PL191395B1 - Nowy szczep mikroorganizmu E.coli - Google Patents

Nowy szczep mikroorganizmu E.coli

Info

Publication number
PL191395B1
PL191395B1 PL331351A PL33135197A PL191395B1 PL 191395 B1 PL191395 B1 PL 191395B1 PL 331351 A PL331351 A PL 331351A PL 33135197 A PL33135197 A PL 33135197A PL 191395 B1 PL191395 B1 PL 191395B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
threonine
strain
gene
strain according
resistant
Prior art date
Application number
PL331351A
Other languages
English (en)
Other versions
PL331351A1 (en
Inventor
Ming-Der Wang
Jill S. Bradshaw
Stacia L. Swisher
Hungming James Liaw
Paul D. Hanke
Thomas P. Binder
Original Assignee
Archer Daniels Midland Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Archer Daniels Midland Co filed Critical Archer Daniels Midland Co
Publication of PL331351A1 publication Critical patent/PL331351A1/xx
Publication of PL191395B1 publication Critical patent/PL191395B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01003—Homoserine dehydrogenase (1.1.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01039—Homoserine kinase (2.7.1.39)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
    • C12Y207/02004—Aspartate kinase (2.7.2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/03—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
    • C12Y402/03001—Threonine synthase (4.2.3.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

