DE2604283A1 - Verfahren zur herstellung von 1,2-diacyl-3-glycerylphosphorylcholinen - Google Patents

Verfahren zur herstellung von 1,2-diacyl-3-glycerylphosphorylcholinen

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DE2604283A1 DE19762604283 DE2604283A DE2604283A1 DE 2604283 A1 DE2604283 A1 DE 2604283A1 DE 19762604283 DE19762604283 DE 19762604283 DE 2604283 A DE2604283 A DE 2604283A DE 2604283 A1 DE2604283 A1 DE 2604283A1
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Description

27 691
Nippon Shoji Kaisha, Ltd., Osaka / Japan
Verfahren zur Herstellung von 1r2-Diacyl-3-glycerylphosphorylcholinen
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von 1^-Diacyl-S-glycerylphosphorylcholinen, und hierbei insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von 1/2-Diacyl-3-glycerylphosphorylcholinen der Formel
CH2-O-COR
CH-O-COR1
I 0 CH
1 ti S ■<
CH2-O-P-O-CH2CH2N+^- CH3 (I)
0~ ^ CH3
worin R und R1 unterschiedlich oder gleich sind und jeweils einen Rest einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure darstellen.
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Die Verbindung der Formel (I) stellt das sogenannte Lecithin dar, welches eines der Glycerylphospho-lipide ist und 5o oder mehr % der Phospholipide ■ ausmacht, die in verschiedenen Tieren oder Pflanzen enthalten sind. Das natürliche Lecithin enthält hauptsächlich einen Rest einer gesättigten Fettsäure (z.B. Myristinsäure, Palmitinsäure oder Stearinsäure) und/oder einen Rest einer ungesättigten Fettsäure (z.B. ölsäure.-, Linolsäure, Linolensäure) als Acylgruppe (RCO-). Unter diesen ist das Lecithin, das einen hohen Anteil an hoch ungesättigter Fettsäure, wie Linolsäure oder Linolensäure enthält, welches eine essentielle Fettsäure darstellt, in letzter Zeit als Medikament wegen seiner ausgezeichneten biologischen Wirkungen eingesetzt worden. Darüber hinaus hat seit etwa 196o, als gefunden worden war, dass das Lecithin eine der Grundkomponenten verschiedener Biomembranen darstellt, die Bedeutung des Lecithins im medizinischen und pharmazeutischen Bereich ständig zugenommen.
Es ist jedoch sehr schwierig, ein Lecithin zu erzeugen, das einen spezifischen Fettsäurerest oder einen mit einem Isotop markierten Fettsäurerest bzw. . insbesondere verschiedene Arten von Fettsäureresten in der 1- und 2-Stellung auf weist (sogenanntes Lecithin des "gemischten Säuretypus").
Es sind bislang verschiedenartige Verfahren zur Herstellung von Diacylglycerylphosphorylcholinen beschrieben worden. Beispielsweise haben Bear et al mitgeteilt, dass die Verbindung dadurch hergestellt werden kann, dass man den Phosphatrest in ein Diglycerid oder ein Diacylglyceryl-Iodhydrin einführt und nachfolgend hiermit den Cholinrest kombiniert, wie es durch das nachfolgende Reaktionsschema gezeigt ist (E. Bear & M. Kates; J. Am. Chem. Soc., Vol. 72, S. 942,1?5o):
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H2C-O-COR H9C-O-COR
RCO-O-CH + CcHc-O-PCl0 ^RCO-O-CH 0
ι -6 5 2 , „
- H9C-OH H2C-O-P-OC5H5
Cl
H-C-O-COR
2I
Cholinchlorid ^ RCO-O-CH 0
H2C-O-P-OCH2CH2N+(CH3) .Cl"
OC6H5
Η-,/Pd 1,2-Diacyl-L-3-glyceryiphosphorylcholin.
Nach diesem Verfahren wird die gewünschte Verbindung nur
in sehr niedriger Ausbeute erhalten, weshalb dieses nicht wirtschaftlich ist.
Es sind auch Verfahren zur Einführung eines spezifischen Fettsäurerestes in Glyceryl-phosphorylcholin" (nachstehend als "GPC" bezeichnet) durch ein Säurechlorid- oder ein Säureanhydrid-Verfahren bekannt. So ist beispielsweise durch Bear et al berichtet worden, dass das Dimyristoyl-Derivat (Ausbeute 51,o %), Distearoyl-Derivat (Ausbeute 38,4%) und das Dioleoyl-Derivat (Ausbeute 54,7 %) durch ein Säurechloridverfahren, d.h. durch Umsetzung von Cadmiumchloridsalz von GPC mit einem Fettsäurechlorid bei Raumtemperatur während drei Stunden (E. Bear et al; Can. J. Biochem. Physiol. Vol. 37, S. 953, 1959) erhalten werden können. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben versucht, die Ausbeute des
Produktes dieses Verfahrens durch Erhöhung der Reaktionszeit zu vergrössern, was jedoch zu einer Zunahme der Nebenprodukte führte (Bear et al führtei an, dass die Nebenprodukte cyclische Verbindungen darstellen könnten). über die Herstellung
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eines hoch ungesättigten Fettsäurederivates durch dieses Verfahren finden sich keine Hinweise.
