JPH11253187A - 発酵法によるl−セリンの製造法 - Google Patents
発酵法によるl−セリンの製造法Info
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- JPH11253187A JPH11253187A JP10353521A JP35352198A JPH11253187A JP H11253187 A JPH11253187 A JP H11253187A JP 10353521 A JP10353521 A JP 10353521A JP 35352198 A JP35352198 A JP 35352198A JP H11253187 A JPH11253187 A JP H11253187A
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Abstract
同微生物が有するL−セリンへの変換能を利用して培養
液中にL−セリンを蓄積させる方法を提供する。すなわ
ち、工業的に実施するのに有利なL−セリンの製造方法
を提供する。 【解決手段】 L−セリン生産性を有し、かつホスホセ
リンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミ
ナーゼ活性の少なくとも一方が増強され、好ましくは、
さらにL−セリンによるフィードバック阻害が解除され
たD−3−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコー
ドする遺伝子が導入されたコリネ型細菌を培地に培養
し、培地中にL−セリンを蓄積させ、培地中から当該L
−セリンを回収することにより、L−セリンを製造す
る。
Description
粧品分野で使用されるアミノ酸混合物を製造するために
用いられるL−セリンの製造法、同製造法を構成するコ
リネ型細菌に関するものである。
としては、グリシン及び糖からL−セリンに変換できる
菌株を使用して、30g/Lのグリシンを有する培地で
最高14g/LのL−セリンを製造したという報告があ
る。この方法におけるグリシンからL−セリンへの変換
収率は46%に相当する(Kubota K. Ag
ricultural Biological Che
mistry,49,7〜12,1985)。また、グ
リシンとメタノールからL−セリンに変換できる菌株を
使用して、100g/Lのグリシンから53g/LのL
−セリンが生産できる(T.Yoshida et a
l. Journal of Fermentatio
n and Bioengineering,Vol.
79,No.2,181−183.1995)。また、
ノカルディア属細菌を使用する方法では、セリンハイド
ロキサメイトやアザセリン等の耐性菌を育種することに
よりL−セリン生産能が改善されることが知られている
(特公昭57−1235号)。しかし、これらの方法は
L−セリンの前駆体であるグリシンを使用しなければな
らず、操作が煩雑でコスト的にも不利であった。
地にL−セリンの前駆体を添加する必要のない菌株とし
て、D−セリン、α−メチル−セリン、o−メチルセリ
ン、イソセリン、セリンハイドロキサメイト、3−クロ
ロアラニンに耐性なコリネバクテリウム グルタミカム
が知られているが、そのL−セリン蓄積は0.8g/L
と極めて低いものであり(農芸化学会誌、第48巻、第
3号、p201−208,1974)、工業的にL−セ
リンの直接発酵を行うには更なる菌株改良が望まれた。
律増殖可能でかつ、薬剤耐性マーカー遺伝子を有するベ
クタープラスミド(米国特許第4514502号参
照)、遺伝子の菌体への導入方法(特開平2−2077
91号等)が開示されており、これらの技術を用いたL
−スレオニンまたはL−イソロイシン生産菌育成の可能
性が開示されている(米国特許第4452890号、及
び米国特許第4442208号参照)。また、L−リジ
ン生産菌育成に関しても、ベクタープラスミドにL−リ
ジン生合成に関与する遺伝子を組み込み、菌体内で増幅
させる技術(特開昭56−160997号などがある)
が知られている。
に関与する酵素のうち、野生型ではフィードバック阻害
を受ける酵素について、フィードバック阻害が解除され
た変異を有する酵素遺伝子を導入してL−セリン生産性
を向上させた例も知られている(特許2584409
号)。このような遺伝子として具体的には、3−PGD
H遺伝子(以下、3−PGDHタンパクをコードする遺
伝子を「serA」ともいう。)が知られている。
H遺伝子の増幅がL−トリプトファン生産性に影響を与
える例が知られている(特開平3−7591号)。
する課題は、糖をL−セリンに変換する微生物を提供
し、同微生物が有するL−セリンへの変換能を利用して
培養液中にL−セリンを蓄積させる方法を提供すること
であり、すなわち、工業的に実施するのに有利なL−セ
リンの製造方法を提供することである。
題を解決すべくL−セリンの製造法について鋭意研究を
重ねた結果、L−セリン生産能を有するコリネ型細菌、
好ましくはL−セリン分解能を欠失した同細菌またはL
−セリンアナログに耐性を示す変異株において、ホスホ
セリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスア
ミナーゼ活性の一方又は両方が増強された株を採取し、
同株を用いてL−セリン発酵を行い培養液中のL−セリ
ン蓄積が飛躍的に向上することを見いだし、この知見に
基づいて本発明を完成するに至った。
し、かつ、ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホ
セリントランスアミナーゼ活性の少なくとも一方が増強
されたコリネ型細菌である。
ーゼ活性及びホスホセリントランスアミナーゼ活性の両
方が増強された同コリネ型細菌;L−セリン分解能を欠
失したことによりL−セリン生産能を有する同コリネ型
細菌;L−セリンアナログに耐性を有することによりL
−セリン生産能を有する同コリネ型細菌;前記ホスホセ
リンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミ
ナーゼ活性の増強が、前記コリネ型細菌細胞内のホスホ
セリンホスファターゼをコードする遺伝子又はホスホセ
リントランスアミナーゼをコードする遺伝子のコピー数
を高めることによるものである同コリネ型細菌;およ
び、L−セリンによるフィードバック阻害が解除された
D−3−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコード
する遺伝子が導入された同コリネ型細菌である。さらに
本発明は、前記コリネ型細菌を培地に培養し、培地中に
L−セリンを蓄積させ、培地中から当該L−セリンを回
収することを特徴とするL−セリンの製造法である。
は、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティ
ブ・バクテリオロジー(Bergey’s Manua
l of Determinative Bacter
iology)第8版599頁(1974)に定義され
ている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗
酸性、胞子形成能を有しない桿菌であり、コリネバクテ
リウム属細菌、および従来ブレビバクテリウム属に分類
されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合
されたブレビバクテリウム属細菌、さらにコリネバクテ
リウム属細菌と非常に近縁なブレビバクテリウム属及び
ミクロバクテリウム属細菌を含む。
能を有し、かつ、ホスホセリンホスファターゼ活性又は
ホスホセリントランスアミナーゼ活性が増強されたコリ
ネ型細菌である。このようなコリネ型細菌は、例えばL
−セリン生産能を有するコリネ型細菌細胞内のホスホセ
リンホスファターゼをコードする遺伝子(以下、「se
rB」ともいう)又はホスホセリントランスアミナーゼ
をコードする遺伝子(以下、「serC」ともいう)の
コピー数を高めることによって得られる。また、本発明
のコリネ型細菌は、ホスホセリンホスファターゼ活性又
はホスホセリントランスアミナーゼ活性が増強されたコ
リネ型細菌に、L−セリン生産能を付与することによっ
ても取得することができる。
しては、L−セリン解能を欠失したコリネ型細菌、L−
セリンアナログに耐性なコリネ型細菌、またはL−セリ
ン解能を欠失しかつ、L−セリンアナログに耐性なコリ
ネ型細菌が挙げられる。本発明においてL−セリンアナ
ログとしては、アザセリンまたはβ−(2−チエニル)
−DL−アラニンが挙げられる。
ン生産能を有するコリネ型細菌、さらに好ましくは同細
菌のうちL−セリン分解能を欠失しているコリネ型細菌
は、野生型あるいはL−セリン生産能を有するコリネ型
細菌を親株として人工的に変異、誘導される。
ン分解能を欠失しL−セリン生産能を有するコリネ型細
菌の採取は、例えば次のようにして行うことができる。
すなわち親株としてブレビバクテリウム フラバム A
TCC14067を通常の方法で変異処理(N−メチル
−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジンへの接触等)
に付して、L−セリン分解能を欠失した変異株を得、さ
らにこの変異株を親株としてL−セリンアナログ、例え
ばアザセリンまたはβ−(2−チエニル)−DL−アラ
ニン耐性菌を採取する。また、親株からL−セリンアナ
ログに対する耐性菌を取得した後に、L−セリン分解能
を欠失した変異株を得てもよい。このような方法により
得られた変異株の中にL−セリンを高濃度で蓄積する菌
株が得られる。L−セリンアナログに対する耐性菌は、
後述する変異型serAを親株またはL−セリン分解能
を欠失した変異株に導入することによっても、得られう
る。
ンアナログを含有する培地において野生株よりも速い生
育を示す性質をいう。具体的には例えば、アザセリン耐
性とは、アザセリンを含有する培地において野生株より
も速い生育を示す性質をいうが、例えば、0.25g/
Lのアザセリンを含有する固体培地上で、30℃、4〜
5日でコロニーを形成できる株はアザセリン耐性を有す
る。
ニン耐性とは、β−(2−チエニル)−DL−アラニン
を含有する培地において野生株よりも速い生育を示す性
質をいうが、例えば、β−(2−チエニル)−DL−ア
ラニン耐性とは、β−(2−チエニル)−DL−アラニ
ンを含有する培地において野生株よりも速い生育を示す
性質 をいうが、例えば、0.25g/Lのβ−(2−
チエニル)−DL−アラニンを含有する固体培地上で、
30℃、4〜5日でコロニーを形成できる株はβ−(2
−チエニル)−DL−アラニン耐性を有する。
はホスホセリントランスアミナーゼ活性の増強について
説明する。ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホ
セリントランスアミナーゼ活性の増強は、serB又は
serCを、それぞれ発現可能な形態でコリネ型細菌に
導入することによって行うことができる。これは、各々
の酵素をコードする各々の遺伝子を別々のプロモーター
により強制発現させる手法でも、あるいは、一つのプロ
モーターの制御下で両遺伝子を強制発現させることでも
可能である。また、これらの遺伝子がプラスミド上にあ
る場合でも、あるいは、染色体上に存在する場合であっ
ても、これらの遺伝子のプロモーター等の発現調節配列
を強化することによって、又は翻訳効率を改善すること
によって、発現を強化してもよい。あるいは、染色体上
の遺伝子数を増幅することによっても酵素活性を増強す
ることができる。更に、比活性を上昇させた改変酵素を
コードするように変化させたホスホセリンホスファター
ゼ又はホスホセリントランスアミナーゼをコードする遺
伝子を用いることによって、これらの酵素活性の増強は
達成される。
入するには、serB又はserCを含むDNA断片
を、コリネ型細菌で機能するベクターと連結して組み換
えDNAを作製し、これをL−セリン生産能を有するコ
リネ型細菌宿主に導入して形質転換すればよい。形質転
換株の細胞内のserB又はserCのコピー数が上昇
する結果、ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホ
セリントランスアミナーゼ活性が増幅される。また、コ
リネ型細菌に、serB及びserCの両方を含む組み
換えDNAを導入すれば、又はserBを含む組み換え
DNA及びserCを含む組み換えDNAの両DNAを
導入すれば、ホスホセリンホスファターゼ活性及びホス
ホセリントランスアミナーゼ活性がともに増幅される。
であり(serB:GenBank;X03046 M
30784、serC:GenBank;D9072
8)、それらの塩基配列に基づいてプライマーを合成
し、エシェリヒア・コリ又はブレビバクテリウム フラ
バム等の微生物の染色体DNAを鋳型にしてPCR法に
より、これらの微生物のserB遺伝子又はserC遺
伝子を取得することが可能である。このようなプライマ
ーとして、配列表配列番号15〜18に示す塩基配列を
有するプライマーが挙げられる。
シェリヒア コリ及び/又はコリネ型細菌の細胞内にお
いて自律複製可能なベクターDNAに接続して組み換え
DNAを調製し、これをエシェリヒア コリ細胞に導入
しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア
コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、
プラスミドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自律複
製可能なものが好ましく、例えば pUC19、pUC
18、pBR322、pHSG299、pHSG39
9、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。
serB遺伝子及びserC遺伝子を、それぞれ別個の
ベクターに搭載してコリネ型細菌に導入する場合は、異
なるマーカー遺伝子を有する2つのベクターを用いるこ
とが好ましい。
(WO02/02627国際公開パンフレット、WO9
3/18151国際公開パンフレット、欧州特許公開0
445385号、特開平6−46867号、Verte
s, A. A. et al., Mol. Mic
robiol., 11, 739−746 (199
4)、Bonamy, C., et al., Mo
l. Microbiol., 14, 571−58
1 (1994)、Vertes, A. A.et
al., Mol. Gen. Genet., 24
5, 397−405 (1994)、Jagar,
W. et al., FEMS Microbiol
