JPS6236672B2

JPS6236672B2 -

Info

Publication number: JPS6236672B2
Application number: JP10339480A
Authority: JP
Inventors: Osamu Tosaka; Masuyoshi Sugano; Shigeo Ikeda; Hiroi Yoshii
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1980-07-28
Filing date: 1980-07-28
Publication date: 1987-08-07
Also published as: JPS5729290A

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は、発酵法によるＬ−リジンの製造法
に関する。本発明者らは、より効率の高いＬ−リ
ジン生産菌を誘導すべく研究した結果、ブレビバ
クテリウム属又はコリネバクテリウム属のＬ−リ
ジン生産菌のホスフオエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼ（EC 4、１、１、31以下、PEPCと
記す）活性が、親株の1.2倍以上の活性を有する
変異株のうちより、高い頻度でＬ−リジンの生産
能が、親株より高い菌株を得た。本発明において使用される変異株は、ブレビバ
クテリウム属又はコリネバクテリウム属に属し、
PEPC活性が、親株のそれより1.2倍以上高くなつ
ていて、更に従来のＬ−リジン生産性付与の為に
必要な性質、（例えば、Ｓ−（２−アミノエチル）
−Ｌ−システイン（以下、ＡＥＣと記す）耐性、
ホモセリン要求性、α−クロロカプラクタム耐
性）即ち、Ｌ−リジン生産能を有しているもので
ある。具体的に例示すれば、以下のものがある。ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム AJ 11604 FERM−P 5629 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム AJ 11605 FERM−P 5630 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム AJ 11606 FERM−P 5631 コリネバクテリウム・グルタミクム AJ 11607 FERM−P 5632 この様な変異株を得る際に使用される親株とし
ては、すでにＬ−リジンを生産する事が知られて
いるブレビバクテリウム属およびコリネバクテリ
ウム属の変異株が用いられる。更に下記に例示したブレビバクテリウム属およ
びコリネバクテリウム属の野性株も本親株として
使用できる。ブレビバクテリウム・デイバリカタム ATCC 14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 14067 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム ATCC 13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825 コリネバクテリウム・グルタミクムATCC 13032 コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム ATCC 13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC 15806 これらの野性株に先にＬ−リジン生産能を付与
してもよいが、先にPEPC活性が高い菌株を誘導
し、後でＬ−リジン生産能を付与してもよい。これらの親株を変異処理する方法は、Ｎ−メチ
ル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンに接
触せしめる等の通常の方法が、適用できる。変異処理した菌株よりPEPC活性の高い菌株を
得るには、本発明者らの知見によれば、モノフル
オロ酢酸に耐性を有する変異株を選択すれば、高
い頻度でPEPC活性が強化された菌株が得られ
る。従つて先ずモノフルオロ酢酸に耐性を有する変
異株を選択したのち、それぞれの菌株について
PEPC活性を測定し、PEPC活性が望ましい程度
にまで強化された菌株を選べばよい。モノフルオロ酢酸に耐性を有する変異株の選別
方法は、通常の方法でよい。PEPC活性の測定方
法は、T.Nishikidoらの方法（Biochem.Biophys.
Res.Comm.21、Ｐ95（1965））を用いて行つた。本発明の変異株に更に従来Ｌ−リジン生産性を
高めることが等られている性質、例えば、Ｌ−ロ
イシン要求性、Ｌ−アラニン要求性、Ｌ−セリン
要求性、Ｌ−ロイシンアナログ耐性、フロロピル
ビン酸感受性、γ−メチルリジン耐性等を付与す
れば、よりＬ−リジン収率が高くなることが多
い。上記例示の変異株について、その具体的誘導法
の１例と得られた菌株について、モノフルオロ酢
酸に対する耐性度を第１表に、PEPC活性を第２
表に、それぞれ親株と比較して示す。