Jedoch auch Cubero Robles et al haben eine Säureanhydridmethodik zum Vorschlag gebracht, um die Erzeugung des Nebenproduktes bei dem Saurechloridverfahren zu verhindern (E. Cubero Robles et al; Biochem. Biophys. Acta, Vol. 187, S. 52o, 1969). Nach diesem Verfahren wurden das Dipalmitoyl-Derivat (Ausbeute 9o %), das Distearoyl-Derivat (Ausbeute 81 %) und das Dioleoyl-Derivat (Ausbeute 7o %) durch Umsetzung von Cadmiumchloridsalz von GPC mit einem Fettsäureanhydrid und Fettsäuretetraäthylammoniumsalz erhalten. Dieses Verfahren kann die gewünschten Diacylderivate in vergleichsweise hoher Ausbeute im Fall der stabilen, gesättigten Fettsäurederivate liefern. Es ist jedoch nicht notwendigerweise auch für die Herstellung der ungesättigten Fettsäurederivate geeignet. Lediglich ein Beispiel der Herstellung von Ölsäurederivaten, welches einen Ungesättigkeitsgrad von 1 aufweist, ist mitgeteilt worden, und es ist angenommen worden, dass dieses Verfahren auf die Herstellung hoch ungesättigter Fettsäurederivate, wie von Linolsäure, nicht anwendbar sei. Kürzlich hat Gordon mitgeteilt, dass das Dioleoyl-Derivat durch ein Saureanhydrxdverfahren erhalten werden konnte (G.T. Gordon; Lipid, Vol. 7, S." 261, 1972), worin die gewünschte Verbindung (Ausbeute 67 %) durch Umsetzung eines Gemisches von GPC, Linolsäureanhydrid und Kaliumlinolat (1 : 2 : 2 in Gewichten) bei 44°C während 6o Stunden erhalten wurde. Jedoch müssen in diesem Verfahren das Linolsäureanhydrid und das Alkalimetallsalz der Linolsäure separat erzeugt werden, und es ist sehr schwierig, die Ausgangsmaterialien mit Isotopenmarkierung zu erzeugen, die in Spurenmengen erzeugt werden sollten. Darüber hinaus ist die Ausgangsfettsäure in der zweifachen theoretischen Menge erforderlich. Daher kann auch dieses Verfahren aus
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wirtschaftlicher Sicht nicht befriedigen.
Darüber hinaus ist kürzlich mitgeteilt worden, dass markierte Lecithine durch direkte Umsetzung eines Lysolecithins mit einem Acylimidazol-Zwischenprodukt (W. F. Boss et al; Analytical Biochemistry, Vol.64, S. 289-292, 1975)erzeugt werden konnten. Jedoch sogar bei diesem Verfahren konnten die gewünschten Diacylderivate nicht in hoher Ausbeute erhalten werden, und es ist auch unmöglich, ein Derivat hoch ungesättigter Fettsäuren darzustellen.
Unter diesen Umständen wurden seitens der Erfinder intensive Studien mit dem Ziel durchgeführt, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von 1,2-Diacyl-3-glycerylphosphorylcholinen aufzufinden, weiche insbesondere einen hoch ungesättigten Fettsäurerest aufweisen, und noch bevorzugter, verschiedene Arten von Fettsäureresten in den 1- und 2-Stellungen besitzen. Hierbei ist gefunden worden, dass die gewünschten Verbindungen in hoher Ausbeute und hoher Reinheit durch Acylierung von Glyceryl-phosphorylcholin (GPC) oder von dessen Monoacylderivat oder von dessen Salz mit einem spezifischen Acylxerungsmittel in Gegenwart eines spezifischen Katalysators erzeugt werden können.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von 1,2-Diacyl-3-glycerylphosphorylcholinen zu schaffen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung wird in der Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung hoch ungesättigter Fettsäurederivate von Lecithin gesehen.
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Der Erfindung liegt weiter die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Herstellung von Lecithinen des "gemischten Säuretypus" gestattet.
Eine weitere Aufgabenstellung der Erfindung liegt schliesslich in der Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung markierter Lecithine.
Diese und andere Aufgabenstellungen der Erfindung werden durch die nachfolgende Beschreibung veranschaulicht.
Gemäss der Erfindung werden die gewünschten 1,2-Diacyl-3-glycerylphosphorylcholine durch Acylierung von GPC oder dessen Monoacyl-Derivat oder dessen Salz mit einem Acylierungsmittel, das unter 1-Acylimidazol und 4-Acyl-3-phenyl-1,2,4-oxadiazol-5-on ausgewählt ist, in Gegenwart eines Katalysators erzeugt, der aus der Gruppe, die aus einem Alkalisalz einer stickstoffhaltigen 5-gliedrigen heterocyclischen Verbindung urid Natriumoxid besteht, ausgewählt ist.
Das Ausgangs GPC kann in Form der freien Base oder seines Salzes, beispielsweise Cadmiumchloridsalzes oder Bariumchloridsalzes ,eingesetzt werden. Diese Salze werden üblicherweise als Komplexverbindung angesehen. Das GPC und ein Verfahren zu dessen Herstellung sind beispielsweise in H. Brockerhoff et al; Can. J. Biolchem., Vol. 43, S. 1777 (1965) und J.S. Chadha; Chem. Phys. Lipids, Vol. 4, S. 1o4 (197o) beschrieben.
