CN110272904A

CN110272904A - 水稻氮高效利用基因OsNLP4及其编码蛋白的应用

Info

Publication number: CN110272904A
Application number: CN201810216180.5A
Authority: CN
Inventors: 向成斌; 吴杰
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2018-03-15
Filing date: 2018-03-15
Publication date: 2019-09-24
Anticipated expiration: 2038-03-15
Also published as: CN110272904B

Abstract

本发明涉及一种氮高效利用基因OsNLP4及其编码蛋白的应用。所述氮高效利用基因编码SEQ ID NO.2所示的多肽。本发明通过过量表达OsNLP4基因，使水稻的氮营养利用效率显著提高，增加水稻产量，减少过度使用的氮肥引起的环境污染，并且通过T‑DNA插入突变体和CRISPR技术在OsNLP4目的基因突变体中证实了该基因的功能。本发明的氮高效利用基因将在培育氮肥高效吸收和利用植物(特别是水稻、玉米、小麦、大豆、棉花、油菜等农作物)中发挥重要的作用，具有广阔应用前景。

Description

水稻氮高效利用基因OsNLP4及其编码蛋白的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，特别涉及水稻中提高氮利用效率的基因及其编码蛋白在农业中的应用。植物体拥有一系列的氮素转运基因以实现从土壤中吸收氮素营养和在植物体内对氮素营养的重新分配，来满足植株在生长、发育和繁殖过程中对氮素营养的需要。本发明涉及的OsNLP4基因在水稻高效利用氮肥与提高产量方面具有重要的应用价值。

背景技术

水稻(Oryza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一，约为30亿人口提供35％-60％的饮食热量。在我国，目前的水稻平均氮肥施用量180kg/hm²，比世界平均水稻氮肥施用量高出75％，中国水稻生产所消耗的氮肥占世界水稻氮肥总消耗量的37％左右，而且虽然氮肥用量增加，但粮食并没有同步增产。随着氮肥的过量施用，造成严重环境污染的同时，水稻氮素利用效率却随着氮肥用量的增长明显下降，因此培育氮高效利用的水稻新品种，为水稻栽培中氮肥的合理利用提供必要依据，降低过量施用氮肥带来的环境污染，具有潜在的农业生产价值。

氮是控制植物生长和高产极其重要的一种大量营养元素。它是构成生物基础结构的关键组分，对于植物的生长和发育是必需的。氮营养的缺乏不仅可导致植物生长缓慢，产量下降，还可以使粮食作物籽粒蛋白质含量下降，从而降低其品质。植物在长期进化过程中形成了一套有效的氮吸收和代谢的系统，对这套系统的生理过程及其分子遗传机制的研究，可以为培育高效利用氮肥的作物品种提供理论基础。大多数植物虽能通过铵转运体吸收NH₄ ⁺，但在一般田间条件下，NO₃ ^-是植物吸收的主要形式。NO₃ ^-进入细胞后，就被硝酸还原酶(NR)和亚硝酸还原酶(NIR)还原成铵。铵通过谷氨酸合成循环转变为可以被植物直接利用的有机态氮。

转录因子可能是最有效的改良作物氮利用效率的候选基因，因为转录因子可以同时协调大量基因的表达，避免或者削弱植物内平衡机制的影响。在拟南芥中发现了一类NLP(NIN-like protein)转录因子，其中NLP7被发现在氮的早期信号和代谢中具有极其重要的作用。虽然在提高植物氮利用效率方面前人做了大量的研究，但是真正应用到水稻等作物上，发现能够有效提高作物氮利用效率的转录因子却很少。由此可见，本领域对于提高水稻等农作物的氮利用率存在迫切的需求。

发明内容

本发明人在研究中发现OsNLP4基因能够促进植物的氮吸收利用，尤其是提高水稻的氮利用效率。在此基础上，本发明人完成了本发明。

本发明的一个目的是鉴定一种能提高水稻氮利用效率的基因及其编码蛋白。本发明的另一个目的是确定该鉴定的水稻氮高效利用基因在培育具有提高的氮利用率的植物方面的应用，以及提供一种利用该鉴定的水稻氮高效利用基因培育具有提高的氮利用率的植物的方法。

因此，在第一方面，本发明鉴定了一种氮高效利用的基因OsNLP4，其编码SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。

