ou para fragmentos destas toxinas podem ser facilmente preparados utilizando procedimentos padronizados nesta técnica. Estes ge- ne que codificam estas toxinas podem então ser obtidos do microorganismo.

Os fragmentos e equivalentes que conservam a atividade pesti- cida das toxinas exemplificadas estariam dentro do âmbito da presente in- venção. Além disso, devido à redundância do código genético, uma varie- dade de sequências de DNA diferentes podem codificar as sequências de aminoácido descritas aqui. Está bem dentro de um conhecimento de um versado na técnica criar estas seqüências alternativas de DNA que codifi- cam as mesmas, ou essencialmente as mesmas, toxinas. Estas seqüências variantes de DNA estão dentro do âmbito da presente invenção. Como utili- zado aqui, é feita a referência à "essencialmente a mesma" seqüência a se- qüências que tenham substituições, deleções, adições ou inserções de amino- ácidos que não afetam materialmente a atividade pesticida. Os fragmentos que conservam a atividade pesticida estão também incluídos nesta definição.

Um método adicional para identificar as toxinas e genes da pre- sente invenção é feito através do uso de sondas de nucleotídeos. Estas sondas são seqüências detectáveis de nucleotídeos. As sondas fornecem um método rápido para identificar genes da presente invenção que codifi- cam toxina. Os segmentos de nucleotídeos que são utilizados como sondas de acordo com a presente invenção podem ser sintetizados utilizando um sintetizador de DNA ou RNA e procedimentos padronizados. A sonda irá ter normalmente pelo menos 10 bases, mais geralmente pelo menos aproxima- damente 18 bases e pode ter até aproximadamente 50 bases ou mais, ge- ralmente não possuindo mais que aproximadamente 200 bases se a sonda for obtida sinteticamente. Entretanto, sondas maiores podem ser rapida- mente utilizadas e tais sondas podem ter, por exemplo, vários quilobases em comprimento. A seqüência da sonda é projetada para ser pelo menos substancialmente complementar a um gene que codifica uma toxina de inte- resse. A sonda não precisa ter perfeita complementaridade com a seqüência à qual se hibridiza. As sondas podem ser marcadas utilizando técnicas que são bem conhecidas pelos versados na técnica. Tal análise da sonda forne- ce um método rápido para identificar genes de endotoxina inseticida poten- cialmente valiosos comercialmente dentro das variadas subespécies de B.t.

Podem ser empregados vários graus de rigor de hibridização.

Quanto mais rigorosas as condições maior a complementaridade que é ne- cessária para a formação do dúplex. A severidade pode ser controlados por temperatura, concentração da sonda, comprimento da sonda, força iônica, tempo e semelhantes. Preferencialmente, a hibridização é conduzida sob condições rigorosas por técnicas bem conhecidas na técnica, como descrito, por exemplo, em Keller, G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockon Press, New York, NY, pp. 169-170. A hibridização em baixa severidade é o método preferido quando é utilizado um fragmento maior do gene.

Como utilizado aqui condições "rigorosas" para hibridização re- fere-se a condições que alcançam o mesmo ou aproximadamente o mesmo grau de especificidade de hibridização que o das condições empregadas pelas Requerentes habituais. Especificamente, a hibridização de DNA imo- bilizado em "Southern blots" com sondas específicas de gene rotulado com 32P foi executada por métodos padronizados (Maniatis, T., E.F. Fritsch, J.

Sambrook [1982] Molecular Clonirtg: A Laboratory Manual, Cold Spring Har- bor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Em geral, a hibridização e lava- gens subsequentes foram conduzidas sob condições severas que permiti- ram a detecção de seqüências alvo com homologia ao genes de toxina exemplificados. Para as sondas de gene de DNA de duplo filamento, a hi- bridização foi conduzida durante a noite a 20-25°C abaixo da temperatura de fusão (Tm) do híbrido de DNA em SSPE 6X, solução de Denhardt.SX, SDS 0,1%, DNA desnaturado 0,1 mg/ml. A temperatura de fusão é descrita pela fórmula a seguir (Beltz, G.A., K.A. Jacobs, T.H. Eickbush, P.T. Cherbas e F.C. Kafatos [1983] Methods of Enzymofogy, R. Wu., L. Grossman e K.

Moldave [eds.] Academic Press, New York 100:266-285).

Tm = 81,5°C+16,6Log[Na+]+0,41 (%G+C)-0,61 (% de formamida)- 600/comprimento do duplex em pares de base.

As lavagens são tipicamente conduzidas como a seguir: (1) Duas vezes à temperatura ambiente durante 15 minutos em SSPE 1X, SDS 0,1% (lavagem em baixas condições de severidade).

(2) Uma vez à Tm-20°C durante 15 minutos em SSPE 0,2X, SDS 0,1% (lavagem em condições moderadas de severidade).