ogy Letters, 126, 1−6 (19
95)、特開平7−107976号、特開平7−327
680号等)やファージベクター、染色体組み換え(E
xperiments in Molecular G
enetics,Cold Spring Harbo
r Laboratorypress(1972);M
atsuyama,S. and Mizushim
a,S.,J.Bacteriol.,162,119
6(1985))等を利用することによっても行うこと
ができる。
でプラスミドを自律複製可能にする能力をもつDNA断
片を挿入すると、エシェリヒア コリ及びコリネ型細菌
の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとし
て使用することができる。このようなシャトルベクター
としては、以下のものが挙げられる。なお、それぞれの
ベクターを保持する微生物及び国際寄託機関の寄託番号
をかっこ内に示した。
ようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリ
ゾチーム及びSDSを用いて溶菌し、30000×gで
遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリ
コールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロ
マイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
て形質転換するには D.M.Morrisonの方法
(Methods in Enzymology, 6
8,326, 1979)あるいは受容菌細胞を塩化カ
ルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法(Man
del,M. and Higa,A.,J.Mo
l.,Biol.,53,159(1970))等によ
り行うことができる。
転換するには、電気パルス法(杉本ら、特開平2−20
7791号 公報)によって行うことができる。
しては、例えば次のような野生株が挙げられる。 コリネバクテリウム アセトアシドフィルム ATCC13870 コリネバクテリウム アセトグルタミカム ATCC15806 コリネバクテリウム カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム グルタミカム ATCC13032 (ブレビバクテリウム ディバリカタム) ATCC14020 (ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム)ATCC13869 (コリネバクテリウム リリウム) ATCC15990 (ブレビバクテリウム フラバム) ATCC14067 コリネバクテリウム メラセコーラ ATCC17965 ブレビバクテリウム サッカロリティクム ATCC14066 ブレビバクテリウム インマリオフィルム ATCC14068 ブレビバクテリウム ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム チオゲニタリス ATCC19240 ミクロバクテリウム アンモニアフィラム ATCC15354 コリネバクテリウム サーモアミノゲネス AJ12340 (FERM BP−1539 )
ホセリントランスアミナーゼ活性の増幅は、serB遺
伝子又はserC遺伝子を上記宿主の染色体DNA上に
多コピー存在させることによっても達成できる。コリネ
型細菌の染色体DNA上にserB遺伝子又はserC
遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多
コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより
行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列として
は、レペッティブDNA、転移因子の端部に存在するイ
ンバーティッド・リピートが利用できる。あるいは、特
開平2−109985号公報に開示されているように、
serB遺伝子又はserB遺伝子をトランスポゾンに
搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導
入することも可能である。いずれの方法によっても形質
転換株内のserB遺伝子又はserC遺伝子のコピー
数が上昇する結果、ホスホセリンホスファターゼ活性又
はホスホセリントランスアミナーゼ活性が増幅される。
ホセリントランスアミナーゼ活性の増幅は、上記の遺伝
子増幅による以外に、serB遺伝子又はserC遺伝
子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換
することによっても達成される。たとえば、lacプロ
モーター、trpプロモーター、trcプロモーター、
tacプロモーター、ラムダファージのPRプロモータ
ー、PLプロモーター等が強力なプロモーターとして知
られている。これらのプロモーターへの置換により、s
erB遺伝子又はserC遺伝子の発現が強化されるこ
とによってホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホ
セリントランスアミナーゼ活性が増幅される。
L−セリン生産能を有し、かつ、ホスホセリンホスファ
ターゼ活性又はホスホセリントランスアミナーゼ活性が
増強されたコリネ型細菌において、さらにL−セリンに
よるフィードバック阻害が解除されたD−3−ホスホグ
リセレートデヒドロゲナーゼ(以下、「3−PGDH」
ともいう)をコードする遺伝子が導入された菌株であ
る。
ジヌクレオチド(NAD)を補酵素として、3−ホスホ
グリセレートが3−ホスホヒドロキシピルビン酸に酸化
される反応を触媒する。
はL−セリンによるフィードバック阻害を受け、10m
MのL−セリン存在下ではその活性がほぼ完全に阻害さ
れる。L−セリンによるフィードバック阻害が解除され
た3−PGDHとは、10mMのL−セリン存在下でも
L−セリン非存在下における活性の20%以上、好まし
くは40%以上、さらに好ましくは90%以上の活性を
有する3−PGDHをいう。後述の実施例に示されるブ
レビバクテリウム フラバムAJ13327由来の3−
PGDHは80mMのL−セリン存在下で活性をほぼ1
00%維持しており、最も好ましい3−PGDHの一つ
である。L−セリンによるフィードバック阻害が解除さ
れた3−PGDHをコードする遺伝子は、L−セリンア
ナログに耐性なコリネ型細菌、例えば後述の実施例で得
られたブレビバクテリウム フラバムのアザセリン耐性
株AJ13327の染色体DNAから調製することがで
きる。
(以下、これをコードするDNAを「野生型serA」
ともいう)は配列表の配列番号12記載のアミノ酸配列
を有する。L−セリンによるフィードバック阻害が解除
された3−PGDH(以下、これをコードするDNAを
「変異型serA」ともいう)として具体的には、配列
表配列番号12に記載されるアミノ酸配列、または同配
列に1または複数のアミノ酸置換、付加または欠失が生
じたアミノ酸配列を有するD−3−ホスホグリセレート
デヒドロゲナーゼにおいて、配列番号12に記載される
アミノ酸配列の325番目のグルタミン酸残基に相当す
るアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したことを特
徴とするD−3−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ
が挙げられる。同他のアミノ酸残基として最も好ましい
ものはリジン残基である。
NA断片を単離するには、例えば、斎藤、三浦の方法
(H.Saito and K.Miura Bioc
hem.Biophys.Acta, 72,619,
(1963))等により染色体DNAを調製し、ポリメ
ラーゼチェインリアクション法(PCR:polyme
rase chain reaction; Whit
e,T.J. et al ;Trends Gene
t. 5,185(1989)参照)により、serA
遺伝子を増幅することによって行うことができる。例え
ば、配列表配列番号11のORF(172〜1705)
を含むDNA断片を増幅できるよう、配列表の1番目の
塩基からATG直前の塩基の範囲から任意に20〜30
塩基を選択してプライマーの一つとする。また、終始コ
ドン直下流の塩基から配列表の最後の塩基に至る範囲か
ら任意に20〜30塩基を選択してプライマーのもう一
つとする。
serAを単離すれば野生型serAが得られ、L−セ
リンによるフィードバック阻害が解除された3−PGD
Hを保持する変異株(3−PGDH変異株)からser
Aを単離すれば変異型serAが得られる。具体的に
は、野生型serAは配列表の配列番号11に記載され
る配列を有し、変異型serAは配列番号13に記載さ
れる配列を有する。変異型serAをコリネ型細菌に導
入するには、前記serB又はserCの導入と同様に
して、変異型serAを含む組み換えベクターでコリネ
型細菌を形質転換すればよい。変異型serAは、多コ
ピーで導入することが好ましい。変異型serAとse
rB又はserCは、単一のベクターにそれぞれ搭載し
てもよいし、別個の2種類又は3種類のベクターにそれ
ぞれ搭載してもよい。
るには次のような方法が用いられる。使用する培地とし
ては、炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてア
ミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を適宜含有する通
常の液体培地が使用される。炭素源としては、グルコー
ス、シュークロース、フラクトース、ガラクトース等の
糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜
菜糖蜜、ハイテストモラセス、さらには酢酸等の有機
酸、エタノール等のアルコール類、グリセリン等も使用
される。窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的
に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解
液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、コーンスティ
ープリカー、酵母または酵母エキス、ペプトン等のペプ
チド類等が使用される。無機イオンとしてはリン酸イオ
ン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、鉄イオ
ン、マンガンイオン等が適宜添加される。また本発明の
微生物にアミノ酸等の要求性物質がある場合には、その
要求物質を添加しなければならない。
〜40℃の範囲で好気的条件下で行われる。培養液のp
Hは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらに
は尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって
上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。
えば菌体を分離除去し、イオン交換樹脂処理あるいは濃
縮冷却晶析法、膜分離法、その他公知の方法を組み合わ
せることにより行われる。不純物を除くためには常法の
活性炭吸着法及び再結晶法を用いて精製してもよい。
テリウム フラバムAJ13324およびAJ1332
7の構築 ブレビバクテリウム フラバムAJ13324およびA
J13327は野生型株ブレビバクテリウム フラバム
ATCC 14067から得られたL−セリンの分解
能が欠失したブレビバクテリウム フラバム AJ13
377から構築された。
肉エキス1g、ポリペプトン1g、酵母エキス0.5
g、食塩0.5gを水1Lに含みpH7.0に調整した
培地)で一昼夜増殖させた菌体を、100mMリン酸緩
衝液(pH7.0)に懸濁し(1ml当たり109−1
010個の菌体を含む)、これに200μg/ml濃度と
なるようにNG(N−メチル−N’−ニトロ−N−ニト
ロソグアニジン)を加えて30℃で30分間保持した。
このようにしてNG処理した菌体を同緩衝液で十分洗浄
した。
ない菌株を選択するためには、洗浄したブレビバクテリ
ウム フラバム ATCC 14067のNG菌体をブ
イヨン寒天培地に塗布し、30℃、24時間培養してコ
ロニーを形成させた。次にブイヨン寒天培地のコロニー
を原版にして、最少培地と選択用最少培地にレプリカを
行い、最少培地で生育し選択用最少培地で生育しない菌
株を探した。最少培地は純水1L当たりグルコース20
g、硫酸アンモニウム1g、リン酸2水素カリウム1
g、尿素2.5g、硫酸マグネシウム・7水和物0.4
g、硫酸鉄(II)・7水和物0.01g、硫酸マンガ
ン・4〜5水和物0.01g、ビオチン50μg、塩酸
チアミン200μg、ニコチン酸アミド200μg、寒
天2.0gを含有する培地で、選択用最少培地は、純粋
1L当たり硫酸アンモニウム1g、リン酸2水素カリウ
ム1g、尿素2.5g、硫酸マグネシウム・7水和物
0.4g、硫酸鉄(II)・7水和物0.01g、硫酸
マンガン・4〜5水和物0.01g、ビオチン50μ
g、塩酸チアミン200μg、ニコチン酸アミド200
μg、L−セリン0.5g、寒天2.0gを含有する培
地であった。このような方法で得られた変異株の中に
は、L−セリンの分解能がない菌株が多く見いだされ、
その1株としてブレビバクテリウム フラバム AJ1
3377を取得した。
377を親株にして、NG処理した菌株からアザセリン
耐性株を選択するため、洗浄したブレビバクテリウム
フラバム AJ13377のNG処理菌体を選択用最少
培地に接種した。選択用最少培地は純水1L当たりグル
コース20g、硫酸アンモニウム1g、リン酸2水素カ
リウム1g、尿素2.5g、硫酸マグネシウム・7水和
物0.4g、硫酸鉄(II)・7水和物0.01g、硫
酸マンガン・4〜5水和物0.01g、ビオチン50μ
g、塩酸チアミン200μg、ニコチン酸アミド200
μg、アザセリン250mgを含有する培地である。N
G処理変異株を同培地上で30℃で5〜10日間培養し
た。このようにして得られた菌液をブイヨン寒天培地に
塗布し、30℃、24時間培養しコロニーを形成させ
た。コロニーを形成する株の中からアザセリンに耐性な
菌株を取得した。得られた変異株の中には、高収率で著
量のL−セリンを蓄積する菌株が多く見いだされ、それ
らよりブレビバクテリウムフラバム AJ13324お
よびAJ13327の2株を取得した。本菌株らは0.