在一个优选的方面，所述氮高效利用的基因OsNLP4的核苷酸序列可以选自：

1)SEQ ID NO.1所示的DNA序列；或

2)在高严谨条件下可与SEQ ID NO.1所示的DNA序列杂交的核苷酸序列。

在第二方面，本发明提供氮高效利用基因OsNLP4编码的蛋白，所述OsNLP4蛋白是如下(a)或(b)或(c)的蛋白：

(a)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；

(b)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和缺失和/或添加且具有与(a)相同活性的由(a)衍生的蛋白质；

(c)其它基因编码的与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白具有50％以上的氨基酸同一性并且具有与(a)相同活性的蛋白。

其中，SEQ ID NO.2由843个氨基酸残基组成。

在第三方面，本发明涉及包含氮高效利用基因OsNLP4的表达载体；包含氮高效利用基因OsNLP4的转基因细胞系；包含氮高效利用基因OsNLP4的宿主细胞。其中所述宿主细胞为微生物细胞，例如，可为真菌细胞或细菌细胞，例如，但不限于，农杆菌、酵母菌、大肠杆菌等。

通过常规的转化或转染技术，可以将OsNLP4基因或其活性片段或包含OsNLP4基因的重组表达载体导入植物细胞，得到转基因植物细胞，并进一步得到过量表达OsNLP4基因或其活性片段的转基因植株。

在第四方面，本发明涉及氮高效利用基因OsNLP4或其编码的蛋白用于提高植物氮利用效率的应用。本发明人发现，在植株中过表达OsNLP4基因能够提高植物的氮利用效率。本领域技术人员应该理解，获得过表达OsNLP4基因的植株可以通过转基因技术实现，例如，通过农杆菌介导的转染、质粒转化、直接DNA转化、微注射等技术实现。

在第五方面，本发明提供一种培育氮高效利用植物的方法，所述方法包括将氮高效利用基因OsNLP4或其活性片段导入植物细胞，由此获得氮利用效率增强的转基因植物，或者利用杂交方法得到过表达氮高效利用基因OsNLP4或其活性片段的后代植株。在本发明的一个实施方案中，所述植物包括，但不限于，水稻、拟南芥、小麦、玉米、棉花、油菜或大豆，优选水稻。在本发明的一个实施方案中，在植物中过量表达氮高效利用基因OsNLP4并进一步获得氮高效利用的植物。所述方法中具体转化和选择方法可根据本领域公知的多种方式进行。在本发明的一个实施方案中，所述方法可参照实施例中描述的过程进行并根据不同植物进行适当修改。

在本发明的优选实施方案中，提供一种培育具有提高的氮利用率的植物的方法，所述方法包括：将编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的分离的核苷酸序列或其活性片段导入植物细胞，得到转基因植物细胞，由所述转基因植物细胞产生表达所述分离的核苷酸序列或其活性片段的转基因植株，与未导入所述分离的核苷酸序列或其活性片段的对照植株相比，所述转基因植株具有提高的氮利用率。

在另一个实施方案中，通过杂交方法在后代植株中导入氮高效利用基因OsNLP4。例如，将包含编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的分离的核苷酸序列或其活性片段的植株与另一植株杂交获得后代植株，筛选出稳定纯合的含有所述核苷酸序列或其活性片段的杂交植株，与未杂交的植株相比，所得到的杂交后代植株具有提高的氮利用率。

本领域技术人员应该理解，上述方法还包括在导入植物细胞之前将编码SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列的分离的核苷酸序列针对所述植物的密码子应用进行密码子优化的步骤。

本发明的培育方法可以用于水稻、玉米、小麦、棉花、油菜、大豆、牧草或拟南芥的育种，优选用于水稻育种。利用该方法，可以得到具有提高的氮利用率的植物品种。育种的原理即为在植株中过表达OsNLP4基因，具体而言，可以通过在植株中过表达编码SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列的分离的核苷酸序列或其活性片段而实现。利用所述培育方法得到的转基因植株或杂交后代植株在低氮和/或高氮生长条件下具有生长优势。在本发明中，正常施氮量一般为25KG尿素/亩，“低氮生长条件”通常是指施加正常施氮量0.1-0.5倍的氮肥量，“高氮生长条件”通常是指施加正常施氮量2.0-2.5倍的氮肥量。