Para as sondas de oligonucleotídeo, a hibridização foi conduzi- da durante a noite a 10-20°C abaixo da temperatura de fusão (Tm) do híbri- do em SSPE 6X, solução de Denhardt 5X, SDS 0,1%, DNA desnaturado 0,1 mg/ml. A Tm para as sondas de oligonucleotídeo podem ser determinadas pelo método do "vizinho mais próximo”. Ver Breslauer e outros, "Predicting DNA duplex stability from the base sequence," Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83 (11 ):3746-3750 (junho 1986); Rychlik e Rhoads, "A Computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA," Nucleic Acids Res., 17(21):8543-8551 (11 de nov, 1989); SantaLucia e outros, "Improved nearest-neighbor parameters for predicting DNA duplex stability," Biochemistry 35 (11):3555-3562 (19 de março, 1996); Doktycz e outros, "Optical melting of 128 octamer DNA dupie- xes. Effects of base pair location and nearest neighbors on thermal stability," J. Biol. Chem., 270 (15):8439-8445 (14 de abril, 1995). Alternativamente, a Tm pode ser determinada pela seguinte fórmula: Tm (°C)=2(número de pares de base T/A)+4(número de pares de base G/C) (Suggs, S.V., T. Miyake, E.H. Kawashime, M.J. Johnson, K.

Itakura e R.B. Wallace [1981] ÍCN-UCLA Symp. Dev. Biot. Using Purified Genes, D.D. Brown [ed.], Academic Press, New York, 23:683-693).

As lavagens são tipicamente conduzidas coma a sequir (1) Duas vezes à temperatura ambiente durante 15 minutos em SSPE 1X, SDS 0,1% (lavagem em condições de baixa severidade). (2) Uma vez à temperatura de hibridização durante 15 minu- tos em SSPE 1X, SDS 0,1% (lavagem em condições mo- deradas de severidade).

As sequências de DNA da presente invenção podem também ser utilizadas como iniciadores para a amplificação por PCR. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma síntese repetitiva, enzimática iniciada de uma seqüência de ácido nucléico. Este procedimento é bem conhecido e é comumente utilizado pelos versados na técnica (ver Mulits, Patentes U.S. N°s 4.683.195, 4.683.202 e 4.800.159; Saiki, Randall K, Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mullis, Glenn T. Horn, Henry A. Erlich, Norman Ar- nheim [1985] "Enzimatic Amplification of β-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia," Science 230:1350-1354.). O PCR é baseado na amplificação enzimática de um fragmento de DNA de interesse que é flanqueado por dois iniciadores de oligonucleotídeo que se hibridizam em filamentos opostos da seqüência alvo. Os iniciadores são orientados com as extremidades 3' apontando um em direção à outra. Ciclos repetidos de desnaturação térmica do molde, anelamento dos iniciadores com suas seqüências complementares e exten- são dos iniciadores anelados com uma DNA polimerase resultam na amplifi- cação do segmento definido pelas extremidades 5' dos iniciadores de PCR.

Uma vez que o produto de extensão de cada iniciador pode servir como um molde para o outro iniciador, cada ciclo essencialmente dobra a quantidade de fragmento de DNA produzido no ciclo anterior. Isto resulta em um acú- mulo exponencial do fragmento alvo específico, até vários milhões de vezes em poucas horas. Pelo uso de uma DNA polimerase termoestável tal como Taq polimerase, que é isolada da bactéria termofílica Thermus aquaticus, o processo de amplificação pode ser completamente automatizado.

Certas toxinas da presente invenção foram especificamente exemplificadas aqui. Uma vez que estas toxinas são simplesmente exem- plos das toxinas da presente invenção, devería ser rapidamente evidente que a presente invenção compreende toxinas variantes ou equivalentes (e sequências de nucleotídeos que codificam toxinas equivalentes) que possu- em a mesma atividade pesticida ou semelhante da toxina exemplificada. As toxinas equivalentes terão alta homologia de aminoácido como uma toxina exemplificada. Esta identidade de aminoácido irá ser tipicamente maior que 60%, preferenciaimente será maior que 75%, mais preferencialmente maior que 80%, mais preferencialmente maior que 90% e pode ser maior que 95%. Estas identidades são como determinado utilizando técnicas padroni- zadas de alinhamento. A homologia de aminoácido será maior em regiões críticas da toxina que são responsáveis pela atividade biológica ou estão envolvidas na determinação da configuração tridimensional que é basica- mente responsável pela atividade biológica. Sob este aspecto, certas subs- tituições de aminoácidos são aceitáveis e pode-se esperar que estas este- jam em regiões que não são críticas para a atividade ou que sejam substi- tuições conservadoras de aminoácidos que não afetam a configuração tri- dimensional da molécula. Por exemplo, os aminoácidos podem ser coloca- dos nas seguintes classes: apoiares, polares não carregados, básicos e acidicos. As substituições conservadoras em que um aminoácido de uma classe é substituído por um outro aminoácido do mesmo tipo estão dentro do âmbito da presente invenção desde que a substituição não altere materi- almente a atividade biológica do composto. A Tabela 1 fornece uma lista- gem de exemplos de aminoácidos que pertencem a cada classe.