【表】

【表】実験方法 (1) ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム AJ 11273（ＦＥＲＭ−Ｐ 4547）（AEC^r、
CCL^r、Ala^-、EP^s）を常法により、Ｎ− メチル
−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンにて
処理（250μｇ／ml、30℃で30分）した後、以
下に示す最少培地に、モノフルオロ酢酸を親株
を阻害する濃度に添加した培地で生育したコロ
ニーを採取した。最少培地組成：グルコース 2.0ｇ／dl 尿素 0.25ｇ／dl 硫酸アンモニウム 1.0ｇ／dl KH₂PO₄ 0.1ｇ／dl MgSO₄・7H₂O 0.04ｇ／dl FeSO₄・7H₂O 0.1mg／dl Ｌ−アラニン 50mg／dl ニコチン酸アミド 0.5mg／dl MnSO₄・4H₂O 1.0mg／dl ビオチン 5.0μｇ／dl サイアミン・塩酸塩 10μｇ／dl NaCl 5.0mg／dl pH7.2 この様にして得られた変異株の内、Ｌ−リジ
ン生産能のすぐれた変異株として AJ 11604（ＦＥＲＭ−Ｐ 5629）（AEC^r、
CCL^r、Ala^-、EP^s、MF^r、 KM^r）、ＡＪ 11605
（ＦＥＲＭ−Ｐ 5630）（AEC^r、CCL^r、A la^-、
FP^s、MF^r）を採取した。又、同様の方法により、コリネバクテリウ
ム・アセトグルタミクムAJ 11094（ＦＥＲＭ−
Ｐ 3856）（AEC^r、Ala^-）を親株としてＡＪ
11606（ＦＥＲＭ−Ｐ 5631）（AEC^r、Ala^-、
MF^r）を採取した。更に同様の方法により、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムＡＪ 3463（ＦＥＲＭ−Ｐ
1987）（AEC^r）を親株として、AJ 11607
（ＦＥＲＭ−Ｐ 5632）（AEC^r、MF^r）を得た。 Ala^-：アラニン要求性 CCL^r：α−クロロカプロラクタム耐性 EP^s：フルオロピルビン酸感受性 KM^r：ケトマロン酸耐性 MF^r：モノフルオロ酢酸耐性 (2) 下記の組成の培地にモノフルオロ酢酸を添加
し、その４mlを小型試験管に分注し、殺菌後、
試験菌株を接種して、30℃にて、24時間、培養
した。吸光度を測定して、相対生育度を算出し、各
菌株の耐性度を調べた。培地組成：グルコース 2.0ｇ／dl （NH₄)₂SO₄ 1.0ｇ／dl KH₂PO₄ 0.1ｇ／dl MgSO₄・7H₂O 0.04ｇ／dl NaCl 0.05ｇ／dl 尿素 0.25ｇ／dl ビチオン 5.0μｇ／dl サイアミン塩酸塩 20μｇ／dl FeSO₄・7H₂O 1.0mg／dl MnSO₄・4H₂O 1.0mg／dl Ｌ−アラニン 50mg／dl ニコチン酸アミド 0.5mg／dl pH7.2（ＫＯＨによる）これらの変異株およびその親株のPEPC活性
を測定した結果を第２表に示す。