Die Monoacyl-Derivate von GPC, d.h. Monoacyl-3-glycery.lphosphorylcholine, die alternativ auch als Lysolecithine
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des 1(oder 2)-Acyltypus bezeichnet werden, umfassen 1-Monoacylderivate und 2-Monoacylderivate, die auch in Form der freien Base oder dessen Salz mit Cadmiumchlorid oder Bariumchlorid verwendet werden können. Die i-Monoacyl-3-glycerylphosphorylcholine werden üblicherweise durch Hydrolyse eines natürlichen oder synthetischen Lecithins mit Phospholipase A2 oder einem analogen Enzym hiervon, wie es in dem nachfolgenden Schema gezeigt ist, hergestellt:
CH2-O-COR
CH-O-COR
H , Phospholipase A9
CH2-O-P-O-CH2CH2N (CHJ
o"
(ID
CH0-O-COR
I 2
CH-OH
I 0
CH2-O-P-O-CH2CH2N+(CH3)3 (III)
R bedeutet einen Rest einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure.
Das Enzym Phospholipase A2 oder das analoge Enzym wird üblicherweise aus Schlangengiften (z.B. Crotalus admanteus-Gifrk/ Naja naja-Gift oder Trimeresurus flavoviridis-Gift) Bienengift (z.B.Apis mellifera-G.ift) , GiIa monster-Giften
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(z.B. Heloderma horidum-Gift) , Skorpiongiften(z.B. Leurusquinques triatus-Gift) oder verschiedenen Tierorganen (z.B. Schweine-pancreas oder Rattenleber) gewonnen. Die Hydrolyse sollte zur Verhinderung der unerwünschten Umlagerung der Acylgruppe vorsichtig durchgeführt werden, wobei dies normalerweise durch Behandlung des Lecithins mit dem Enzym in einem geeigneten Lösungsmittel (z.B. Äthyläther) in Gegenwart einer Pufferlösung (pH: 7,ο bis 7,2, z.B. o,2 m Borsäure-Natriumcarbonat-Pufferlösung, o,2 m Tris-Pufferlösung) und einem Aktivierungsmittel (z.B. Calciumchlorid) bei Raumtemperatur durchgeführt wird.
Die 2-Monoacyl-3-glycerylphosphorylcholine werden gleicherweise durch Hydrolyse eines natürlichen oder synthetischen Lecithins mit Phospholipase A^ oder einem analaogen Enzym hiervon, welches aus verschiedenen Bakterien (z.B. Escherichia coli, Mycobacterium phlei, Bacillus megaterium oder Bacillus subtilis) oder verschiedenen Tierorganen (z.B. Rinder pancreas, oder Ratten-thymus,-niere, -pancreas oder -lunge) erhalten wird, erzeugt.
Darüber hinaus kann die Reinheit der Monoacylderivate, wie des 1-Monoacylderivates oder des 2-Monoacylderivates, durch enzymatische Hydrolyse des Monoacyl-3-glycerylphosphoryl· cholins mit Phospholipase C bestimmt werden, wodurch der Phosphorylcholinrest unter Erhalt eines Monoglycerides abgespalten wird, und sodann das resultierende Monoglycerid analysiert wird.
Das Acylierungsmittel 1-Acylimidazol kann leicht durch Umsetzung von N, N1-Carbonyldximidazol mit einer Fettsäure durch ein herkömmliches Verfahren erzeugt werden. In
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alternativer Weis können die 1-Acylimidazole durch Umsetzung von Imidazol mit einem Fettsäurechlorid hergestellt werden /~H.A. Staab; Chem. Ber., Vol. 89, S. 194o (1956JT7, Die 4-Acyl-3-phenyl-1,2,4-oxadiazol-5-one können ebenso leicht durch Umsetzung von 3-Phenyl-1,2,4-oxadiazol-5-on mit einer Fettsäure durch ein herkömmliches Verfahren erzeugt werden. Diese Acylierungsmittel können nach Isolierung aus dem Reaktionsgemisch oder in Form des Reaktionsgemisches so wie es ist, verwendet werden. Das Acylierungsmittel kann in einer äquimolaren oder geringfügig darüber liegenden Menge (üblicherweise etwa 1- bis 3-fache stoechiometrische Menge) bezogen auf das Ausgangs-GPC oder dessen Monoacylderivate verwendet werden.
Die Fettsäuren umfassen gesättigte Fettsäuren mit 1o bis 22 Kohlenstoffatomen (z.V. Caprinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Arachinsäure, Behensäure, etc.) und ungesättigte Fettsäuren mit 14 bis 2o Kohlenstoffatomen (z.B. Myristoleinsäure, PaLmitoleinsäure, ölsäure, Linolsäure, Linolensäure, Arachidonsäure, etc.). Bevorzugte Fettsäuren sind die hoch ungesättigten Fettsäuren mit zwei oder mehr Doppelbindungen, wie beispielsweise Linolsäure, Linolensäure und Arachidonsäure. Diese Fettsäuren können mit einem Isotop (z.B. C oder H) markiert werden.
Der Katalysator kann ein Alkalisalz einer stickstoffhaltigen, 5-gliedrigen, heterocyclischen Verbindung, wie beispielsweise Imidazolnatriumsalz, Triazolnatriumsalz, Benzimidazolnatriumsalz, oder andere Alkalimetallsalze (z.B. Kaliumsalz) dieser heterocyclischen Verbindungen darstellen. Auch Natriumoxid kann als Katalysator verwendet werden.