1. Nowy szczep mikroorganizmu E. coli NRRL B-21593 wytwarzaj acy treonin e. PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep mikroorganizmu E.coli wytwarzający L-treoninę.
U Escherichia coli, aminokwasy L-treonina, L-izoleucyna, L-lizyna oraz L-metionina wywodzą wszystkie lub część swoich atomów węgla od asparaginianu (kwasu asparaginowego) poprzez następujący, powszechnie występujący szlak biosyntezy (G.N. Cohen, The common pathway to lysine, methionine and threonine, str. 147-171 w Amino Acids: Biosynthesis and Genetic Regulation, K.M. Herrmann i R. L. Somerville, wyd. Addison-Wesley Publishing Co., Inc., Reading, Mass. (1983)):
LYS
I asparaginian -> fosforan aspartylu -> semialdehyd asparaginowy -> homoseryna -> -> MET/THR/ILE
Pierwsza reakcja tego powszechnie występującego szlaku biosyntetycznego jest katalizowana przez jedną z trzech różnych kinaz asparaginowych (AK l, II lub III), z których każda jest kodowana przez oddzielny gen i różni się od pozostałych sposobem regulacji jej aktywności i syntezy.
Kinaza asparaginowa I, na przykład, jest kodowana przez thrA, jej aktywność jest inhibitowana przez treoninę, a jej synteza podlega represji treoniną w połączeniu z izoleucyną. AK II, natomiast, jest kodowana przez metL a jej synteza podlega represji przez treoninę (jednak jej aktywność nie jest inhibitowana przez metioninę lub połączone w pary metioninę, lizynę, treoninę i izoleucynę) (F. Falcoz-Kelly i wsp., Eur. J. Biochem. 8: 146-152 (1969), J.C. Pette i wsp., Biochim. Biophys. Acta 136:245-257 (1967)). AK III jest kodowana przez lysC a jej aktywność i synteza są inhibitowane i podlegają represji przez lizynę.
Dwie z AK, I i II, nie są wyraźnymi białkami, ale raczej obszarem kompleksu enzymu, w którego skład wchodzą dehydrogenazy homoserynowe I lub II, odpowiednio, z których każda katalizuje redukcję semialdehydu asparaginianu do homoseryny (P. Truffa-Bachi i wsp., Eur. J. Biochem. 5: 73-80 (1968)). Dehydrogenaza homoserynowa I jest więc także kodowana przez thrA, jej synteza podlega represji przez treoninę i izoleucynę, a jej aktywność jest inhibitowana przez treoninę. Dehydrogenaza homoserynowa (HD) II jest podobnie kodowana przez metL a jej synteza podlega represji przez metioninę.
Biosynteza treoniny obejmuje następujące dodatkowe reakcje: homoseryna -> fosforan homoseryny -> treonina. Fosforylacja homoseryny jest katalizowana przez kinazę homoserynowa, białko zwierające dwie identyczne podjednostki o wielkości 29 kDa, kodowane przez thrB i którego aktywność jest inhibitowana przez treoninę (B. Burr i wsp., J. Biochem. 62: 519-526 (1976)). Ostatni etap, skomplikowana konwersja fosforanu homoseryny do L-treoniny jest katalizowana przez syntazę treoninową, białko o wielkości 47 kDa kodowane przez thrC (C. Parsot i wsp., Nucleic Acids Res. 11: 7331-7345 (1983)).
Geny thrA, thrB i thrC wszystkie należą do operonu thr, pojedynczego operonu zlokalizowanego na mapie genetycznej na 0 minucie u E.coli (J. Theze i I. Saint-Girons, J. Bacteriol. 118: 990-998 (1974); J. Theze i wsp., J. Bacteriol 117: 133-143 (1974)). Geny te kodują, odpowiednio, kinazę asparaginową I - dehydrogenazę homoserynową I, kinazę homoserynową oraz syntazę treoninową. Biosynteza tych enzymów jest obiektem wielowartościowej represji przez treoninę i izoleucynę (M. Freundlich, Biochem. Biophys. Res. Commun. 10: 277-282 (1963).
Region regulatorowy w operonie thr znajduje się przed pierwszym genem strukturalnym a jego sekwencja została wyznaczona ( J. F. Gardner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1706-1710 (1979)). Atenuator thr, znajdujący się za miejscem inicjacji transkrypcji, zawiera sekwencję kodującą początkowy peptyd; ta sekwencja zawiera dziewięć kodonów treoniny i cztery kodony izoleucyny. Atenuator thr zawiera również klasyczne wspólne wyłącznie drugorzędowe struktury które umożliwiają lub uniemożliwiają polimerazie RNA transkrypcję strukturalnych genów w operonie thr, w zależności od poziomu dostępnego treonylo- i izoleucylo-tRNA.
Z powodu problemów związanych z osiągnięciem wysokiego poziomu produkcji aminokwasów poprzez naturalną biosyntezę (na przykład represji operonu thr przez pożądany produkt), zostały wytworzone szczepy bakteryjne niosące plazmidy zawierające operon thr z genem thrA kodującym enzym oporny na efekt sprzężenia zwrotnego. Z takimi plazmidami, L-treonina była wytwarzana w skali przemysłowej w procesie fermentacyjnym przy użyciu różnych mikroorganizmów, takich jak Brevibacterium flavum, Seratia marcescens i Escherichia coli.
PL 191 395 B1
Na przykład, szczep E.coli BKIIM B-3996 (Debabov i wsp., opis patentowy US 5.175.107), który zawiera plazmid pVIC40, wytwarza około 85 g/l treoniny w ciągu 36 godzin. Gospodarzem jest szczep wymagający treoniny z powodu defektywnej syntazy treoninowej. W BKIIM B-3996, znajduje się zrekombinowany plazmid pVIC40, który zapewnia kluczowe aktywności enzymatyczne, tj., AK I-HD I oporny na efekt sprzężenia zwrotnego, kinazę homoserynową i syntazę treoninową, potrzebne do biosyntezy treoniny. Ten plazmid zapewnia również gospodarzowi auksotrofię względem treoniny.
Szczep 29-4 E.coli (E. Shimizu i wsp., Biosci. Biotech. Biochem. 59: 1095-1098 (1995)) jest innym przykładem zrekombinowanego szczepu E.coli wytwarzającego treoninę. Szczep 29-4 został skonstruowany przez sklonowanie operonu thr zmutowanego szczepu wykazującego nadprodukcję treoniny, E.coli K-12 ((3lM-4) (uzyskanego z szczepu E.coli ATCC 21277), do plazmidu pBR322, który został następnie wprowadzony do szczepu rodzicielskiego (K. Wiwa i wsp., Agric. Biol. Chem. 47: 2329-2334 (1983)). Szczep 29-4 wytwarza około 65 g/l L-treoniny w ciągu 72 godzin.
Podobnie skonstruowane zrekombinowane szczepy zostały otrzymane przy użyciu innych mikroorganizmów. Na przykład, szczep T2000 S.marcescens zawiera plazmid z operonem thr, który koduje oporny na efekt sprzężenia zwrotnego produkt genu thrA i wytwarza około 100 g/l treoniny w cią gu 96 godzin (M. Masuda i wsp., Applied Biochemistry and Biotechnology 37:255-262 (1922)). Wszystkie te szczepy zawierają plazmidy z wieloma kopiami genów kodujących enzymy biorące udział w biosyntezie treoniny, co umoż liwia nadekspresję tych enzymów. Ta nadekspresja genów pochodzą cych z plazmidów kodujących enzymy biorące udział w biosyntezie treoniny, szczególnie genu thrA kodującego oporną na efekt sprzężenia zwrotnego AK I-HD I, umożliwia tym szczepom wytwarzanie dużych ilości treoniny. Inne przykłady mikroorganizmów zawierających plazmidy są opisane, na przykład w opisach patentowych US 4.321.325; 4.347.318; 4.371.615; 4.601.983; 4.757.009; 4.945.058; 4.946.781; 4.980.285; 5.153.123 oraz 5.236.831.
Szczepy zawierające plazmidy sprawiają jednak problemy ograniczające ich zastosowanie przy fermentacyjnej produkcji przemysłowej aminokwasów. Na przykład, znaczącym problemem jaki stwarzają te szczepy jest zapewnienie integralności szczepu zawierającego plazmid podczas procesu fermentacyjnego, ponieważ istnieje potencjalna możliwość utracenia plazmidu podczas wzrostu i podziałów komórek. Aby uniknąć tego problemu, jest konieczne selektywne eliminowanie komórek, które utraciły plazmid podczas hodowli, na przykład przez zastosowanie genów oporności na antybiotyki wbudowanych w plazmid. To rozwiązanie jednak wymaga dodania jednego lub więcej antybiotyków do pożywki fermentacyjnej, co nie jest praktyczne w fermentacjach przemysłowych w duż ej skali.
Innym istotnym problemem jaki stwarzają szczepy zawierające plazmidy jest zapewnienie stabilności plazmidu. Wysoki stopień ekspresji enzymów kodowanych przez geny wbudowane w plazmid, konieczny w praktyce przy przemysłowych fermentacjach, często wpływa na stabilność plazmidu (E. Shimizu i wsp., Biosci. Biotech. Biochem. 59: 1095-1098 1995)). Stabilność plazmidu jest ponadto uzależniona od takich czynników jak temperatura hodowli i poziom rozpuszczonego tlenu w poż ywce. Na przykład, szczep 29-4 zawierający plazmid był bardziej stabilny w niższej temperaturze (30°C wobec 37°C) i przy wyższych poziomach rozpuszczonego tlenu (E. Shimizu i wsp., Biosci. Biotech. Biochem. 59: 1095-1098 (1995)).
Mikroorganizmy nie zawierające plazmidu, mimo, że są mniej wydajne niż wymienione powyżej, również były używane do wytwarzania treoniny. Szczepy E.coli takie jak H-8460, który jest uzyskany przez serię konwencjonalnych mutagenez i selekcji na odporność na kilka analogów metabolicznych, wytwarza około 75 g/l L-treoniny w ciągu 70 godzin (Kino i wsp., Patent USA nr 5,474,918). Szczep H-8460 nie jest gospodarzem zrekombinowanego plazmidu i posiada w chromosomie jedną kopię genów biosyntezy treoniny. Uważa się, że niższa produktywność tego szczepu w porównaniu ze szczepami zawierającymi plazmidy, takimi jak BKIIM B-3996, jest spowodowana niższą aktywnością enzymatyczną (zwłaszcza enzymów kodowanych przez operon thr), jako że szczepy nie zawierające plazmidu posiadają jedynie pojedynczą kopię genów biosyntezy treoniny. Inne przykłady dogodnych mikrooranizmów nie zawierających plazmidów są opisane, na przykład, w opisach patentowych US 5.376.538; 5.342.766; 5.264.353; 5.217.883; 5.188.949; 5.164.307; 5.098.835; 5.087.566; 5.077.207; 5.019.503; 5.017.483; 4.996.147; 4.463.094; 4.452.890; 3.732.144; 3.711.375; 3.684.654; 3.684.653; 3.647.628; 3.622.453; 3.582.471; 3.580.810; 3.984.830 i 3.375.173.
W przypadku obydwu typów szczepów E. coli, zawierających plazmid i nie zawierających plazmidu, operon thr jest kontrolowany przez właściwy dla danego szczepu natywny promotor. Jak to
PL 191 395 B1 opisano powyżej, ekspresja natywnego promotora jest regulowana przez mechanizm atenuacyjny kontrolowany przez region DNA kodujący początkowy peptyd i zawiera wiele kodonów treoniny i izoleucyny.
Region ten podlega translacji na rybosomie wrażliwym na poziom treoninylo-tRNA i izoleucynylo-tRNA. Jeśli poziom ten jest wystarczający do translacji początkowego peptydu, transkrypcja jest przedwcześnie zatrzymywana, ale kiedy poziom ten jest niewystarczający do translacji początkowego peptydu, transkrypcja nie jest zakończona i cały operon podlega transkrypcji co, po następnej translacji, daje w rezultacie zwiększone wytwarzanie enzymów biorących udział w biosyntezie treoniny. Tak więc, kiedy poziom treonylo-tRNA i/lub izoleucylo-tRNA jest niski, operon thr podlega transkrypcji w stopniu maksymalnym oraz osiągany jest maksymalny poziom wytwarzania enzymów biorących udział w biosyntezie treoniny.
W szczepie BKIIM B-3996 E.coli wytwarzają cym treoninę , operon treoninowy w plazmidzie jest kontrolowany przez natywny promotor. W rezultacie, operon thr podlega maksymalnej ekspresji tylko wtedy gdy szczep jest pozbawiony treoniny i/lub izoleucyny. Ponieważ pozbawienie treoniny jest niemożliwe w przypadku szczepu wytwarzającego treoninę, to szczepy te zostały przekształcone na auksotrofowe względem izoleucyny w celu uzyskania wyższego poziomu aktywności enzymatycznej.
Inną metodą uniknięcia kontroli atenuacyjnej jest obniżenie poziomu treonylo-tRNA i/lub izoleucylo-tRNA w komórkach. Mutant thrS, na przykład, zawierający syntazę treonylo-tRNA, która wykazuje 200-krotnie zmniejszone powinowactwo do treoniny, daje w rezultacie nadekspresję operonu thr, przypuszczalnie z powodu niskiego poziomu treonylo-tRNA (E.J. Johnson i wsp., J. Bacteriol. 129:66-70 (1977)).
Jednak w procesie fermentacyjnym, przy użyciu tych szczepów, komórki muszą być zaopatrywane w izoleucynę w fazie wzrostu, ponieważ nie zawierają enzymów biorących udział w biosyntezie izoleucyny. Kolejno, w fazie wytwarzania, komórki są pozbawione izoleucyny, aby zaindukować ekspresję enzymów biorących udział w biosyntezie treoniny. Główną niedogodnością przy użyciu natywnych promotorów treoniny do kontrolowania ekspresji enzymów biorących udział w biosyntezie treoniny jest to, że komórki muszą być zaopatrywane w izoleucynę.
Antybiotyk borelidyna jest również znany jako czynnik redukujący aktywność enzymatyczną syntetazy treonylo-tRNA, a zatem inhibitujący wzrost E.coli (G. Nass i wsp., Biochem. Biophys. Res. Commun. 34: 84 (1969)). Ze względu na tą zredukowaną aktywność, określony szczep E. coli wrażliwy na borelidynę zastosowano do wytwarzania dużych ilości treoniny (opublikowany japoński opis patentowy nr 6752/76; opis patentowy US 5.264.353). Okazało się, że dodanie borelidyny do hodowli powoduje zwiększenie wytwarzania L-treoniny. Szczepy Brevibacterium i Corynebacterium wrażliwe na borelidynę były także używane do wytwarzania dużych ilości treoniny (patent japoński nr 53-101591).
