KR101995642B1 - 포스파티딜콜린으로부터 식품원료로 이용가능한 콜린알포세레이트의 제조방법 - Google Patents

포스파티딜콜린으로부터 식품원료로 이용가능한 콜린알포세레이트의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포스파티딜콜린으로부터 식품원료로 이용가능한 콜린알포세레이트의 제조방법에 대한 것으로, 본 발명에 따른 콜린알포세레이트 제조방법은 특정 반응매질 및 특정 촉매 효소를 사용함으로써, 고순도의 콜린알포세레이트를 효과적으로 제조할 수 있다. 특히 상기 제조방법은 기질에 대한 용해성이 높고 식품원료 제조에 사용가능한 추출용매인 물과 헥산의 혼합용매를 반응매질로 이용하고 반응매질의 층 분리 과정만으로 콜린알포세레이트를 고순도로 정제할 수 있기 때문에 기존 효소적 합성법에 비해 콜린알포세레이트의 생산성이 크게 향상되며 기존 화학적 합성법 및 기존 정제법과 달리 정제가 매우 간단하며 식품원료로 이용가능한 콜린알포세레이트의 제조가 가능한 장점이 있다. 또한, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 콜린알포세레이트는 뇌졸중과 알츠하이머병 등의 치매 환자의 인지기능 개선을 위한 식품, 의약품 등의 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

포스파티딜콜린으로부터 식품원료로 이용가능한 콜린알포세레이트의 제조방법{Manufacturing method of food-grade choline alfocerate from phosphatidylcholine}
본 발명은 포스파티딜콜린으로부터 식품원료로 이용가능한 콜린알포세레이트의 제조방법에 관한 것이다.
콜린알포세레이트(choline alfoscerate)는 L-α-글리세릴포스포릴콜린(L-α-glycerylphosphorylcholine; sn-glycero-3-phosphocholine)이라고도 불리는 물질로 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine; 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine)으로부터 두 개의 아실기(acyl group)가 제거된 형태를 가진다. 콜린알포세레이트는 신경전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine)과 세포막의 주요성분인 포스파티딜콜린의 생체 내 전구물질로 뇌졸중과 알츠하이머병 등의 치매 환자의 인지기능 개선제(cognitive enhancer)로 사용된다. 콜린알포세레이트는 2012년 11월에 미국 FDA에 의해 GRAS로 인정되었다(GRN No. 419). 반면에 국내에서는 콜린알포세레이트의 식품첨가물이나 건강기능식품 원료로의 사용이 아직까지 인정되지 않았다.
현재 콜린알포세레이트의 합성방법은 크게 화학적 방법과 효소적 방법이 있다. 화학적 합성법은 염기(e.g., Tetrabutylammonium hydroxide (TBAI)) 촉매 하에 유기용매를 반응매질로 하여 포스파티딜콜린의 탈아실화반응 또는 글리세롤 유도체(e.g., glycidol, solketal)와 포스포콜린 공여체 간의 축합반응으로 콜린알포세레이트를 제조하는 방법이다. 화학적 합성법은 반응의 효율성과 생산성이 높은 장점이 있으나 유독성의 기질과 촉매를 사용한다는 문제점이 있어 식품원료로 이용이 어려우며 최근의 세계적인 환경규제 강화와 친환경 제조기술 개발 추세에 부합하지 않는다. 이에 반해 효소적 합성법은 화학적 합성법에 비해 환경 친화적 대체기술로 주목을 받고 있는데 반응촉매로 포스포리파아제 A1(phospholipase A1)을 단독으로 사용하거나 sn-1,3 위치 특이성 리파아제(sn-1,3 specific lipase)와 포스포리파아제 A2(phospholipase A2)를 병용하여 pH 완충용액과 같은 수용액 매질에서 순수 포스파티딜콜린 또는 레시틴을 가수분해하여 콜린알포세레이트를 제조하는 방법이 널리 사용되고 있다. 하지만 이와 같은 기존의 효소반응 시스템은 레시틴 등의 기질이 수용액 매질에 대한 용해도가 낮기 때문에 화학적 합성법에 비해 반응의 효율성 및 생산성이 현저히 떨어지는 문제점이 있어 산업적으로 활용하기에는 많은 제한점이 있다. 예를 들어 Blasi et al. (2006)은 sn-1,3 위치 특이성 리파아제와 포스포리파아제 A2를 함께 반응촉매로 사용하여 Tris buffer 100mL에서 난황 포스파티딜콜린 0.5g을 가수분해하여 콜린알포세레이트를 제조하였다.
화학적 또는 효소적 방법에 의해 합성된 콜린알포세레이트의 분리정제에는 주로 유기용매 추출법과 칼럼 크로마토그래피법이 이용되고 있다. 유기용매 추출법은 에테르, 메탄올 등을 이용하여 콜린알포세레이트보다 극성도가 낮은 물질들을 선택적으로 추출하여 제거함으로써 콜린알포세레이트를 분리정제하는 방법이다(McArthur, US Patent, US 2864848, 1958). 칼럼 크로마토그래피법은 주로 극성 고정상(실리카, 이온 교환수지 등)에서 메탄올, 클로로포름 등의 유기용매를 이동상으로 이용하여 콜린알포세레이트 등 반응산물 내 물질들을 극성도에 따라 순차적으로 분리정제하는 방법이다. 하지만 에테르, 메탄올, 클로로포름 등의 유기용매는 식품공전 또는 식품첨가물공전에서 기능성 식품원료의 제조에 사용될 수 있는 추출용매로 규정하고 있지 않으며 부득이하게 사용할 경우 제조공정 중 이를 제거하는 공정을 추가하고 그 잔류기준을 설정하여 제품생산 시 잔류 용매량을 관리해야 한다.