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- 1ο -
Die erfindungsgemässen Verbindungen umfassen ein asymmetrisches Kohlenstoffatom in dem Molekül und können deshalb als D- oder L-optisches-Isomeres oder als racemische Substanz, vorliegen. Sofern es in der Beschreibung und den< Ansprüchen nicht-anders angegeben ist, sollen alle Isomeren, entweder in getrennter Form oder deren Gemische, umfasst werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann im Fall der Verwendung von 1-Acylimidazol als Acylierungsmittel durch das folgende Reaktionsschema veranschaulicht werden:
CH0-O-R"
s ι
CH—0-R"1 R(or R1J-CO-N I
CH2-O-P-O-CH2CH2N (CH3J3 ! ä>
(IV)
worin R und R1 die vorstehende Bedeutung besitzen und R1' Wasserstoff oder das gleiche wie R bedeutet, und R1 '_' Wasserstoff oder das gleiche wie R1 bedeutet, vorausgesetzt, dass beide Gruppen R11 und R1 " gleichzeitig nicht eine Gruppe bedeuten, die von Wasserstoff verschieden ist.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist nachstehend für den Fall der Verwendung von 1-Acylimidazol als Acylierungsmittel im Detail beschrieben.
Ν,Ν'-Carbonyldiimidazol wird in wasserfreiem Tetrahydrofuran, (nachstehend als "THF" bezeichnet) suspendiert und der
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Suspension wird eine gesättigte oder ungesättigte Fettsäure hinzugegeben. Das Gemisch wird sodann mehrere bis zu mehreren 1o Stunden in einem Inertgas (z.B. Stickstoffgas) unter Erhalt von 1-Acylimidazol gerührt. Diese Verbindung wird für die Acylierung nach Isolierung oder in Form des Reaktionsgemisches, so wie es ist, eingesetzt.
Zu einem Gemisch von GPC (sowohl R1' und R1" in Formel (IV) bedeuten Wasserstoff) oder dessen MonoacyIderivat (eine der R1'-und R1''-Gruppen der Formel (IV) stellt Wasserstoff und die andere eine von Wasserstoff verschiedene Gruppe dar) oder dessen Salz und 1-Acylimidazol, das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, in wasserfreiem THF wird Imxdazolnatriumsalz (als Katalysator) hinzugegeben, welches durch Umsetzung eines Gemisches von Imidazol und. metallischem Natrium in wasserfreiem THF während 3o bis 6o Minuten am Rückfluss erhalten worden war. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während mehreren bis zu mehreren 1o Stunden unter Erhalt der gewünschten Diacylverbindung gerührt.
Die markierten Verbindungen, d.h. die 1,2j-Diacyl-3-glycerylphosphorylcholine, in denen eine oder beide der Diacylgruppen einen mit einem Isotop markierten Fettsäurerest darstellen, können unter Verwendung eines Acylierungsmittels
■, worin die Acylgruppe einen Fettsäurerest bedeutet, der mit einem Isotop (z.B. C oder H)markiert wurde in gleicher Waise wie im Fall der nicht markierten Verbindungen hergestellt werden. In alternativer Weise kann bei Verwendung von Monoacyl-3-glycerylphosphorylcholinen als Ausgangssubstanz deren Acylgruppe mit einem Isotop markiert werden.
Die Gewinnung der aus dem Reaktionsgemisch gemäss vorstehender Vorschrift erhaltenen gewünschten Verbindungen kann
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wie folgt durchgeführt werden:
Zu dem Reaktionsgemisch wird Chloroform hinzugegeben und das Gemisch wird mit 1 n.HCl-Methanol neutralisiert. Nach Zugabe einer geeigneten Menge an verdünntem Methanol wird das Gemisch in einem Scheidetrichter in zwei Schichten getrennt. Die untere Schicht wird herausgenommen und unter verringertem Druck kondensiert. Der Rückstand wird in Äthanol-Chloroform-Wasser (7 ζ 1 : 3 Volumenteile) aufgelöst und die resultierende Lösung wird durch eine mit Harz des Amberlite MB-3-Typus gefüllte Säule ge*führt und sodann wird die Säule mit Äthanol-Chloroform-Wasser (7:1:3 Volumenteile) gewaschen. Die durchgeführte Lösung und die Waschlösung werden vereinigt und kondensiert. Das resultierende Kondensat wird beispielsweise einer Silicagel-Säulenchromatografie unterworfen, welches ein herkömmliches Reinigungsverfahren darstellt, um das gewünschte Produkt in hoher Ausbeute und hoher Reinheit herzustellen.
Gemäss !der Erfindung können sowohl die gesättigten als auch ungesättigten Fettsäuren unter milden Bedingungen verwendet werden, d.h. ohne dass harte Reaktionsbedingungen zu deren Umwandlung in ein Säurechlorid oder Säureanhydrid nach üblichen Verfahren erforderlich wären, und die Fettsäuren können in 1-Acyl-imidazol unter milden Bedingungen (z.B. bei Raumtemperatur) übergeführt werden, das für die Reaktion mit GPC oder dessen Monoacylderivat oder dessen Salz, so wie es ist, verwendet werden kann. Da die Acylierungsreaktion gemäss der Erfindung in Gegenwart eines spezifischen Katalysators durchgeführt wird, erfolgt die Reaktion darüber hinaus unter milden Bedingungen (z.B. bei Raumtemperatur) wobei die gewünschte Verbindung in hoher
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Ausbeute und hoher Reinheit erhaicen wird. Somit ist die Erfindung insbesondere für die Einführung eines unstabilen, hoch ungesättigten Fettsäurerestes und insbesondere für die Herstellung von Lecithinen des gemischten Säuretypus geeignet (gemäss der Erfindung umfassen die Lecithine des gemischten Säuretypus solche Verbindungen, worin eine der Acylgruppen mit einem Isotop markiert ist).