25g/Lのアザセリン存在下で生育可能であることを
確認した。
バクテリウム フラバムAJ13325の構築 ブレビバクテリウム フラバムAJ13325は野生型
株ブレビバクテリウムフラバム ATCC 14067
から得られたL−セリンの分解能が欠失したブレビバク
テリウム フラバム AJ13377から構築された。
377を親株にして、NG処理した菌株からβ−(2−
チエニル)−DL−アラニン耐性株を選択するため、洗
浄したブレビバクテリウム フラバム AJ13377
のNG処理菌体を選択用最少培地に接種した。選択用最
少培地は純水1L当たりグルコース20g、硫酸アンモ
ニウム1g、リン酸2水素カリウム1g、尿素2.5
g、硫酸マグネシウム・7水和物0.4g、硫酸鉄(I
I)・7水和物0.01g、硫酸マンガン・4〜5水和
物0.01g、ビオチン50μg、塩酸チアミン200
μg、ニコチン酸アミド200μg、β−(2−チエニ
ル)−DL−アラニン250mgを含有する培地であ
る。NG処理変異株を同培地上で30℃で5〜10日間
培養した。このようにして得られた菌液をブイヨン寒天
培地に塗布し、30℃、24時間培養しコロニーを形成
させた。コロニーを形成する株の中からβ−(2−チエ
ニル)−DL−アラニンに耐性な菌株を取得した。得ら
れた変異株の中には、高収率で著量のL−セリンを蓄積
する菌株が多く見いだされ、その1株としてブレビバク
テリウム フラバム AJ13325を取得した。本菌
株は0.25g/Lのβ−(2−チエニル)−DL−ア
ラニン存在下で生育可能であることを確認した。
テリウム フラバムAJ13324、AJ13325お
よびAJ13327によるL−セリンの生産 ブレビバクテリウム フラバムAJ13324、AJ1
3325およびAJ13327をブイヨン寒天培地で3
0℃、24時間培養し、次いで表1の組成の発酵培地2
0mlを含有する500ml振とうフラスコに白金耳で
接種した。対照として親株であるブレビバクテリウム
フラバム ATCC14067およびAJ13377を
同様に接種した。培地は水酸化カリウムでpH7.0に
調整後115℃、15分間オートクレーブ殺菌した。殺
菌冷却後、180℃、3時間乾熱殺菌した炭酸カルシウ
ム5g/L添加した。
体クロマトグラフィー(日立L−8500アミノ酸分析
装置)によって行った。その結果、ブレビバクテリウム
フラバム AJ13324、AJ13325およびA
J13327はL−セリンをそれぞれ15.2g/L、
14.3g/L、15.4g/L 培地中に蓄積した。
一方、対照として培養したブレビバクテリウム フラバ
ム ATCC14067およびAJ13377のL−セ
リン蓄積量はそれぞれ0g/L、5.0g/Lであっ
た。
324の培養液は遠心分離後、定法によりカチオン交換
樹脂による脱塩処理を行い、その後カチオン交換樹脂及
びアニオン交換樹脂によるクロマト分離を用いて副生物
を除き、晶析処理による精製を行い、99%以上の純度
のL−セリン結晶をブロスからの収率55%で得た。
13325およびAJ13327をブイヨン寒天培地で
30℃、24時間培養し、次いで表2の組成の接種用培
地50mlを含有する500ml振とうフラスコの中に
白金耳で接種した。対照として親株であるブレビバクテ
リウム フラバム ATCC14067、AJ1337
7を同様に接種した。接種用培地は水酸化ナトリウムで
pH5.5に調整し、115℃、15分間オートクレー
ブ殺菌した後使用した。
た後、生理食塩水で2度洗浄し、2mMのジチオスレイ
トールを含む50mMリン酸ナトリウムバッファー p
H7.0で懸濁した。氷冷後、超音波破砕機で菌体を破
砕し、破砕液を超遠心分離機にかけた。超遠心は45,
000rpmで1時間行い、粗酵素液を得た。
h H.J.らの方法(Method in enzy
mology v9,216−220,1966)に従
った。
5M NAD 0.4ml、0.25M EDTA(p
H9 NaOH)0.12ml、0.05M Glut
athione(pH6 KOH)0.1ml、1M
Hydradine(pH9Acetate)0.5m
l、1M Tris(pH9 HCl)0.6ml、適
当な濃度のL−セリン(0〜40mM)を加え、水を加
えて2.3mlに調整し、その後粗酵素液を0.2ml
加え、5分間保温し、0.1M 3−PGA(3−ホス
ホグリセリン酸二ナトリウム塩、pH7 NaOH)を
0.5ml加え、撹拌後340nmの吸光度を30秒間
測定した。反応は25℃で行った。
ectrophotometerを使用した。
CC14067に比べAJ13377はL−セリンに対
する感受性が緩和されていた。AJ13324では更に
感受性が緩和されており、AJ13325もほぼ同等で
あった。AJ13327では感受性が大幅に緩和され8
0mMのL−セリン存在下でも阻害は完全に解除されて
いた。
除についてはエシェリヒア コリの例(トサ(Tos
a)及びピッツア(Pizer)、J. Bacter
iol.106:972〜982(1971)、又は特
表平6−510911)があるが、これほど高濃度のL
−セリンの存在下で阻害が完全解除されている例はな
い。
び変異型serAのクローニング 実施例4で示されたように、AJ13327ではL−セ
リンによるフィードバック阻害が完全に解除されてい
た。そこで、ATCC14067由来の野生型、及びA
J13327由来の変異型3−PGDHをコードするs
erA遺伝子をクローニングして、変異点を明らかに
し、また3−PGDHの増幅効果を確認することとし
た。
りPCR法を用いてserAを増幅するためには対応す
るプライマーを作製しなければならない。ブレビバクテ
リウムのserA遺伝子のクローニング及び塩基配列に