미국등록특허 US8658401 (2014.02.25 등록)
본 발명은 포스파티딜콜린으로부터 식품원료로 이용가능한 콜린알포세레이트를 제조하는 방법과 이를 통해 제조된 콜린알포세레이트에 관한 것이다. 보다 자세하게는 1) 식품원료 제조에 사용가능한 추출용매인 물과 헥산을 혼합한 반응매질을 사용하여 포스파티딜콜린을 효소촉매 하에 가수분해하여 콜린알포세레이트를 수득하는 방법과 2) 이 반응매질을 단순히 층 분리하는 과정만으로 수득된 콜린알포세레이트를 추출하거나 추가적으로 식품원료 제조에 사용가능한 추출용매인 물을 사용하여 수득된 콜린알포세레이트를 추출하여 콜린알포세레이트를 고순도로 분리정제하는 방법에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 포스파티딜콜린에 물과 헥산의 혼합용매 및 리파아제 효소를 첨가한 후 가수분해 반응시키는 단계; 2) 상기 반응물로부터 리파아제 효소를 제거하는 단계; 3) 상기 2) 단계 반응물을 층 분리하는 단계; 및 4) 상기 층 분리된 반응물로부터 물층을 회수하여 물 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 콜린알포세레이트 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 식품원료로 이용가능한 콜린알포세레이트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 콜린알포세레이트를 유효성분으로 함유하는 인지기능 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명은 포스파티딜콜린으로부터 식품원료로 이용가능한 콜린알포세레이트의 제조방법에 대한 것으로, 본 발명에 따른 콜린알포세레이트 제조방법은 특정 반응매질 및 특정 촉매 효소를 사용함으로써, 고순도(98~99중량%)의 콜린알포세레이트를 효과적으로 제조할 수 있다. 또한 상기 반응매질은 식품제조에 사용이 가능한 용매들로 구성되며 반응 종료 후 상기 반응매질을 단순히 층 분리하는 과정만으로 콜린알포세레이트를 고순도로 분리정제하는 것이 가능하므로 식품원료로 이용가능한 콜린알포세레이트를 효과적으로 제조할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 방법으로 제조된 콜린알포세레이트는 치매 환자의 인지기능 개선제 등 건강보조를 위한 소재로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 콜린알포세레이트 제조를 위한 포스파티딜콜린의 리파아제 촉매 가수분해 반응을 간략하게 보여주는 반응식이다.
도 2는 효소반응 단계 및 분리정제 단계를 포함하는 콜린알포세레이트의 제조 과정을 전체적으로 나타내는 흐름도이다.
도 3은 효소 종류(Novozyme® 435, Lipozyme® RM IM, Lipozyme® TL IM, immobilized Candida rugosa lipase, Lecitase® Ultra)에 따른 대두 포스파티딜콜린의 가수분해 반응의 반응산물 내 콜린알포세레이트 함량을 반응시간의 함수로 나타낸 그래프이다.
도 4는 반응매질 내 물의 비율(대두 포스파티딜콜린 무게 대비 20~400%)에 따른 대두 포스파티딜콜린의 가수분해 반응의 반응산물 내 콜린알포세레이트 함량을 반응시간의 함수로 나타낸 그래프이다.
도 5는 콜린알포세레이트의 제조에 사용된 대두 포스파티딜콜린 기질과 콜린알포세레이트 제조 과정 중 수득된 반응산물 및 정제물을 액체 크로마토그래피-증기화 광산란 검출기(LC-ELSD) 시스템을 이용하여 분석하여 얻은 크로마토그램이다. 약어: PC, 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine); FFA, 유리지방산(free fatty acid).
본 발명자들은 선행연구에서 물과 헥산(n-hexane)의 혼합용매를 반응매질로, 포스포리파아제 A1을 반응촉매로 사용하여 대두 포스파티딜콜린을 가수분해하여 콜린알포세레이트를 제조하면 이 반응매질에 대한 대두 포스파티딜콜린의 용해도가 크게 증가하여(반응매질 100mL 당 포스파티딜콜린 ~21g 용해) 반응의 효율성 및 생산성이 크게 증가하는 것을 확인하였다(Bang et al., Food Chem., 190, 201-206, 2016). 또한 이 선행연구에서는 반응 후 에테르를 이용하여 생성된 유리지방산을 추출하여 제거하고 다시 메탄올과 물의 혼합용매를 이동상으로 이용한 칼럼 크로마토그래피법으로 고순도(>99중량%)의 콜린알포세레이트를 분리정제하였다. 다만 이 선행연구에서 사용한 콜린알포세레이트 제조방법은 반응시간이 길고(e.g., 30시간) 식품제조에 사용이 불가능한 추출용매를 이용하여 콜린알포세레이트를 분리정제하기 때문에 수득된 콜린알포세레이트를 식품원료로 이용이 어려운 단점이 있었다. 이러한 문제를 해결하기 위한 후속 연구에서 물과 헥산의 혼합 반응매질 중 물이 일정 용량 비율 이상이 되면 특정 효소를 사용하였을 때만 짧은 반응시간(e.g., 5~6시간) 내에 대두 포스파티딜콜린이 모두 콜린알포세레이트로 전환되는 것을 확인하였다. 또한 반응 종료 후 이 물과 헥산의 혼합 반응매질을 단순히 층 분리하는 과정만으로 콜린알포세레이트가 고순도(98~99중량%)로 분리정제되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 1) 포스파티딜콜린에 물과 헥산의 혼합용매 및 리파아제 효소를 첨가한 후 가수분해 반응시키는 단계; 2) 상기 반응물로부터 리파아제 효소를 제거하는 단계; 3) 상기 2) 단계 반응물을 층 분리하는 단계; 및 4) 상기 층 분리된 반응물로부터 물층을 회수하여 물 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 콜린알포세레이트 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 리파아제는 sn-위치 비특이성 리파아제일 수 있으며, 보다 바람직하게는, 칸디다 안타르크티카 리파아제 B(Candida antarctica lipase B)일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는, 다공성 아크릴 수지(macroporous acrylic resin)를 고정화 담체로 사용한 칸디다 안타르크티카 리파아제 B일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 물과 헥산의 혼합용매 내 물의 양은 포스파티딜콜린 중량 대비 20 내지 400 중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 리파아제 효소량은 포스파티딜콜린 중량 대비 5 내지 15 중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 가수분해 반응은 50 내지 55℃에서 2 내지 12시간 동안 반응시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 가수분해 반응은 상기 물과 헥산의 혼합용매 내 물의 양은 포스파티딜콜린 중량 대비 100 내지 200 중량%이고, 상기 리파아제 효소량은 포스파티딜콜린 중량 대비 5 내지 10 중량%이며, 50 내지 55℃에서 3 내지 6시간 동안 반응시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 3) 단계는 1 : 1 부피비의 물 및 헥산을 추가로 첨가하여 층 분리하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 4) 단계의 물 분획물을 수득하는 단계는 헥산층에 존재하는 유리지방산을 제거하기 위한 것일 수 있다.
