CN110760467A - 一株发酵乳杆菌及其在功能性黄酒中的应用 - Google Patents

一株发酵乳杆菌及其在功能性黄酒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株发酵乳杆菌及其在功能性黄酒中的应用，属于生物技术领域。本发明提供了一株可耐受黄酒的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2‑34‑1‑2，将此发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2‑34‑1‑2以3×109CFU/mL的浓度添加至黄酒中于4℃下保存40d后，黄酒中发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2‑34‑1‑2的活菌数仍可高达1×106～1×107CFU/mL，因此，本发明的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2‑34‑1‑2在制备富含活性乳酸菌的黄酒中具有极高的应用前景。

Description

一株发酵乳杆菌及其在功能性黄酒中的应用
技术领域
本发明涉及一株发酵乳杆菌及其在功能性黄酒中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
中国是酿酒历史最悠久的国家之一，而黄酒则称得上是我国历史最悠久的酒种。黄酒中营养物质丰富，享有“液体蛋糕”的美名，且具有一定的药用价值，深受消费者的喜爱。
黄酒经过长时间的糖化和发酵后，其中的营养成分更容易被人体吸收。据检测，黄酒中富含氨基酸、糖类、维生素等重要化合物以及硒、锌、铁、铜等多种人体必需的金属元素。其中，硒具有较强的抗肿瘤作用，被公认为是一种天然的肿瘤抑制剂；锌是维持生命活动的多种酶的活性成分；铜与铁则与机体造血、活血和补血等功能有关。此外，黄酒中特有的酚类物质、活性肽及功能性低聚糖等，均有不同程度的保健作用，因此，黄酒可被称为营养保健饮品。
伴随着社会的发展，人们对健康的追求越来越高，烈性酒类对人体有害的观念在人们的脑子里根深蒂固。相反，享有营养保健饮品之誉的黄酒对酒类爱好者的吸引逐渐增加，促进了黄酒行业的迅猛发展。因此，增加黄酒的益生性能对想增加黄酒市场竞争力的黄酒酿造厂商来说愈发重要。
乳酸菌是一种益生菌，因其能够将碳水化合物发酵成乳酸而得名。大量研究表明，乳酸菌能促进动物生长、改善胃肠道功能、提高食物消化率和生物效价、降低血清胆固醇、控制内毒素、抑制肠道内腐败菌生长以及提高机体免疫力等。因此，制备一种富含活性乳酸菌的黄酒对增加黄酒的益生性能十分有帮助。
但是，黄酒中富含乙醇、乙酸和高级醇等抑制乳酸菌菌体存活或生长的物质，这使得乳酸菌很难在黄酒中长时间存活。因此，急需找到一株可耐受黄酒且能够在黄酒中长时间存活的乳酸菌，使得富含活性乳酸菌的黄酒的制备成为可能。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一株可耐受黄酒的发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)。
[技术方案]
为解决上述技术问题，本发明提供了一株发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)M2-34-1-2，所述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019584，保藏日期为2019年07月25日。
所述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2来源于绍兴地区的酿造黄酒样本(即黄酒发酵过程中取得的样品)，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ IDNO.1所示。将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示其与发酵乳杆菌的核酸序列相似度为97.45％，因此，将该菌株命名为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。
所述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2在MRS培养基上的菌落呈圆形、乳白色、凸起、边缘整齐。
本发明还提供了上述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2在制酒中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述酒中，上述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)M2-34-1-2的活菌含量不低于1×106CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述酒中，上述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)M2-34-1-2的活菌含量为1×108～1×109CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述酒为黄酒。
本发明还提供了一种酒，所述酒含有上述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)M2-34-1-2。
在本发明的一种实施方式中，所述酒中，上述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)M2-34-1-2的活菌含量不低于1×106CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述酒中，上述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)M2-34-1-2的活菌含量为1×108～1×109CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述酒为黄酒。
本发明还提供了一种制备上述酒的方法，其特征在于，所述方法为将上述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2添加至酒中，得到上述酒。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将上述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)M2-34-1-2接种至培养基中进行培养，得到培养液；将培养液进行离心，收集菌体；将菌体添加至酒中进行重悬，得到上述酒。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将上述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)M2-34-1-2接种至培养基中进行培养，得到培养液；将培养液进行离心，收集菌体；将菌体用生理盐水或缓冲液洗涤2～3遍后添加至酒中进行重悬，得到上述酒。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基为MRS培养基、MC培养基或LBS培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述培养的温度为35～38℃。
在本发明的一种实施方式中，所述酒为黄酒。
[有益效果]
本发明提供了一株可耐受黄酒的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2，将此发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2以3×109CFU/mL的浓度添加至黄酒中于4℃下保存40d后，黄酒中发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2的活菌数仍可高达1×106～1×107CFU/mL，因此，本发明的发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)M2-34-1-2在制备富含活性乳酸菌的黄酒中具备极高的应用前景。
生物材料保藏
一株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2，其特征在于，所述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2已于2019年07月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019584，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
附图说明
图1：发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2的显微镜镜检形态图。
图2：发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2分别在25℃或4℃下于黄酒中保存3d、7d、10d、15d、20d、30d、40d后的活菌数。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。
下式实施例中涉及的黄酒分别购自浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司、会稽山绍兴酒股份有限公司以及上海金枫酒业股份有限公司，购自浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司、会稽山绍兴酒股份有限公司以及上海金枫酒业股份有限公司的黄酒的酒精度均为8～12％vol、总酸含量均为3.5～8.0g/L(以乳酸计)。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2HPO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4·H2O 0.05g/L、吐温801mL/L、琼脂15g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2HPO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4·H2O 0.05g/L、吐温801mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