Hiermit können gemäss der Erfindung die gewünschten 1,2-Diacyl-3-glycerylphosphorylcholine, insbesondere die Lecithine des gemischten Säuretypus, und ganz besonders die markierten Lecithine in hoher Ausbeute und hoher Reinheit erzeugt werden.
Die Erfindung wird nachstehend durch folgenden, nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiel 1-
In einem 1oo ml Dreihalskolben wird Ν,Ν'-Carbonyldiimidazol
_2
(1,62 g, 1 χ Io Mol) in trockenem THF (1o ml) suspendiert und hierzu eine Lösung von Linolsäure (2,1 gr 7,5 χ 1o Mol) in THF (15 ml) hinzugegeben. Das Gemisch wird mit einem Magnet rührer unter Stickstoffgas bei Raumtemperatur während 28 Stunden gerührt (unter bestmöglichem Feuchtigkeitsausschluss).
Zu dem hierdurch erhaltenen Reaktionsprodukt wird eine
Suspension des Cadmiumchloridsalzes von GPC (1,1 g, 2,5 χ Mol) in THF (2o ml)und eine Lösung eines Imidazolnatriumsalzes /""welches durch Rückflusserhitzung von Imidazol (1g) und metallischem Natrium (o,1 g) in THF (1o ml) während einer Stunde erzeugt worden war/ in THF (2,5 ml) hinzugefügt. Das Gemisch wird bei Räumtemperatur während 43 Stunden gerührt.
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Zu dem Reaktionsgemisch wird Chloroform (2oo ml) hinzugegeben und das Gemisch wird weiter mit 1 η HCl-Methanol (12 ml) neutralisiert. Zu dem Gemisch werden Wasser (6o ml) und Methanol (1oo ml) hinzugegeben. Das Gemisch wird in einem Scheidetrichter in zwei Schichten aufgetrennt und die untere Schicht wird herausgenommen und sodann kondensiert. Der resultierende Rückstand wird in Äthanol-Chloroform-Wasser (7:1:3 Volumenteile, 4o ml) aufgelöst und die Lösung wird durch eine Säule geführt, die mit Harz vom Amberlite MB-3-Typus gefüllt ist (4o ml, welches mit dem vorstehend angegebenen gleichen Lösungsmittel aktiviert worden war) und sodann wird die Säule mit dem vorstehend angegebenen gleichen Lösungsmittel gewaschen. Die durchgeführte Lösung und die Waschlösung werden vereinigt und unter verringertem Druck kondensiert. Das Kondensat wird in Chloroform-Methanol (98 : 2 Volumenteile) aufgelöst und durch eine Säule geführt, die mit Silicagel gefüllt ist (6o g, welches mit dem gleichen obigen Lösungsmittel (Chloroform-Methanol) behandelt wurde). Die auf der Säule adsorbierten Substanzen werden mit Chloroform-Methanol (98 : 2 Volumenteile, 1oo ml), Chloroform-Methanol (6 : 4 Volumenteile, 1.2oo ml) und Chloroform-Methanol (2 :8 Volumenteile, 1.ooo ml) unter Erhält von Fraction I, Fraktion II und Fraktion III jeweils eluiert. Die Fraktion II wird unter verringertem Druck kondensiert, wobei das gewünschte 1,2-Dilinoleoyl-L-3-glycerylphosphorylcholin (1,8o g, 9o %) erhalten wurde.
Dieses Produkt stellt eine farblose, klebrige Substanz dar und zeigt in der Dünnschicht-Chromatografie einen einzigen Fleck bei Verwendung der folgenden Lösungsmittelsysteme (als Entwickler):
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1. CHCl3-CH3OH-H2O (65 : 25 : 4 Volumenteile} (für Phospholipide)
2. CHCI3-CH3OH-Ch3COOH-H2O (25 : 15 : 4 : 2 Volumenteile)
(für Phospholipide)
3. Petroläther-Äthyläther-Ch3COOH (9o : 1o : 1 Volumenteile) (für Fettsäure)
Dies bedeutet, dass das Produkt keine freie Fettsäure, Imidazol oder Lysolecithin enthält. Darüber hinaus stimmt der Rf-Wert dieses Flecks mit dem des gereinigten Lecithins (in Eigelb) überein. Darüber hinaus zeigt die Substanz die folgenden optischen Roatations- und Elementaranalysenwerte:
Optische Rotation: {XJ ^7= + 7,3° (CHCl3 : CH3OH =1:1, C=4,4)
foOp7= + 7,4° (CHCl3 : CH3OH =1:1, C=4,2)
Elementaranalyse für:C44Hg2O9NP:
berechnet: (%) : N 1,68; P 3,89; P/Ester 1/2 gefunden (%) : N 1,75; ρ 3,99, 3,99 P/Ester,1/2,2o,
1/2,o2
Durch diese Werte wird bewiesen, dass das vorstehend angeführte Produkt rein ist.