한편, 상기 방법에 의해 제조되는 콜린알포세레이트는 식품원료로 이용가능하다.
본 발명에서 "포스파티딜콜린(phosphatidylcholine; 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine)"은 글리세로인지질(glycerophospholipids)의 한 종류로 글리세롤, 지방산, 인산 및 콜린[CH2CH2N+(CH3)3]기로 구성되며 모든 동물과 식물의 세포막의 주요성분으로 하기 화학식 1로 표시된다.
[화학식 1]
Figure 112017130432443-pat00001
상기 포스파티딜콜린은 시중에서 판매되는 것을 구입하여 사용하거나 또는 당업계의 공지된 방법으로 대두유 또는 난황으로부터 직접 분리·정제하여 사용할 수도 있다.
본 발명에서 “콜린알포세레이트(choline alfoscerate)”는 L-α-글리세릴포스포릴콜린(L-α-glycerylphosphorylcholine; sn-glycero-3-phosphocholine)라고도 불리는 물질로 포스파티딜콜린으로부터 두 개의 아실기(acyl group)가 제거된 형태를 가지며 하기 화학식 2로 표시된다. 콜린알포세레이트는 신경전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine)과 세포막의 주요성분인 포스파티딜콜린의 생체 내 전구물질로 뇌졸중과 알츠하이머병 등의 치매 환자의 인지기능 개선제(cognitive enhancer)로 사용된다.
[화학식 2]
Figure 112017130432443-pat00002
본 발명에 있어서, 포스파티딜콜린은 기질이며, 물과 헥산의 혼합용매는 반응매질이고, 리파아제 효소는 촉매로 작용한다. 반응매질 중 헥산은 1) 기질인 포스파티딜콜린의 용해도를 향상시켜 반응의 효율성과 생산성을 증가시키고 2) 반응산물 정제를 위한 반응매질의 층 분리 과정에서 반응산물 내 유리지방산을 용해시켜 제거하는 역할을 한다. 반응매질 중 물은 1) 가수분해 반응의 기질로 사용되는 동시에 2) 반응산물 정제를 위한 반응매질의 층 분리 과정에서 반응산물 내 콜린알포세레이트를 용해시켜 수득하는 역할을 한다.
본 발명의 실시예에서, 반응매질로서 물과 헥산의 혼합용매를 이용하였으며, 혼합용매 내 헥산의 양은 바람직하게는 기질로 사용된 분별 레시틴 중량 대비 약 260%(즉 기질 1g 당 4mL)이고, 물의 양은 바람직하게는 기질로 사용된 포스파티딜콜린 중량 대비 20 내지 400 중량%일 수 있으나, 물의 양이 적을수록 반응속도가 느려지고 반면에 물의 양이 너무 많으면 상기 고정화 효소의 침출(leaching from the solid support)이 촉진되는 등 효소의 안정성이 감소하기 때문에, 보다 바람직하게는 포스파티딜콜린 중량 대비 100 내지 200 중량(즉 포스파티딜콜린 1g 당 1 내지 2mL)일 수 있다. 따라서 반응매질은 헥산과 물이 4:1의 부피비로 구성될 수도 있다.
본 발명에서 상기 3) 단계 및 4) 단계는 물과 헥산의 혼합용매인 반응매질을 층 분리하여 포스파티딜콜린으로부터 생성된 콜린알포세레이트를 수득하는 단계로서, 층 분리 후 물 층에 녹아있는 콜린알포세레이트를 회수하는 과정을 포함한다. 반응 종료 후 포스파티딜콜린으로부터 얻은 반응산물은 여과하여 효소가 제거된 반응산물을 얻을 수 있다. 상기 반응산물은 식품제조에 사용이 가능한 용매들인 물과 헥산으로 구성된 반응매질에 용해되어 있는데 특히 포스파티딜콜린이 가수분해되면서 생성된 유리지방산은 헥산층에 존재하고 콜린알포세레이트는 물층에 녹아있기 때문에 상기 반응매질을 상온에서 30분 동안 정치하여 물층을 분리한 후 회전식 감압 농축기 등을 이용하여 건조하면 식품원료로 이용가능한 콜린알포세레이트만을 분리정제할 수 있다. 본 발명에 따른 포스파티딜콜린으로부터 얻은 반응산물의 상기 분리정제 단계 후 수득되는 정제물(물 분획물)의 콜린알포세레이트 함량은 98중량% 이상일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 포스파티딜콜린으로부터 얻은 반응산물의 최종 정제물은 98~99중량%의 콜린알포세레이트를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 식품원료로 이용가능한 콜린알포세레이트를 제공한다.
본 발명에서 포스파티딜콜린으로부터 얻은 반응산물의 정제물들은 콜린알포세레이트를 고순도(98~99중량%)로 함유하고 있기 때문에 콜린알포세레이트가 가지는 주요 생리학적 활성을 가질 수 있다. 콜린알포세레이트는 신경전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine)과 세포막의 주요성분인 포스파티딜콜린의 생체 내 전구물질로 뇌졸중과 알츠하이머병 등의 치매 환자의 인지기능을 개선한다고 알려져 있으므로, 본 발명의 콜린알포세레이트는 상기 효능을 포함하는 식품, 의약품 등의 생산 분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 특히 본 발명에서 포스파티딜콜린으로부터 얻은 반응산물의 정제물들은 물 분획물로 수용성이므로 액상형태의 식품(음료, 차 등), 의약품 등의 생산 분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
또한, 본 발명은 상기 콜린알포세레이트를 유효성분으로 함유하는 인지기능 개선용 건강기능식품을 제공한다. 또한, 상기 콜린알포세레이트를 유효성분으로 함유하는 인지기능 개선용 약제학적 조성물, 식품 조성물, 식품 첨가제 조성물 또는 건강보조식품 조성물로도 사용될 수 있다.
