JP5159319B2 - 新規ヒダントイナーゼ及びn−カルバモイル−d−アミノ酸の製造方法 - Google Patents
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Description
1)本発明の一つの特徴は、以下の(a)、(b)又は(c)のポリペプチドである:
(a)配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(b)配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチド;
(c)配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列と73%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチド。
5)本発明の一つの特徴は、以下の(d)、(e)、(f)または(g)のDNAである:
(d)配列表配列番号2に示される塩基配列からなるDNA、
(e)配列表配列番号2に示される塩基配列において1若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および/または付加された塩基配列を有し、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA、
(f)配列表配列番号2に示される塩基配列と69%以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA、
(g)配列表配列番号2に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
6)本発明の一つの特徴は、前記DNAを含む組換えプラスミドである。
7)本発明の一つの特徴は、前記組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体である。
8)本発明の一つの特徴は、前記ポリペプチドを生産する能力を有し、かつ、アネウリニバチルス(Aneurinibacillus)属に属する微生物である。
9)本発明の一つの特徴は、前記ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積させ、これを採取することを特徴とするヒダントイナーゼの製造方法である。
11)本発明の一つの特徴は、前記ヒダントイナーゼ(ヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチド)、形質転換体、または微生物を、5−置換ヒダントインに作用させN−カルバモイル−D−アミノ酸(例えば、N−カルバモイル−D−α−アミノ酸)を製造する方法である。
1.ヒダントイナーゼ活性測定
実施形態において、ポリペプチドのヒダントイナーゼ活性測定は、反応で生成するN−カルバモイルアミノ酸を、以下に示すp−ジメチルアミノベンズアルデヒドを用いた発色法で定量することができる。
2.微生物
実施形態のポリペプチドは、ヒダントイナーゼ活性を有する微生物から取得できる。同ポリペプチドを生産する微生物であれば特に限定されないが、例として、好ましくはアネウリニバチルス(Aneurinibacillus)属に属する微生物が挙げられ、なかでもアネウリニバチルス・エスピー(Aneurinibacillus sp.)が好ましい。さらに好ましくは、本発明者らが土壌より新たに分離したアネウリニバチルス・エスピー(Aneurinibacillus sp.)KNK491C株である。なお、本発明で得られたアネウリニバチルス・エスピー(Aneurinibacillus sp.)KNK491C株は平成18年11月20日に受託番号FERM BP−10735として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(〒305−8566 茨城県つくば市東1丁目1番1号)に寄託されている。
2−1.形態
1)直径0.8μm、長さ2.0〜3.0μm程度の桿菌
2)グラム染色:不定
3)運動性:あり
4)胞子形成:あり
2−2.培養的性質
1)ニュートリエントアガー(オキソイド製)培地でのコロニー形態:淡黄色、不規則形、中央隆起、周縁波状、表面スムーズ、不透明
2)生育温度:20℃生育性有り、30℃生育性あり、45℃生育性あり、55℃生育性なし
3)嫌気条件下での生育性:なし
2−3.生理学的試験
1)カタラーゼ活性:+
2)オキシダーゼ活性:+
3)グルコースからの酸/ガス産生:−/−
4)O/Fテスト(酸化/発酵):−/−
5)酸化試験
グリセロール:+
エリスリトール:−
D−アラビノース:−
L−アラビノース:−
リボース:+