Em alguns casos, podem ser também feitas substituições não conservadoras. O fator crítico é que estas substituições não devem diminuir significativamente a atividade biológica da toxina.

Como utilizado aqui, é feita a referência a polinucleotídeos "isolados" e/ou toxinas "purificadas" a estas moléculas quando não estão associadas com as outras moléculas com as quais serão encontrados na natureza. Assim, a referência a "isolado e purificado" significa o envolvi- mento da "mão do homem" como descrito aqui.

Hospedeiros recombinantes. Os genes que codificam toxinas da presente invenção podem ser introduzidos em uma ampla variedade de hospedeiros microbianos e vegetais, A expressão do gene da toxina resulta, direta ou indiretamente, na produção intracelular e na manutenção do pesti- cida. Com os hospedeiros microbianos adequados, por exemplo, Pseudomo- nas, os micróbios podem ser aplicados no local da praga, onde irão se proliferar e serão ingeridos. O resultado é um controle da peste. Alternativamente, o mi- cróbio, portando, o gene da toxina pode ser tratado sob condições que prolon- gam a atividade da toxina e estabilizam a célula. A célula tratada, que conserva a atividade tóxica, pode ser então aplicada no ambiente da praga alvo.

Quando o gene da toxina de B.t. é introduzido através de um vetor adequado em um hospedeiro microbiano e o dito hospedeiro é aplica- do no ambiente em um estado de vida, é essencial que sejam utilizados certos micróbios hospedeiros. São selecionados os microorganismos hos- pedeiros que sabe-se que ocupam a "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera e/ou rizoplano) de uma ou mais plantações de interesse. Estes microorga- nismos são selecionados de forma a serem capazes de competir com sucesso no ambiente particular (plantação e outros hábitats de insetos) com os microor- ganismos do tipo selvagem, de fornecer manutenção e expressão estável do gene que expressa o pesticida polipeptídico e, desejavelmente, de fornecer proteção aumentada ao pesticida da degradação e da inativação ambiental.

Sabe-se que um grande número de microorganismos habitam o filo- plano (a superfície de folhas de plantas) e/ou a rizosfera (o solo que circunda as raízes das plantas) de uma ampla variedade de plantações importantes. Estes microorganismos incluem bactérias, algas e fungos. São de interesse particular microorganismos, tais como bactérias, por exemplo, os gêneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodop- seudomonas, Methytophilus, Agrobactehum, Acetobacter, Lactobacfflus, Arthro- bader, Azotobader, Leuconostoc e Alcatigenes; fungos, particularmente levedu- ras, por exemplo, os gêneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula e Aureobasidium. São de interesse particular es- pécies bacterianas da fitosfera tais como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobaderxylinum, Agrobaderium tumefaci- ens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium me- liloti, Alcaligenes eutrophus e Azotobacter vinlandii; e espécies de leveduras da fitosfera tais como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretori- ensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, $. odorus, Kluyveromyces vero- nae e Aureobasidium pullu/ans. São de interesse particular os microorganismos pigmentados.

Está disponível um número significante de métodos para introduzir um gene de B.t. que codifica uma toxina em um microorganismo hospedeiro sob condições que permitem a manutenção estável e a expressão do gene. Estes métodos são bem conhecidos pelos versados na técnica e são descritos, por exemplo, na Patente U.S. N°5.135.867, que é incorporada aqui como referência. O controle de coleópteros, incluindo o do verme da raiz de milho, assim como o de nematodos, utilizando os isolados, toxinas e genes da pre- sente invenção pode ser executado por uma variedade de métodos conhecidos pelos versados na técnica. Estes métodos incluem, por exemplo, a aplicação de isolados de B.t. nas pragas (ou seus locais), a aplicação de micróbios recombi- nantes nas pragas (ou seus locais) e a transformação de plantas com genes que codificam as toxinas pesticidas da presente invenção. Os mi- cróbios recombinantes podem ser, por exemplo, um B.t, uma E. coli ou Pseudomonas. As transformações podem ser feitas pelos versados na técnica utilizando técnicas padronizadas. Os materiais necessários para estas transformações são descritos aqui ou são de outra forma facil- mente disponíveis para o versado na técnica.

Os genes sintéticos que são funcionalmente equivalentes aos genes exemplificados aqui podem ser também utilizados para transformar hospedeiros. Os métodos para a produção de genes sintéticos podem ser encontrados, por exemplo, na Patente U.S. N° 5.380.831.

