JPH1118790A

JPH1118790A - ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）の製造方法

Info

Publication number: JPH1118790A
Application number: JP9199411A
Authority: JP
Inventors: Noboru Endo; 昇遠藤; Tetsuhisa Yada; 哲久矢田; Akira Tsubokura; 章坪倉; Miyoshi Mizuta; 美能水田
Original assignee: Nippon Oil Corp
Current assignee: Eneos Corp
Priority date: 1997-07-09
Filing date: 1997-07-09
Publication date: 1999-01-26

Abstract

(57)【要約】【課題】培地成分の複雑なコントロールを必要とせず
に、１段培養でＰＨＢを効率よく産生させることができ
る方法の提供。【解決手段】細菌Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭＢＰ−４
２８３）またはその突然変異株からなる菌株を、炭素
源、窒素源及び無機塩が含まれる培地内で培養する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は微生物によるポリ
（３−ヒドロキシ酪酸）（以下、これをＰＨＢと表す）
の製造方法に関する。ＰＨＢは下記の一般式で表される
熱可塑性ポリエスエルであり、優れた生物分解性と生体
適合性を有することから環境を汚染しないクリーンプラ
スチックとして注目され、手術糸などの医療用高分子材
料および農薬徐放出システムなどの農業用高分子材料と
して有用である。

【０００２】

【化１】

【０００３】

【従来の技術】ＰＨＢは、グルコース、シュークロー
ス、フルクトースなどの糖質を原料として、微生物を用
いて生産できることできる。ＰＨＢを生産する微生物と
しては、アルカリゲネス・ファセカリス（Alcaligenes
faecalis) 、アルカリゲネス・ルーランデイ（Alcalige
nes ruhlandii)、アルカリゲネス・レイタス（Alcalige
nes latus)、アルカリゲネス・アクアマリヌス（Alcali
genes aquamarinus)、アルカリゲネス・エウトロフス
（Alcaligenes eutrophus)、バチルス・メガテリウム(B
acillus megaterium) 、シュードモナス・ファシリス(P
seudomonas facilis)、アゾトバクター・クロオコッカ
ム(Azotobacter chroococcum) 、アゾトバクター・ビネ
ランデイ(Azotobacter vinelandii)などが知られてい
る。糖質を炭素源とする培地にて上記の微生物を培養す
ると、ＰＨＢが菌体内に蓄積されるので、超音波処理な
どでこの菌体を破壊した後、ＰＨＢ可溶性溶媒を用いて
ＰＨＢを抽出し、抽出液にヘキサンのような貧溶媒を加
えてＰＨＢを沈澱させることにより、菌体内からＰＨＢ
を回収することができる。従って、微生物を利用してＰ
ＨＢを商業的規模で製造せんとする場合には、そこで使
用する菌体は、増殖が良好で菌体収率が高く、しかも菌
体内にＰＨＢを豊富に蓄積できる菌体であることが望ま
しい。しかしながら、上に例示した従来公知の微生物
は、培養に際して培地に窒素源を添加することで増殖率
が高まるものの、菌体中のＰＨＢ含有率が低下し、結果
としてＰＨＢの生産性を向上させることができない。