Oporne na borelidynę mutanty E.coli również wykazują zmiany aktywności syntetazy treonylo-tRNA. Bardziej szczegółowo, szczepy E.coli odporne na borelidynę wykazywały jedną z charakterystycznych cech: (i) konstytutywnie zwiększony poziom aktywności syntetazy t-RNA; (ii) syntetaza t-RNA zmieniona strukturalnie; lub (iii) pewne nieznane zmiany komórkowe, prawdopodobnie spowodowane zmianami w membranach (G. Nass i J. Thomale, FEBS Lett. 39: 182-186 (1974)). Żaden z tych zmutowanych szczepów, jednak, nie był zastosowany do fermentacyjnej produkcji L-treoniny.
W ś wietle dyskusji przeprowadzonej powyż ej, stale pozostaje potrzeba opracowania efektywnego procesu wytwarzania L-treoniny poprzez uzyskanie szczepów mikroorganizmów dla procesów fermentacyjnych, które efektywnie wytwarzają aminokwasy takie jak treonina, ale nie sprawiają problemów znanych ze stanu techniki.
Szczep mikroorganizmu E.coli NRRL B-21593 według wynalazku wytwarza treoninę. Jego chromosom zawiera, co najmniej jeden operon treoninowy (thr) w połączeniu czynnym, z co najmniej jednym promotorem nienatywnym. Szczep oznaczony jest jako kat-13.
Operon treoninowy zawiera gen opornego na efekt sprzężenia zwrotnego układu kinaza asparaginowa I - dehydrogenaza homoserynowa I (thrA), gen kinazy homoserynowej (thrB) i gen syntazy treoninowej (thrC), natomiast promotor nienatywny wybrany jest z grupy obejmującej promotor tac, promotor trp, promotor lpp, promotor PL i promotor PR. W szczególności promotorem nienatywnym jest promotor tac.
Operon treoninowy otrzymany jest korzystnie ze szczepu ATCC 21277.
PL 191 395 B1
Operon treoninowy szczepu korzystnie zawiera gen opornego na efekt sprzężenia zwrotnego układu kinaza asparaginowa I - dehydrogenaza homoserynowa.
Szczep E. coli według wynalazku jest zdolny do wytworzenia co najmniej około 50 g/l L-treoniny w czasie 30 godzin.
Szczep ten jest oporny na borelidynę.
Szczep zawiera na chromosomie defektywny gen dehydrogenazy treoninowej.
Mikroorganizm według wynalazku wytwarza L-treoninę efektywnie i w dużych ilościach i nie wymaga genów zawierających zrekombinowane plazmidy kodujące enzymy biorące udział w biosyntezie treoniny oraz korzystnie nie wymaga pożywek z dodatkiem aminokwasów.
Pożądane wyniki osiąga się prowadząc hodowlę szczepu E.coli w medium hodowlanym i odzyskując aminokwasy z tego medium. Stosowany szczep E.coli posiada następujące cechy charakterystyczne: (i) zawiera genetyczny czynnik determinujący biosyntezę aminokwasów, taki jak operon treoninowy (kodujący enzymy biorące udział w biosyntezie aminokwasów), w chromosomie kontrolowanym przez nienatywny promotor; oraz (ii) nie wymaga genów zawierających zrekombinowany plazmid kodujących enzymy biorące udział w biosyntezie treoniny, do wytwarzania treoniny. Stosuje się szczep E.coli odporny na borelidynę.
Szczep E.coli użyteczny przy fermentacyjnej produkcji aminokwasu treoniny otrzymuje się stosując etapy, w których (a) wprowadza się materiał genetyczny pochodzący z mikroorganizmu zdolnego do wytwarzania aminokwasów do chromosomu aksotroficznego E.coli tak, aby E.coli stała się prototrofem; (b) wbudowuje nienatywny promotor do chromosomu przed genami biosyntezy aminokwasów w celu zapewnienia kontroli ich ekspresji; oraz, ewentualnie, (c) likwiduje się zapotrzebowanie na aminokwasy w pożywce i/lub usuwa ograniczenia regulatorowe biosyntezy aminokwasów z chromosomu.
Wynalazek w przykładach wykonania został przedstawiony na rysunku, na którym fig. 1 ilustruje konstruowanie plazmidu pAD103 z lambda 676 Kohary i plazmidu pUC19, fig. 2 ilustruje konstruowanie plazmidu pAD106 z plazmidu pAD103 i plazmidu pUC4k, fig. 3 ilustruje konstruowanie plazmidu pADllS z plazmidu pAD103 i plazmidu pkk223-3, fig. 4 ilustruje konstruowanie plazmidu pAD123 z plazmidu pADllS i plazmidu pAD106, fig. 5 ilustruje wbudowanie regionu promotora z plazmidu pAD123 do chromosomu E.coli.
Nowy szczep bakteryjny ma następujące cechy charakterystyczne:
(i) komórki zawierają co najmniej jeden operon thr, tj. co najmniej jeden zbiór genów kodujących enzymy biorące udział w biosyntezie treoniny, w chromosomie kontrolowanym przez nienatywny promotor; i (ii) komórki nie wymagają żadnego zrekombinowanego plazmidu kodującego enzymy biorące udział w biosyntezie treoniny do wytwarzania treoniny.
Szczep według wynalazku jest zdolny do wytwarzania co najmniej około 50 g/l L-treoniny w ciągu około 30 godzin, korzystniej co najmniej około 70 g/l w ciągu około 30 godzin, jeszcze korzystniej co najmniej około 80 g/l w ciągu około 30 godzin i najkorzystniej co najmniej około 90 g/l w ciągu około 30 godzin. Korzystnie, szczep według wynalazku jest zdolny do wytwarzania co najmniej około 90 g/l w ciągu około 48 godzin, korzystniej co najmniej około 100 g/l w ciągu około 48 godzin i najkorzystniej co najmniej około 110 g/l w ciągu około 48 godzin.
Korzystnie, szczep według wynalazku jest zdolny wytwarzać L-treoninę w ilości co najmniej około 2 g/l/godzinę, korzystniej co najmniej około 2,5 g/l/godzinę, i najkorzystniej co najmniej około 3,6 g/l/godzinę.
Nowy szczep bakteryjny nie ma także zapotrzebowania na aminokwasy w pożywce do produkcji fermentacyjnej treoniny, tj. komórki nie potrzebują dodatków aminokwasowych do wzrostu i wytwarzania treoniny.
Szczep bakteryjny według wynalazku nie wymaga żadnego zrekombinowanego plazmidu zawierającego jeden lub więcej genów kodujących enzymy biorące udział w biosyntezie treoniny, to znaczy, że szczep jest zdolny do wytwarzania treoniny bez takiej potrzeby, aby jeden lub więcej enzymów biorących udział w biosyntezie treoniny było kodowanych przez geny zawarte w zrekombinowanym plazmidzie. Szczep według wynalazku może, ewentualnie, jeśli ma to być korzystne, zawierać jeden lub więcej zrekombinowanych plazmidów. Na przykład, mimo, że takie plazmidy nie są potrzebne do wytwarzania treoniny, szczep według wynalazku może pomimo to zawierać zrekombinowane plazmidy kodujące enzymy biorące udział w biosyntezie treoniny w celu dalszego zwiększenia wytwarzania treoniny. Szczep według wynalazku może również zawierać zrekombino6
PL 191 395 B1 wane plazmidy kodujące inne enzymy biorące udział w biosyntezie treoniny, takie jak dehydrogenaza semialdehydu asparaginianowego (asd).
Szczep bakteryjny według wynalazku jest szczepem Escherichia coli kat-13, który został zdeponowany w Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, 28 czerwca 1996r. i został mu nadany numer NRRL B-21593. Wykazuje on oporność na antybiotyk makrolidowy borelidynę.
Opreron treoninowy (thr) w chromosomie komórek szczepu bakterii według wynalazku koduje enzymy niezbędne do biosyntezy treoniny. Korzystnie, operon treoninowy zawiera gen AK-HD (thrA lub metL), gen kinazy homoserynowej (thrB), oraz gen syntazy treoninowej (thrC). Korzystniej, operon thr zawiera thrA (gen AK I-HD I), thrB oraz thrC. Odpowiednie operony thr mogą być uzyskane, na przykład, ze szczepu E.coli ATCC 21277 oraz szczepu ATCC 21530. Operon thr ze szczepu ATCC 21277 jest szczególnie korzystny. W chromosomie może być obecnych wiele kopii operonu thr.
Korzystnie, operon thr zawiera co najmniej jeden gen nie atenuowany, tj. ekspresja tego genu nie jest tłumiona przez poziom (zewnątrz lub wewnątrzkomórkowy) enzymu lub enzymów biosyntezy treoniny i/lub jego produktów (na przykład treoniny lub izoleucyny). Szczep według wynalazku może także zawierać operon thr zawierający defektywny atenuator thr (region regulatorowy za miejscem inicjacji transkrypcji a przed pierwszym genem strukturalnym) lub operon thr z całkowitym brakiem atenuatora thr.
W szczególności operon thr koduje jeden lub wię cej enzymów biosyntezy treoniny opornych na efekt sprzężenia zwrotnego, tj. aktywność enzymu nie jest inhibitowana przez zewnątrz i/lub wewnątrzkomórkowy poziom związków pośrednich i produktów biosyntezy treoniny. Najkorzystniej, operon thr zawiera gen kodujący AK-HD oporny na efekt sprzężenia zwrotnego, taki jak AK I-HD I oporny na efekt sprzężenia zwrotnego. Użycie AK-HD opornego na efekt sprzężenia zwrotnego zapewnia wyższy poziom aktywności enzymatycznej podczas biosyntezy treoniny, nawet w obecności produkowanej L-treoniny.
Ekspresja operonu(ów) treoninowego w szczepie według wynalazku jest kontrolowana przez nienatywny promotor, tj. promotor który nie kontroluje ekspresji operonu thr u szczepów bakteryjnych E.coli normalnie występujących w naturze. Zastąpienie natywnego promotora enzymów biorących udział w biosyntezie treoniny przez silny nienatywny promotor w celu kontrolowania ekspresji operonu thr daje w rezultacie wyższą produkcję treoniny nawet przy tylko jednej genomowej kopii operonu thr. Dodatkowo, ponieważ nienatywny promotor jest używany do kontrolowania ekspresji operonu treoninowego, nie jest konieczne przekształcenie szczepu bakteryjnego w auksotrofowy względem izoleucyny w celu osiągnięcia większej produkcji treoniny. Odpowiednie promotory obejmują, w szczególności: promotor lac promotor trp, promotor PL bakteriofaga X, promotor PR, promotor Ipp oraz promotor tac, a szczególnie promotor tac.
Poza operonem treoninowym, chromosom komórek szczepu według wynalazku może zawierać również co najmniej jeden gen kodujący dehydrogenazę semialdehydu asparaginianowego (asd). Korzystnie, chromosom komórek szczepu według wynalazku zawiera co najmniej jeden gen asd, co najmniej jeden gen thrA, co najmniej jeden gen thrB oraz co najmniej jeden gen thrC. Chromosom może, oczywiście, zawierać wiele kopii jednego lub więcej tych genów.
Dehydrogenaza treoninowa (tdh) katalizuje utlenianie L-treoniny do α-amino-e-ketomaślanu. Zgodnie z tym, szczególnie korzystnie, chromosom komórek według wynalazku zawiera dalej co najmniej jeden defektywny gen dehydrogenazy treoninowej (tdh). Defektywny gen tdh może być genem z obniżonym poziomem ekspresji dehydrogenazy treoninowej lub genem kodującym zmutowaną dehydrogenazę treoninową o zredukowanej aktywności enzymatycznej w porównaniu z natywną dehydrogenazą treoninową. Korzystnie, defektywny gen tdh zastosowany w szczepie według wynalazku ma taką właściwość, że dehydrogenazą treoninową nie ulega ekspresji. Przykłady ilustrujące geny tdh, w których dehydrogenaza treoninowa nie ulega ekspresji obejmują gen tdh z wszczepionym genem acetylotransferazy chloramfenikolowej (cat) lub gen tdh z wszczepionym transpozonem Tn5, jak opisano w US 5.175.107.
Szczep bakteryjny według wynalazku może być wytworzony dowolną znaną metodą lub techniką. Dogodne metody konstruowania szczepu bakteryjnego według wynalazku obejmują mutagenezę przy użyciu dogodnych środków takich jak NTG, techniki integracji genów, za pośrednictwem transformacji fragmentów liniowego DNA oraz rekombinacji homologicznej i transdukcję, za pośrednictwem bakteriofaga P1. Metody te są dobrze znane z publikacji takich jak na przykład: J.H. Miller, Expriments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nowy Jork (1972),
PL 191 395 B1
J.H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nowy Jork (1992), M. Singer i P. Berg, Genes & Genomes, University Science Books, Mili Valley, California (1991), J. Sambrook, E.F. Fritsch i T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nowy Jork (1989), P.B. Kaufman i wsp., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton, Floryda (1995), Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, wyd. B. R. Glick i J. E. Thompson, CRC Press, Boca Kation, Floryda (1993) oraz P.F. Smith-Keary,Molecular Genetics of Escherichia coli, The Guilford Press, Nowy Jork, NY (1989).
Przykładowo, szczep E.coli 472T23, który wymaga treoniny do wzrostu, może być przekształcony tak, aby wytwarzał treoninę przy użyciu metody transdukcji P1 w celu wprowadzenia operonu treoninowego szczepu E.coli ATCC 21277, który może być uzyskany z kolekcji „American Type Culture Collection”, 12301 Parklawn Drive, Rockwille, Maryland 20852, Stany Zjednoczone Ameryki. Ten operon thr zawiera gen kinazy asparaginianowej-dehydrogenazy homoserynowej (thrA), gen kinazy homoserynowej (thrB) oraz gen syntazy treoninowej (thrC).