Tratamento das células. Como mencionado acima, B.t. ou célu- las recombinantes que expressam uma toxina de B.t. podem ser tratadas para prolongar a atividade da toxina e estabilizar a célula. A microcápsula de pesticida que é formada compreende a toxina de B.t. dentro de uma es- trutura celular que foi estabilizada e irá proteger a toxina quando a micro- cápsula for aplicada no ambiente da praga alvo. As células hospedeiras adequadas podem incluir procariotas ou eucariotas, sendo normalmente li- mitadas àquelas células que não produzem substâncias tóxicas para orga- nismos superiores, tais como mamíferos. Entretanto, os organismos que produzem substâncias tóxicas para organismos superiores poderíam ser utilizados, quando as substâncias tóxicas são instáveis ou o nível de aplicação é suficientemente baixo de forma a evitar qualquer possibilida- de de toxicidade para um hospedeiro mamífero. Como hospedeiros, se- rão de interesse particular as procariotas e as eucariotas inferiores, tais como fungos. A célula estará geralmente intacta e estará substancialmente na forma proliferativa quando tratada, ao invés de em uma forma de esporo, embora em alguns casos os esporos possam ser empregados. O tratamento da célula microbiana, por exemplo, um micróbio que contenha o gene da toxina de B.t, pode ser por meios químicos ou físi- cos ou por uma combinação de meios químicos e/ou físicos, desde que a técnica não afete de forma deletéria as propriedades da toxina, nem diminua a capacidade celular de proteger a toxina. Os exemplos de reagentes quí- micos são agentes de halogenação, particularmente halogênios de n° atô- mico 17-80. Mais particularmente, o iodo pode ser utilizado sob condições suaves e durante tempo suficiente para alcançar os resultados desejados.

Outras técnicas adequadas incluem o tratamento com aldeídos, tais como glutaraldeído; antiinfecciosos, tais como cloreto de zefirano e cloreto de de cetiípiridínio; álcoois, tais como isopropil e etanol; vários fixadores histológi- cos, tais como Lugol iodo, fixador de Bouin, vários ácidos e fixador de Helly (ver: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman and Company, 1967); ou uma combinação de agentes físicos (calor) e químicos que preservam e prolongam a atividade da toxina produzida na célula quan- do a célula é administrada no ambiente do hospedeiro. Os exemplos de meios físicos são a radiação de curto comprimento de onda tal como a radi- ação gama e a radiação X, congelamento, irradiação de UV, liofilização e semelhantes. Os métodos para tratamento de células microbianas são des- critos nas Patentes U.S. N°s 4.695.455 e 4.695.462, que são incorporadas aqui como referência.

As células terão geralmente estabilidade estrutural aumentada o que irá melhorar a resistência às condições ambientais. Quando o pesticida está em uma pró-forma, o método de tratamento celular deveria ser selecio- nado de forma que não iniba o processamento da pró-forma para a forma madura do pesticida pelo patógeno da praga alvo. Por exemplo, o formal- deído irá fazer ligações cruzadas nas proteínas e poderia inibir o processa- mento da pró-forma de um pesticida polipeptídico. O método de tratamento deveria conservar pelo menos uma porção substancial da biodisponibilidade ou da bioatividade da toxina.

As características de interesse particular na seleção de uma célula hospedeira para as finalidades de produção incluem a facilidade de introduzir o gene B.t. no hospedeiro, a disponibilidade de sistemas de ex- pressão, a eficiência da expressão, a estabilidade do pesticida no hospedei- ro e a presença de capacidades genéticas auxiliares. As características de interesse para uso como uma microcápsula de pesticida incluem as quali- dades protetoras para o pesticida, tais como paredes celulares grossas, pigmentação e empacotamento intracelular ou formação de corpos de inclu- são; sobrevivência em ambientes aquáticos; ausência de toxicidade em mamíferos; atração de pragas para ingestão; facilidade de matar e fixar sem danificara toxina; e semelhantes. Outras considerações incluem a facilidade de formulação e manipulação, econômica, de estabilidade de armazena- mento e semelhantes.

Crescimento das células. O hospedeiro celular que contém o gene inseticida de B.t. pode ser crescido em qualquer meio de cultura con- veniente, onde o constructo do DNA fornece uma vantagem seletiva, forne- cendo um meio seletivo de forma que substancialmente todas ou todas as células conservam o gene de B.t.. Estas células podem então ser coletadas de acordo com maneiras convencionais. Alternativamente, as células podem ser tratadas antes de serem coletadas.

As células de B.t. da invenção podem ser cultivadas utilizando técnicas padronizadas de meios e fermentação da técnica. Após completar o ciclo de fermentação, as bactérias podem ser coletadas primeiro por separação dos esporos e cristais de B.t. do caldo de fermentação atra- vés de meios bem conhecidos na técnica. Os esporos e cristais de B.t. podem ser formulados na forma de um pó que pode ser umedecido, de um concentrado líquido, de grânulos ou outras formulações pela adição de tensoativos, dispersantes, carreadores inertes e outros componentes para facilitar a manipulação e a aplicação em pragas alvo particulares.