【表】実験方法は：Biochem.Biophys.Res.Comm.
21、Ｐ95（1965）に記載の方法に準じて行つ
た。酵素標品は、次のように調整した。グルコース10ｇ／dl、硫酸アンモニウム4.5
ｇ／dl、KH₂PO₄0.1ｇ／dl、MgSO₄・
7H₂O0.04ｇ／dl、FeSO₄・7H₂O1.0mg／dl、
MnSO₄・4H₂O1.0mg／dl、ビオチン500μｇ／
、サイアミン塩酸塩200μｇ／、大豆タン
パク塩酸加水分解液濃縮物（総窒素７％）1.5
ml／dl、および炭酸カルシウム（別殺菌添加）
５ｇ／dlを含み、pH8.0に調節した培地を用い
て31℃、48時間とう培養後、集菌した。トリ
ス・塩酸バツフアー（pH7.5、0.56Ｍ）で２回
洗浄し、超音波破砕（10ＫＣ、５分間）後
12000rpm−30分後遠沈し、破砕物を除いた。上清は、「セフアデツクスＧ−10」を用
い、低分子物質を除き、ゲル濾過した液を酵素
標品として用いた。これらの微生物をもちいてＬ−リジンを生産
せしめるには、とくに困難はなく、炭素源、窒
素源、無機塩類、生育因子および使用する微生
物が要求する栄養物質を含有する通常の栄養培
地をもちいて常法によりおこなう。もちいられ
る炭素源としては、グルコース、シユークロー
ス、糖密、デンプン加水分解液などの糖類、酢
酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、
プロパノールなどのアルコール類などが使用で
きる。窒素源としては、硫安、硝安、塩安、リン
安、尿素、アンモニアその他を使用できる。培養方法は、通気培養が良く、発酵温度は、
24〜37℃、発酵日数は通常２〜７日である。発
酵開始時および培養中のpHは5.0〜9.0が良く、
pHの調整には、無機あるいは有機の酸性あるい
はアルカリ性物質、更には尿素、炭素カルシウ
ム、アンモニアガスなどを使用することができ
る。発酵液からのＬ−リジンの採取は、通常イ
オン交換樹脂法、その他の公知の方法を組み合
わせることにより、おこなわれ、培地の種類に
よつては、直接晶析法により行なうことも可能
である。実施例１下記の組成の培地を20ml宛、500ml容振とうフ
ラスコに分注し、110℃にて５分間蒸気殺菌し
た。培地組成：グルコース 10ｇ／dl 硫酸アンモニウム 4.5ｇ／dl KH₂PO₄ 0.1ｇ／dl MgSO₄・7H₂O 0.04ｇ／dl FeSO₄・7H₂O 1.0mg／dl MnSO₄・4H₂O 1.0mg／dl ビオチン 5.0μｇ／dl サイアミン塩酸塩 20μｇ／dl 大豆タンパク塩酸加水分解液濃縮物（総窒素７
％）1.5ml／dl 炭酸カルシウム（別殺菌添加）５ｇ／dl pH7.0 上記の如く調製したフラスコ中の培地に、あら
かじめグルコース・ブイヨンスラント上で育成せ
しめた第３表に示す菌株を１白金耳ずつ接種し、
それらを３℃にて72時間振とう培養した。72時間
培養後の培地中のＬ−リジン生成量を、酸性−銅
ニンヒドリン反応を用いる比色法によつて行つ
た。結果を第３表に示す。

【表】同様にして培養したＡＪ 11604株の培養終了液
を集め、遠心分離によつて、菌体およびカルシウ
ム塩を除いた上清液１を強酸性イオン交換樹脂
「アンバーライト」ＩＲ−120 ＯＨ型）に通過さ
せ、Ｌ−リジンを吸着させた。ついで、３％アン
モニア水で吸着したＬ−リジンを溶出し、溶出液
を減圧濃縮した。濃縮液に塩酸を添加した後冷却
し、Ｌ−リジンをＬ−リジン塩酸塩第２水和物と
して析出させ、結晶38.5ｇを得た。実施例２コリネバクテリウム・グルタミクムＡＪ11607お
よびその親株ＡＪ 3463をそれぞれスランド上より
１白金耳かきとり、次記種培養培地50mlに接種
し、18時間、31℃にて通気攪拌培養をおこなつて
種培養液を調整した。種培養培地組成：グルコース 1.5ｇ／dl 酢酸アンモニウム 0.3ｇ／dl 尿素 0.1ｇ／dl KH₂PO₄ 0.1ｇ／dl MgSO₄・7H₂O 0.04ｇ／dl FeSO₄・7H₂O 1.0mg／dl MnSO₄・4H₂O 1.0mg／dl ビオチン 5.0μｇ／dl サイアミン塩酸塩 20μｇ／dl 大豆タンパク塩酸加水分解液濃縮物（総窒素７
％）2.0ml／dl pH7.5 一方、１容小型ガラス製ジヤー・フアーメン
ターに次記の組成より成る主発酵培地を300ml宛
分注し、常法により殺菌した。これらに上記の種培養液をそれぞれ15ml宛接種
し、31℃にて通気攪拌培養を開始した。主発酵培地組成：グルコース 2.0ｇ／dl 酢酸アンモニウム 0.5ｇ／dl 尿素 0.2ｇ／dl KH₂PO₄ 0.1ｇ／dl MgSO₄・7H₂O 0.04ｇ／dl FeSO₄・7H₂O 1.0ml／dl MnSO₄・4H₂O 1.0mg／dl ビオチン 5.0μｇ／サイアミン塩酸塩 50μｇ／ニコチン塩酸塩 1.0mg／大豆タンパク塩酸加水分解液濃縮物（総窒素７
％）3.0ml／dl pH7.2 培養液中に、酢酸と酢酸アンモニウムとの混合
液（酢酸：酢酸アンモニウムとの混合液のモル比
は１：0.25、混合液の酢酸濃度は60％）を培地の
pHを7.2〜8.0の間に保持するように添加して31〜
33℃で、55時間培養を行つた。結果を、第４表に
示す。