본 발명에서 건강기능식품의 형태는 특별히 제한되지 않는다. 공지의 부재료, 식품 첨가물 등을 혼합하여 음료, 과립, 정제, 분말, 환, 캅셀, 선식, 면류, 과자류, 육류, 생선류, 나물류, 찌개류, 밥류 등을 포함하는 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
식품 첨가물로 예를 들어 단당류, 이당류, 다당류, 당알콜 등의 당류와, 타우마틴, 스테비아 추출물, 사카린, 아스파탐 등의 향미제와, 영양제, 비타민, 식용 전해질, 풍미제, 착색제, 증진제(예, 치즈, 초콜릿 등), 펙트산, 알긴산, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산화제 등이 이용될 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분(콜린알포세레이트)을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 감미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분(콜린알포세레이트)을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 상기 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분(콜린알포세레이트)과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분(제피제)과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 감미제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공되어 휴대가 간편하고 언제 어디서나 수시로 섭취하기가 용이하다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
< 실험예 >
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 시약
하기 실험에서 사용한 대두 포스파티딜콜린(순도 >97%)은 Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL, USA)에서 구입하였고; Novozym 435 [Candida antarctica lipase B immobilized on a macroporous anionic resin (Lewatit VP OC 1600), Lipozyme RM IM (Rhizomucor miehei lipase immobilized on an ion-exchange resin), Lipozyme TL IM (Thermomyces lanuginosus lipase immobilized on silica gel) 및 Lecitase Ultra (phospholipase A1 from T. lanuginosus/Fusarium oxysporum)는 Novozymes A/S (Bagsvaerd, Denmark)에서 구입하였으며; Candida rugosa lipase immobilized on Immobead 150는 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
< 실시예 1> 대두 포스파티딜콜린의 지방산 조성 분석
본 발명에서 콜린알포세레이트 제조를 위한 효소반응의 기질로 사용된 상업용 대두 포스파티딜콜린의 지방산 조성을 하기 표 1에 나타내었다.
대두 포스파티딜콜린의 지방산 조성
Fatty acid Content (mol%)
14:0 0.1±0.0
16:0 15.1±0.1
16:1n-7 0.1±0.0
18:0 3.5±0.0
18:1n-9 11.0±0.0
18:1n-7 1.7±0.0
18:2n-6 62.6±0.1
18:3n-3 5.8±0.0
20:1 0.1±0.0
Total SFA 18.7±0.1
Total USFA 81.3±0.1
모든 수치는 평균 ± SD (n = 2)으로 나타냈다.
약어: SFA, 포화지방산(saturated fatty acids); 및 USFA, 불포화지방산(unsaturated fatty acids).
상기 표 1에서 나타낸 바와 같이, 대두 포스파티딜콜린의 주요 지방산은 리놀레산(62.6몰%), 팔미트산(15.1몰%) 및 올레산(11.0몰%)이었으며 총 불포화지방산의 함량은 81.3몰%이었다.
< 실시예 2> 효소촉매 반응을 이용한 콜린알포세레이트의 제조
상업용 대두 포스파티딜콜린을 기질로 하고 물과 헥산의 혼합용매를 반응매질로 하여 리파아제를 촉매로 이용하는 가수분해 반응을 통해 본 발명의 콜린알포세레이트를 제조하였다.
<2-1> 콜린알포세레이트 제조에 적합한 효소의 선별
본 실험에서는 포스파티딜콜린을 가수분해하여 콜린알포세레이트를 제조하는 반응의 촉매로 적합한 상업용 고정화 리파아제를 선별하기 위해 반응온도를 50℃, 효소량을 기질인 대두 포스파티딜콜린의 무게의 10%로 유지하면서 리파아제의 종류에 따른 반응산물 내 콜린알포세레이트 함량을 측정하였다. 반응 적합성을 평가한 상업용 고정화 효소는 노보짐 435(Novozym 435), 리포자임 RM IM(Lipozyme RM IM), 리포자임 TL IM(Lipozyme TL IM), 칸디다 루고사 리파아제(Candida rugosa lipase immobilized on Immobead 150)의 리파아제 4종과 포스포리파아제 A1 활성을 갖는 Lecitase Ultra를 이용하였다. 상기 리파아제 중 리포자임 RM IM과 리포자임 TL IM은 중성지방 또는 인지질의 sn-1,3 위치 특이성을 가지며 노보짐 435와 칸디다 루고사 리파아제는 중성지방 또는 인지질의 sn 위치에 특이성이 없는 리파아제이다.
자세하게는, 대두 포스파티딜콜린 4g을 회분식 반응기(15cm×5cm i.d.)에 넣고 반응매질로 물과 헥산의 혼합용매 20mL(헥산 16mL + 물 4mL), 각각의 리파아제 0.4g(기질무게의 10%)를 첨가한 후 반응온도 50℃에서 600rpm의 속도로 교반하였다. 반응온도는 반응기의 물 재킷에 연결된 항온 순환 수조에 의하여 일정하게 유지하였다. 반응시간은 최소 2시간에서 12시간으로 설정하였고 반응산물의 시료는 반응시간 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12시간에서 각각 0.2mL씩 취하였다.
한편, 리파아제의 종류에 따른 반응산물 내 콜린알포세레이트 함량을 측정을 위해, 효소반응에 의해 생성된 반응산물 내 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린 및 콜린알포세레이트 함량을 액체크로마토그래피를 이용하여 분석하였다.
효소반응에 의해 생성된 반응산물 0.2mL에 클로로포름/메탄올(1:2, v/v) 2mL을 가하고 0.45μm syringe filter (13mm)로 여과하여 효소를 제거하였다. 질소 기류 하에 용매를 제거하고 액체 크로마토그래피의 이동상으로 사용한 93 v/v% 메탄올 0.2mL에 1mg/mL의 농도로 녹인 후 0.45μm syringe filter (13mm)로 여과한 후 액체크로마토그래프(JASCO Corp., Tokyo, Japan)에 주입하여 분석을 실시하였다. 칼럼으로 LiChrosorb Si 60 column (250mm × 4mm i.d., 5μm particle size, Merck, Darmstadt, Germany)을 사용하였고 증기화 광산란 검출기(Evaporative Light Scattering Detector, ELSD)를 이용하여 검출하였다. 시료 주입량은 20μL, 이동상의 유속은 1mL/분이었다. ELSD의 drift tube 온도는 60℃이었으며 질소는 1.5L/분의 유속으로 공급하였다.