当用于培育具有提高的氮利用率的水稻时，所述培育方法包括：将编码SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列的分离的核苷酸序列或其活性片段导入水稻细胞，得到转基因水稻细胞，由所述转基因水稻细胞产生表达所述分离的核苷酸序列或其活性片段的转基因水稻植株，与未导入所述分离的核苷酸序列或其活性片段的对照水稻相比，所述转基因水稻具有提高的氮利用率；或者所述方法包括：将包含编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的分离的核苷酸序列或其活性片段的水稻植株与另一水稻植株杂交获得后代水稻植株，筛选出稳定纯合的含有所述核苷酸序列或其活性片段的杂交植株，与未杂交的水稻植株相比，所得到的杂交后代植株具有提高的氮利用率。

此外，本发明将编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的分离的核苷酸序列或其活性片段导入模式植物拟南芥氮利用率低下的突变体nlp7-1细胞，得到转基因拟南芥细胞，由所述转基因拟南芥细胞产生表达所述分离的核苷酸序列或其活性片段的转基因拟南芥植株，与未导入所述分离的核苷酸序列或其活性片段的对照拟南芥相比，所述转基因拟南芥具有提高的氮利用率。这一结果表明本发明提供的基因在模式植物中的功能保守，为该基因在不同农作物育种方面提供了有力证据。

总的来说，本发明所提供的氮高效利用基因，名称为OsNLP4，来源于水稻，是下述核苷酸序列之一：

1)编码SEQ ID NO.2所示的多肽的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO.1的DNA序列；

3)在高严谨条件下可与SEQ ID NO.1限定所示的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所谓高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

SEQ ID NO.1由2529个碱基组成，其编码序列为自5′端第1位碱基开始，编码SEQID NO.2所示的氨基酸序列。

含有本发明的氮高效利用基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌也在本发明的保护范围内。

扩增OsNLP4中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

利用植物表达载体，将本发明的氮高效利用基因导入植物细胞，可获得对氮素利用效率增强的转基因细胞系及转基因植株。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其他的可参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶NOS基因)、植物基因(如大豆储存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用OsNLP4构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其他的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如除草剂Bar基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明OsNLP4的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、玉米、小麦等单子叶植物，也可以是拟南芥、大豆、油菜、棉花等双子叶植物。

通过对转化OsNLP4基因后所得到的转基因水稻在不同氮水平营养液中生长实验以及田间实验，证明该基因在转入植物后可显著提高植株的氮利用效率，提高植物的生物量；通过对转化OsNLP4基因后所得到的转基因拟南芥在不同氮水平培养基中的生长实验，证明该基因在模式植物中的功能保守。本发明为人为增强植物氮利用效率提供了基础，将在培育氮营养高效利用的植物(特别是水稻、玉米、小麦、油菜、大豆、棉花等农作物)中发挥重要的作用。

因此，本发明提供下述：

1.一种氮高效利用基因，所述基因编码氨基酸序列为SEQ ID NO.2的多肽。

2.根据第1项所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.包含第1或2项所述的氮高效利用基因的重组表达载体。

4.包含第1或2项所述的氮高效利用基因或权利要求3所述的重组表达载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞为微生物细胞。

5.根据第4项所述的宿主细胞，其中所述微生物细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

6.第1或2项所述的基因用于培育具有提高的氮利用率的植物的应用。

7.一种培育具有提高的氮利用率的植物的方法，所述方法包括：将第1或2项所述的基因或其活性片段或第3项所述的重组表达载体导入植物细胞，得到转基因植株，或将包含第1或2项所述的基因或其活性片段的植株与另一植株杂交获得后代植株，与未导入所述基因或其活性片段或所述重组表达载体的对照植株或未杂交的植株相比，所述转基因植株具有提高的氮利用率。