Aby poprawić wytwarzanie treoniny przez szczep według wynalazku, może zostać wprowadzony defektywny gen dehydrogenazy treoninowej ze szczepu E.coli CGSC6945 (odnośny genotyp: tdh-1::cat1212, uzyskany z Genetic Stock Center E.coli, 355 Osborne Memoriał Laboratory, Wydział Biologii, Uniwersytet Yale, New Haven, Connecticut 06520-8104, Stany Zjednoczone Ameryki) za pomocą transdukcji Pl. Otrzymany w rezultacie szczep wytwarzający treoninę może być dalej ulepszony przez mutagenezę z NTG i/lub selekcję na oporność na borelidynę.
Plazmidy zawierające gen wyznacznik oporności na antybiotyki, takie jak kan (kodujący odporność na kanamycynę), oraz silny promotor, taki jak PL lub tac, korzystnie otoczony przez DNA przed thrA oraz kilkaset par zasad dzikiego genu thrA (tj., nie cały gen thrA), może być konstruowany i stosowany jako nośnik dostarczający wymagane fragmenty DNA do chromosomu. Fragment z plazmidu moż e być izolowany przez trawienie dogodnym enzymem restrykcyjnym i oczyszczany, a następnie wprowadzany, przez transformację lub elektroporację , do szczepu w celu usunię cia regionu kontrolera operonu treoninowego oraz zastąpienie go przez rekombinację homologiczną z pożądanym fragmentem, tj. genem wyznacznikiem opornoś ci na antybiotyki i silnym promotorem na początku genu thrA. Ten fragment może być następnie przetransferowany na szczep oporny na borelidynę za pomocą transdukcji P1.
Zapotrzebowanie na izoleucynę szczepu korzystnego gospodarza, 472T23, może być wyeliminowane, na przykład, przez wprowadzenie allelu typu dzikiego wyznacznika przez transdukcję P1. Niepożądane potrzeby pokarmowe innych gospodarzy mogą być zlikwidowane w podobny sposób lub według innych metod znanych i dostępnych dla specjalisty.
L-treonina jest uzyskiwana przez hodowlę szczepu bakteryjnego według wynalazku na syntetycznej lub naturalnej pożywce zawierającej co najmniej jedno źródło węgla, co najmniej jedno źródło azotu oraz właściwe sole nieorganiczne, czynniki wzrostu i tym podobne.
Przykładowe źródła węgla obejmują, ale nie są do nich ograniczone: węglowodany, takie jak glukoza, fruktoza, sacharoza, hydrolizat skrobi, hydrolizat celulozy i melasa; kwasy organiczne, takie jak kwas octowy, kwas propionowy, kwas mrówkowy, kwas maleinowy, kwas cytrynowy oraz kwas fumarynowy; oraz alkohole, takie jak glicerol.
Przykładowe dogodne źródła azotu obejmują, ale nie są do nich ograniczone: amoniak, włączając gaz i roztwór; sole amonowe, kwasy organiczne i nieorganiczne, takie jak chlorek amonowy, fosforan amonowy, siarczan amonowy oraz octan amonowy; oraz inne zawierające azot, włączając wywar z mię sa, pepton, namok z kukurydzy, hydrolizat kazeiny, hydrolizat sojowy oraz ekstrakt dro żd ż owy.
Po hodowli, L-treonina zakumulowana w zawiesinie komórkowej może zostać wydzielona dowolną znaną metodą, na przykład, przy użyciu żywic jonowymiennych, tak jak opisano w US 5.342.766. Metoda ta w pierwszej kolejności obejmuje usunięcie mikroorganizmów z zawiesiny przez wirowanie a następnie nastawienie pH zawiesiny na około 2 za pomocą kwasu solnego. Zakwaszony roztwór jest kolejno przepuszczany przez silnie kwasowe żywice kationowymienne i adsorbent jest eluowany roztworem amoniaku. Amoniak jest usuwany przez destylację próżniową i otrzymany w rezultacie roztwór jest zatężany. Dodatek alkoholu i kolejne ochłodzenia dostarczają kryształów L-treoniny.
Metodami podobnymi do opisanej powyżej mogą być wytwarzane inne aminokwasy, pochodne asparaginianu. Izoleucyna, na przykład, może być otrzymywana ze szczepów bakteryjnych zawierających, w chromosomie lub w plazmidzie, zamplifikowany gen ilvA lub gen tdc, które to obydwa
PL 191 395 B1 geny kodują deaminazę treoninową, pierwszy enzym bierze udział w biokonwersji treoniny do izoleucyny. Amplifikacja genu, na przykład, przy użyciu genu ilvA kodującego enzym odporny na efekt sprzężenia zwrotnego, prowadzi do zwiększenia biosyntezy izoleucyny.
Podobnie, metionina może być wytwarzana przez mikroorganizmy takie jak E.coli, które zawierają co najmniej jeden operon met w chromosomie, tj. gen metL (kodujący AK II-HD II), gen metA (sukcynylotransferazę homoserynową), gen metB (γ-syntazę cystationinową), gen metC ((β-liazę cystationinową) oraz gen metE i metH (metylazę homocysteinową). Te geny, łącznie z ich odmianą oporną na efekt sprzężenia zwrotnego i ewentualnie nienatywny promotor mogą zostać wprowadzone do chromosomu mikroorganizmu gospodarza co najmniej jedną ogólną metodą omówioną powyżej. Lizyna może również być wytwarzana przez mikroorganizmy zawierające gen kodujący enzymy biosyntezy lizyny (korzystnie enzym biosyntezy lizyny odporny na efekt sprzężenia zwrotnego kodowany przez lysC i/lub dapA) oraz, ewentualnie, nienatywny promotor.
Oporność na borelidynę może być uzyskana za pomocą dowolnej znanej metody. Na przykład, szczepy oporne na borelidynę mogą być izolowane przez hodowlę szczepów wyjściowych na pożywce minimalnej zawierającej około 139 μΜ borelidyny, według G. Nass i J. Thomale, FEBS Lett. 39:182-186 (1974). Dodatkowo, oporność na borelidynę konkretnych szczepów objawia się zmianą jednej lub większej liczby cech fenotypu komórek. Na przykład, mutant E.coli oporny na borelidynę, szczep 6-8 i jego pochodne jest raczej okrągły niż podłużny. W takich przypadkach, objaw zmiany charakterystyki fenotypu może być wystarczający do dokładnego zidentyfikowania szczepów opornych na borelidynę.
Mutanty oporne na borelidynę są zdolne do wytwarzania treoniny. Geny kodujące enzymy biorące udział w biosyntezie treoniny mogą być obecne w chromosomie lub zawarte w plazmidach lub ich kombinacji. Mogą także występować zwielokrotnione kopie tych genów. Korzystnie, geny kodujące enzymy biorące udział w biosyntezie treoniny są oporne na kontrolę poprzez atenuację i/lub kodują enzymy odporne na efekt sprzężenia zwrotnego.
Jak to wskazano powyżej, szczep oporny na borelidynę według wynalazku może ewentualnie zawierać jeden lub więcej zrekombinowanych plazmidów. Na przykład, mikroorganizm według wynalazku może zawierać zrekombinowane plazmidy kodujące enzymy biorące udział w biosyntezie treoniny. Szczep bakteryjny może również zawierać zrekombinowane plazmidy kodujące enzymy biorące udział w biosyntezie treoniny, takie jak dehydrogenaza semialdehydu asparaginianu (asd), lub enzymy zwiększające wzrost.
Dodatkowo, szczep odporny na borelidynę może być modyfikowany według potrzeb, na przykład, w celu zwiększenia produkcji treoniny, zlikwidowania potrzeb pokarmowych i tym podobnych, przy użyciu dowolnego znanego sposobu. Przykłady ilustrujące dogodne metody modyfikowania mutantów E.coli odpornych na borelidynę i ich odmian obejmują, ale nie są do nich ograniczone: mutagenezę przez napromieniowanie ultrafioletem lub promieniami X, lub przez potraktowanie mutagenem chemicznym takim jak nitrozoguanidyna (N-metylo-N'-nitro-N-nitrozo-guanidyna), metanosulfonian metylu, iperyt azotowy i tym podobne; techniki integracji genów, za pośrednictwem transformacji fragmentów liniowego DNA i rekombinacji homologicznej; oraz transdukcji za pośrednictwem bakteriofagów takich jak P1. Te metody są dobrze znane i są opisane, na przykład, w J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nowy Jork (1972); J.H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nowy Jork (1992); M. Singer i P. Berg, Genes & Genomes, University Science Books, Mill Valley, California (1991), J. Sambrook, E.F. Fritsch i T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, II wyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nowy Jork (1989), P.B. Kaufman i wsp., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton, Floryda (1995), Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B.R. Glick i J.E. Thompson, eds, CRC Press, Boca Ration, Floryda (1993) oraz P. F. Smith-Keary, Molecular Genetics of Escherichia coli, The Guilford Press, Nowy Jork, NY (1989).
Korzystnie, mutanty odporne na borelidynę według wynalazku są modyfikowane tak, aby zawierały nienatywny promotor połączony czynnie, to znaczy w sposób umożliwiający jego funkcjonowanie, przed jednym lub więcej genem kodującym enzymy biorące udział w biosyntezie treoniny, niezależnie od tego czy te geny są w chromosomie i/lub w plazmidach.
L-treonina jest uzyskiwana przez hodowlę szczepu bakteryjnego odpornego na borelidynę na syntetycznej lub naturalnej pożywce zawierającej co najmniej jedno źródło węgla, co najmniej jedno
PL 191 395 B1 źródło azotu i korzystnie nieorganiczne sole, czynniki wzrostu i tym podobne, jak to opisano powyżej. Zakumulowana treonina może być odzyskana dowolnym znanym sposobem.
P r z y k ł a d 1
Preparowanie szczepu kat-13 E.coli
A. Przeniesienie operonu treoninowego szczepu ATCC 21277 E.coli na chromosom szczepu 472T23 E.coli.
Szczep ATCC 21277 E.coli (opis patentowy US 3.580.810), dostępny z „American Type Culture Collection” 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Stany Zjednoczone Ameryki, jest oporny na kwas amino-(e-hydroksywalerianowy (AHV) ale wymaga proliny, tiaminy, izoleucyny i metioniny do wzrostu na minimalnej pożywce. Jak podano ATCC 21277 akumuluje 6,20 g/l treoniny w procesie fermentacyjnym. Operon treoninowy ATCC 21277 zawiera gen kinazy asparaginianowej I - dehydrogenazy homoserynowej I (thrA) kodujący enzym odporny na efekt sprzężenia zwrotnego, gen kinazy homoserynowej (thrB) i gen syntazy treoninowej (thrC).
Szczep 472T23 E.coli, zdeponowany w Handlowej Kolekcji Mikroorganizmów ZSRR w Instytucie Badań Antybiotyków ZSRR pod nr BKIIM B-2307, potrzebuje treoniny i izoleucyny do wzrostu na minimalnej pożywce zawierającej glukozę, sole amonowe, witaminę B1 i sole mineralne. Ten szczep nie może wytwarzać treoniny ponieważ zawiera defektywny gen thrC, kluczowy gen przy biosyntezie treoniny. Szczep 472T23 również zawiera defektywny gen deaminazy treoninowej, ilvA, kodujący pierwszy enzym biorący udział w biosyntezie izoleucyny.
Lizat bakteriofaga P1 przygotowano przez rozwój faga na ATCC 21277. Następnie szczep 472T23 zainfekowano lizatem P1, w którym mała ilość cząstek faga zawierała operon treoninowy z ATCC 21277. Po infekcji, bakterie syntetyzujące treoninę wyselekcjonowano przez wzrost na minimalnej pożywce E (glukoza 0,05 g/l; MgSO47H2O 0,2 g/l; kwas cytrynowy H2O 2,0 g/l; K2HPO4 10,0 g/l; NaHNH4PO4 4H2O 3,5 g/l; agar 15,0 g/l) na płytkach agarowych wzbogaconych w 0,25 g/l izoleucyny. Kilka transduktantów prototroficznych względem treoniny, zawierających operon treoninowy z ATCC 2177, były teraz zdolne do wzrostu na minimalnej pożywce wzbogaconej tylko w izoleucynę.
Wymienione transduktanty przetestowano na produkcję treoniny w hodowli na wytrząsarce w kolbach jak to przedstawiono niżej w przykładzie 2. Jeden z nich, G9, wytwarzający treoninę, został wyselekcjonowany do dalszego rozwoju szczepu.
B. Przeniesienie genu z brakiem dehydrogenazy treoninowej (tdh) wbudowanego w gen acetylotransferazy chloroamfenikolowej (cat) do chromosomu szczepu G9 E.coli.
Szczep CGSC6945, zawierający defektywny gen dehydrogenazy treoninowej (tdh), uzyskano z E.coli Genetic Stock Center, 355 Osborne Memoriał Laboratory, Wydział Biologii, Uniwersytet Yale, New Haven, Connecticut 06520-8104, Stany Zjednoczone Ameryki. Gen dehydrogenazy treoninowej jest defektywny ze względu na jego wbudowanie w gen acetylotransferazy chloroamfenikolowej (cat). W celu przeniesienia tego uszkodzonego genu do G9, fag P1 hodowano na CSCG6945, i lizat użyto do zainfekowania G9. Kilka transduktantów G9 opornych na chloroamfenikol wyselekcjonowano i przetestowano na wytwarzanie treoniny przez fermentację w kolbach na wytrząsarce jak to opisano poniżej w przykładzie 2. Jeden z nich, G909, wytwarzający więcej treoniny niż G9, został wyselekcjonowany do dalszego rozwoju.
C. Wbudowanie nie natywnego promotora w chromosom szczepu 6909 E.coli.
W celu wbudowania promotora tac w chromosom G909, zastosowano homologiczną rekombinację pomiędzy fragmentem liniowego DNA a chromosomem szczepu eksonukleazoV minus (recD).