상기와 같은 방법으로 측정된 반응산물 내 콜린알포세레이트 함량은 반응산물 내 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린 및 콜린알포세레이트의 총 함량 대비 백분율로 계산하여 반응시간에 따른 함수로 나타내었다.
그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 노보짐 435와 Lecitase Ultra를 촉매로 사용한 경우에만 포스파티딜콜린의 가수분해 반응이 일어났으며 특히 노보짐 435 촉매 가수분해 반응에서는 반응시간 6시간 만에 포스파티딜콜린이 완전히 가수분해되어 콜린 알포세레이트로 전환되었다. 반면에 리포자임 RM IM, 리포자임 TL IM과 칸디다 루고사 리파아제의 경우 조사한 반응시간 범위 내에서는 포스파티딜콜린의 가수분해 반응이 일어나지 않는 것으로 나타났다.
상기와 같은 결과를 통해, sn-위치 비특이성 리파아제인 노보짐 435이 콜린알포세레이트 제조에 적합한 효소로 확인되었다.
이에, 하기 실험에서는 노보짐 435 촉매 가수분해 반응에 적합한 매질 내 물의 양과 최적 반응조건을 추가로 조사하였고 기질인 포스파티딜콜린의 반응 적합성을 비교 평가하였다.
<2-2> 콜린 알포세레이트 제조에 적합한 매질 내 물의 양 선별
콜린알포세레이트 제조를 위해 대두 포스파티딜콜린을 기질로 하고 반응 적합성이 가장 우수한 것으로 나타난 노보짐 435를 촉매로 하여 가수분해 반응을 실시하였다.
상기 포스파티딜콜린의 가수분해 반응의 매질인 물과 헥산의 혼합용매 중 반응에 필요한 물의 최적 첨가량을 결정하기 위해 반응온도를 50℃, 효소량을 기질인 대두 포스파티딜콜린의 무게의 10%로 유지하면서 매질 내 물의 양(포스파티딜콜린 무게 대비 20~400%)에 따른 반응산물 내 콜린알포세레이트 함량을 측정하였다.
자세하게는, 대두 포스파티딜콜린 4g을 회분식 반응기(15cm×5cm i.d.)에 넣고 반응매질로 물과 헥산의 혼합용매 16.8~32mL(헥산 16mL + 물 0.8, 1.6, 2.4, 3.2, 4, 8, 12, 또는 16mL), 노보짐 435 0.4g(기질무게의 10%)를 첨가한 후 반응온도 50℃에서 600rpm의 속도로 교반하였다. 반응온도는 반응기의 물 재킷에 연결된 항온 순환 수조에 의하여 일정하게 유지하였다. 반응시간은 최소 1시간에서 6시간으로 설정하였고 반응산물의 시료는 반응시간 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6시간에서 각각 0.2mL씩 취하였다.
반응산물 내 콜린알포세레이트 함량 측정은 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방식으로 측정하였으며, 매질 내 물의 양에 따른 반응산물 내 콜린알포세레이트 함량은 반응산물 내 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린 및 콜린알포세레이트의 총 함량 대비 백분율로 계산하여 반응시간에 따른 함수로 나타내었다.
그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 물의 양이 기질 무게 대비 20% 이상일 때 조사한 반응시간 내에서 포스파티딜콜린이 가수분해되어 콜린알포세레이트가 생성되었으며 물의 양이 증가할수록 콜린알포세레이트가 빨리 생성되었다. 물의 양이 기질 무게 대비 20%, 40%, 60%일 때 반응시간 6시간에서 수득된 반응산물의 콜린알포세레이트 함량은 각각 2.4중량%, 21.4중량%, 46.9중량%이었다. 물의 양이 기질 무게 대비 80%일 때 반응시간 5시간에서 수득된 반응산물의 콜린알포세레이트 함량은 97.2중량%이었고 반응시간 6시간에서 수득된 반응산물의 콜린알포세레이트 함량은 100.0중량%이었다. 물의 양이 기질 무게 대비 100%, 200%, 300%, 400%일 때 반응시간 4시간에서 수득된 반응산물의 콜린알포세레이트 함량은 각각 79.3중량%, 99.7중량%, 99.7중량%, 99.9중량%이었고 반응시간 5시간에서 수득된 반응산물의 콜린알포세레이트 함량은 모두 100.0중량%이었다. 결과적으로 물의 양이 기질 무게 대비 100% 이상일 때 반응시간 5시간 이내에 포스파티딜콜린이 완전히 콜린알포세레이트로 전환되는 것을 확인하였다. 상기와 같은 결과를 통해, 기질 무게 대비 100% 이상을 콜린알포세레이트 제조에 적합한 매질 내 물의 양으로 선정하였다.
< 실시예 3> 콜린알포세레이트 제조를 위한 최적 반응조건
상기 실시예 2를 통해 효소촉매 반응을 이용한 콜린알포세레이트 제조를 위해 효소로 노보짐 435를 사용하고, 매질로 물과 헥산의 혼합용매를 사용하여야 하며 매질 내 물의 양은 기질 무게 대비 100% 이상 사용하는 것이 효과적인 사실을 규명하였는바, 본 실험에서는 추가적으로 콜린알포세레이트 제조를 위한 최적 반응조건을 분석하였다.
<3-1> 반응표면분석법을 이용한 최적 반응조건 확립
본 실험에서는 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)의 원리를 이용하여 콜린알포세레이트의 생성량을 최대화하는 포스파티딜콜린의 노보짐 435 촉매 가수분해 반응의 최적 반응조건(반응온도, 반응시간, 매질 내 물의 양, 효소량)을 설정하였다.