Estas formulações e procedimentos de aplicação são todos bem conhe- cidos na técnica. Métodos e formulações para controlar pragas. O controle de coleópteros utilizando as toxinas e genes da presente invenção pode ser executado por uma variedade de métodos conhecidos pelos versados na técnica. Estes métodos incluem, por exemplo, a aplicação de isolados de B.t. nas pragas (ou seus locais), a aplicação de micróbios recombinantes nas pragas (ou seus locais) e a transformação de plantas com genes que codificam as toxinas pesticidas da presente invenção. Os micróbios re- combinantes podem ser, por exemplo, um B.t., E. coli ou Pseudomonas.

As transformações podem ser feitas pelos versados na técnica utilizando técnicas padronizadas. Os materiais necessários para estas transforma- ções são descritos aqui ou são de outra forma facilmente disponíveis para o versado na técnica.

Os grânulos de isca formulados contendo um atrativo e esporos e cristais dos isolados de B.t. ou micróbios recombinantes que compreen- dem os genes que podem ser obtidos dos isolados de B.t. descritos aqui, podem ser aplicados no solo. O produto formulado pode também ser aplicado como um revestimento de semente ou um tratamento de raiz ou um tratamento total da planta nos estágios mais tardios do ciclo da plantação. Os tratamentos da planta e do solo das células de B.t. podem ser empregados como pós que podem ser umedecido, grânulos ou pós finos, pela mistura com vários materiais inertes, tais como materiais inor- gânicos (filossilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos e semelhantes) ou materiais botânicos (espiga de milho em pó, cascas de arroz, cascas de nozes e semelhantes). As formulações podem incluir adjuvantes para espalhar e aderir, agentes estabilizadores, outros aditivos pesticidas ou tensoativos. As formulações líquidas podem ter base aquosa ou não aquosa e ser empregadas na forma de espumas, géis, suspensões, con- centrados emulsificadores ou semelhantes. Os ingredientes podem in- cluir agentes reoíógicos, tensoativos, emulsificantes, dispersantes ou polímeros.

Como seria considerado por um versado na técnica, a concen- tração de pesticida irá variar amplamente dependendo da natureza da for- mulação particular, particularmente se for um concentrado ou para ser utilizado diretamente. O pesticida estará presente em pelo menos 1% em peso e pode ser 100% em peso. As formulações secas terão de aproxi- madamente 1-95% em peso do pesticida enquanto que as formulações líquidas estarão geralmente de aproximadamente 1-60% em peso dos sólidos na fase líquida. As formulações terão geralmente de aproxima- damente 102 até aproximadamente 104 células/mg. Estas formulações serão administradas em aproximadamente 50 mg (líquidas ou secas) até 1 kg ou mais por hectare.

As formulações podem ser aplicadas ao ambiente da praga por exemplo, solo e folhagem, por borrifação, pulverização, dispersão ou se- melhantes.

Todas as Patentes U.S. aqui citadas são incorporadas neste caso como referência. A seguir estão exemplos que ilustram os procedimentos para a prática da invenção. Estes exemplos não deveríam ser considerados como limitantes. Todas as percentagens estão em peso e todas as proporções de mistura de solvente estão em volume a não ser que seja citado de outra forma.

Exemplo 1 - Cultura de Isolados de B.t.

Uma subcultura do isolado de B.t. pode ser utilizada para ino- cular o seguinte meio, um meio de peptona, glicose e sais.

Bacto Peptona 7,5 g/l Glicose 1,0 g/l KH2P04 3,4 g/l K2HPO4 4,35 g/l Solução de Sais 5,0 ml/l Solução de CaCI2 5,0 ml/l Solução de Sais (100 ml) MgS04.7H20 2,46 g MnS04.H20 0,04 g ZnS04.7H20 0,28 g FeS04.7H20 0,40 g Solução de CaCI2 (100 ml) CaCI2.2H20 3,66 g pH 7,2 As soluções de sais e a solução de CaCI2 são esterilizadas por filtração e adicionadas ao caldo autoclavado e cozido no momento da ino- culação. Os frascos são incubados a 30°C e um agitador rotatório a 200 rpm durante 64 horas. 0 procedimento acima pode ser facilmente ampliado para fer- mentadores maiores por procedimentos bem conhecidos na técnica.

Os esporos e cristais de B.t, obtidos na fermentação acima, po- dem ser isolados por procedimentos bem conhecidos na técnica. Um proce- dimento utilizado freqüentemente é sujeitar o caldo de fermentação coletado a técnicas de separação, por exemplo, centrifugação.