Beispiel 2
In gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, wird Palmitinsäure (1,o g, 3,8 χ 1o Mol) in THF (2o ml) aufgelöst und hierzu wird N,N1-Carbonyldiimidazol (81 ο mg, 5 χ 1o~ Mol)
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hinzugefügt. Das Gemisch wird unter Stickstoffgas bei Raumtemperatur während drei Stunden gerührt. Nach Zugabe von Imidazolnatriumsalz (1oo mg) wird das Gemisch zusätzlich während 3o Minuten gerührt und hierzu wird GPC-Cadmiumsalz (55omg) hinzugegeben und das Gemisch wird erneut bei Raumtemperatur während 96hgerührt. Das resultierende Reaktionsgemisch wird in gleicher Weise wie in Beispeil 1 beschrieben unter Erhalt des gewünschten 1/2-Dipalmitoyl-L-3-glycerylphosphorylcholin (873 mg, 93 %) in Form farbloser Kristalle behandelt. Schmelzpunkt: 235 - 236°C
/PO p2= +8,1° (CHCl3 : CH3OH =1:1, C=6,3)
Elementaranalyse für C. Hg-OgNP (Molekulargewicht 752): berechnet (%) : C 53,89; H 11,00; N 1,86 gefunden (%) : C 64,24; H 11,o9, N 1,93
Beispiel 3
In einen trockenen 5o ml Zweihalskolben, der mit einem Stickstoffeinlassrohr und einem Rückflusskühler mit Calciumchlorid-Trockenrohr versehen ist, werden eine geeignete Menge Glasperlen und ein Rotator für einen Magnetrührer eingebracht und hierein wird Stickstoffgas eingeblasen. In dem Kolben werden eine Lösung von N^'-Carbonyl-diimidazol (4o7 mg) und Palmitinsäure (47o mg) in einer kleinen Menge THF eingebracht. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wird ohne Isolierung des erzeugten 1-Palmitoylimidazols GPC (2o5 mg) und weiter eine Lösung (3 ml) von Imidazolnatriumsalz in THF hinzugegeben, welche durch Umsetzung von Natriumhydrid (13o mg) und Imidazol (5oo mg) in THF (1o ml) während 3o Minuten erzeugt worden 'war.
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Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während 65 Stunden umgesetzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben unter Erhalt des gewünschten 1,2-Dipalmitoyl-L-3-glycerylphosphorylcholin (485 mg, 81 %) behandelt. Schmelzpunkt 235 - 236°C.
Dieses Produkt stellt eine farblose, kristalline Verbindung dar und zeigt in der Dünnschicht-Chromatografie einen einzigen Fleck.
Beispiel 4
In das gleiche Reaktionsgefäss wie es in Beispiel- 3 verwendet wurde, wird eine Lösung von 4-Linoleoyl-3-phenyl-
—2
1,2,4-oxadiazol-5-on (3,5o g, 1 χ 1o Mol) in einer kleinen Menge THF eingegeben und hierzu wird GPC-Cadmiumchloridsalz (55o mg, 1,25 χ 1o_ Mol) hinzugegeben. Zu dem Gemisch. wird weiterhin das Natriumsalz von 3-Phenyl-1,2,4-oxadiazol-5-on (1oo mg) hinzugefügt und das Gemisch wird bei Raumtemperatur während 48 Stunden umgesetzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben unter Erhalt des gewünschten 1,2-Dilinoleoyl-L-3-glyceryl-phosphorylcholing' (747 mg, 75 %) behandelt.
Dieses Produkt stellt eine farblose, klebrige Verbindung dar und zeigt in der Dünnschicht-Chromatografie einen einzigen Fleck. Auch das Infrarotspektrum ist mit jenem einer Bezugsstandardverbindung identisch.
Beispiel 5
Synthetisches, reines 1^-Distearoyl-L-S-glycerylphosphorylcholin (5o mg) wird in Äthyläther (1 ml) aufgelöst und hierzu
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werdaieine Lösung von Phospholipase A2 (ο,5 mg) , die aus Crotalus admanteus-Gift erhalten wurde, in o,2 m Borsäure-Natriumcarbonat-Puffer (pH 7,o, o,5 ml) und mehrere Tropfen einer wässrigen, 2,5 m Calciumchloridlösung (als Aktivierungsmittel ) hinzugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während einer Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wird unter verringertem Druck kondensiert und hierzu wird eine kleine Menge Benzol hinzugefügt und das Gemisch wird erneut zur vollständigen Entfernung der Feuchtigkeit kondensiert. Das resultierende, farblose, feste Material wird in absolutem Äthanol aufgelöst und die Lösung wird zur Entfernung der unlöslichen Materialien filtriert, wonach zu dem Filtrat Äthyläther hinzugefügt und das feste Material bei -2o°C umkristalliaiert wird. Die ümkristallisierung wird zweimal wiederholt. Das resultierende kristalline Produkt ( 25 mg,. 77 %) stellt i-Stearoyl-L-S-glycerylphosphorylchölin dar. Dieses Produkt zeigt einen einzigen Flecken bei der Dünnschi cht-Chromatograf ie /Entwickler: CHCl3-CH3OH-H2O ( 65 : 25 : 4 VolumenteileQ , welcher mit jenem eines Bezugsstandards identisch ist. Darüber hinaus weist die Analyse des Monoglycerides nach, welches durch Hydrolyse des Produktes mit Phospholipase C erhalten wurde, dass das Produkt eine Reinheit von 95,5 & als Verbindung des 1-Acyltypus aufweist.
In Übereinstimmung mit dem Verfahren von Hanahan et al Co.J. Hanahan et al ; J. Biol. Chem., Vol. 235,S. 1918 (1969)D, wird das vorstehend erhaltene 1-Stearoyl-L-3-glycerylphosphorylcholin (5oo mg) in Äthanol (1o ml) aufgelöst und zu der Lösung wird eine Lösung von Cadmiumchlorid (CdCl-«2,5 H2O, 7oo mg) in Wasser (o,5 ml)"und Äthanol (8 ml) hinzugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während zwei Stunden stehen gelassen. Die ausgeschiedenen
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Kristalle werden durch Filtration abgetrennt und mit Äthanol und Äthyläther gut unter Erhalt von Cadmiumchloridsalz von i-Stearoyl-L-3-glycerylphosphorylcholin (65o mg, 64 %) gewaschen.