8.第7项所述的方法，其中所述方法还包括在导入植物细胞之前将第1或2项所述的基因针对所述植物的密码子应用进行密码子优化的步骤。

9.第7项所述的方法，其中所述植物选自水稻、玉米、小麦、棉花、油菜、大豆、牧草或拟南芥，优选水稻。

10.第7项所述的方法，其中第1或2项所述的基因或其活性片段在转基因植株中过表达。

11.第7项所述的方法，其中所述转基因植株或杂交后代植株在低氮和/或高氮生长条件下具有生长优势。

12.第7项所述的方法，其中所述转基因植株或杂交后代植株具有提高的产量。

13.一种分离的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

附图说明

图1、过量表达载体pCB2006-OsNLP4(A)和pCB2004-OsNLP4(B)的物理图谱；

图2、CRISPR实验的pH-Ubi-cas9-7(A)和pOs-sgRNA(B)载体物理图谱；

图3、过表达和敲除OsNLP4基因的水稻株系中OsNLP4基因表达情况的qRT-PCR检测(A)以及CRISPR基因突变位点情况(B)；其中，WT表示野生型水稻(作为对照)，OE-1表示OsNLP4基因过量表达的转基因水稻株系，OE-9表示另一个OsNLP4基因过量表达的转基因水稻株系，nlp4-1表示OsNLP4基因T-DNA插入突变体；

图4、转基因水稻在不同氮浓度的水培条件下的生长状况。(A)显示在不同氮营养水平(0.02mM，0.2mM，2mM)情况下生长20天，OsNLP4过表达株系(OE-1和OE-9)与野生型(WT)相比，长势更好，生物量更高，而OsNLP4基因突变株系(crispr-1和crispr-2)以及OsNLP4基因T-DNA插入突变体(nlp4-1)与野生型相比，生物量显著降低；(B)显示生长20天后OsNLP4各遗传材料干重的统计情况；其中，WT表示野生型水稻(作为对照)，crispr-1表示OsNLP4基因CRISPR-cas9基因突变株系，crispr-2表示OsNLP4基因另一个不同突变位点的CRISPR-cas9基因突变株系；

图5、田间正常情况下OsNLP4各水稻遗传材料的生长状况。(A)显示OsNLP4过表达株系具有明显的生长优势，而敲除突变体生长态势较弱；(B)显示田间OsNLP4各遗传材料的结实率、分蘖数和单株产量的统计情况。图5中字母缩写表示的意义同图3-4。

图6、过表达OsNLP4基因的拟南芥的生长状况。(A)显示在不同氮浓度的固体培养基上，转基因拟南芥具有显著的生长优势；(B)显示OsNLP4转基因拟南芥在土壤中的生长状况。其中，WT表示野生型对照，KO表示氮利用率低下的突变体nlp7-1对照，OX-7表示在突变体nlp7-1背景下过量表达OsNLP4基因的过表达株系，OX-12表示另一个在突变体nlp7-1背景下过量表达OsNLP4基因的过表达株系。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂。

实施例1、氮高效利用基因OsNLP4及其转基因植物的获得

1、OsNLP4cDNA序列的获得

提取7天大的中花11(由华中农业大学熊立仲老师馈赠)幼苗的总RNA，反转录得到cDNA，然后以cDNA作为模板RT-PCR扩增出OsNLP4cDNA序列。具体过程如下：采用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)抽提水稻总RNA，取1μg总RNA采用大连宝生物工程公司生产的反转录试剂盒，按照产品使用指南反转录得到cDNA。

RT-PCR引物如下：

上游引物：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT

atggaagagggagaccccca-3’，

下游引物：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT

tcatgagaaaccagtgtgacca-3’。

引物中大写字母序列为attB2全接头，小写字母为按照OsNLP4基因序列设计的序列(上游引物中的小写字母表示的序列为SEQ ID NO.1的5’端序列，下游引物中的小写字母表示的序列为SEQ ID NO.1的3’端序列的反向互补序列)。

50uL PCR扩增体系为：0.8uL FastPfu聚合酶(北京全式金生物技术公司)，0.5uLcDNA，5×PCR缓冲液10uL，dNTPs 100uM，上下游引物各25uM，再用双蒸水将反应体系补充至50uL。

PCR程序为：先95℃，1min，再58℃，30s，最后72℃，1min，共40个循环。反应结束后，对PCR产物进行回收测序，测序表明该PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码SEQ ID NO.2所示的蛋白序列。

2、OsNLP4过量表达载体的构建

pCB2006和pCB2004分别是含有Actin1启动子和35S启动子的植物过量表达双元载体，其构建方法可参见High-throughput binary vectors for plant gene functionanalysis.Journal of Integrative Plant Bi01.49(4)∶556-567。