Exemplo 2 - Expressão e Purificação da Toxina Crv6A Recombinante da Cepa PS86A1 Foi preparada uma cultura de partida que consistia em 50 ml de meio LB autoclavado contidos em um frasco de cultura com aletas de 250 mí, inoculados com 50 μΙ de PS86A1. O frasco foi fechado e incubado a 30°C em um agitador rotatório a 225 rpm durante 4-6 horas. Cinco mililitros da cultura de partida foram então utilizados para inocular 300 ml de meio de crescimento autoclavado em um frasco de cultura com aletas de 2 litros com rolhas de espuma. O meio de crescimento é denominado NYS-CAA e con- siste em: Caldo de nutrientes (Difco) 3,75 g Triptona 3,75 g Casaminoácidos 6,00 g Extrato de levedura 1,50 g Sais de B.t. 30 ml A solução estoque de sais de B.t. consiste de: CaCI22H20 10,30 g MgCI2 6H20 20,35 g MnCI24H20 1,00 g FeS047H20 0,02 g ZnS04'7H20 0,02 g (NH4)2S04 0,02 g HCI (7N) 1,00 ml A cultura inoculada foi crescida em um agitador rotatório grande a 30°C durante até 65 horas ou mais (até a lise estar substancialmente completa). Os particulados foram recolhidos por centrifugação a 4°C e 8.000 rpm em um rotor Sorvall GS-3. A pelota resultante foi lavado três vezescom aproximadamente 5 volumes de água destilada ressuspendendo o material pelotizado e centrifugando com descrito. Os cristais de toxina foram purifi- cados utilizando centrifugação (100 minutos a 6.500 rpm em um rotor Sor- vall HS-4 a 4°C) sob gradientes de etapa de brometo de sódio que consis- tem de 15 mí de 50%, 7 ml de 45% e 7 ml de 40% de NaBr. Os cristais fo- ram removidos dos gradientes, diluídos aproximadamente a 50% com água destilada e concentrados por centrifugação a 14.000 rpm a 4°C em um rotor Sorvall SS-34. A pelota de cristal de proteína foi suspensa em uma quantidade mínima de água destilada, congelada rapidamente em um banho de gelo seco/propanol e armazenada a -80°C. A análise de SDS- PAGE dos produtos deste processo revela uma banda dominante corada com Coomassie de 54 kDa. A análise por espectroscopia de massa (matrix-assisted laser desorbtion-time of flight, MALDI-TOF) da proteína detecta um pico dominante em 54.080 dáltons. O peso molecular calcu- lado da seqüência de aminoácido da toxina 86A1 intacta é de 54.080 dáltons.

Exemplo 3 - Digestão Proteolítica da Toxina Crv6A

Os cristais de proteína obtidos como anteriormente foram dige- ridos proteoliticamente utilizando tripsina bovina. A mistura de digestão con- tinha Tris base 133 mM, uréia 1 M, 5 mg da proteína da toxina 86A1, 50 pg de tripsina (por exemplo, Sigma Tipo XIII ou Boerhinger-Mannheim grau de seqüênciamento), em um volume final de 2,0 ml. A mistura acima menos a tripsina foi incubada a 37°C durante 15 minutos. A tripsina, como uma solu- ção de 1 mg/ml em acetato de sódio 10 mM, pH 4,5 foi então adicionada e permitiu-se que fosse incubada durante duas horas adicionais a 37°C. No final da incubação, a mistura de reação foi centrifugada durante 15 minutos em uma centrífuga Eppendorf a 4°C. O sobrenadante foi removido e coloca- do em um Centricon 30 de 2 ml (Amicon) e foi lavado três vezes com 2 ml de água destilada. A amostra lavada foi armazenada a 4°C ou foi congelada rapidamente em um banho de gelo seco/isopropanol e arma- zenada a -80°C. A análise de SDS-PAGE da mistura de digestão lavada revela uma banda dominante corada com Coomassie em 45.000 dáltons, com ban- das secundárias detectáveis em 46.000 dáltons e aproximadamente 34.000 dáltons. O MALDI-TOF revela uma única banda aproximadamente em 46.500 dáltons. A análise de seqüência de terminal amino utilizando a de- gradação de Edman automatizada (ABI) da banda do SDS-PAGE manchada em uma membrana de PVDF, revela uma seqüência de aminoácido que cor- responde à seqüência conhecida da toxina 86A1 de tamanho completo (SEQ ID N° 2) que se inicia no resíduo de aminoácido número 11. O se- qüênciamento automatizado do terminal amino (HP) da banda principal do SDS-PAGE manchada em uma membrana Zitex revelou uma seqüência que corresponde à seqüência conhecida da toxina 86A1 que começa no resíduo de aminoácido 441 e termina no resíduo de aminoácido 443 da SEQ ID N° 2. A massa calculada do fragmento seqüênciado (resíduo 12-443) é de 48.725 dáltons.

Esta toxina truncada resultante é identificada aqui como R443, a toxina 86A1 truncada ou a toxina Cry6A truncada. A seqüência desta toxina foi determinada como sendo a da SEQ ID N° 6. Ver também SEQ ID N° 5.

