DE10142014A1 - Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserin (PS) durch immobilisierte Phospholipase D. - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserin (PS) durch immobilisierte Phospholipase D.Info
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Abstract
Ein Prozess zur Herstellung von Phosphatidylserin mit immobilisiertem Enzym. Die Reaktion läuft in zwei Schritten ab. Erstens wird Phospholipid-Gemisch wie z. B. Epikuron 100P (Lucas Meyer) mit immobilisierter Phospholipase D in Phosphatidsäure umgewandelt. Zweitens wird die umgewandelte Phosphatidsäure mit immobilisierter Phospholipase D und L-Serin mit anwesendem Metall-Ion zum Phosphatidylserin umgesetzt. Die Reaktion wird in einer wässrigen Phase durchgeführt (Figur).
Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Synthese von Phospholipiden mit definierten Kopfgruppen (PS im besonderen) aus Phospholipidgemischen.
- Organische Lösemittel stören bei der Verwendung von Phospholipiden im Lebensmittelbereich, so z. B. Toluol, das nicht zugelassen ist.
- Phosphatidylcholin (PC) ist das Hauptsubstrat für die verwendeten Phospholipasen D. Angereicherte PC-Fraktionen sind sehr teuer. Bei Gemischen wird unter milden Bedingungen nur der PC-Anteil (auch etwas vom Phosphatidylethanolamin: PE) umgesetzt.
- Bei der Verwendung von Lösemitteln, die OH-Gruppen (Wasser, Alkohole) enthalten, stellt man einen Austausch von Cholin zum "Lösemittelrest" fest. Bei Wasser ist dies die Bildung von Phosphatidsäure (PA).
- Es ist bekannt (US 5,700,668: Process for the industrial preparation of Phosphatidylserine), dass PS in industriellem Maßstab in zwei Stufen hergestellt werden kann.
- Es ist auch bekannt (Comfurius P. et al Biochim. Biophys. Acta 488, 36 (1977): The Enzymatic Synthesis of phosphatidylserine and purification by CM-cellulose column chromatography), dass PS zwar gut gereinigt werden kann, aber die Ausbeute nur um 40% liegt.
- Es wird auch beschrieben (Lekh Raj Juneja et al Biochimica et Biophysica Acta, 1003 (1989) 277-283, Conversion of phosphatidylcholine to phosphatidylserine by various phospholipases D in the presence of L- or D-serine), dass unterschiedliche PLD unterschiedliche Transphosphatidylationsaktivitäten zeigen.
- Es ist auch bekannt (EP PS 922 707 A1), durch selektive Extraktion von PS enthaltenden Phospholipid-Mischungen in di-phasischen Systemen organischer Lösemittel und Kristallisation zu reinigen.
- Auch bekannt ist es (EP 1 048 738 A1), PS aus der Reaktion von Phosphatiden mit Serin zu gewinnen, wobei diese Reaktion in einer wässrigen Dispersion der Phosphatide in Anwesenheit von PLD und von Calciumsalzen durchgeführt wird.
- Statt einer Einschrittreaktion werden gemäß der Erfindung zwei Schritte durchgeführt, nämlich
- a) Austausch sämtlicher Kopfgruppen in einem PL-Gemisch gegen die Gruppe des Lösemittels (-H bei Wasser entsteht PA; -CH2CH3 bei Ethanol durch Verwendung eines Enzyms, welches zur Hydrolyse (z. B. PL D aus Weisskohl oder Streptomyces chromofoscus) neigt. Vorteil ist die nahezu vollständige Reaktion, d. h. aus PL-Gemisch wird eine einheitliche Kopfgruppe gemacht.
- b) Umsetzung dieses vereinheitlichten Phospholipids zu PS o. a. durch Verwendung eines anderen Enzyms (andere PL D) unter geeigneten Bedingungen.
- Zur Preisreduktion wird das Enzym immobilisiert.
- Für die vorliegende Erfindung ist wesentlich:
Der Prozess zur Herstellung von Phosphatidylserin wird mit immobilisiertem Enzym in zwei Verfahrensschritten durchgeführt. - Ausgangsmaterialien sind neutrale Phospholipide bzw. ein Gemisch.