D−キシロース:−
L−キシロース:−
アドニトール:−
β−メチル−D−キシロース:−
ガラクトース:−
フラクトース:+
マンノース:−
ソルボース:−
ラムノース:−
ズルシトール:−
イノシトール:−
マンニトール:−
ソルビトール:−
α−メチル−D−マンノース:−
α−メチル−D−グルコース:−
N−アセチルグルコサミン:−
アミグダリン:−
アルブミン:−
エスクリン:−
サリシン:−
セロビオース:−
マルトース:−
乳糖:−
メリビオース:−
白糖:−
トレハロース:−
イヌリン:−
メレチトース:−
ラフィノース:−
澱粉:−
グリコーゲン:−
キシリトール:−
ゲンチオビオース:−
D−ツラノース:−
D−リキソース:−
D−タガトース:−
D−フコース:−
L−フコース:−
D−アラビトール:−
L−アラビトール:−
グルコネート:−
2−ケトグルコン酸:−
5−ケトグルコン酸:−
6)β−ガラクトシダーゼ活性:−
7)アルギニンジヒドロラーゼ活性:−
8)リシンデカルボキシラーゼ活性:−
9)オルチニンデカルボキシラーゼ活性:−
10)クエン酸の利用性:−
11)H2S産生:−
12)ウレアーゼ活性:−
13)トリプトファンデアミナーゼ活性:−
14)インドール産生:−
15)アセトイン産生(VP):+
16)ゼラチナーゼ活性:−
17)硝酸塩還元:+
18)カゼインの加水分解:−
19)資化性
L−アスパラギン酸ナトリウム:+
D−フラクトース:+
フマル酸ナトリウム:+
D−グルコン酸ナトリウム:+
D−グルコサミン:−
グルタミン酸ナトリウム:+
DL−グリセリン酸ナトリウム:−
グリセロール:+
DL−乳酸ナトリウム:+
ラクトース:−
D−リンゴ酸ナトリウム:+
マルトース:−
プトレスシン:+
L−ソルボース:−
サッカロース:−
L−酒石酸ナトリウム:−
D−トレハロース:−
2−4.16SrDNA塩基配列解析
アネウリニバチルス・エスピー(Aneurinibacillus sp.)KNK491C株の16SrDNA塩基配列を決定し、国際塩基配列データベース(GeneBank,DDBJ,EMBL)に対し、検索ソフトとしてBLASTを使用して相同性検索を行なった結果、最も高い相同性を示した菌はアネウリニバチルス・ミグランス(Aneurinibacillus migulanus)DSM2895株であり、相同率は99.9%であった。
3.アミノ酸配列
本発明のポリペプチドは、上記のように微生物から取得される天然酵素であってもよいし、遺伝子組換え技術を利用して生産される組換え酵素であってもよい。天然酵素としては、配列表の配列番号1に示されるポリペプチドをあげることができる。
4.DNA
本発明の実施形態としての「DNA」について説明する。本発明のDNAは、上記のようなポリペプチドをコードするDNAであればよい。配列表の配列番号2で示されるDNAであってもよいし、配列表配列番号2に示される塩基配列において1若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および/または付加された塩基配列を有し、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAであってもよい。「数個の塩基」とは、DNAによってコードされるポリペプチドがヒダントイナーゼ活性を失われない限り、その個数は制限されないが、好ましくは50塩基以下であり、より好ましくは30塩基以下、さらに好ましくは20アミノ酸以下、最も好ましくは、10、9、8、7、6、5、4、3、または2個以下である。
5.形質転換体・ベクター
上記方法によって取得したDNA、または該DNAをベクターに組み込んで得られる組換えプラスミドを用いることにより、宿主微生物を形質転換し形質転換体を得ることができる。
6.形質転換体等の培養
本発明のヒダントイナーゼを生産しうる上記形質転換体等を培養することにより当該酵素を大量に生産することができ、N−カルバモイル−D−アミノ酸の製造に利用することができる。
7.N−カルバモイル−D−アミノ酸の製造方法
実施形態で得られるヒダントイナーゼを使用することによる、効率的なN−カルバモイル−D−アミノ酸の製造方法について説明する。N−カルバモイル−D−アミノ酸は5−置換ヒダントインにヒダントイナーゼを作用させ、立体選択的に加水分解することにより得ることができる。5−置換ヒダントインはラセミ体であってもよく、また、L体あるいはD体のような光学活性体であってもよい。ヒダントイナーゼによる立体選択的加水分解反応と、基質の化学的なラセミ化が同時に進行することにより、ラセミ体、L体、またはD体のいずれの5−置換ヒダントインを基質とした場合からでも、すべて対応するN−カルバモイル−D−アミノ酸に変換されうる。