Em adição ao método preferido acima, um resultado semelhante pode ser obtido na ausência de uréia 1 M. Se for adicionado -mercaptoetanol 140 mM, na presença ou na ausência de uréia 1 Μ, o rendimento do produto é muito reduzido. Isto pode ser evitado, até certo ponto, na ausência de uréia pelo aumento da quantidade de tripsina em 10 vezes. É provável que qualquer tampão que possua um pH entre pH 9-11 atuasse semelhantemente.

Exemplo 4 - Bioensaio do Verme da Raiz de Milho do Oeste As preparações de proteína truncada obtidas como descrito acima no Exemplo 3 foram bioensaiadas contra verme da raiz de milho do oeste e foi descoberto que possuíam atividade de toxina.

Como mostrado na Tabela 2, os níveis de atividade obtidos pelo uso da proteína 86A1 truncada excedem inesperadamente os níveis con- trole obtidos pelo uso da proteína 86A1 de tamanho completo. O LC50 (pg/cm2) foi determinado para a proteína 86A1 de com- primento original (58 kDa) e para a forma truncada da proteína 86A1 (45 kDa). Os resultados são relatados na Tabela 3.

Exemplo 5 - Construção de Proteínas e Genes de Fusão Uma proteína de fusão que consiste de Cry6B e Cry6A possuin- do atividade contra verme da raiz de milho do oeste pode ser construída.

Deveria ser citado que não se sabia previamente que a proteína Cry6B/69D1 é útil para controlar o verme da raiz de milho. A seqüência da toxina Cry6B de tamanho completo que pode ser obtida de PS69D1 corres- ponde a SEQ ID N° 10. Ver também SEQ ID N°9. A fusão consiste de um segmento de gene de Cry6B unido a um de Cry6A de forma que o quadro aberto de leitura é mantido. Uma modali- dade consiste da junção dos aminoácidos de 1 a 394 de CryQB aos aminoá- cidos de 386 a 443 de Cry6A. Seria preferível fazer uma permutação entre os genes em um ponto onde há homologia substancial, devido ao fato de que a homologia substancial indica estrutura tridimensional semelhante e a possibilidade de menores perturbações prejudiciais na estrutura tridimensi- onal. A Figura 1 é um alinhamento de Cry6A com Cry6B exibindo regiões de homologia para permutações. Outros exemplos possíveis de pontos de per- mutação para fusões de genes são exibidos abaixo na Tabela 2. A tabela não deve ser considerada como íimitante.

Adicionalmente, as construções podem ser truncadas no termi- nal amiho de forma que aproximadamente os 10-25 primeiros aminoácidos possam estar ausentes.

Exemplo 6 - Inserção de Genes de Toxina em Plantas Um aspecto da presente invenção é a transformação de plantas com os presentes genes que codificam a toxina inseticida. As plantas transformadas são resistentes ao ataque pelas pragas alvo. Em modalida- des preferidas, os genes truncados da presente invenção são otimizados para o uso em plantas. As SEQ ID Nos 3 e 4 fornecem a informação da se- qüência para versões otimizadas para plantas do gene e da toxina cry6A de tamanho completo. Os genes truncados podem ser também otimizados para uso em plantas. Por exemplo, as sequências do gene e da toxina de SEQ 1D

Nos 7 e 8, que podem ser também identificadas como R390, são otimizadas para uso em plantas.

Os genes que codificam toxinas pesticidas, como descrito aqui, podem ser inseridos em células de planta utilizando uma variedade de téc- nicas que são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, um grande número de vetores de clonagem que compreendem um sistema de replicação em E. coli e um marcador que permite a seleção das células transformadas está disponível para preparar a inserção de genes estranhos em plantas superio- res. Os vetores compreendem, por exemplo, pBR322, séries de pUC, séries de M13mp, pACYC184, etc. Conseqüentemente, a sequência que codifica a toxina de B.t pode ser inserida no vetor em um sítio de restrição adequado. O plasmídeo resultante é utilizado para a transformação em E, coli. As cé- lulas de E. coli são cultivadas em um meio de nutrientes adequado, são en- tão coletadas e lisadas. O plasmídeo é recuperado. A análise de sequência, a análise de restrição, a eletroforese e outros métodos biológicos bioquími- cos-moleculares são geralmente conduzidos como métodos de análise.

Após cada manipulação, a seqüência de DNA utilizada pode ser clivada e ligada à próxima seqüência de DNA. Cada seqüência do plasmídeo pode ser clonada no mesmo plasmídeo ou em outros. Dependendo do método de inserção dos genes desejados na planta, podem ser necessárias outras se- qüências de DNA. Se, por exemplo, o plasmídeo Ti ou Ri for utilizado para a transformação da célula de planta, então pelo menos a borda direita, mas frequentemente a borda esquerda do T-DNA do plasmídeo Ti ou Ri, tem que ser ligada como a região flanqueadora dos genes que serão inseridos. O uso de T-DNA para a transformação de células de planta foi intensivamente pesquisado e foi suficientemente descrito na EP 120 516;

Hoekema (1985) Em: The Binary Plant Vector System, Oftset-durkkerij*Kan- ters B.V., Alblasserdam, Capítulo 5; Fraley e outros, Crít. Rev. Plant Sei. 4:1- 46; e An e outros (1985) EMBO J. 4:277-287.