ついては報告されていないため、コリネバクテリウム由
来のserAの配列を利用することとした。コリネバク
テリウム由来のserA断片がクローニングされている
菌株コリネバクテリウム グルタミカム K82(FE
RM BP−2444、特開平3−7591号公報参
照)からWizard Minipreps DNA
Purification System(Prome
ga社製)を使用してプラスミド pDTS9901を
抽出し、制限酵素BamHI(宝酒造(株)製)でse
rAを含む約1.4kbのDNA断片を切り出した。
は、新規に構築したコリネ型細菌用クローニングベクタ
ーpVK7を用いた。pVK7は、以下のようにして、
エシェリヒア コリ用ベクターであるpHSG299
(Kmr;Takeshita, S. et a
l., Gene, 61, 63−74, (198
7)、特開平10−215883号参照)にブレビバク
テリウム ラクトファーメンタムのクリプティックプラ
スミドであるpAM330を結合することによって構築
した。pHSG299を一箇所切断酵素であるAvaI
I(宝酒造(株)製)にて切断し、T4DNAポリメラ
ーゼにて平滑末端化したのち、HindIII(宝酒造
(株)製)にて切断し、T4DNAポリメラーゼにて平
滑末端化したpAM330と接続した。pHSG299
に対するpAM330の挿入方向により、生成した2種
類のプラスミドをpVK6、pVK7と命名し、pVK
7を以下の実験に用いた。pVK7は、エシェリヒア
コリ及びブレビバクテリウム ラクトファーメンタムの
細胞中で自律複製可能であり、かつ、pHSG299由
来のマルチプルクローニングサイトとlacZ’を保持
している。pVK6及びpVK7の構築の過程を図2に
示す。
rAを含む約1.4kbのDNA断片を接続した。pD
TS9901を制限酵素BamHI(宝酒造(株)製)
にて切断し、同じく制限酵素BamHIにて切断したp
VK7と接続した。DNAの接続はDNAライゲーショ
ンキット(宝酒造(株)製)を用い、指定された方法に
て行った。
イクラー MP型(宝酒造(株)製)を用い、Dye
Terminator Cycle Sequenci
ngFS Ready Reaction Kit(P
ERKIN ELMER社製)を使用した。DNAプラ
イマーとしてはM13(−21)、RVプライマー(宝
酒造(株)製)を使用した。得られた配列を配列表の配
列番号1に示す。この配列によってコードされ得るアミ
ノ酸配列を配列番号2に示す。
合成し、ブレビバクテリウム フラバム変異株AJ13
327の染色体DNAを鋳型にしてPCR法によりse
rAを増幅した。ここで遺伝子増幅に用いるために合成
したN末側のDNAプライマーの配列を配列表の配列番
号3に、C末側を配列番号4に示す。
NAの調製にはGenomic DNA Purifi
cation Kit(Bacterial)(Adv
anced Genetic Technologie
s Corp.製)を使用し、調製方法は添付のプロト
コールに従った。
ー MP型(宝酒造(株)製)を用い、TaKaRa
Taq(宝酒造(株)製)を使用した。
loning Kit(Invitrogen社製)を
使用して直接プラスミドpCR2.1ベクターにライゲ
ーションして、INVαF’のCompetent C
ellを用いて形質転換を行い、X−Gal(5−ブロ
モ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシ
ド)40μg/mlおよびカナマイシン25μg/ml
を含むL培地(バクトトリプトン10g/L、バクトイ
ーストエキストラクト5g/L、NaCl15g/L、
寒天15g/L)に塗布し、一晩培養後、出現した白色
のコロニーをつり上げ、単コロニー分離して、形質転換
株を得た。
R法によりserA断片の挿入が確認できたものについ
ては制限酵素EcoRI処理を行いシャトルベクター
pVK7につなぎかえた。これの塩基配列を決定したと
ころC末端側には完全長の配列が含まれていないと考え
られた。得られた配列は配列表の配列番号13の、5’
側はさらに277塩基上流、3’側は1134番目の塩
基までにあたる。
ため、TaKaRa LA PCRin vitro
Cloning Kit(宝酒造(株)製)を使用し、
添付のプロトコールに従ってブレビバクテリウム フラ
バムAJ13327の染色体DNAから欠損部分のクロ
ーニングを行った。
素で完全消化し、ライゲーション反応によりこれらにそ
れぞれ対応する制限酵素サイトを持つカセットを連結し
た。カセットプライマー(C1)(配列表配列番号5)
と、DNA上の既知領域に相補的なプライマー(S1)
(配列表配列番号6)を用いて1回目のPCRを行っ
た。反応液の一部を用いて、内側のプライマーC2(配
列表配列番号7)とS2(配列表配列番号8)で2回目
のPCRを行い、目的のDNAのみを増幅させた。
製)を使用した際に目的DNAの増幅が確認され、この
PCR産物の塩基配列を直接決定した。得られた塩基配
列に基づきC末側をコードするプライマーを作製し、野
生型としてブレビバクテリウム フラバム ATCC1
4067、変異型としてAJ13327からserA全
長を含む断片の取得を行った。ここで使用したN末側の
DNAプライマーの配列を配列表の配列番号9に、作製
したC末側のDNAプライマーの配列を配列表の配列番
号10に示す。
A全長を含む遺伝子断片をOriginalTA Cl
oning Kit(Invitrogen社製)を用
いて、EcoRI切断したシャトルベクターpVK7に
接続した。各遺伝子断片を搭載したプラスミドを各々作
製し、塩基配列の決定を行った。野生型の配列を配列表