采用高通量构建载体的方法(Gateway Technology)(汪宗桂，郑文岭，马文丽；通路克隆系统：DNA重组技术的新进展.中国生物工程杂志(2003)，第23卷第7期)，将步骤1中PCR扩增得到的OsNLP4基因的cDNA，利用Gateway^R BP Clonase^TM II Enzyme Mix试剂盒(Invitrogen，Cat.No.11789-020)通过Gateway^TM克隆技术重组克隆到pCB2006和pCB2004的attR1和attR2之间，将经测序鉴定表明含有OsNLP4cDNA的pCB2006重组载体命名为pCB2006-OsNLP4和pCB2004-OsNLP4(如图1所示)。

3、OsNLP4过表达转基因植物的获得和鉴定

将上述构建的重组表达载体pCB2006-OsNLP4采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，PlantJourna1 6：271-282)导入正常中花11水稻品种中。待转基因植株长大后，剪取叶子提DNA，并设计引物对其进行PCR，筛选出转入OsNLP4基因的阳性植物，单株收种，直至T2代检测出纯合植株。取在MS培养基(配方见表1)上萌发的纯合株系通过qRT-PCR鉴定各株系中OsNLP4基因的表达量。同时我们也检测了从韩国Kyung Hee University，Crop BiotechInstitute购买的OsNLP4的T-DNA插入突变体nlp4-1中OsNLP4的表达量。具体操作如下：取OsNLP4转基因株系、野生型和突变体nlp4-17天大的小苗，参照步骤1中的方法抽取总RNA，反转录得到cDNA，以该cDNA为模版，以ACTIN1基因作为内参，采用大连宝生物工程公司生产的Q-PCR试剂盒(TakaraPremix ExTaq^TMII)进行qRT-PCR。从构建的过表达OsNLP4基因的水稻株系中选择两个株系，命名为OE1和OE-9，用于后续实验。

将上述构建的重组表达载体pCB2004-OsNLP4用电转化法转入根癌农杆菌系GV3101：：pMP90(该菌株由美国ISU大学Oliver D.J.教授惠赠，也可参见Koncz C，Schell J(1986)The promoter of T_L-DNA gene 5controls the tissue-specific expression ofchimeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector.Mol GenGenet 204∶383-396.)，再用浸花转化方法(floral dip method)(Steven J，Clough andAndrew F.Bent(1998)Floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal 16(6)，735-743.)转化从拟南芥种子资源库中(http：//abrc.osu.edu/resources)购买的拟南芥氮利用率低下突变体nlp7-1植株。收到T0代种子后铺到含50mg/L除草剂(g1ufosinate ammonium，商用名为Liberty，法国Aventis作物科学公司)的MS培养基上筛选转入OsNLP4基因的阳性拟南芥植物。抗除草剂的T1阳性苗移植到土壤中生长直至成熟，单株收取T2代种子。T2代种子种下去单株收种，鉴定纯合株系。取在除草剂上全萌的纯合株系，以UBQ5基因作为内参，通过qRT-PCR鉴定各拟南芥株系中OsNLP4基因的表达量。选择两个在拟南芥突变体nlp7-1背景下过量表达OsNLP4基因的过表达拟南芥株系，即，OX-7和OX-12，用于后续实验。

OsNLP4 qRT-PCR引物序列为：

上游引物LP 5’-AGTCGCCATTCTGACGAGAACT-3’，

下游引物RP 5’-TGGGTACTCCAGTTTAGTGGAG-3’。

ACTIN1基因qRT-PCR引物序列为：

上游引物LP 5’-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3’，

下游引物RP 5’-TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’。

Ubiqutin5基因qRT-PCR引物序列为：

上游引物LP 5’-AGAAGATCAAGCACAAGCAT-3’，

下游引物RP 5’-CAGATCAAGCTTCAACTCCT-3’。

qRT-PCR体系：10μM LP 0.25μl，10μM RP 0.25μl，cDNA 0.3μl，双蒸水4.2μl，SYBRGreen试剂5μl。qRT-PCR程序：95℃，1min；95℃，5s；60℃，30s，40个循环。

表1.MS培养基的配制

MS培养基配方如下(1L)：

10x大量元素(MS<sub>max</sub>)	100mL
		100x微量元素(MS<sub>min</sub>)	10mL
100x铁盐	10mL
		蔗糖	100g
水	补足至1L

10x大量元素(MS_max)配方如下(1L)：

NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>	16.5g
		KNO<sub>3</sub>	19g
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O	4.40g
		MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	3.7g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	1.7g
		水	补足至1L