Liniowy fragment DNA zawierał 1,5 kz sekwencji przed (koniec 5') operonem treoninowym, wyznacznik odporności na kanamycynę, sekwencję promotora tac oraz około 480 pz genu thrA. Ten fragment, homologiczny do końca 5', wyznacznik selekcji (odporność na kanamycynę), silny i możliwy do kontroli promotor do operonu treoninowego (tac), oraz homologiczny do końca 3', odpowiednio, zostały uzyskane następująco.
Operon treoninowy z dzikiego szczepu E.coli W3110 sklonowano do miejsca enzymu restrykcyjnego Sphl plazmidu pUC19 przez użycie DNA klonu lambda 676 od Dr. Yuji Konara, Wydział Biologii Molekularnej, School of Science, Uniwersytet Nagoya, Chikusaku, Nagoya, Japonia. DNA klonu lambda 676 oraz pUC19 następnie trawiono przez Sphl. Fragment pUC19 kolejno defosforylowano za pomocą krewetkowej fosfatazy alkaliczej (SAP) i oczyszczano na żelu agarozowym. Fragment 6,9 kz operonu treoninowego z klonu lambda został także oczyszczony. Te dwa fragmenty były kolejno wiązane przez ligazę T4 DNA w celu wygenerowania plazmidu pAD103.
PL 191 395 B1
Następnie spreparowano region ochronny ukierunkowany przeciwnie do transkrypcji do rekombinacji homologicznej oraz wyznacznik odporności na kanamycynę. pAD103 był trawiony przez enzym restrykcyjny BstEII, Xbal i stępiony przez traktowanie fragmentem Klenowa. Fragment 1,5 kz zawierający tylko koniec 5' (przeciwnie do kierunku transkrypcji) operonu treoninowego (ale nie operon thr jako taki lub jego region kontrolowany) został wyizolowany i przyłączony do fragmentu genu odporności na kanamycynę z pUC4K (Pharmacia), który był trawiony przez enzym restrykcyjny Sall i traktowany fragmentem Klenowa aby wypełnić 3' nawis w celu wygenerowania pośredniego plazmidu pAD106.
pAD103 był także trawiony enzymem restrykcyjnym Taq1 i stępiony przez traktowanie fragmentem Klenowa. Fragment zawierający natywne miejsce wiązania rybosomu oraz około 480 pz sekwencji kodującej genu thrA został wyizolowany i następnie związany z fragmentem pKK233-3 (Pharmacia), który był trawiony enzymem restrykcyjnym Sma l i defosforylowany przez SAP, w celu otrzymania plazmidu pAD115, który zawierał sekwencję DNA promotora tac, miejsca wiązania rybosomu oraz kilkaset par zasad genu thrA.
pAD115 był kolejno trawiony przez enzym restrykcyjny BamHI i wyizolowano fragment 0,75 kz DNA, który zawierał pożądane sekwencje DNA. pAD106 był także trawiony przez BamHI a następnie defosforylowany przy użyciu SAP. Te dwa fragmenty zostały wówczas połączone tworząc plazmid pAD123, który zawierał sekwencję DNA znajdującą się przed operonem treoninowym, gen wyznacznika odporności na kanamycynę, promotor tac, oraz około 480 pz początku genu thrA.
pAD123 był następnie trawiony przez Spel, BglI i fragment zawierający pożądane sekwencje DNA został wyizolowany.
Szczep egzonukleazy V minus (recD) wytworzono hodując faga P1 na szczepie KW251 E.coli (odpowiedni genotyp: argA81::Tn10, recD1014; uzyskany od Pharmacia), który zawiera gen recD z kotransduktywną insercją transpozonu Tn10 do argA. Lizat, który został przygotowany z faga został następnie użyty do zainfekowania szczepu G9 i wyizolowano transduktant G9T7 oporny na tetracyklinę.
Fragment DNA z plazmidu pAD123 wbudowano do szczepu G9T7 E.coli przez elektroporację. Szczep G9T7 oporny na kanamycynę wyizolowano i lizat faga P1 przygotowano poprzez hodowlę faga na tym szczepie. Lizat faga P1 następnie użyto do transdukcji G909. Jeden z transduktantów odpornych na kanamycynę z G909, tac3, który wykazywał największą produkcję treoniny w obecności IPTG w teście hodowli na wytrząsarce, został wyizolowany.
Lizat faga P1 był kolejno przygotowany ze szczepem tac3, a następnie użyty do zainfekowania szczepu 6-8 (opisanego poniżej). Transduktanty odporne na kanamycynę zostały wyselekcjonowane i wyizolowano jeden z nich, szczep 6-8 tac3, który nawet wytwarzał więcej treoniny niż tac3 w teście hodowli na wytrzą sarce.
D. Mutageneza NTG oraz izolacja mutantów odpornych na borelidynę ze szczepów G909 i 6-8 E.coli.
Komórki szczepu G909 zmutowano przez traktowanie N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyną (NTG) (50 mg/l, 30 minut, temperatura 36°C) przy użyciu konwencjonalnych metod. Otrzymane w rezultacie komórki rozprowadzono nastę pnie na minimalnej poż ywce E, płytce agarowej zawierającej 0,25 g/l L-izoleucyny i 0,1% wagowo borelidyny. Po inkubacji trwającej 3-5 dni w temperaturrze 36°C, duże kolonie uformowane na płytce, które zawierały szczep 6-8, wyselekcjonowano do testu na odporność na borelidynę i wytwarzanie L-treoniny.
Aby przeprowadzić test odpornościowy na borelidynę, każdy szczep hodowano w 20 ml pożywki
SM do wysiewania [32,5 g/l glukozy; 1 g/l MgSO47H2O; 24,6 g/l K2HPO4; 9,52 g/l KH2PO4; 5 g/l (NH4)SO4; 15 g/l ekstraktu drożdżowego; pH 7,2] w temperaturze 36°C przez 17 godzin z wytrząsaniem. Komórki zebrano i przemyto minimalną pożywką E. Zawiesinę komórek następnie wysiano do sterylnej probówki zwierającej 3 ml minimalnej pożywki E i 0, 0,1, 0,5 lub 1 mM borelidyny. Po 24 godzinnej hodowli w temperaturze 36°C z wytrząsaniem, zmierzono wzrost poprzez pomiar gęstości optycznej przy 660 nm. Wyniki przedstawiono poniżej w zależności od wzrostu przy braku borelidyny.
Borelidyna mM G909 6-8
0 100,0 100,0
0,1 24,2 134,5
0,5 2,9 141,5
1 0,9 184,5
PL 191 395 B1
E. Zlikwidowanie zapotrzebowania na izoleucynę i usunięcie genu represora laktozy (lad).
Poprzez wprowadzenie nienatywnego promotora tac i genu thrA opornego na efekt sprzężenia zwrotnego, ekspresja operonu thr (thrA, thrB, thrC) nie jest już kontrolowana przez mechanizm atenuacyjny. W rezultacie, pozbawienie izoleucyny i/lub obecność wyznacznika auksotrofowości względem ilvA nie jest już wymagane do wytwarzania treoniny.
Zgodnie z tym, wyznacznik ilvA dzikiego typu został wbudowany przez transdukcję w 6-8tac3 w celu uporania się z zapotrzebowaniem szczepu na izoleucynę , tj., w celu wyeliminowania potrzeby zapewnienia pożywki wzbogaconej w izoleucynę do wzrostu komórek. Lizat faga P1 uzyskany z CGSC7334 (odnośny genotyp: lacI42::Tn10, lacZU118; uzyskany z E.coli Genetic Stock Center, 255 Osborne Memoriał Laboratory, Wydział Biologii, Uniwersytet Yale, New Haven, Connecticut 06520-8104, USA) użyto do zainfekowania 6-8tac3 i wyselekcjonowano transduktanty pozytywne względem biosyntezy izoleucyny. Transduktanty te wytwarzały w przybliżeniu taką samą ilość L-treoniny jak szczep 6-8tac3 w teście na wytrząsarce w kolbach. Jeden z transduktantów, 6-8 tac3ile + został wybrany do dalszych doświadczeń.
Ponieważ operon treoninowy z 6-8tac3ile jest kontrolowany przez promotor tac, izopropylo-β-D-tiogalaktozyd (IPTG) był konieczny do pobudzenia komórek do pełnej ekspresji operonu thr. Użycie IPTG w celu pobudzenia ekspresji operonu thr, jest jednak mniej korzystne.
Zatem, w celu wyeliminowania tego niepotrzebnego ograniczenia regulatorowego, wprowadza się defektywny gen lac represora (lacI) przez zainfekowanie 6-8tac3ile+ fagiem P1 uzyskanym z CGSC7334. Otrzymane w rezultacie transduktanty (6-8tac3lacI-) zostały przetestowane na odporność na tetracyklinę i wyselekcjonowano kolonie oporne na tetracyklinę.
P r z y k ł a d 2
Badania nad wytwarzaniem treoniny w hodowli w kolbach na wytrząsarce
Porównanie różnych szczepów E.coli ze względu na wytwarzanie treoniny przeprowadzono na podstawie ich zdolności do wytwarzania treoniny w hodowli w kolbach na wytrząsarce. Testowane szczepy były hodowane na pożywce agarowej LB [10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu, 15 g/l agaru]. Po 1 do 2 dniach wzrostu, komórki zostały zawieszone w pożywce wysiewowej [32,5 g/l dekstrozy; 24,35 g/l KH2PO4; 9,5 g/l KH2PO4; 15 g/l ekstraktu drożdżowego; 5 g/l (NH4)SO4; 1 g/l MgSO<7H2O] pH 7,2. Posiew był hodowany przez 24 godziny z prędkością mieszania 250 obr/min w temperaturze 37°C. 15 ml pożywki fermentacyjnej [40 g/l dekstrozy; 2 g/l ekstraktu drożdżowego; 2 g/l kwasu cytrynowego; 25 g/l (NH4)2SO4; 2,8 g/l MgSO<7H2O; 20 g/l CaCO3; 2 ml roztworu metali śladowych] w pH 7,2 następnie dodano do posiewu i przeprowadzono proces fermentacji w temperaturze 37°C z prędkością mieszania 250 obr/min. Po hodowli, ilość L-treoniny zakumulowana w medium hodowlanym została zbadana za pomocą HPLC (Pompa model ISCO 2353, Model Rainin RI-1 detektora stopnia załamania światła, kolumna aminex Hp87-CA)
Ilość L-treoniny wytworzonej przez każdy z badanych szczepów przedstawiono poniżej.
Szczep Wytworzona L-treonina (g/l)
G909 4,95
6-8 11,45
tac3 12,9 (pobudzony przez IPTG)
10,9 (nie pobudzony)
6-8tac3ile+ 12,7 (pobudzony przez IPTG)
6-8tac3lacI- 13,9
Kat 13 14,0
P r z y k ł a d 3 Badanie fermentacji
Szczepy E.coli oraz ich szczepy wyjściowe badano pod kątem wytwarzania L-treoniny przez fermentację.
G909 zbadano w następujących warunkach: 0,5 l wodnego roztworu pożywki zawierającej 30 g/l bulionu tryptic soy i 5 g/l ekstraktu drożdżowego w 2 litrowej kolbie z deflektorem zostało po12
PL 191 395 B1 siane 1,5 ml G909 i inkubowano na wytrząsarce w temperaturze 35°C przy 200 obr/min przez 8,5 godziny. 0,9 ml (0,03%) dojrzałego posiewu dodano do szklanego fermentora zawierającego 3,0 l pożywki wysiewowej dla fermentora [10 g/l s.m. syropu kukurydzianego; 0,4 g/l izoleucyny; 2,5 g/l KH2PO4; 2 g/l MgSO47H2O; 0,5 g/l (NH4)2SO4; 0,192 g/l bezwodnego kwasu cytrynowego; 0,03 g/l FeSO<7H2O; 0,021 g/l MnSO47H2O i 80 g/l dekstrozy]. Inkubację przeprowadzono w następujących warunkach: temperatura 39°C przez pierwsze 18 godzin, a następnie 37°C do końca, pH 6,9 (nastawione przez dodanie NH4OH); przepływ powietrza 3,5 l/min; mieszanie 500 obr/min początkowo, następnie zwiększone w celu osiągnięcia DO przy 20%; ciśnienie 0,7-1,6 kPa. Zakończenie fazy wysiewowej w fermentorze zostało osiągnięte przez wyczerpanie dekstrozy. 315 ml (15%) dojrzałego inokulum z fermentora posiewowego przeniesiono do szklanego fermentora zawierającego tę samą pożywkę (pożywka głównego fermentora) wymienioną powyżej poza następującymi wyjątkami: objętość wynosiła 2,1 l i dodano 0,34 g/l izoleucyny. Inkubacja trwała 48 godzin w następujących warunkach: temperatura 37°C, pH 6,9 (nastawione przez dodanie NH4OH); przepływ powietrza 3,5 l/min przez 20 godzin a następnie zwiększony do 4,0 l/min; mieszanie 500 obr/min początkowo, następnie zwiększone w celu osiągnięcia DO przy 20%; ciśnienie 0,7-1,4 kPa i poziom dekstrozy 10 g/l (podtrzymywany przez zasilanie 50% wagowo roztworem dekstrozy). Fermentację zakończono po 48 godzinach. Z G909 uzyskano następujące wyniki: końcowe stężenie treoniny 62,3 g/l z całkowitą ilością 274 g i wydajnością 23,2%.
tac3 badano w tych samych warunkach co G909, opisanych powyżej, z następującym wyjątkiem: dodano 1 mg/l IPTG na początku hodowli w głównym fermentorze. Z dodatkiem IPTG, tac3 wytworzył końcowe stężenie treoniny 85,7 g/l z całkowitą ilością 355 g i wydajnością 28,3%.
6-8 został zbadany w takich samych warunkach co tac3 opisanych powyżej, włączając dodanie IPTG. 6-8tac3 wytworzył: końcowe stężenie treoniny 99,3 g/l z całkowitą produktywnością 421 g i wydajnością 35,1%.
6-8tac3ile+ przebadano w takich samych warunkach co 6-8tac3, jak opisano powyżej, z następującym wyjątkiem: nie było potrzeby dodawania L-izoleucyny zarówno na etapie posiewu jak i hodowli w głównym fermentorze. Z powodu awarii mieszadła po 22,5 godzinach, zostało zanotowane stężenie tylko po 22 godzinach (62 g/l treoniny).
Kat-13 przebadano w takich samych warunkach co 6-8tac3, jak opisano powyżej, z następującym wyjątkiem: nie dodano IPTG. W tych warunkach kat-13 wytworzył końcowe stężenie 102 g/l treoniny z całkowitą produktywnością 445 g i wydajnością 33,1%.
Stosowne genotypy skonstruowanych szczepów, dodatki potrzebne do wytwarzania treoniny drogą fermentacji, oraz odnotowane stężenia przedstawiono w tabeli poniżej:
Szczep Odnośny genotyp Dodatki potrzebne Stężenie po 30 godz. Stężenie po 48 godz. Wydajność
1 2 3 4 5 6
G9 IlvA- Ile NS NS NS
G909 IlvA-, Tdh : : Cm Ile 53 62,3 23,2
tac3 IlvA-, Tdh : : Cm ptacthrABC Ile, IPTG 86 85,7 28,8
6-8 IlvA-, Tdh : : Cm Bor-R Ile 70 74,1 28,3
6-8tac3 IlvA-, Tdh : : Cm ptacthrABC Bor-R Ile, IPTG 75 99,3 35,1
PL 191 395 B1 ciąg dalszy tabeli
1 2 3 4 5 6
6-8fac3-ile+ Tdh : : Cm Bor-R ptacthrABC IPTG 62 (22 godz.) Niedostępne Niedostępne
kat 13 Tdh: :Cm, Bor-R ptacthrABC LacI brak 92,1 102 33,1
Bor-R - oporne na borelidynę
NS - nie sprawdzone ptacthrABC - geny thrA, thrB i thrC kontrolowane przez promotor tac