8.生成物の単離
生成したN−カルバモイル−D−アミノ酸の単離は、常套分離方法、例えば、抽出、濃縮、晶析、またはカラムクロマトグラフィーなどの分離方法や、それらの組み合わせにより分離、精製することができる。また、上記記載の方法にて得られたN−カルバモイル−D−アミノ酸は、化学的、または脱カルバモイル活性を有する酵素の作用により、容易に対応するD−アミノ酸に変換することができる。
アネウリニバチルス・エスピー(Aneurinibacillus sp.)KNK491C株(FERM BP−10735)を500mL坂口フラスコ内で滅菌した100mLの培地A(肉エキス1.0%、ペプトン1.0%、酵母エキス0.5%、滅菌前pH7.5)に植菌して37℃で30時間、好気的に振とう培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を集菌し、Marmur法を用いて染色体DNAを調製した。
実施例1で得られたヒダントイナーゼ遺伝子を有するプラスミドを鋳型として、ヒダントイナーゼ遺伝子のN末端に制限酵素NdeIの切断部位を結合させたプライマー(Primer−1:配列表の配列番号3)及び、ヒダントイナーゼ遺伝子の1228塩基目に存在するNdeIの切断部位をアミノ酸置換が起こらないように変更したプライマー(Primer−2:配列表の配列番号4)を用いてPCRによるDNA増幅を行ない、約1.2KbpのN末側DNA断片を得た。同様にヒダントイナーゼのC末端部分に制限酵素HindIIIの切断部位を結合させた配列を持つプライマー(Primer−3:配列表の配列番号5)及び、ヒダントイナーゼ遺伝子の1228塩基目に存在するNdeIの切断部位をアミノ酸置換が起こらないように変更したプライマー(Primer−4:配列表の配列番号6)を用いて、PCRによるDNA増幅を行ない、約0.2KbpのC末側DNA断片を得た。上記N末側DNA断片とC末側DNA断片を混合したものを鋳型として、Primer−1及びPrimer−3を用いたPCRによるDNA増幅を行ない、配列表の配列番号7に示されるDNA断片を取得した。得られたDNA断片を制限酵素NdeIとHindIIIで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドpUCNT(国際公開第WO94/03613号公報の明細書の記載に基づいて当業者が製造可能)とT4DNAリガーゼを用いて結合することで、図1の制限酵素地図で表され、ヒダントイナーゼ遺伝子を大量に発現できるように設計されたプラスミドpALH101を取得した。
実施例2で得られたプラスミドpALH101をエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)HB101のコンピテントセルと混合することで形質転換を行い、寒天培地C(トリプトン10g、イーストエキス5g、塩化ナトリウム10g、寒天15g、アンピシリン100mg、脱イオン水にて1Lにメスアップ、滅菌前pH7.0、ただしアンピシリンは滅菌後に添加した。)にプレーティングして、ヒダントイナーゼ遺伝子を含む組換え体DNAを含有する形質転換体エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)HB101(pALH101)(FERM P−20712)をコロニーとして取得した。
アネウリニバチルス・エスピー(Aneurinibacillus sp.)KNK491C株を500mL坂口フラスコ内で滅菌した培地E(肉エキス2.0%、イーストエキス1.0%、塩化ナトリウム0.3%、ウラシル0.5%、塩化マンガン4水和物0.002%、滅菌前pH7.5)に植菌して37℃で20時間、好気的に振とう培養した。得られた培養液に5−メチルヒダントイン10.0gを添加し、6M水酸化ナトリウム水溶液にてpHを8.7に保ちつつ、55℃にて20時間攪拌した。生成したN−カルバモイル−D−アラニンの変換率をHPLCを用いて分析したところ、96.3%であった。また、得られたN−カルバモイル−D−アラニンに硫酸存在下、亜硝酸ナトリウムを作用させて脱カルバモイル化し、生成したD−アラニンの光学純度をHPLCを用いて分析したところ、96.1%e.e.であった。HPLC分析は次に示す条件で実施した。
(変換率分析)カラム:COSMOSIL 5C18ARII(4.6mm×250mm、ナカライテスク社製)、移動相:10mMリン酸カリウム緩衝液(pH2.0)、流速:1.0mL/min.、カラム温度:20℃、検出:210nm
(光学純度分析)カラム:SUMICHIRAL OA−5000(4.6mm×250mm、住化分析センター社製)、移動相:0.5mM硫酸銅水溶液、流速:0.5mL/min.、カラム温度:10℃、検出:254nm