- Das endogen gebildete Phosphatidylserin (PS) ist das wichtigste saure Phospholipid im Gehirn. PS wird in die Zellmembran eingebaut und fungiert zusammen mit anderen Phospholipiden als deren Grundbaustein. Membranphosphlipide spielen eine zentrale Rolle für die interzelluläre Kommunikation und für die Übertragung biochemischer Signale in das Zellinnere, wo zelluläre Reaktionen ausgelöst werden. Das einwandfreie Funktionieren dieser Prozesse ist insbesondere im Zentralnervensystem von entscheidender Bedeutung. Theoretischen Überlegungen zufolge unterstützt PS sowohl den Zellstoffwechsel als auch die interzelluläre Kommunikation, indem es die Fluidität der Zellmembran positiv beeinflusst.
- Die konventionellen Verfahren zur Herstellung von PS beruhen auf:
- - Die Reaktion läuft entweder in zwei Phasen (Lösungsmittel/wässrige Phase) oder nur in einer organischen Phase ab.
- - Organische Lösemittel sind Toluol, Diethylether oder Ethylacetat usw.
- - Rohstoff ist meistens angereichertes Phosphatidylcholin, wobei die Ausbeute vom PC-Gehalt abhängt.
- - Die Produktionskosten sind sehr hoch.
- Um einen umweltfreundlichen und industriellen Prozess zur Herstellung von Phosphatidylserin zu schaffen, wird die Reaktion nur in wässriger Phase und in zwei Schritten durchgeführt. Erstens wird Phosphatidylsäure aus einem Phospholipid-Gemisch durch enzymatische Hydrolyse mit immobilisiertem PLD und mit Metall-Ionen hergestellt und zweitens wird Phosphatidylserin aus der Phosphatidylsäure unter anderen Reaktionsbedingungen fast vollständig umgewandelt.
- Im Vergleich zu bekannten Verfahren entstehen folgende Vorteile:
- - Phospholipid-Gemische lassen sich leicht zu Phosphatidylsäure umwandeln, wobei die Ausbeute nicht nur vom Phosphatidylcholin-Anteil abhängt.
- - Das Enzym, Phospholipase D, wird immobilisiert und die Produktionskosten können dadurch erheblich gesenkt werden.
- - Die Reaktion läuft in wässriger Phase ab und ist umweltfreundlich und das Endprodukt PS kann als Lebensmittelzusatz und in funktional food-Produkten ohne weiteres eingesetzt werden.
- Die Reaktion wird an Hand der Figur im Vergleich zu bekannten Verfahren erläutert.
- Die Figur zeigt, dass die PS-Herstellung gemäß der Erfindung in zwei Schritten ausgeführt wird. In dem ersten Schritt wird Phosphatidylsäure (PA) durch enzymatische Hydrolyse mit PLD und Ca2+ in wässriger Lösung hergestellt. In dieser Reaktion ist die Temperatur 35-60°C, PLD wird in 50-1500 Units PLD/mmol Phospholipid eingesetzt, wobei der pH-Wert 5,5-8 beträgt.
- In dem zweiten Schritt werden die Reaktionsbedingungen im Vergleich zu dem ersten Schritt geändert. Vor allem L-Serin wird zugesetzt. Die Menge soll mehrfach überschüssig zu den Phospholipiden sein. Der pH-Wert ist 1-5 und die Temperatur beträgt 20-60°C.
- Als Ausgangsmaterial wird ein Phospholipid-Gemisch (1,5 mmol-7,5 mmol) eingesetzt, in dem Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylinositol enthalten sind, z. B. Epikuron 100 P (PC: 20-30%, PE: 15-20% und PI: 15%, PA: 5-7% Lucas Meyer) oder Epikuron 130 (PC: 30-40%, PE: 15%, PI: 15%, 3-5% Lucas Meyer).
- Das Ausgangsmaterial muss vor der Reaktion gut in wässriger Phase homogenisiert werden.
- Zur Reaktion wird ein Metall-Ion (9,89 mmol) (z. B. Ca2+ oder Mg2+ benötigt.
- Der Immobilisierungsschritt von PLD wird nach der Methode von Röhm mit Eupergit C durchgeführt.