Claims (21)

1. Nowy szczep mikroorganizmu E. coli NRRL B-21593 wytwarzają cy treoninę .
2. Szczep wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e jego chromosom zawiera co najmniej jeden operon treoninowy (thr) w połączeniu czynnym z co najmniej jednym promotorem nienatywnym.
3. Szczep według zastrz. 2, znamienny tym, że operon treoninowy zawiera gen opornego na efekt sprzężenia zwrotnego układu kinaza asparaginowa I - dehydrogenaza homoserynowea I (thrA), gen kinazy homoserynowej (thrB) i gen syntazy treoninowej (thrC).
4. Szczep według zastrz. 2, znamienny tym, że oznaczony jest kat-13.
5. Szczep według zastrz. 2, znamienny tym, ż e promotor wybrany jest z grupy obejmują cej promotor tac, promotor trp, promotor lpp, promotor PL i promotor PR.
6. Szczep według zastrz. 2, znamienny tym, że promotorem nienatywnym jest promotor tac.
7. Szczep według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera na chromosomie defektywny gen dehydrogenazy treoninowej.
8. Szczep według zastrz. 2, znamienny tym, że operon treoninowy otrzymany jest ze szczepu ATCC 21277.
9. Szczep według zastrz. 2, znamienny tym, że jest oporny na borelidynę .
10. Szczep według zastrz. 2, znamienny tym, że jest zdolny do wytworzenia co najmniej około 50 g/l L-treoniny w czasie 30 godzin.
11. Szczep według zastrz. 2, znamienny tym, że operon treoninowy zawiera gen opornego na efekt sprzężenia zwrotnego układu kinaza asparaginowa I - dehydrogenaza homoserynowa.
12. Szczep według zastrz. 3, znamienny tym, że jest oporny na borelidynę.
13. Szczep według zastrz. 5, znamienny tym, że jest oporny na borelidynę.
14. Szczep według zastrz. 6, znamienny tym, że jest oporny na borelidynę.
15. Szczep według zastrz. 7, znamienny tym, że jest oporny na borelidynę.
16. Szczep według zastrz. 8, znamienny tym, że jest oporny na borelidynę.
17. Szczep według zastrz. 11, znamienny tym, że jest oporny na borelidynę.
18. Szczep według zastrz. 3, znamienny tym, że zawiera na chromosomie defektywny gen dehydrogenazy treoninowej.
19. Szczep według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera na chromosomie defektywny gen dehydrogenazy treoninowej.
20. Szczep według zastrz. 8, znamienny tym, że zawiera na chromosomie defektywny gen dehydrogenazy treoninowej.
21. Szczep według zastrz. 11, znamienny tym, że zawiera na chromosomie defektywny gen dehydrogenazy treoninowej.
PL331351A 1996-07-30 1997-07-30 Nowy szczep mikroorganizmu E.coli PL191395B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2240796P 1996-07-30 1996-07-30
PCT/US1997/013359 WO1998004715A1 (en) 1996-07-30 1997-07-30 Novel strains of escherichia coli, methods of preparing the same and use thereof in fermentation processes for l-threonine production