(実施例5)ヒダントイナーゼ遺伝子形質転換体を利用したN−カルバモイル−D−アラニンの合成
実施例3で得たヒダントイナーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)HB101(pALH101)を坂口フラスコ内にて滅菌した100mLの培地Dに植菌し、37℃にて24時間、好気的に振とう培養した。培養液10mLから遠心分離により菌体を集菌し、0.1mM 硫酸マンガン、0.1M Tris−塩酸緩衝液(pH8.5)10mLに懸濁して超音波により菌体を破砕後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた粗酵素液40μLに、0.1M Tris−塩酸緩衝液(pH8.7)1.96mL、5−メチルヒダントイン400mgを添加して、10M 水酸化ナトリウム水溶液にてpHを8.7に保ちつつ、50℃にて29時間攪拌した。生成したN−カルバモイル−D−アラニンの変換率を実施例4と同様の方法で分析したところ、97.0%であった。また、得られたN−カルバモイル−D−アラニンに硫酸存在下、亜硝酸ナトリウムを作用させて脱カルバモイル化し、生成したD−アラニンの光学純度を実施例4と同様の方法で分析したところ、89.9%e.e.であり、後述の比較例1に記述したバチルス・エスピー(Bacillus sp.)KNK245株(FERM BP−4863)由来ヒダントイナーゼ遺伝子形質転換体を利用した場合の反応と比較して、高い光学純度のN−カルバモイル−D−アラニンが得られた。
実施例5で得たエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)HB101(pALH101)の粗酵素液を用いて、各種ヒダントインに対する活性を測定した。ヒダントイナーゼの活性測定は、次のように実施した。基質溶液4mL(30mM 各種ヒダントイン(ただし5−ベンジルヒダントインのみ15mM)、0.1mM 塩化マンガン、50mM 炭酸ナトリウム/炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH8.7))と、適宜希釈した粗酵素液0.1mLを混合し、40℃で15分間反応させた後、5N HClを2mL添加して反応を停止した。次いで、10%(w/v)p−ジメチルアミノベンズアルデヒド/35%塩酸溶液1mLを混合し、遠心分離して得られた上清の440nmにおける吸光度を測定した。予め作成した検量線に基づき、反応液中に生成したN−カルバモイルアミノ酸を定量した。表1は、5−メチルヒダントインを基質とした場合の活性を100%としたときの相対活性値を示す。
バチルス・エスピー(Bacillus sp.)KNK245株(FERM BP−4863)由来のヒダントイナーゼ遺伝子を有する形質転換体エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)HB101(pTH104)(FERM BP−4864)を坂口フラスコ内にて滅菌した100mLの培地Dに植菌し、37℃にて24時間、好気的に振とう培養した。培養液から遠心分離により集菌し、0.1mM 硫酸マンガン、0.1M Tris−塩酸緩衝液(pH8.5)10mLに懸濁して超音波により菌体を破砕後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた粗酵素液160μLに、0.1M Tris−塩酸緩衝液(pH8.7)1.84mL、5−メチルヒダントイン400mgを添加して、10M 水酸化ナトリウム水溶液にてpHを8.7に保ちつつ、50℃にて29時間攪拌した。生成したN−カルバモイル−D−アラニンの変換率を実施例4と同様の方法で分析したところ、97.5%であった。また、得られたN−カルバモイル−D−アラニンに硫酸存在下、亜硝酸ナトリウムを作用させて脱カルバモイル化し、生成したD−アラニンの光学純度を実施例4と同様の方法で分析したところ、69.7%e.e.であった。
(参考例1)形質転換微生物エシェリヒア・コリHB101(pNT4553)を用いたデカルバモイラーゼ粗酵素液の調製
実施例1で説明したコロニーの選択において使用するデカルバモイラーゼ粗酵素液の調製は、以下の方法で行った。遺伝子改変により耐熱性の向上したアグロバクテリウム・エスピー(Agrobacterium sp.)KNK712株(FERM BP−1900)由来のデカルバミラーゼ遺伝子を含有するエシェリヒア・コリ HB101(pNT4553)(FERM BP−4368)を試験管内で滅菌した10mLの培地F(トリプトン16g、イーストエキス10g、塩化ナトリウム5g、アンピシリン100mg、脱イオン水にて1Lにメスアップ、滅菌前pH7.0、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する)に植菌し、37℃にて12時間、好気的に振とう培養した。この培養液3.5mLを、坂口フラスコ内で滅菌した350mLの培地Cに植菌し、37℃にて30時間、好気的に振とう培養した。得られた培養液を超音波処理にかけて菌体を破砕し、50℃にて30分間保温後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。