Uma vez inserido o D NA foi integrado no genoma, este é relati- vamente estável ali e, como uma regra, não sai novamente. Contém nor- malmente um marcador de seleção que confere às células da planta trans- formada resistência a um biocida ou a um antibiótico, tal como canamicina, G418, bleomicina, higromicina ou cloranfenicol inter alia. 0 marcador em- pregado individualmente deveria conseqüentemente permitir a seleção de células transformadas ao invés das células que não contém o DNA inserido.

Um grande número de técnicas está disponível para inserir DNA em uma célula hospedeira de planta. Estas técnicas incluem a transforma- ção com T-DNA utilizando Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhi- zogenes como agente de transformação, fusão, injeção, biolística (bombar- deamento de micropartículas) ou eletroporação assim como outros métodos possíveis. Se forem utilizadas Agrobactérias para a transformação, o DNA a ser inserido tem que ser clonado em plasmídeos especiais, isto é em um vetor intermediário ou em um vetor binário. Os vetores intermediários podem ser integrados no plasmídeo Ti ou Ri por recombinação homóloga devido a seqüências que são homólogas a seqüências no T-DNA. O plasmídeo Ti ou Ri também compreende a região vir necessária para a transferência do Τ- Ο NA. Os vetores intermediários não podem se replicar em Agrobactérias. O vetor intermediário pode ser transferido para Agrobacterium tumefaciens através de um plasmídeo auxiliar (conjugação). Os vetores binários podem ser replicar tanto em E. coti quanto em Agrobactérias. Compreendem um gene marcador de seleção e um ligante ou poliligante que fica enquadrado nas regiões das bordas direita e esquerda do T-DNA. Podem ser transfor- mados diretamente em Agrobactérias (Holsters e outros [1978] Mol. Gen.

Genet. 163:181-187). O Agrobacterium utilizado como célula hospedeira deve compreender um plasmídeo que carrega uma região vir. A região vir é necessária para a transferência do T-DNA para a célula da planta. Pode estar contido um T-DNA adicional. A bactéria transformada desta maneira é utilizada para a transformação de células de planta Os explantes de planta podem ser vantajosamente cultivados com Agrobacterium tumefadens e Agrobacterium rhizogenes para a transferência do DNA para a célula de planta. Plantas inteiras podem então ser regeneradas do material da planta infectada (por exemplo, pedaços de folha, segmentos de caule, raízes, mas também protoplastos ou células cultivadas em suspensão) em um meio adequado, que pode conter antibióticos ou biocidas para seleção. As plan- tas obtidas desta forma podem ser então testadas quanto à presença do DNA inserido. Não são feitas exigências especiais dos plasmídeo no caso da injeção e eletroporação. É possível utilizar plasmídeos comuns, tais como, por exemplo, derivados do pUC.

As células transformadas crescem dentro das plantas de manei- ra usual. Podem formar células germinativas e transmitir a(s) característi- ca(s) para as plantas da progênie. Tais plantas podem ser crescidas de ma- neira normal e cruzadas com plantas que possuem os mesmos fatores he- reditários transformados ou outros fatores hereditários. Os indivíduos híbri- dos resultantes têm as propriedades fenotípicas correspondentes.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, as plantas serão transformadas com genes em que o uso do códon foi otimizado para plantas. Ver, por exemplo, Patente U.S. N° 5.380.831. Também, vantajosa- mente, serão utilizadas as plantas que codificam uma toxina truncada. A to- xina truncada irá tipicamente codificar aproximadamente 55% até aproxima- damente 80% da toxina de tamanho total. Os métodos para criar genes de B.t sintéticos para uso em plantas são conhecidos na técnica.

Deveria ser entendido que os exemplos e modalidades descritos aqui são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou substi- tuições à luz dos mesmos serão sugeridas por versados na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e o alcance deste pedido de patente e do âmbito das reivindicações em anexo.

SEQUENCE LISTING <110> Mycogen Corporation <120> PROTEÍNA PESTICIDA ISOLADA E PROCESSO DE CONTROLE DE PESTE DE

Claims (7)

1. Proteína pesticida isolada truncada, caracterizada pelo fato de que consiste em uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo de SEQ ID No: 6 e SEQ ID No: 8.

2. Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 6.

3. Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 8.

4. Processo de controle de peste de Coleóptero, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a dita peste com uma proteína pesticida isolada, em que a dita proteína consiste na SEQ ID No: 6 e SEQ ID No: 8.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita proteína consiste na sequência de aminoácido da SEQ ID No: 6.

6. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita proteína consiste na sequência de aminoácido da SEQ ID No: 8.

7. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita proteína é produzida por e presente em uma planta.