の配列番号11に、変異型の配列を配列表の配列番号1
3に示す。これらの配列によってコードされ得るアミノ
酸配列を配列番号12及び14にそれぞれ示す。決定し
たこれらの塩基配列を比較したところ変異型serAで
は1087番目のGがAに変異しており、この結果アミ
ノ酸配列では325番目のグルタミン酸がリジンに変化
していることが確認された。
ラスミドのブレビバクテリウム フラバムへの導入 野生型serA又は変異型serAを搭載したプラスミ
ドをブレビバクテリウム フラバム AJ13377に
それぞれ導入した。プラスミドの導入の方法は、電気パ
ルス法(杉本ら、特開平2−207791号公報)によ
った。形質転換体の選択は25μg/mlのカナマイシ
ンを含む完全培地にて行った。
の生産 野生型serA又は変異型serA全長を含む遺伝子断
片を搭載したプラスミドが導入された形質転換体をそれ
ぞれ実施例3に従い500ml振とうフラスコを用いて
培養し、生産物であるL−セリンの測定を行った。対照
として宿主であるAJ13377株についても同様に培
養を行った。野生型serAを導入した形質転換体では
L−セリン生産能に影響は認められなかったが、変異型
serAを導入した形質転換体ではL−セリン生産能の
向上が確認された(表3)。
77は、平成9年10月15日に、通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所(茨城県つくば市東1丁目1
番3号)に寄託され、受託番号FERM P−1647
1が付与され、平成10年11月20日にブダペスト条
約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERMBP
−6576が付与されている。また、変異型serAを
含むプラスミドをブレビバクテリウム フラバムATC
C14067に保持させた。同プラスミド保持株は、ブ
レビバクテリウム フラバムAJ13378と命名され
て、平成9年10月15日に、通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所(茨城県つくば市東1丁目1番3
号)に寄託されており、受託番号FERM P−164
72が付与され、平成10年11月20日にブダペスト
条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM
BP−6577が付与されている。
ムL−セリン生産菌におけるserB及び/又はser
Cの増幅 (1)serB又はserCを発現するプラスミドの構
築 serBを発現するプラスミドpSB及びserCを発
現するプラスミドpSCを、図3及び図4に示すように
して構築した。
基配列(GenBank;X03046,M3078
4)を基にプライマーを作製(N末側配列表の配列番号
15、C末側を配列番号16に示す)し、また、ser
C遺伝子の取得については、既知である塩基配列(Ge
nBank;D90728)を基にプライマーを作製
(N末側配列表の配列番号17、C末側を配列番号18
に示す)して、エシェリヒア・コリJM109の染色体
DNAを鋳型としてPCRを行い、serBをコードす
るORFを含む遺伝子断片(1197bp)、及びse
rCをコードするORFを含む遺伝子断片(1380b
p)を取得した。配列番号15及び16に示す塩基配列
は、GenBank;X03046,M30784の配
列中の塩基番号1197〜1175、1〜23にそれぞ
れ対応し、配列番号17及び18に示す塩基配列は、G
enBank;D90728の配列中の塩基番号132
05〜13227、14584〜14562にそれぞれ
対応する。
ー型ベクターであるpHSG399のSmaI部位に挿
入し、p399Bを得た。このプラスミドをコリネバク
テリウム属細菌中で自律複製可能にするために、pHM
1519由来の複製開始起点を保持するpBK4から複
製開始起点(以下、「Brev.−ori」と記す)を
切り出し、p399Bに挿入し、pSBを得た(図
3)。pBK4は、以下のようにして作製した。Bre
v.−oriを含むプラスミドpHCを、同プラスミド
を保持するエシェリヒア・コリAJ12617(FER
M BP−3532)より調製し、KpnI(宝酒造
(株)製)及びBamHI(宝酒造(株)製)で切断
し、Brev.−ori断片を抽出した後、末端を平滑
化した。末端の平滑化は、DNA Blunting
Kit(宝酒造(株)製)を用い、指定された方法にて
行った。その後、リン酸化済みBamHIリンカー(宝
酒造(株)製)を接続し、BamHIにて再切断後に、
同じくBamHIにて切断したpHSG298に接続
し、pBK4を得た。pBK4は、BamHIによりB
rev.−ori断片を切り出すことができる。
pt SK(+)のSrfI部位に挿入し、pScri
pt−serCを得た。得られたプラスミドのSacI
部位にPstIリンカーを挿入した後、serC断片を
PstIで切り出し、pHSG399のPstI部位に
挿入し、p399Cを得た。pHM1519由来の複製
開始起点を保持するpBK4から複製開始起点を切り出
し、p399Cに挿入し、pSCを得た(図4)。
ラスミドの構築 次に、serB及びserCを発現するプラスミドpB
C8及びpBC14を作製した(図5)。前記pScr
ipt−serCのserC断片の外側に存在するSa
cI部位にPstIリンカーを挿入してPstI部位を
導入した。このプラスミドをPstI処理してserC
断片を切り出し、serB搭載プラスミドpSBのPs
tI部位に挿入した。塩基配列の確認を行い、serC
断片がlacZに対して逆方向に挿入されたプラスミド