【表】 AJ 11607の発酵終了液300mlから実施例１と同
様の方法により、14.0ｇのＬ−リジン塩酸塩第２
加水物結晶を得た。実施例３コリネバクテリウム・グルタミクムＡＪ11607
およびその親株であるAJ 3463をそれぞれ１白金
耳、実施例２に示した種培養培地（但し、酢酸ア
ンモニウムの代りにエチルアルコールを0.5％使
用し、さらに尿素を0.3ｇ／dlに変更した）50ml
に接種し、18時間31℃にて通気攪拌培養を行つ
た。一方、１容の小型ガラス製ジヤーフアーメ
ンターに実施例２において示した主発酵培地（但
し、グルコース濃度は、１ｇ／dlになるように
し、酢酸アンモニウムの代りにエチルアルコール
を１ｇ／dl、硫酸アンモニウムを0.5ｇdl添加
した。）を300ml宛分注し、殺菌した。これらに上
記の種培養液をそれぞれ15ml宛接種し、31℃にて
通気攪拌培養を開始した。培養中、アンモニアガスによりpHを、7.2〜8.2
の間に保持した。エチルアルコールは、その消費
をガスクロマトグラフで定量し、その培地中の濃
度が0.3ｇ／dlに減少したとき少量培地に添加し
た。31〜33℃で、48時間培養後、それぞれ第５表
に示す量のＬ−リジンが培養液中に蓄積した。

【表】実施例４ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ 11604、同AJ 11605、コリネバクテリウム・
アセトグルタミクムAJ 11606、コネリバクテリ
ウム・グルタミクムAJ 11607、並びに、対照と
してそれらの親株であるブレビバクテリウム・ラ
クトフエルメンタムAJ 11273、コリネバクテリ
ウム・アセトグルタミクムAJ 11094およびコリ
ネリバクテリウム・グルタミクムAJ 3463の計７株
を、あらかじめグルコース・ブイヨンスラント上
で生育させ、それぞれ１白金耳ずつ、50ml容の
振とうフラスコに分注し、殺菌した下記組成の培
地21mlに接種した。培地組成：ビート又はケーン糖蜜（グルコース換算） 10ｇ／dl 硫酸アンモニウム 5.0ｇ／dl KH₂PO₄ 0.1ｇ／dl MgSO₄・7H₂O 40mg／dl ビオチン 50μｇ／dl 炭酸カルシウム（別殺菌添加）５ｇ／dl pH7.0 これらを30℃で72時間培養をおこなつたとこ
ろ、第６表のごとく、リジンを蓄積した。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】

１ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウ
ム属に属し、ホスフオエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼ（EC 4、１、１、31）活性がその親
株の1.2倍以上の活性を有し、かつＬ−リジンを
生産する能力を有する変異株を培養し、生成蓄積
したＬ−リジンを採取することを特徴とする発酵
法によるＬ−リジンの製造法。