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL331351A1 PL331351A1 (en) 1999-07-05
PL191395B1 true PL191395B1 (pl) 2006-05-31

Family

ID=21809430

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL331351A PL191395B1 (pl) 1996-07-30 1997-07-30 Nowy szczep mikroorganizmu E.coli

Country Status (20)

Country Link
US (1) US5939307A (pl)
EP (1) EP0917578B1 (pl)
JP (2) JP4919529B2 (pl)
KR (1) KR20000029691A (pl)
CN (1) CN1261576C (pl)
AT (1) ATE421587T1 (pl)
AU (1) AU730102B2 (pl)
BR (1) BR9710503A (pl)
CA (1) CA2262813C (pl)
DE (1) DE69739234D1 (pl)
HU (1) HUP9903856A2 (pl)
ID (1) ID19402A (pl)
IL (3) IL128293A (pl)
NO (1) NO320044B1 (pl)
NZ (1) NZ334032A (pl)
PL (1) PL191395B1 (pl)
RU (1) RU2212448C2 (pl)
TR (1) TR199900213T2 (pl)
WO (1) WO1998004715A1 (pl)
ZA (1) ZA976803B (pl)

Families Citing this family (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU741038B2 (en) * 1997-10-04 2001-11-22 Degussa A.G. Method for microbial production of amino acids of the aspartate and/or glutamatefamily and agents which can be used in said method
EP1188822B1 (en) * 1999-04-09 2007-01-24 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid-producing bacteria and process for producing l-amino acid
US6984512B1 (en) * 1999-08-02 2006-01-10 Archer-Daniels-Midland Company Bacterial strains, methods of preparing the same and use thereof in fermentation processes for L-lysine production
PL359585A1 (pl) * 2000-05-27 2004-08-23 Degussa Ag Proces fermentacyjnej produkcji L-treoniny
AU2001265969A1 (en) * 2000-07-18 2002-01-30 Degussa A.G. Process for the fermentative preparation of l-threonine
EP1313838A2 (en) * 2000-08-31 2003-05-28 Degussa AG Fermentation process for the preparation of l-threonine
US6562601B2 (en) * 2000-08-31 2003-05-13 Degussa Ag Fermentation process for the preparation of L-threonine
US20030190712A1 (en) * 2000-08-31 2003-10-09 Degussa Ag Fermentation process for the preparation of L-threonine
US7220571B2 (en) * 2000-09-28 2007-05-22 Archer-Daniels-Midland Company Escherichia coli strains which over-produce L-threonine and processes for the production of L-threonine by fermentation
KR100427480B1 (ko) * 2001-01-16 2004-04-27 씨제이 주식회사 Ｌ-쓰레오닌의 제조방법
KR100397423B1 (ko) * 2001-02-13 2003-09-13 씨제이 주식회사 Ｌ-쓰레오닌의 제조방법
US7368266B2 (en) * 2001-02-13 2008-05-06 Cj Corporation Method for L-threonine production
DK1383903T3 (da) * 2001-04-04 2009-03-23 Genencor Int Fremgangsmåder til fremstilling af askorbinsyre-intermediater i vært-celler
DK1373480T3 (da) * 2001-04-04 2009-05-11 Genencor Int Ukoblede produktive og katabolske værtscellebaner
KR100426807B1 (ko) * 2001-06-19 2004-04-13 씨제이 주식회사 엘-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 엘-쓰레오닌 제조방법
KR100426808B1 (ko) * 2001-06-19 2004-04-13 씨제이 주식회사 엘-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 엘-쓰레오닌 제조방법
DE10132945A1 (de) * 2001-07-06 2003-01-16 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
WO2003004664A2 (en) * 2001-07-06 2003-01-16 Degussa Ag Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family with enhanced fba expression
EP1686184B1 (en) * 2001-07-11 2008-08-27 Evonik Degussa GmbH Process for the preparation of L-threonine using strains of the enterobacteriaceae family
ES2269712T3 (es) * 2001-07-11 2007-04-01 Degussa Gmbh Proceso para la preparacion de l-aminoacidos que utiliza cepas de la familia enterobacteriaceas.
WO2003008614A2 (en) * 2001-07-18 2003-01-30 Degussa Ag Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an enhanced suca or sucb gene
KR100547882B1 (ko) 2002-02-26 2006-02-01 삼성전자주식회사 안테나 선택 다이버시티를 지원하는 이동통신시스템에서순방향 채널 상태 정보를 송수신하는 방법 및 장치
RU2244007C2 (ru) * 2002-02-27 2005-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-треонина, штамм escherichia coli - продуцент треонина (варианты)
DE10210960A1 (de) 2002-03-13 2003-09-25 Degussa Verfahren zur fermentativen Hestellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
KR100451299B1 (ko) * 2002-03-21 2004-10-06 씨제이 주식회사 Ｌ―쓰레오닌의 제조방법
US7378267B1 (en) 2002-05-16 2008-05-27 Cheil Jedang Corporation Method for L-threonine production
WO2004033471A2 (en) * 2002-10-04 2004-04-22 Genencor International, Inc. Glucose transport mutants for production of biomaterial
KR100505797B1 (ko) * 2002-10-11 2005-08-04 씨제이 주식회사 염색체 상의 ｆａｄＲ 유전자가 불활성화된 Ｌ-쓰레오닌 생성 변이 미생물과 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌의 제조방법
KR100478468B1 (ko) * 2003-09-06 2005-03-23 씨제이 주식회사 Ｌ―쓰레오닌의 제조방법
JP4380305B2 (ja) * 2003-11-21 2009-12-09 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
RU2275424C2 (ru) * 2003-12-05 2006-04-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-треонина с использованием бактерий, принадлежащих к роду escherichia
MXPA06003775A (es) * 2004-01-30 2006-06-14 Ajinomoto Kk Microorganismo productor de l-aminoacido y metodo para la produccion de l-aminoacido.
RU2288264C2 (ru) * 2004-02-12 2006-11-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Бактерия, принадлежащая к роду escherichia - продуцент l-треонина и способ получения l-треонина
US20050181488A1 (en) * 2004-02-12 2005-08-18 Akhverdian Valery Z. Method for producing L-threonine using bacteria belonging to the genus Escherichia
US7915018B2 (en) 2004-10-22 2011-03-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids using bacteria of the Enterobacteriaceae family
US20070212764A1 (en) * 2005-01-19 2007-09-13 Ptitsyn Leonid R Method for producing l-amino acids using bacterium of the enterobacteriaceae family
RU2304166C2 (ru) * 2005-01-19 2007-08-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН ltaE
US7723097B2 (en) * 2005-03-11 2010-05-25 Archer-Daniels-Midland Company Escherichia coli strains that over-produce L-threonine and processes for their production
DE102005018835A1 (de) 2005-04-22 2006-11-02 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung verbesserter Stämme der Familie Enterobacteriaceae
CN103497979B (zh) * 2005-06-20 2018-09-11 阿彻-丹尼尔斯-米德兰公司 用于改良生产天冬氨酸衍生的氨基酸及化学品的改变的乙醛酸支路
JP2009095237A (ja) 2006-02-02 2009-05-07 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2009118740A (ja) 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2004803A2 (en) 2006-03-23 2008-12-24 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using bacterium of theenterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small rna
JP2009165355A (ja) 2006-04-28 2009-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
WO2007136133A1 (en) 2006-05-23 2007-11-29 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family
RU2006143864A (ru) 2006-12-12 2008-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
JP2010041920A (ja) 2006-12-19 2010-02-25 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
ES2631360T3 (es) 2007-01-22 2017-08-30 Ajinomoto Co., Inc. Microorganismo que produce un L-aminoácido y procedimiento para producir un L-aminoácido
JP2010110216A (ja) 2007-02-20 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法
JP2010110217A (ja) 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
DE102007051024A1 (de) 2007-03-05 2008-09-11 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
KR100858913B1 (ko) * 2007-03-09 2008-09-17 한국과학기술원 부위특이적 변이에 의해 제조된 고수율의 ｌ－쓰레오닌생산균주 및 이를 이용한 ｌ－쓰레오닌의 제조방법
EP1975241A1 (de) 2007-03-29 2008-10-01 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
JPWO2008133131A1 (ja) 2007-04-16 2010-07-22 味の素株式会社 有機酸の製造方法
BRPI0816429A2 (pt) 2007-09-04 2019-09-24 Ajinomoto Kk microorganismo, e, método para a produção de um l-aminoácido.
DE102007044134A1 (de) 2007-09-15 2009-03-19 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102007052270A1 (de) 2007-11-02 2009-05-07 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP2060636A1 (de) 2007-11-14 2009-05-20 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
WO2009072562A1 (ja) 2007-12-06 2009-06-11 Ajinomoto Co., Inc. 有機酸の製造方法
KR20090075549A (ko) * 2008-01-04 2009-07-08 씨제이제일제당 (주) 향상된 ｌ-쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균 및 이를 이용한ｌ-쓰레오닌의 생산 방법
KR100966324B1 (ko) * 2008-01-08 2010-06-28 씨제이제일제당 (주) 향상된 ｌ－쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균 및 이를 이용한ｌ－쓰레오닌의 생산 방법
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
CN102348806A (zh) 2008-01-23 2012-02-08 味之素株式会社 L-氨基酸的生产方法
RU2008105793A (ru) 2008-02-19 2009-08-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена
EP2098597A1 (de) 2008-03-04 2009-09-09 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102008002309A1 (de) 2008-06-09 2009-12-10 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102008040352A1 (de) 2008-07-11 2010-01-14 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102008044768A1 (de) 2008-08-28 2010-03-04 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von organisch-chemischen Verbindungen unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
WO2010027022A1 (ja) 2008-09-05 2010-03-11 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸生産菌及びｌ－アミノ酸の製造法
WO2010027045A1 (ja) 2008-09-08 2010-03-11 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法
JP2012029565A (ja) 2008-11-27 2012-02-16 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2010084995A2 (en) 2009-01-23 2010-07-29 Ajinomoto Co.,Inc. A method for producing an l-amino acid
EP2267145A1 (de) 2009-06-24 2010-12-29 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
BRPI1014661B1 (pt) 2009-07-29 2020-12-15 Ajinomoto Co., Inc. Método para produzir um l-aminoácido
JP2012196144A (ja) 2009-08-03 2012-10-18 Ajinomoto Co Inc ビブリオ属細菌を用いたｌ−リジンの製造法
JP2012223092A (ja) 2009-08-28 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2013013329A (ja) 2009-11-06 2013-01-24 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2460793C2 (ru) 2010-01-15 2012-09-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
JP2013074795A (ja) 2010-02-08 2013-04-25 Ajinomoto Co Inc 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法
RU2471868C2 (ru) 2010-02-18 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот
RU2482188C2 (ru) 2010-07-21 2013-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE
RU2501858C2 (ru) 2010-07-21 2013-12-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
JP2014036576A (ja) 2010-12-10 2014-02-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2479279A1 (de) 2011-01-20 2012-07-25 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Aminosäuren
CN102181502B (zh) * 2011-05-17 2014-03-19 内蒙古阜丰生物科技有限公司 一种提高发酵生产l-苏氨酸产率的方法
EP2711013A4 (en) 2011-05-18 2015-03-04 Ajinomoto Kk IMMUNSTIMULANDS FOR ANIMALS, FEED THEREFOR AND MANUFACTURING PROCESS THEREFOR
RU2011134436A (ru) 2011-08-18 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности
EP2628792A1 (de) 2012-02-17 2013-08-21 Evonik Industries AG Zelle mit verringerter ppGppase-Aktivität
SG11201407375XA (en) * 2012-05-11 2014-12-30 Univ Minnesota Biosynthetic pathways, recombinant cells, and methods
PL2700715T3 (pl) 2012-08-20 2019-03-29 Evonik Degussa Gmbh Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów z zastosowaniem ulepszonych szczepów z rodziny Enterobacteriaceae
EP2762571A1 (de) 2013-01-30 2014-08-06 Evonik Industries AG Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren
RU2013118637A (ru) 2013-04-23 2014-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK
WO2014185430A1 (ja) 2013-05-13 2014-11-20 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
RU2013140115A (ru) 2013-08-30 2015-03-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB
JP2016192903A (ja) 2013-09-17 2016-11-17 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
RU2013144250A (ru) 2013-10-02 2015-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР
ES2761596T3 (es) 2013-10-02 2020-05-20 Ajinomoto Kk Aparato de control de amoniaco y método de control de amoniaco
EP2886651B1 (en) 2013-10-21 2018-08-22 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acid
WO2015060391A1 (ja) 2013-10-23 2015-04-30 味の素株式会社 目的物質の製造法
RU2014105547A (ru) 2014-02-14 2015-08-20 Адзиномото Ко., Инк. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL
RU2015120052A (ru) 2015-05-28 2016-12-20 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA
WO2017146195A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing l-amino acids using a bacterium of the family enterobacteriaceae overexpressing a gene encoding an iron exporter
WO2017151059A1 (en) * 2016-02-29 2017-09-08 Agency For Science, Technology And Research Multiplexable activation of silent biosynthetic clusters in native actinomycete hosts for natural product discovery
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
US11053526B2 (en) 2018-08-09 2021-07-06 Evonik Operations Gmbh Process for preparing L amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family
EP3608409A1 (en) 2018-08-09 2020-02-12 Evonik Operations GmbH Process for preparing l amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family
RU2697219C1 (ru) * 2018-09-28 2019-08-13 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) Рекомбинантный штамм бактерии Escherichia coli - продуцент L-треонина
EP3861109A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
CN109554322B (zh) * 2018-12-03 2020-08-04 江南大学 一种高产l-苏氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法
BR112021014194A2 (pt) 2019-02-22 2021-12-28 Ajinomoto Kk Método para a produção de um l-aminoácido
WO2020204179A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing l-amino acids
EP4034668B1 (en) 2019-09-25 2024-04-17 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing 2-methyl-butyric acid by bacterial fermentation
WO2021060438A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acids by bacterial fermentation
RU2748676C1 (ru) * 2020-10-05 2021-05-28 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) Штамм Escherichia coli с инактивированным геном ydgI - продуцент L-треонина
CN117157394A (zh) 2021-04-16 2023-12-01 因比奥斯公司 发酵生产
KR20230170961A (ko) 2021-04-16 2023-12-19 인바이오스 엔.브이. 시알릴화 이당 및/또는 올리고당의 세포 생산
KR102727407B1 (ko) * 2021-12-21 2024-11-08 씨제이제일제당 주식회사 L-이소루신 생산 미생물 및 이를 이용한 l-이소루신 생산 방법
IL316086A (en) 2022-04-04 2024-12-01 Ajinomoto Kk Method for controlling parasitic plants