자세하게는, 중심합성계획법(central composite design) 중 축점(star point)이 중심점으로부터 1.414의 거리(star distance)에 있는 central composite circumscribed (CCC) design을 이용하여 실험을 설계하였다. 콜린알포세레이트 제조의 최적 반응조건 설정을 위한 독립변수는 반응온도(50~55℃), 반응시간(3~5시간), 매질 내 물의 양(포스파티딜콜린 무게 대비 100~200%) 및 효소량(포스파티딜콜린 무게 대비 5~15%)이였으며 종속변수는 반응산물의 콜린알포세레이트 함량(중량%)이었다. 각 독립변수의 실험범위를 +1.414, +1, 0, -1, -1.414의 5단계로 부호화하고 요인점(factorial point) 16개, 축점 8개, 중심점(center point) 3개를 포함한 27개의 조건을 설정한 후 각각의 조건에서 효소반응을 실시하였다. 위의 4개의 반응조건이 콜린알포세레이트 함량에 미치는 영향을 예측하는 2차 다항 회귀모형(second-order regression model)은 아래의 식과 같다.
Figure 112017130432443-pat00003
Y는 종속변수, 즉 콜린알포세레이트 함량이었고, Xi는 독립변수로, 온도(Te), 반응시간(RT), 매질 내 물의 양(WC) 및 효소량(En)이었다.
상기 반응표면분석법의 실험결과는 Stat-Ease사 (Minneapolis, MN, USA)의 Design Expert 8.0 프로그램을 사용하여 분석하였다.
반응산물 내 콜린알포세레이트 함량 측정은 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방식으로 측정하였으며, 매질 내 물의 양에 따른 반응산물 내 콜린알포세레이트 함량은 반응산물 내 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린 및 콜린알포세레이트의 총 함량 대비 백분율로 계산하여 나타내었다.
그 결과 표 2에서 나타낸 바와 같이, 27개의 반응조건에서 수득된 반응산물의 콜린알포세레이트 함량의 범위는 1.0~100.0 중량%이었다.
포스파티딜콜린의 노보짐 435 촉매 가수분해 반응에 적용한 central composite circumscribed design과 반응조건별 콜린알포세레이트 생성량
Exp.
no.		 Factor Response
Te (℃) RT (h) WC (wt%) En (wt%) Choline alfocerate content (wt%)
1 50.0 3.0 100.0 5.0 1.0±0.3
2 55.0 3.0 100.0 5.0 1.5±0.1
3 50.0 5.0 100.0 5.0 18.6±3.7
4 55.0 5.0 100.0 5.0 44.1±3.8
5 50.0 3.0 100.0 10.0 10.4±2.5
6 55.0 3.0 100.0 10.0 23.7±3.6
7 50.0 5.0 100.0 10.0 99.7±0.5
8 55.0 5.0 100.0 10.0 100.0±0.0
9 50.0 3.0 200.0 5.0 2.2±1.5
10 55.0 3.0 200.0 5.0 10.9±4.2
11 50.0 5.0 200.0 5.0 53.9±3 5
12 55.0 5.0 200.0 5.0 100.0±0.0
13 50.0 3.0 200.0 10.0 27.0±2.1
14 55.0 3.0 200.0 10.0 99.7±0.3
15 50.0 5.0 200.0 10.0 100.0±0.0
16 55.0 5.0 200.0 10.0 100.0±0.0
17 49.0 4.0 150.0 7.5 43.8±4.0
18 56.0 4.0 150.0 7.5 100.0±0.0
19 52.5 2.6 150.0 7.5 4.8±1.4
20 52.5 5.4 150.0 7.5 100.0±0.0
21 52.5 4.0 150.0 4.0 7.0±0.4
22 52.5 4.0 150.0 11.0 100.0±0.0
23 52.5 4.0 79.3 7.5 19.1±2.3
24 52.5 4.0 220.7 7.5 99.9±0.1
25 52.5 4.0 150.0 7.5 91.3±1.0
26 52.5 4.0 150.0 7.5 99.5±0.1
27 52.5 4.0 150.0 7.5 99.8±0.1
모든 수치는 평균 ± SD (n = 3)으로 나타냈다.
약어: Te, 온도(temperature); RT, 반응시간(reaction time); WC, 매질 내 물의 양(water content); 및 En, 효소량(enzyme loading).
위의 반응표면 분석 결과를 바탕으로 얻어진 반응온도(Te), 반응시간(RT), 매질 내 물의 양(WC) 및 효소량(En)에 따른 반응산물의 콜린알포세레이트 함량의 2차 다항 회귀모형의 적합성(goodness-of-fit)을 평가하기 위하여 분산분석(Analysis of Variance, ANOVA)을 실시하였다.
그 결과 표 3에서 나타낸 바와 같이, 상기 4개의 반응인자와 콜린알포세레이트 함량의 관계를 나타낸 2차 다항 회귀모형은 0.01% 유의수준에서 통계적으로 유의하였으며 5% 유의수준에서 적합한 것으로 평가되었다. 상기 2차 다항 회귀모형의 적합성을 평가하기 위한 또 다른 지표로 모형식의 결정계수(coefficients of determination)를 산출하였다. 회귀모형이 회귀모형의 도출에 사용된 데이터에 얼마나 잘 맞는지를 나타내는 지표인 결정계수(R2) 값과 조정 결정계수(adjusted R2) 값은 각각 0.8298과 0.7787이었고 회귀모형이 새로운 관찰에 대한 반응을 얼마나 잘 예측하는 지를 나타내는 지표인 예측 결정계수 (Q2) 값은 0.6965이었다. 따라서 회귀모형의 설명력과 예측력 모두 우수한 것으로 평가되었다.
회귀모형의 분산분석
Variable df SS MS F-value p-value
Corrected total 26 47242.36
Model 6 39200.97 6533.49 16.25 <0.0001
Residual 20 8041.39 402.07
Lack of fit 18 7994.86 444.16 19.09 0.0509
Pure error 2 46.53 23.26
약어: df, 자유도(degree of freedom); SS, 제곱합(sum of squares); 및 MS, 평균제곱(mean square).
앞서 콜린알포세레이트 제조를 위한 포스파티딜콜린의 노보짐 435 촉매 가수분해 반응에 대한 회귀모형의 도출 시 사용된 독립변수들은 후진제거법(backward elimination method)을 이용하여 선택하였다. 즉 본 연구에서 포스파티딜콜린의 가수분해 산물의 콜린알포세레이트 함량에 영향을 미치는 반응인자로 고려된 반응온도(Te), 반응시간(RT), 매질 내 물의 양(WC) 및 효소량(En)의 일차항(linear term)과 이들 인자의 제곱인 이차항(quadratic term), 그리고 이들 인자간의 교차항(interaction term)을 모두 설명변수로 모형에 삽입한 후 가장 유의하지 않은 설명변수를 제외해가면서 최종적으로 모형에는 유의한 설명변수만을 남김으로써 콜린알포세레이트 함량에 대한 회귀모형을 각각 도출하였다. 각각의 회귀모형에서 최종적으로 선택된 독립변수의 계수(coefficients)의 절대값은 종속변수인 콜린알포세레이트 함량에 미치는 상대적인 영향력을 의미한다.