—4 Das Cadmiumchloridsalz (3oo mg, 3,6 χ 1o Mol),das hiermit erhalten wurde, wird in trockenem THF (1o ml) suspendiert und hierzu werden 1-Palmitoylimidazol (66o mg) und Imidazolnatriumsalz (1o mg) hinzugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während 16 Stunden gerührt. Nach Zugabe von Chloroform (5o ml) wird das Reaktionsgemisch mit 1 η HCl-Methanol (3 ml) neutralisiert und hierzu werden Wasser (15 ml) und Methanol (25ml) hinzugegeben. Das Gemisch wird in einem Scheidetrichter getrennt. Die untere Schicht wird herausgenommen und kondensiert. Der resultierende Rückstand wird in Äthanol-Chloroform-Wasser (7:1 : 3 Volumenteile, 1o ml) aufgelöst und die Lösung durch eine Säule geführt, die mit Harz des Ämberlite MB-3 Typus gefüllt ist (1o ml, welches mit dem obigen gleichen Lösungsmittel aktiviert worden war) und die Säule wird sodann mit dem gleichen vorstehend angeführten Lösungsmittel gewaschen. Die durchgeführte Lösung und die Waschlösung werden vereinigt und unter verringertem Druck kondensiert. Das Kondensat wird in Chloroform-Methanol (98 : 2 Volumenteile) aufgelöst und durch eine Säule geführt, die mit Silicagel (3o g, welches mit dem gleichen Lösungsmittel (Chloroform-Methanol) behandelt wurde) gefüllt ist. Die auf der Säule adsorbierten Substanzen werden mit Chloroform-Methanol ( 98 : 2 Volumenteile, 25o ml) ,Chloroformr-Methanol (6:4, 3ooml) und Chloroform-Methanol (2 : 8 Volumenteile, 25o ml) unter Erhalt von jeweils Fraktion I, Fraktion II und Fraktion III eluiert. Fraktion II wird unter verringertem Druck unter Erhalt des gewünschten i-Stearoyl-a-Palmitoyl-L-S-glycerylphosphorylcholin (26o mg, 8o %) in Form farbloser Kristalle
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kondensiert.
Schmelzpunkt 233 - 235°Ο,£θο°= +6,o°+ ο,5° (CHCl3,C=1 ο,ο)
Elementaranalyse für C42Hg6O9NP (Molekulargewicht 78o,1): berechnet (%): C 64,66; H 11,11; N 1f8o gefunden (%) : C 64,3o; H 11,23; N 1,93
Das in dem vorstehenden Beispiel verwendete·1-Palmitoylimidazol wird wie folgt hergestellt:
In einem I00 ml Dreihalskolben wird N,N'-Carbonyldiimidazol (8I0 mg, 5 χ 1o Mol) in trockenem THF (1o ml) suspendiert und hierzu wird eine Lösung von Palmitinsäure (1,o g, 3,8 χ 1o Mol) in THF (2oml) gegeben. Das Gemisch wird mit einem Magnetrührer unter Stickstoffgas bei Raumtemperatur während 3 Stunden gerührt ( und die Feuchtigkeit wird bestmöglich ausgeschlossen). Nach der Reaktion wird das Reaktionsgemisch filtriert. Das Filtrat wird unter verringertem Druck konzentriert und der resultierende Rückstand aus Äthylacetat unter Erhalt der gewünschten Verbindung (1,o g) umkristallisiert. Schmelzpunkt : 81 - 83°C.
Beispiel 6
Synthetisches, reines 1^-Dipalmitoyl-L-S-glycerylphosphorylcholin (1,234 mg) wird in Äthyläther (7o ml) aufgelöst und hierzu werden eine Lösung von Phospholipase A2 (4 mg, welche aus Naja naja-Gift erhalten wurde) in Wasser (4 ml), o,2 m Tris-Puffer (pH 7,2, 2 ml) und o,1 m wässrige Calciumchloridlösung (o,5 ml) hinzugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während 4 Stunden angesetzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wird unter verringertem Druck kondensiert und sodann in gleicher Weise wie in Beispiel 5 beschrieben
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behandelt. Das resultierende feste Material wird aus Äthyläther bie -2o°C unter Erhalt von i-Palmitoyl-L-3-glycerylphosphorylcholin (674 mg, 8o %) umkristallisiert. Nach der Analyse des Monogrycerides, welches durch Hydrolyse des Produktes mit Phospholipase C erhalten wurde, weist das Produkt eine Reinheit von 97,9 % als Verbindung des 1-Acylty.pus auf.
Das i-Palmitoyl-L-3-glycerylphosphorylcholin (266 mg ,
-4
5,17 χ 1o Mol),welches hierdurch erhalten wurde, wird in trockenem THF (1o ml), suspendiert und hierzu werden 1-Linoleoylimidazol (51o mg, 1,55 χ 1o Mol) und Imidazol-Natriumsalz (1o mg) hinzugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während 7o Stunden gerührt. Das resultierende Reaktionsgemisch wird in gleicher Weise wie in Beispiel 5 beschrieben behandelt und wird schliesslich einer Silicagel-Säulenchromatografie unter Erhalt des gewünschten 1-Palmitoyl-2-linoleoyl-L-3-glycerylphosphorylcholin (342,3 mg, 84 %) als farblose, klebrige Verbindung unterworfen.
p0= +6,5°+o,5° (CHCl3 : CH3OH = 1 : 1, C=5,o) Elementaranalyse für C42Hg2O NP (Molekulargewicht 776,1)
berechnet (%) : N 1,8ο; Ρ 3,99
gefunden (%) :"N 2,11; P 3,66
Dieses Produkt zeigt einen einzigen Flecken in der Lünnschicht-Chromatografie, welcher mit dem eines Bezugsstandards identisch ist. Darüber hinaus ist auch das Infrarotspektrum des Produktes mit jenem einer BezugsStandardverbindung identisch.