100x微量元素(MSmin)配方如下(1L)：

K1	0.083g
		H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>	0.62g
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O	2.23g
		ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.86g
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O	0.025g
		CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O	0.0025g
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O	0.0025g
		水	补足至1L

100x铁盐配方如下(1L)：

FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	2.78g
		Na<sub>2</sub>-EDTA·2H<sub>2</sub>O	3.73g
水	补足至1L

4、OsNLP4基因CRISPR-cas9表达载体的构建

首先是靶向OsNLP4基因sgRNA的设计。在OsNLP4基因上选择5’-GGN(19)GG，5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG这样的序列。sgRNA在OsNLP4基因上的靶向位点要位于不同的各种剪切形式的共有外显子上。该靶向位点位于整个基因的前半段，但不能离ATG太近，最好在基因的功能结构域中。其次还要在数据库中通过BLAST确保sgRNA靶序列的唯一性。然后根据选择的sgRNA，在其5’加上CCGG得到正向寡核苷酸；根据选择的sgRNA，获得其对应DNA的互补链，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸成对变性、退火，退火之后形成双链，再通过BsaI酶切位点连入pOs-sgRNA表达载体(由北京大学瞿礼嘉老师馈赠，可参见Targeted mutagenesis inrice using CRISPR-Cas system.Cell Research 23，1233-1236(2013))。最后再通过Gateway^TM克隆技术重组克隆到pH-Ubi-cas9-7(由北京大学瞿礼嘉老师馈赠，可参见Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system.Cell Research 23，1233-1236(2013))的attR1和attR2之间。

5、OsNLP4基因CRISPR-cas9转基因植物的获得与鉴定

将上述OsNLP4基因与pH-Ubi-cas9-7构建的重组表达载体采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，PlantJournal 6：271-282)导入正常中花11水稻品种中。待转基因植株长大后，剪取叶子提DNA，并设计引物对CRISPR-cas9所针对的靶点进行测序，鉴定该靶点附近是否发生了基因突变，具体发生了什么样的突变。筛选出OsNLP4基因发生有效突变的阳性植物，单株收种，直至T2代检测出纯合植株。CRISPR-cas9所针对的靶点序列如图3所示。从所得到的多个OsNLP4基因突变株系中选择两个用于后续实验，将所选的两个OsNLP4基因突变株系分别命名为crispr-1和crispr-2。

实验结果表明得到的所有转基因株系都是OsNLP4过表达株系，突变体nlp4-1中OsNLP4几乎没有表达；CRISPR株系在靶点附近产生了阻碍基因正常行使功能的突变，其中crispr-1株系的OsNLP4基因在靶点位置有7个碱基的缺失，而crispr-2株系的OsNLP4基因在靶点位置有9个碱基的缺失。

实施例2、转基因株系对氮营养利用效率评价

1、转基因水稻在不同氮浓度的水培条件下的生长状况

将OsNLP4过表达株系OE1和OE-9(实施例1构建)，CRISPR基因突变株系crispr-1、crispr-2(实施例1构建)，OsNLP4基因T-DNA插入突变体nlp4-1和野生型水稻种子浸种萌发后分别放到含0.02mM氮，0.2mM氮，2mM氮的不同氮浓度的水培营养液中(氮元素由KNO₃提供，培养基配方见下文)上生长20天，观察各株系的生长情况。

正常培养基配方如下：NH₄NO₃ 80mg/L，NaH₂PO₄·2H₂O 93.6mg/L，K₂SO₄ 52.4mg/L，CaCl₂·2H₂O 44.2mg/L，MgCl₂·6H₂O 122mg/L，Fe·EDTA 19mg/L，H₃BO₃3.01mg/L，MnSO₄·5H₂O 2.17mg/L，ZnSO₄·7H₂O 0.21mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.024mg/L，CuSO₄·5H₂O0.075mg/L。