그 결과 표 4에서 나타낸 바와 같이, 상기 4개의 반응인자 모두 콜린알포세레이트 함량에 유의적인 영향을 미치는 것으로 나타났으며 반응시간(RT; 28.73), 효소량(En; 22.99), 매질 내 물의 양(WC; 15.45) 및 반응온도(Te; 12.33)의 일차항 순으로 큰 양의 계수 값을 가지고 있어 특히 반응시간이 콜린알포세레이트 함량에 대해 가장 큰 설명력을 가지고 있는 변수로 판단되었다. 한편 반응시간(RT*RT; -14.69)과 효소량(WC*WC; -14.14)의 이차항은 5% 수준에서 유의한 설명력을 나타내었으며 음의 계수 값을 가지고 있었다. 반면에 반응온도(Te*Te)와 매질 내 물의 양(WC*WC)의 이차항은 5% 유의수준에서 콜린알포세레이트 함량에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 한편 상기 4개의 반응인자 간의 모든 교차항은 5% 수준에서 콜린알포세레이트 함량에 유의적인 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본 발명에서 조사한 반응온도(50~55℃), 반응시간(3~5시간), 매질 내 물의 양(100~200중량%) 및 효소량(5~15중량%)의 범위에서는 반응시간과 효소량이 증가함에 따라 반응산물 내 콜린알포세레이트 함량이 증가하다가 일정 조건에서 최대값에 도달한 후 다시 그 함량이 감소하는 경향을 나타내는 반면에 반응온도와 매질 내 물의 양의 경우 이들 변수의 값이 증가함에 따라 콜린알포세레이트 함량이 계속 증가한다는 것을 의미한다.
포스파티딜콜린의 노보짐 435 촉매 가수분해 반응에 대한 2차 회귀모형식
Effect Coefficient p-value
Intercept 79.06 <0.0001
Linear term
Te 12.33 0.0124
RT 28.73 <0.0001
WC 15.45 0.0026
En 22.99 <0.0001
Quadratic term
RT*RT -14.69 0.0396
En*En -14.14 0.0468
약어: 자유도(degree of freedom); SS, 제곱합(sum of squares); 및 MS, 평균제곱(mean square).
본 발명에서 도출된 회귀모형의 타당성을 검증하기 위해 독립변수의 주어진 범위에서 표 2의 27개 반응조건을 제외한 10개의 반응조건을 추가적으로 설정하고 이들 조건에서 얻은 반응산물의 콜린알포세레이트 함량을 회귀모형식을 이용하여 예측한 콜린알포세레이트 함량과 서로 비교하였다.
그 결과 표 5에서 나타낸 바와 같이, 콜린알포세레이트 함량에 대한 회귀모형의 예측 오차(prediction error)는 0.6~61.4%의 범위를 나타내었다. 특히 예측 값이 상대적으로 큰 5~10번 조건에서 얻은 반응산물의 콜린알포세레이트 함량에 대한 예측 오차는 0.6~24.6%로 상대적으로 낮게 나타났다. 본 발명에서 도출한 2차 회귀모형의 용도는 콜린알포세레이트의 생성량을 최대한 증가시키는 최적 반응조건을 확립하는데 있으므로 상기 회귀모형은 타당성을 가지고 있는 것으로 평가되었다.
포스파티딜콜린의 노보짐 435 촉매 가수분해 반응에 대한 2차 회귀모형식을 이용하여 예측한 반응조건별 콜린알포세레이트 생성량과 실제 반응 시 콜린알포세레이트 생성량
Exp. no. Factor Response
Te (℃) RT (h) WC (wt%) En (wt%) Choline alfocerate content (wt%)
Observed Predicted %PE
1 50.3 3.1 169.3 5.0 2.2±0.7 2.1 4.6
2 51.0 3.0 121.9 7.0 9.4±3.2 14.8 58.2
3 50.1 4.8 103.2 5.0 20.4±5.3 29.6 45.4
4 51.5 4.9 102.9 5.1 23.1±7.5 37.2 61.4
5 54.2 4.9 100.2 5.0 45.3±13.6 48.8 7.6
6 54.3 4.8 110.5 5.2 50.5±2.5 56.8 12.5
7 50.3 4.9 197.2 5.3 69.3±4.4 66.0 4.8
8 50.0 3.5 198.3 9.9 95.0±4.2 71.6 24.6
9 50.4 4.0 194.4 8.5 98.5±2.2 89.6 9.0
10 54.2 4.2 186.6 7.0 100.0±0.0 99.4 0.6
모든 수치는 평균 ± SD (n = 3)으로 나타냈다.
약어: Te, 온도(temperature); RT, 반응시간(reaction time); WC, 매질 내 물의 양(water content); En, 효소량(enzyme loading); 및 %PE, 백분율 예측오차(percentage prediction error).
본 발명에서 도출된 회귀모형을 이용하여 콜린알포세레이트의 생성량을 최대화하는 포스파티딜콜린의 노보짐 435 촉매 가수분해 반응의 최적 반응조건을 설정하였다. Design Expert 8.0 프로그램의 Optimization function을 이용하여 반응산물 내 콜린알포세레이트 함량이 100중량%가 될 것으로 예측되는 반응온도, 반응시간, 매질 내 물의 양, 효소량에 대한 조건 4가지를 도출하였으며 이들 최적조건에서 얻은 반응산물의 콜린알포세레이트 함량을 조사하였다.