をpBC8、順方向に挿入されたプラスミドをpBC1
4とした。
L−セリンの生産 上記で作製したプラスミドpSB、pSC及びpBC8
を用いて、それぞれブレビバクテリウム フラバムの野
生株ATCC14067を形質転換し、得られた形質転
換体からプラスミドを抽出してL−セリン生産能を有す
るブレビバクテリウム フラバムAJ13377及びA
J13327を形質転換した。また、pBC8を保持す
るAJ13377及びAJ13327を、ブレビバクテ
リウムフラバムAJ13378(FERM P−164
72)が保持する変異型serAを搭載したプラスミド
で形質転換した。
ラムフェニコールを含む寒天培地で培養し、形成したコ
ロニーについて実施例3と同様に培養して、培地中に蓄
積されたL−セリンの量を測定した。尚、変異型ser
Aを搭載したプラスミドを保持する形質転換株は、培地
に25mg/Lのカナマイシンを添加して培養した。結
果を表3に示す。
増幅によって、L−セリン蓄積量が増加した。また、s
erB及びserCの両遺伝子を増幅することによっ
て、L−セリン蓄積量はさらに増加した。さらに、変異
型serA遺伝子を併せて増幅すると、一層L−セリン
蓄積量が増加した。尚、pBC8の代わりにpBC14
を用いても、同様の結果が得られた。
リン生産能を有するコリネ型細菌宿主として、ブレビバ
クテリウム フラバムのL−セリン分解能欠失株(AJ
13377)、またはL−セリン分解能を欠失したアザ
セリン耐性株(AJ13327)を用いたが、他のアザ
セリン耐性株(AJ13324)またはL−セリン分解
能を欠失したβ−(2−チエニル)−DL−アラニン耐
性株(AJ13325)を用いてもよい。
するコリネ型細菌が提供される。同コリネ型細菌は、工
業的に有利なL−セリンの製造法に利用することができ
る。
フィードバック阻害の様子を示す。横軸は、酵素液中に
存在するL−セリンの濃度を示す。縦軸は、L−セリン
が存在しない時の3−PGDH活性に対する、L−セリ
ンが存在するときの3−PGDH活性を百分率で示す。
◆はATCC14067株由来の3−PGDHがL−セ
リンによって受けるフィードバック阻害の様子を示す。
■はAJ13377株由来の3−PGDHがL−セリン
によって受けるフィードバック阻害の様子を示す。▲は
AJ13324株由来の3−PGDHがL−セリンによ
って受けるフィードバック阻害の様子を示す。×はAJ
13325株由来の3−PGDHがL−セリンによって
受けるフィードバック阻害の様子を示す。*はAJ13
327株由来の3−PGDHのがL−セリンによって受
けるフィードバック阻害の様子を示す。
図。
図。
pBC8及びpBC14の構築図。
ニン耐性とは、β−(2−チエニル)−DL−アラニン
を含有する培地において野生株よりも速い生育を示す性
質をいうが、例えば、0.25g/Lのβ−(2−チエ
ニル)−DL−アラニンを含有する固体培地上で、30
℃、4〜5日でコロニーを形成できる株はβ−(2−チ
エニル)−DL−アラニン耐性を有する。
ー型ベクターであるpHSG399のSmaI部位に挿
入し、p399Bを得た。このプラスミドをコリネバク
テリウム属細菌中で自律複製可能にするために、pHM
1519由来の複製開始起点を保持するpBK4から複
製開始起点(以下、「Brev.−ori」と記す)を
切り出し、p399Bに挿入し、pSBを得た(図
3)。pBK4は、以下のようにして作製した。Bre
v.−oriを含むプラスミドpHC4を、同プラスミ
ドを保持するエシェリヒア・コリAJ12617(FE
RM BP−3532)より調製し、KpnI(宝酒造
(株)製)及びBamHI(宝酒造(株)製)で切断
し、Brev.−ori断片を抽出した後、末端を平滑
化した。末端の平滑化は、DNA Blunting
Kit(宝酒造(株)製)を用い、指定された方法にて
行った。その後、リン酸化済みBamHIリンカー(宝
酒造(株)製)を接続し、BamHIにて再切断後に、
同じくBamHIにて切断したpHSG298に接続
し、pBK4を得た。pBK4は、BamHIによりB
rev.−ori断片を切り出すことができる。
Claims (7)
- 【請求項1】 L−セリン生産能を有し、かつ、ホスホ
セリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスア
ミナーゼ活性の少なくとも一方が増強されたコリネ型細
菌。 - 【請求項2】 ホスホセリンホスファターゼ活性及びホ
スホセリントランスアミナーゼ活性の両方が増強された
請求項1記載のコリネ型細菌。 - 【請求項3】 L−セリン分解能を欠失したことにより
L−セリン生産能を有する請求項1記載のコリネ型細
菌。 - 【請求項4】 L−セリンアナログに耐性を有すること
によりL−セリン生産能を有する請求項1又は3記載の
コリネ型細菌。 - 【請求項5】 前記ホスホセリンホスファターゼ活性又
はホスホセリントランスアミナーゼ活性の増強が、前記
コリネ型細菌細胞内のホスホセリンホスファターゼをコ
ードする遺伝子又はホスホセリントランスアミナーゼを
コードする遺伝子のコピー数を高めることによるもので
ある請求項1記載のコリネ型細菌。 - 【請求項6】 L−セリンによるフィードバック阻害が
解除されたD−3−ホスホグリセレートデヒドロゲナー
ゼをコードする遺伝子が導入された請求項1〜5のいず
れか一項に記載のコリネ型細菌。 - 【請求項7】 請求項1〜6のいずれか一項に記載のコ
リネ型細菌を培地に培養し、培地中にL−セリンを蓄積
させ、培地中から当該L−セリンを回収することを特徴
とするL−セリンの製造法。
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