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3375173A (en) * 1964-07-01 1968-03-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fermentation process for the production of l-threonine
GB1122508A (en) * 1965-07-16 1968-08-07 Kyowa Hakko Kogyo Kk Process for producing l-threonine
GB1176125A (en) * 1967-01-21 1970-01-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Process for Producing L-Threonine.
US3582471A (en) * 1967-07-03 1971-06-01 Ajinomoto Kk Method of producing threonine by fermentation
FR1580549A (pl) * 1967-07-28 1969-09-05
GB1185130A (en) * 1967-09-12 1970-03-18 Kyowa Hakko Kogyo Kk Process for producing L-Threonine
US3684654A (en) * 1968-06-17 1972-08-15 Kyowa Hakko Kogyo Kk Process for producing l-threonine
JPS4825515B1 (pl) * 1968-08-17 1973-07-30
GB1342308A (en) * 1970-01-22 1974-01-03 Kyowa Hakko Kogyo Kk Production of threonine and lysine by fermentation
JPS53101591A (en) * 1977-02-15 1978-09-05 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-threonine by fermentation
SU943282A1 (ru) * 1979-07-13 1982-07-15 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Способ получени L-треонина
JPS55131397A (en) * 1979-04-02 1980-10-13 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-threonine by fermentation
JPS55156591A (en) * 1979-05-23 1980-12-05 Ajinomoto Co Inc Method for stabilizing property of bacteria containing plasmid
JPS56134993A (en) * 1980-03-21 1981-10-22 Tanabe Seiyaku Co Ltd Preparation of l-threonine by fermentation method
JPS57186496A (en) * 1981-05-11 1982-11-16 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-threonine by fermentation
SU974817A1 (ru) * 1981-06-16 1990-08-23 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Способ получени L-треонина
US5236831A (en) * 1981-12-29 1993-08-17 Kiowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Amino acid synthesis in corynebacteria using E. coli genes
US4601983A (en) * 1983-06-15 1986-07-22 Ajinomoto Co., Inc. Coryneform bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-threonine and L-isoleucine
JPH0783714B2 (ja) * 1983-08-29 1995-09-13 味の素株式会社 発酵法によるｌ―アミノ酸の製造法
JPS6062982A (ja) * 1983-09-14 1985-04-11 Ajinomoto Co Inc 組換えｄνａ，該組換えｄνａを有する細菌及び該細菌を用いるｌ−スレオニン又はｌ−イソロイシンの製造法
JPH0746994B2 (ja) * 1984-10-04 1995-05-24 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
EP0205849B1 (en) * 1985-05-13 1991-12-04 Toray Industries, Inc. Process for producing l-threonine by fermentation
US5264353A (en) * 1985-08-23 1993-11-23 Toray Industries, Inc. Process for producing L-threonine by fermentation
US5342766A (en) * 1985-08-26 1994-08-30 Toray Industries, Inc. Process for producing L-threonine by fermentation with P. rettgeri.
EP0219808B1 (en) * 1985-10-18 1993-12-22 Toray Industries, Inc. Plasmid with wide host range
US5017483A (en) * 1986-02-20 1991-05-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing L-threonine
JP2516625B2 (ja) * 1986-06-02 1996-07-24 三菱化学株式会社 Ｌ−スレオニンの製造法
US5188949A (en) * 1986-09-29 1993-02-23 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-threonine by fermentation
US5164307A (en) * 1987-01-23 1992-11-17 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing L-amino acids by fermentation
JPS6437295A (en) * 1987-07-31 1989-02-07 Kyowa Hakko Kogyo Kk Production of l-threonine by fermentation
DE3888076T2 (de) * 1987-10-15 1994-07-14 Mitsubishi Petrochemical Co Verfahren zur Herstellung von L-Threonin.
SU1694643A1 (ru) * 1987-11-26 1991-11-30 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент L-треонина
JP2600750B2 (ja) * 1988-01-21 1997-04-16 味の素株式会社 発酵法によるｌ―スレオニンの製造法
US5705371A (en) * 1990-06-12 1998-01-06 Ajinomoto Co., Inc. Bacterial strain of escherichia coli BKIIM B-3996 as the producer of L-threonine
DE3891417C5 (de) * 1988-10-25 2006-01-05 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zur Veränderung eines L-Threonin produzierenden Mikroorganismus und Verwendung eines so erhaltenen Mikroorganismus zur Herstellung von L-Threonin
JP2578492B2 (ja) * 1988-11-10 1997-02-05 協和醗酵工業株式会社 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法
JP3046332B2 (ja) * 1990-08-02 2000-05-29 協和醗酵工業株式会社 発酵法によるアミノ酸の製造法
JP3006926B2 (ja) * 1991-09-04 2000-02-07 協和醗酵工業株式会社 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法
JP3151073B2 (ja) * 1992-02-25 2001-04-03 協和醗酵工業株式会社 発酵法によるアミノ酸の製造法
TW258753B (en) * 1992-06-30 1995-10-01 Dev Center Biotechnology Direct fermentation of L-tryptophan by a recombinant microbe
DE69219775T3 (de) * 1992-10-14 2004-08-05 Ajinomoto Co., Inc. Neuartiges L-threoninproduzierendes Mikrobakterium und eine Herstellungsmethode für L-Threonin
US5998178A (en) * 1994-05-30 1999-12-07 Ajinomoto Co., Ltd. L-isoleucine-producing bacterium and method for preparing L-isoleucine through fermentation

Also Published As

Publication number Publication date
AU730102B2 (en) 2001-02-22
CA2262813A1 (en) 1998-02-05
KR20000029691A (ko) 2000-05-25
CN1261576C (zh) 2006-06-28
IL166146A (en) 2006-12-31
HUP9903856A2 (hu) 2000-03-28
IL166146A0 (en) 2006-01-15
NO990362D0 (no) 1999-01-26
ID19402A (id) 1998-07-09
IL166145A (en) 2006-12-31
PL331351A1 (en) 1999-07-05
JP4919529B2 (ja) 2012-04-18
CA2262813C (en) 2011-09-13
ATE421587T1 (de) 2009-02-15
RU2212448C2 (ru) 2003-09-20
EP0917578A1 (en) 1999-05-26
IL166145A0 (en) 2006-01-15
EP0917578B1 (en) 2009-01-21
ZA976803B (en) 1998-02-19
NO990362L (no) 1999-01-26
IL128293A (en) 2006-12-31
JP2000515763A (ja) 2000-11-28
JP2012070752A (ja) 2012-04-12
NO320044B1 (no) 2005-10-17
BR9710503A (pt) 2000-01-11
DE69739234D1 (de) 2009-03-12
WO1998004715A1 (en) 1998-02-05
IL128293A0 (en) 1999-11-30
CN1226931A (zh) 1999-08-25
NZ334032A (en) 2000-09-29
TR199900213T2 (xx) 1999-04-21
US5939307A (en) 1999-08-17
AU3899497A (en) 1998-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL191395B1 (pl) Nowy szczep mikroorganizmu E.coli
US8101386B2 (en) Escherichia coli strains which over-produce L-threonine and processes for the production of L-threonine by fermentation
EP1687408B1 (en) Method for producing l-amino acid by fermentation
WO1998004715A9 (en) Novel strains of escherichia coli, methods of preparing the same and use thereof in fermentation processes for l-threonine production
AU2001296415A1 (en) Escherichia coli strains which over-produce L-threonine and processes for the production of L-threonine by fermentation
EP2233570B1 (en) L-threonine producing escherichia coli and process for producing l-threonine using same
KR100608084B1 (ko) ｉｃｌＲ 유전자가 불활성화된 Ｌ-쓰레오닌을 생산하는 미생물, 그를 제조하는 방법 및 그를 이용한 Ｌ-쓰레오닌의 제조방법
MXPA99000962A (en) Novel strains of escherichia coli