实施例1：乳酸菌的筛选及菌种鉴定
1、筛选
将来源于绍兴地区的酿造黄酒样本(即黄酒发酵过程中取得的样品)经预处理后，在20％甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀样本吸取1mL样本，以含有0.05g/L半胱氨酸的0.9％(m/m)生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在含有10％(v/v)乙醇的MRS固体培养基上，于37℃培养48h，挑取比较大的菌落转接至含有10％(v/v)乙醇的MRS液体培养基中，于37℃培养48h，使用紫外分光光度计检测培养液的OD600，选取OD600高的培养液稀释后涂布于MRS固体培养基上，于37℃培养48h，挑取乳酸菌的典型菌落继续接种至MRS固体培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至MRS液体培养基增菌，30％甘油保藏，得到一株菌株；此菌株的菌落呈圆形、乳白色、凸起、边缘整齐，属于乳酸菌的典型菌落。
2、鉴定
提取筛选得到的菌株的基因组，将菌株的16S rDNA进行扩增和测序(扩增得到的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，将获得的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示：此菌株为发酵乳杆菌，命名为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2。
实施例2：乳酸菌的培养和观察
将发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2接入MRS固体培养基中，于37℃厌氧培养24h后，转入新鲜的MRS液体培养基中，同样条件培养24h，6000×g离心菌体15min，0.9％生理盐水洗涤菌体后6000×g再次离心10min，得到发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2的菌体。
取发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2的菌体于显微镜下观察(观察结果见图1)，发现其菌体呈杆状。
实施例3：不同保存温度下黄酒中发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2在的耐受性
取发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2的菌体加入黄酒(此处黄酒分别为购自浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司、会稽山绍兴酒股份有限公司以及上海金枫酒业股份有限公司的黄酒)中至黄酒中发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2的活菌数为3×109CFU/mL，获得富含乳酸菌的黄酒；将富含乳酸菌的黄酒取一半置于4℃下保存40d，另一半置于25℃下保存40d，并且，分别于保存3d、7d、10d、15d、20d、30d、40d后通过平板计数法测定富含乳酸菌的黄酒中发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2的活菌数，检测结果见图2。
由图2可知，将发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2以3×109CFU/mL的浓度添加至黄酒中于4℃下保存40d后，黄酒中发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)M2-34-1-2的活菌数仍可高达1×106～1×107CFU/mL。可见，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2耐黄酒的能力强。
并且，由图2可知，25℃的常温环境不利于发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)M2-34-1-2在黄酒中的生存，应将含有发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)M2-34-1-2的黄酒在如4℃的低温下冷藏。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一株发酵乳杆菌及其在功能性黄酒中的应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1137
<212> DNA
<213> 发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）
<400> 1
cccccccata atctctgtcc caccttaggc ggctggctcc taaaaggtta ccccaccgac 60
tttgggtgtt acaaactctc atggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat 120
tcaccgcggc atgctgatcc gcgattacta gcgattccga cttcgtgcag gcgagttgca 180
gcctgcagtc cgaactgaga acggttttaa gagatttgct tgccctcgcg agttcgcgac 240
tcgttgtacc gtccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc ataaggggca tgatgatctg 300
acgtcgtccc caccttcctc cggtttgtca ccggcagtct cactagagtg cccaacttaa 360
tgctggcaac tagtaacaag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac 420
acgagctgac gacgaccatg caccacctgt ctttgcgttc ccgaaggaaa cgccctatct 480
ctagggttgg cgcaagatgt caagacctgg taaggttctt cgcgtagctt cgaattaaac 540
cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagtttcaa ccttgcggtc 600
gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt agctccggca ctgaagggcg gaaaccctcc 660
aacacctagc actcatcgtt tacggcatgg actaccaggg tatctaatcc tgttcgctac 720
ccatgctttc gagtctcagc gtcagttgca gaccacgtag ccgccttcgc cactggtgtt 780
cttccatata tctacgcatt ccaccgctac acatggagtt ccactaccct cttctgcact 840
caagttatcc agtttccgat gcacttctcc ggttaagccg aaggctttca catcagactt 900
agaaaaccgc cctgcactct ctttacgccc aataaatccc ggatacgctt gccacctacg 960
taattaccgc ggactgctgg ccacgtagtt agccgtgact ttctggttaa ataccgtcca 1020
cgtatgaaca gtacttcctc atacgtgttc ttctttaaca acgagcttta cgaagccgaa 1080
cccttcttca cattcaggca gtgtttgcct tcctatcaag cttggcagcc catagtt 1137

Claims (10)

1.一株发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)，其特征在于，所述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019584，保藏日期为2019年07月25日。
2.权利要求1所述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)在制酒中的应用。
3.一种酒，其特征在于，所述酒含有权利要求1所述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)。
4.如权利要求3所述的一种酒，其特征在于，所述酒中，权利要求1所述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)的活菌含量不低于1×106CFU/mL。
5.如权利要求3或4所述的一种酒，其特征在于，所述酒为黄酒。
6.一种制备权利要求3-5任一所述酒的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1所述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)添加至酒中，得到权利要求3-5任一所述酒。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1所述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)接种至培养基中进行培养，得到培养液；将培养液进行离心，收集菌体；将菌体添加至酒中进行重悬，得到权利要求3-5任一所述酒。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1所述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)接种至培养基中进行培养，得到培养液；将培养液进行离心，收集菌体；将菌体用生理盐水或缓冲液洗涤2～3遍后添加至酒中进行重悬，得到权利要求3-5任一所述酒。
9.如权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于，所述培养基为MRS培养基、MC培养基或LBS培养基。
10.如权利要求6-9任一所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为35～38℃。
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