- Immobilisiertes PLD (50-1500 Units/mmol) wird eingesetzt, am besten 200-700 Units/mmol.
-
- 1. Eine Suspension eines Phospholipidgemischs (2,26 mmol) und CaCl2(9,89 mmol) in Wasser wird einem Reaktionsgefäß zugesetzt und wird zuerst mit NaOH (0,1 M) auf pH = (6,5-7,5) eingestellt. Mit PLD (1000-1500 Units) läuft die Reaktion unter Rühren 1-20 Stunden bei 40-50°C ab. Nach 5 Stunden liegt die Ausbeute an Phosphatidylsäure schon bei 90-95%. Dies kann durch die HPLC-Methode ermittelt werden.
- 2. Phosphatidylsäure kann nach der Reaktion von wässriger Phase abfiltriert und mehr in als mit Wasser gewaschen werden. In diesem Schritt werden Cholin, Ehtanolamin bzw. Inositol und andere Salze ausgewaschen.
- 3. Das immobilisierte PLD kann in Lösung bleiben und wird weiter benutzt.
- 4. Die PA-Lösung (1 mmol-2 mmol) wird nun weiter zu PS umgewandelt. In diesem Schritt wird die Lösung zuerst auf pH = 4-6 eingestellt und die Temperatur bei 20-30°C gehalten. CaCl2(9,89 mmol) wird der Lösung zugesetzt.
- 5. Unter Führen wird die Reaktion 4-20 h laufen gelassen. Nach 4 Stunden liegt die Ausbeute von PS schon bei 40%.
- 6. Nach der Reaktion wird die Lösung mit Hexan/Isopropanol extrahiert und durch Aceton- Fällung wird PS aufgereinigt.
- 7. Das immobilisierte PLD kann wegen seiner Partikel- Größe durch ein Sieb von der PA getrennt und wiedergewonnen werden.
-
- 1. Eine Suspension eines Phospholipidgemischs (2,26 mmol) und CaCl2 (9, 89 mmol) wird einem Reaktionsgefäß zugesetzt und wird zuerst mit NaOH (0,1M) pH = (6,5-7,5) eingestellt. Mit PLD (1000-1500 Units) läuft die Reaktion unter Rühren 1-20 Stunden bei 40-50°C. Nach 5 Stunden liegt die Ausbeute an Phosphatidylsäure schon bei 90-95%. Dies kann durch HPLC-Methode ermittelt werden.
- 2. Phosphatidylsäure kann nach der Reaktion aus der wässrigen Phase abfiltriert und mehrmals mit Wasser gewaschen werden. In diesem Schritt werden Cholin, Ethanolamin bzw. Inositol und andere Salze ausgewaschen.
- 3. Das immobilisierte PLD kann wegen seiner Partikel- Größe durch ein Sieb von PA getrennt und wiedergewonnen werden.
- 4. Man kann je nach Wunsch auch PA aufreinigen oder weiter aufarbeiten. Hierzu kann die PA-Lösung bis auf 90-100°C erhitzt werden, um die PLD-Aktivität zu stoppen. Die wässrige Phase kann abfiltriert werden. Der Feststoff wird unter Vakuum abgetrocknet.
- 5. Weitere Schritte zur PS-Herstellung können wie in Beispiel 1 nach den Schritten 4-7 durchgeführt werden.
Claims (1)
- Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserin (PS) aus einem Phospholipidgemisch, dadurch gekennzeichnet, dass in einer ersten Stufe in wässriger Phase vermittels von immobilisierter Phospholipase D (PLD) und von Metallionen, vorzugsweise von Ca2+ oder Mn2+, Phosphatidylsäure (PA) hergestellt wird, und dass in einer zweiten Stufe aus der Phosphatidylsäure in wässriger Phase vermittels von immobilisierter Phospholipase D, L-Serin und von Metallionen, vorzugsweise Ca2+ oder Mn2+, Phosphatidylserin hergestellt wird, wobei die Betriebsparameter beider Stufen (Temperatur, pH-Wert) unterschiedlich eingestellt werden und vorzugsweise auch unterschiedliche Phospholipasen D in beiden Stufen eingesetzt werden.
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