【０００４】この問題点の解決手段としては、例えば、
培地の炭素源中の炭素と窒素源中の窒素の重量比を、所
定の範囲内に調節する方法（特開昭６０−２５１８８９
号公報参照）が提案されている。また、菌体の培養を２
段に分け、前段では窒素源を培地に加えて菌体の増殖の
みを行い、後段の培養では窒素源と燐源を制限してＰＨ
Ｂの蓄積のみを行う２段階培養法（特開昭５６−１１７
７９３号公報参照）も提案されている。前者の方法で
は、炭素源中の炭素と窒素源中の窒素の重量比が６〜５
０：１である培地を用いることが必要であるとされてい
るが、成分組成が一定せず、ロット差が大きい天然培地
では、上記の重量比を所定の範囲内に維持することが極
めて難しい。成分組成が一定の培地であっても、上記の
重量比を培養の過程で所定の範囲内に維持するには、培
地の炭素濃度と窒素濃度を迅速かつ連続的に測定し、そ
の濃度の過不足に応じて炭素源と窒素源を自動供給しな
ければならない。従って、培地の炭素と窒素の重量比を
所定範囲に維持する前者の方法は、その実施に炭素およ
び窒素の自動濃度検出器と自動供給装置の併設が必要に
なるため、培養装置が複雑にならざるを得ない。一方、
菌体の増殖とＰＨＢの蓄積を別々に行う後者の２段階培
養法は、前段の培養工程で所望のバイオマス濃度が得ら
れるものの、窒素源および燐源を制限することが不可欠
な後段の培養工程に、前段の培地に残存する窒素および
／または燐が不可避的に持ち込まれた場合には、ＰＨＢ
への充分な転化が実現できない不都合がある。そして、
前段の培養工程が終了する時点で、過剰量の窒素および
／または燐が前段の培地中に実質的に存在しないように
前段の培養工程を操作することは極めて難しい実情であ
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、培地成
分の複雑なコントロールなしに通常の１段培養により経
済的に望ましいバイオマス重量を達成できるＰＨＢの製
造方法について検討した結果、カロチノイド色素を生産
することができる細菌のなかの特定の菌体が、培養時の
増殖率を高めるための窒素源が共存しても、菌体中のＰ
ＨＢ含有率が低下しないことを見出し、本発明を完成し
たものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明に係るＰＨＢの製
造方法は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲ
ＭＢＰ−４２８３として寄託されたＥ−３９６株、ま
たはその突然変異株からなる菌体を、炭素源、窒素源及
び無機塩が含まれる培地内で培養してＰＨＢを産生さ
せ、次いでその菌体からＰＨＢを回収することからな
る。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明で用いられる培地は、生産
菌の生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩を含有し、こ
の培地には必要に応じて、特殊な要求物質（例えば、ビ
タミン、アミノ酸、核酸塩基等）を含ませることができ
る。培地の炭素源としては、グルコース、シュークロー
ス、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニ
トール、マルトースなどの糖類；酢酸、フマル酸、クエ
ン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸などの有機
酸；エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノ
ール、ヘキサノール、イソブタノールなどのアルコール
類等が使用できる。培地への添加量は使用する炭素源の
種類にもよるが、通常培地１リットル当たり、１〜１０
０ｇ、好ましくは２〜５０ｇである。培地の窒素源とし
ては、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモ
ニア、尿素などの１種または２種以上が使用可能であ
る。培地への添加量は使用する窒素源の種類により異な
るが、通常は培地１リットル当たり、０．１〜１０ｇ、
好ましくは１〜３ｇである。培地の無機塩としては、リ
ン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水
素二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウ
ム、硫酸鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫
酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カル
シウム、炭酸ナトリウムなどの１種または２種以上が使
用可能である。培地への添加量は使用する無機塩の種類
により異なるが、通常は培地１リットル当たり、０．０
０１〜１０ｇである。本発明で使用される培地には、必
要に応じて特殊な要求物質の１種または２種以上を添加
することができるが、その特殊な要求物質としては、ビ
タミン類、核酸類、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、
麦芽エキス、コーンスチープリカー、アミノ酸、乾燥酵
母、大豆粕、大豆油、オリーブ油、トウモロコシ油、ア
マニ油などを例示することができる。培地への添加量は
使用する物質の種類により異なるが、通常は培地１リッ
トル当たり１〜２００ｇ、好ましくは１０〜１００ｇで
の範囲にある。

【０００８】菌体の培養に際しては、培地のｐＨを通常
２〜１２の範囲に、好ましくは６〜１０の範囲に調整す
る。培養温度は通常１５〜８０℃、好ましくは２０〜３
５℃の範囲にあり、通常１日〜２０日間、好ましくは２
〜８日間振盪培養あるいは通気撹拌培養を行う。培養終
了後、得られた培養液からＰＨＢを回収する方法として
は、従来知られている任意の方法を採用することができ
る。例えば、遠心分離もしくは濾過等により菌体を分離
し、この菌体から溶媒でＰＨＢを抽出する。抽出溶媒と
しては、ＰＨＢを溶解する溶剤であればいずれも使用可
能であって、例えば、クロロホルム、ジクロロエタン、
エチレンカーボネイト、ピリジンなどが使用できる。ま
た、菌体からの抽出効率を高めるために、上に例示した
抽出溶媒にはメタノール、エタノール、ＴＨＦ等を混合
しても差し支えない。抽出液に溶解しているＰＨＢを固
体として回収するには、抽出液をそのまま濃縮乾固する
方法が採用できるが、好ましくはＰＨＢの非溶媒、例え
ば、メタノール、ｎ−ヘキサン、メタノールと水の混合
液等を添加するか、もしくは抽出液の温度を例えば−４
０℃〜−１０℃まで冷却することによりＰＨＢを析出さ
せ、その後遠心分離または濾過などの手段でＰＨＢを分
離回収し、しかる後乾燥することで、固形状のＰＨＢを
得ることができる。