Claims (10)
- 以下の(a)、(b)又は(c)のポリペプチド:
(a)配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(b)配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列において20個以下のアミノ酸が置換、
挿入、欠失および/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチド;
(c)配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドであって、前記相同性は、遺伝情報処理ソフトウェアGENETYX Ver.7/ネットワーク版(ゼネティックス社製)のホモロジー検索を使用して求めているポリペプチド。 - アネウリニバチルス(Aneurinibacillus)属に属する微生物に由来する請求項1に記載のポリペプチド。
- アネウリニバチルス・エスピー(Aneurinibacillus sp.)KNK491C(FERM BP−10735)に由来する請求項1に記載のポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドをコードするDNA。
- 以下の(d)、(e)、(f)、又は(g)のDNA:
(d)配列表配列番号2に示される塩基配列からなるDNA、
(e)配列表配列番号2に示される塩基配列において50個以下の塩基が置換、挿入、欠失および/または付加された塩基配列を有し、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA、
(f)配列表配列番号2に示される塩基配列と95%以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAであって、前記相同性が、遺伝情報処理ソフトウェアGENETYX Ver.7/ネットワーク版(ゼネティックス社製)のホモロジー検索を使用して求めているDNA、
(g)配列表配列番号2に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAと、75mMクエン酸三ナトリウム、750mM塩化ナトリウム、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム、0.1%ウシ血清アルブミン、0.1%ポリビニルピロリドン、および、0.1%Ficoll 400の組成からなる水溶液中、65℃でハイブリダイゼーションを実施した後に、1.5mMクエン酸三ナトリウム、15mM塩化ナトリウム、および0.1%ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、60℃で洗浄が行われる条件下でハイブリダイズし、かつヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA。 - 請求項4又は5のいずれかに記載のDNAをベクターに挿入して得られる組換えプラスミド。
- 請求項6に記載の組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体。
- アネウリニバチルス・エスピー(Aneurinibacillus sp.)KNK491C(FERM BP−10735)。
- 請求項7に記載の形質転換体、または、請求項8に記載のアネウリニバチルス・エスピー(Aneurinibacillus sp.)KNK491C(FERM BP−10735)を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積させ、これを採取することを特徴とするヒダントイナーゼの製造方法。
- 請求項1に記載のポリペプチド、請求項7に記載の形質転換体、または請求項8に記載のアネウリニバチルス・エスピー(Aneurinibacillus sp.)KNK491C(FERM BP−10735)を、5−置換ヒダントインに作用させ、N−カルバモイル−D−アミノ酸を製造する方法。
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