不同氮浓度水培培养基配方：在正常培养基基础上，去除培养基中的NH₄NO₃，根据不同氮水平，额外添加KNO₃至需要的浓度，作为唯一氮源。

如图4A所示，培养20天后，在不同氮水平培养液中，两个过表达株系相对野生型和crispr-1、crispr-2株系均长得更大更好，说明过表达株系氮利用效率更高；crispr-1、crispr-2株系相对于野生型长势较弱，在低浓度的情况下，根长较野生型更长；T-DNA插入突变体nlp4-1比野生型矮小，并且根系相比野生型很不发达。统计各株系干重，结果见图4B，从图中可以看出过表达株系相对野生型，在低氮的情况下有差异，但不是特别显著，而在氮充足的情况下，这种生长的差异变得极其显著；crispr-1、crispr-2株系和突变体nlp4-1则在不同氮浓度下干重都显著低于野生型。说明敲除OsNLP4后，植物对不同氮营养的反应和利用效率降低，这进一步说明OsNLP4在氮营养的感知和利用中扮演着重要角色，一旦该基因缺失，植物对外界的氮营养感知和利用就受到影响，如果该基因过表达，则植物对氮营养的感知增强，对氮的吸收和代谢增强，植物的生物量就得到提高。

2、田间正常情况下OsNLP4各水稻遗传材料的生长状况

各株系在大田正常情况下生长3个月，观察各株系的生长状况，拍照并统计各株系的结实率，有效分蘖数和单株产量，结果如图5所示，过表达株系的结实率相对野生型有所增加，但不明显，分蘖数有显著的增加，产量显著提高；而crispr-1、crispr-2株系的结实率则相对野生型有所降低，降低的也不明显，但分蘖数显著下降，产量显著降低；T-DNA插入突变体nlp4-1相较于野生型结实率近似于零，基本不结实，分蘖数显著增加，产量急剧降低。这说明T-DNA插入突变体对水稻氮利用效率的影响比crispr-1、crispr-2株系更剧烈。以上这些数据说明过表达OsNLP4的水稻在大田中生长具有明显的优势，暗示这个基因将是一个具有广阔应用前景的基因，通过这个基因可以提高农作物氮利用效率，进而提高作物生物量和产量，减少环境污染。

3、OsNLP4转基因拟南芥的生长状况

将野生型(WT)拟南芥、T-DNA插入突变体nlp7-1(KO)、OsNLP4过表达株系OX-7和OX-12(实施例1构建)分别放到含1mM氮，3mM氮，10mM氮的不同氮浓度的固体培养基中竖直培养一周(氮元素由KNO₃提供，培养基配方见表1，在正常MS培养基基础上，去除大量元素中的NH₄NO₃，用1400mg/L KCl代替KNO₃，根据不同氮水平，额外添加KNO₃至需要的浓度，作为唯一氮源。微量和铁盐不变)，观察各株系的生长情况。结果如图6A所示，与WT和KO拟南芥株系相比，过表达的拟南芥株系生物量显著增加，具有更加发达的根系，根冠比显著提高，具有明显的生长优势；图6B显示OsNLP4过表达拟南芥株系在土壤中的正常生长条件下，地上部分莲台叶更大，长势也更加良好。这些数据表明OsNLP4基因在模式植物中具有保守的功能，为该基因能够应用在不同的农作物育种方面提供了有力证据。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求书所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims

2.根据权利要求1所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.包含权利要求1或2所述的氮高效利用基因的重组表达载体。

4.包含权利要求1或2所述的氮高效利用基因或权利要求3所述的重组表达载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞为微生物细胞，优选为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

5.权利要求1或2所述的基因用于培育具有提高的氮利用率的植物的应用。

6.一种培育具有提高的氮利用率的植物的方法，所述方法包括：将权利要求1或2所述的基因或其活性片段或权利要求3所述的重组表达载体导入植物细胞，得到转基因植株，或将包含权利要求1或2所述的基因或其活性片段的植株与另一植株杂交获得含有所述基因或活性片段的后代植株，与未导入所述基因或其活性片段或所述重组表达载体的对照植株或未杂交的植株相比，所述转基因植株或杂交后代植株具有提高的氮利用率。

7.权利要求6所述的方法，其中所述方法还包括在导入植物细胞之前将权利要求1或2所述的基因针对所述植物的密码子应用进行密码子优化的步骤。

8.权利要求6所述的方法，其中所述植物选自水稻、拟南芥、玉米、小麦、棉花、油菜、大豆、牧草，优选水稻。

9.权利要求6所述的方法，其中权利要求1或2所述的基因或其活性片段在转基因植株或杂交后代植株中过表达。

10.权利要求6所述的方法，其中所述转基因植株或杂交后代植株在低氮和/或高氮生长条件下具有生长优势，并且所述转基因植株或杂交后代植株具有提高的产量。