【０００９】

【実施例】以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく
説明するが、これら実施例は本発明を限定するものでは
ない。実施例１表１に示す組成からなる培地１０ｍＬを直径１８ｍｍの
試験管に入れ、１２１℃で１５分間蒸気殺菌した。これ
にＥ−３９６株（ＦＥＲＭＢＰ−４２８３）を１白金
耳植菌し、３０℃で６日間、３００ｒｐｍの往復振盪培
養を行った。この培養液１０本分（１００ｍＬ）を遠心
分離し、得られた菌体を水およびメタノールで洗浄し、
クロロホルムで抽出した。次いで抽出液にヘキサンを添
加し、析出した白色沈澱を濾別して乾燥した。白色沈殿
物の回収量は４．５ｇであった。この白色沈殿物がＰＨ
Ｂであることは、質量分析及び核磁気共鳴スペクトルで
確認された。

【００１０】

【表１】グルコース３０ｇ／Ｌ酵母エキス２０ｇ／Ｌ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １０ｇ／ＬＫＨ₂ＰＯ₄ １．５ｇ／ＬＮａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ３．８ｇ／ＬＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．５ｇ／ＬＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０１ｇ／ＬＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ０．０１ｇ／Ｌ

【００１１】実施例２表１に示す組成からなる培地１０ｍＬを直径１８ｍｍの
試験管に入れ、１２１℃で１５分間蒸気殺菌した。これ
にＥ−３９６株（ＦＥＲＭＢＰ−４２８３）を１白金
耳植菌し、３０℃で２日間、３００ｒｐｍの往復振盪培
養を行った。次いで、培養液１０ｍＬを、表１に示す組
成からなる培地が１００ｍＬ入った５００ｍＬ容の坂口
フラスコに植菌し、３０℃で２日間、３００ｒｐｍの往
復振盪培養を行った。この培養液を遠心分離して菌体を
得、実施例１と同様の抽出処理によりＰＨＢを得た。そ
の結果を表２に示す。

【００１２】

【表２】乾燥菌体中のＰＨＢ菌体湿菌体量（ｇ）ＰＨＢ含有率（％）生産量（ｇ） E-396 ２６５４５．６ IFO-13581 ２３１２１．１

【００１３】比較例１表１に示す組成からなる培地１０ｍＬを直径１８ｍｍの
試験管に入れ、１２１℃で１５分間蒸気殺菌した。これ
にアゾトバクター・ビネランデイ(Azotobactervineland
ii)種の菌株であるＩＦＯ−１３５８１株を１白金耳植
菌し、３０℃で２日間、３００ｒｐｍの往復振盪培養を
行った。次いで、この培養液１０ｍＬを、表１に示す組
成からなる培地が１００ｍＬ入った５００ｍＬ容の坂口
フラスコに植菌し、３０℃で２日間、３００ｒｐｍの往
復振盪培養を行った。この培養液を遠心分離して菌体を
得、実施例１と同様の抽出処理によりＰＨＢを得た。そ
の結果を表２に併記した。表２にから明かなように、窒
素源が豊富な表１の培地では、両菌株とも増殖が良好で
あったが、ＰＨＢ生産量はＥ−３９６株の方がに優れ
ている。

【００１４】実施例３表１に示す組成からなる培地１０ｍＬを直径１８ｍｍの
試験管に入れ、１２１℃で１５分間蒸気殺菌した。これ
にＥ−３９６株（ＦＥＲＭＢＰ−４２８３）を１白金
耳植菌し、３０℃で２日間、３００ｒｐｍの往復振盪培
養を行った。この培養液１０ｍＬを、表１に示す組成か
らなる培地が１００ｍＬ入った５００ｍＬ容の坂口フラ
スコに植菌し、３０℃で２日間、３００ｒｐｍの往復振
盪培養を行った。次にこの培養液１００ｍＬを、表１に
示す組成からなる培地が２Ｌ入った５Ｌ容の発酵槽に植
菌し、３０℃、５００ｒｐｍ、１．０ｖｖｍの好気培養
を行った。得られた培養液３．５Ｌを遠心分離し、湿菌
体８７５ｇを得た。これを水及びメタノールで洗浄し、
クロロホルムで抽出した。次いで抽出液にヘキサンを添
加してＰＨＢを析出させ、濾過により析出物を回収して
乾燥したところ、ＰＨＢ２５２ｇを得た。乾燥菌体中の
ＰＨＢ含有率は７２％であった。

【００１５】

【発明の効果】本発明によれば、生物分解性と生体適合
性に優れたポリ（３−ヒドロキシ酪酸）を高収率、高収
量で製造することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:01） (72)発明者水田美能横浜市中区千鳥町８番地日本石油株式会社中央技術研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細菌Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭＢＰ−４
２８３）またはその突然変異株からなる菌株を、炭素
源、窒素源及び無機塩が含まれる培地内で培養してポリ
（３−ヒドロキシ酪酸）を産生させ、次いでその菌体か
らポリ（３−ヒドロキシ酪酸）を回収することからなる
ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）の製造方法。