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Das in dem vorstehenden Beispiel verwendete 1-Linoleoylimidazol wird aus Ν,Ν'-Carbonyldiimidazol (1.62o mg) und Linolsäure (2.1oo mg) in gleicher Weise wie es in Beispiel 5 beschrieben ist erzeugt.
Beispiel 7
In gleicher Weise wie in Beispiel 5 oder 6 beschrieben wird i-Linoleoyl-L-S-glycerylphosphorylcholin aus reinem 1,2-Dilinoleoyl-L-3-glycerylphosphorylcholin unter Anwendung von Phospholipase A2, welche aus Crotalus admanteus-Gift oder Naja naja-Gift erhalten wurde, hergestellt.
Das i-Linoleoyl-L-3-glycerylphosphorylcholin (352,2 mg, 6,54 χ 1o Mol), 1-Palmitoylimidazol ( 594,8 mg, 1,96 χ 1o Mol) und Imidazolnatriumsalz (1o mg) werden zu trockenem THP (15 ml) gegeben und das Gemisch wird bei Raumtemperatur während 7o Stunden umgesetzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wird in gleicher Weise wie in Beispiel 5 beschrieben behandelt und schliesslich einer Silicagel-Säulenchromatografie unterworfen, wobei das gewünschte i-Linoleoyl-2-Palmitoyl-L-3-glycerylphosphorylcholin (3o2, 6 mg, 58,9 %) als farblose, klebrige Verbindung erhalten wird.
0= +6,5°+ 0,5° (CHCl3: CH3OH = 1 f 1, C= 5,o)
Elementaranalyse für C42H82O9NP (Molekulargewicht 776,1)
berechnet (%) : N 1,8ο; Ρ 3,99
gefunden (%) : N 1,78; P 3,80
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Dieses Produkt zeigt einen einzigen Flecken bei der Dünnschicht-Chromatografie, welcher mit jenem eines Bezugsstandards identisch ist. Darüber hinaus ist auch das Infrarotspektrum des Produktes mit jenem einer Bezugsstandardverbindung identisch.
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Claims (11)

  1. Patentansprüche
    f 1 .J Verfahren zur Herstellung eines 1,2-Diacyl-3· ^■"glycerylphosphorylcholins der Formel
    CH0-O-COR
    CH-0-COR1 CH
    CH2-O-P-O-CH2CH2N \ CH3
    4 \
    CH3
    worin R und R1 verschieden oder gleich sind und jeweils einen Rest einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure darstellen, dadurch gekennzeichnet , dass man ein Glyceryl-phosporylcholin oder Monoacylderivat hiervon oder das -Salz hiervon mit einem Acylierungsmittel, das unter 1-Acylimidazol und 4-Acyl-3-phenyl-1 ,2 ,4-oxadiaz.ol-5-on ausgewählt ist, in Gegenwart eines Katalysators acyliert, der unter Alkalisalzen einer Stickstoff enthaltenden 5-gliedrigen, heterocyclischen Verbindung und Natriumoxid ausgewählt ist.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Monoacylderivat 1-Monoacy1-3-glycerylphosphorylcholin der Formel
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    CH2-O-COR
    CH—OH
    ι> +
    CH2-O-P-O-CH2CH2N (CH3)
    O"
    verwendet, worin R einen gesättigten oder ungesättigten Fettsäurerest bedeutet.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Monoacylgruppe des i-Monoacyl-S-glycerylphosphorylcholin einen gesättigten oder ungesättigten Fettsäurerest verwendet, der mit einem Isotop markiert ist.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Monoacylderivat 2-Monoacyl-3-glycerylphosphorylcholin der Formel
    CH0-OH
    CH—0-COR1
    11 +
    CH2O-P-O-CH2CH2N (CH3)3
    o"
    worin R1 einen gesättigten oder ungesättigten Fettsäurerest bedeutet *■ verwendet
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man als Acylierungsmittel 1-Acylimidazol verwendet.
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  6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Acylgruppe des 1-Acylimidazols einen Rest einer ungesättigten Fettsäure mit 14 bis 2o Kohlenstoffatomen verwendet.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass man als ungesättigte Fettsäure Myristolsäure, Palmitolsäure, ölsäure, Linolsäure, Linolensäure und Arachidonsäure verwendet.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Acylgruppe des 1-Acylimidazols einen Rest einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure, die mit einem Isotop markiert ist, verwendet.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Gruppen R und R1 voneinander verschieden sind.
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , dass eine der Gruppen R und R1 einen gesättigten Fettsäurerest und die andere einen ungesättigten Fettsäurerest darstellt.
  11. 11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man einen Katalysator verwendet, der unter Imidazol-natriumsalz, Triazolnatriumsalz und Benzimidazolnatriumsalz ausgewählt ist.
    \
    609832/0969
DE2604283A 1975-02-04 1976-02-04 Verfahren zur Herstellung von 1,2-Diacyl-3-glycerylphosphorylcholinen Expired DE2604283C2 (de)

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