그 결과 표 6에서 나타낸 바와 같이, 상기 조건 4가지에서 모두 포스파티딜콜린이 완전히 콜린알포세레이트로 전환되는 것을 확인하였다. 효소반응을 산업적으로 이용하는데 있어서 가장 어려운 점은 대부분의 효소촉매가 비싸 경제성이 떨어지는 것이다. 따라서 본 발명의 궁극적인 목표인 콜린알포세레이트의 산업적 제조를 위해서는 상기 가수분해 반응 후 노보짐 435 효소를 회수하여 재사용하는 것이 반드시 필요하다. 상기 노보짐 435 효소의 고정화 담체는 교반 등의 전단력에 의해 파괴되기(ruptured) 쉽고 계면활성제 또는 극성용매에 의해 고정화 담체로부터 효소의 침출이 일어날 가능성이 높다. 따라서 본 발명에 따른 반응조건 중 매질 내 물의 양이 많을수록 상기 노보짐 435의 안정성이 감소하여 반응 후 회수하여 재사용이 어려워지는 문제점이 있어 본 발명에서는 매질 내 물의 양이 상대적으로 적은 4번 조건(반응온도 55.0℃, 반응시간 4.9시간, 매질 내 물의 양 105.9중량%, 효소량 9.4중량%) 또는 이와 유사한 조건(반응온도 55℃, 반응시간 6시간, 매질 내 물의 양 100중량%, 효소량 10중량%)을 콜린알포세레이트의 생성량을 최대화하는 포스파티딜콜린의 노보짐 435 촉매 가수분해 반응의 최적 반응조건으로 설정하였다.
포스파티딜콜린의 노보짐 435 촉매 가수분해 반응에 대한 2차 회귀모형식을 이용하여 도출한 최적 반응조건과 실제 반응 시 콜린알포세레이트 생성량
Exp. no. Factor Response
Te (℃) RT (h) WC (wt%) En (wt%) Choline alfocerate content (wt%)
Observed Predicted %PE
1 54.1 3.9 185.2 8.8 100.0±0.0 100.0 0.0
2 55.0 5.0 199.2 6.2 100.0±0.0 100.0 0.0
3 50.0 4.4 198.7 8.9 100.0±0.0 100.0 0.0
4 55.0 4.9 105.9 9.4 100.0±0.0 100.0 0.0
모든 수치는 평균 ± SD (n = 3)으로 나타냈다.
약어: Te, 온도(temperature); RT, 반응시간(reaction time); WC, 매질 내 물의 양(water content); En, 효소량(enzyme loading); 및 %PE, 백분율 예측오차(percentage prediction error).
< 실시예 4> 반응산물로부터 콜린알포세레이트의 분리정제
상기 실시예 <3-1>를 통해 설정한 최적 반응조건에서 제조한 대두 포스파티딜콜린의 노보짐 435 촉매 가수분해 반응산물을 반응 후 반응매질을 층 분리하는 과정을 통해 콜린알포세레이트를 분리정제하였다.
<4-1> 반응산물의 물 분획물 제조
본 실험에서는 대두 포스파티딜콜린을 노보짐 435 촉매 하에 가수분해하여 수득된 반응산물로부터 물 분획물을 제조하고 상기 분획물의 콜린알포세레이트 함량을 측정하였다.
자세하게는, 대두 포스파티딜콜린 4g을 회분식 반응기(15cm×5cm i.d.)에 넣고 반응매질로 물과 헥산의 혼합용매 20mL(헥산 16mL + 물 4mL), 노보짐 435 0.4g(기질무게의 10%)를 첨가한 후 반응온도 55℃에서 600rpm의 속도로 교반하면서 6시간 반응시켰다. 반응온도는 반응기의 물 재킷에 연결된 항온 순환 수조에 의하여 일정하게 유지하였다. 반응 종료 후 반응산물을 여과지가 깔린 부흐너깔때기에 넣고 감압 여과하여 노보짐 435 효소를 제거한 반응산물을 얻었다. 반응기 내에 남아 있는 반응산물은 추가로 물 20mL로 상기 부흐너깔때기에 씻어 넣고 여과하였다. 여과 후 반응산물을 분액깔대기에 넣고 추가로 물 20mL과 헥산 20mL을 넣은 후 상온에서 30분 동안 정치하여 반응매질을 헥산층과 물층으로 분리하였다. 이 때 기질이 가수분해되면서 생성된 유리지방산은 헥산층에 존재하고 콜린알포세레이트는 물층에 용해되어 있기 때문에 상기 물층을 회수하여 회전식 감압 농축기를 이용하여 40℃에서 건조하여 콜린알포세레이트의 정제물(물 분획물)을 제조하였다.
대두 포스파티딜콜린의 반응산물로부터 수득된 물 분획물 내 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린 및 콜린알포세레이트 함량 측정은 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방식으로 측정하였으며, 각 성분의 함량은 상기 물 분획물 내 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린 및 콜린알포세레이트의 총 함량 대비 백분율로 나타내었다.
그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 대두 포스파티딜콜린의 반응산물로부터 수득된 물 분획물에서는 상기 반응산물에 존재했던 유리지방산이 거의 완전히 제거된 것을 확인하였다.
그 결과 표 7에서 나타낸 바와 같이, 대두 포스파티딜콜린의 반응산물에서 수득된 물 분획물의 수율은 원료 기질인 대두 포스파티딜콜린콜린의 무게 대비 31.8중량%이었으며 상기 물 분획물의 콜린알포세레이트 함량은 98.6중량%이었다.
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대두 포스파티딜콜린의 노보짐 435 가수분해 반응산물로부터 수득된 물 분획물의 수율 및 콜린알포세레이트 함량
Products Product yield (wt% of substrate) Choline alfocerate content (wt%)
Water-soluble fraction 31.8±5.6 98.6±0.3
모든 수치는 평균 ± SD (n = 3)으로 나타냈다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

1) 포스파티딜콜린에, 헥산과 상기 포스파티딜콜린 중량 대비 80 내지 400 중량%의 물이 혼합된 혼합용매 및 다공성 아크릴 수지(macroporous acrylic resin)를 고정화 담체로 사용한 칸디다 안타르크티카 리파아제 B 효소를 첨가한 후, 50 내지 55℃에서 4 내지 12시간 동안 가수분해 반응시키는 단계;
2) 상기 가수분해 반응의 반응물로부터 리파아제 B 효소를 제거하는 단계;
3) 상기 2) 단계의 리파아제 B 효소가 제거된 반응물에, 1 : 1 부피비의 물 및 헥산을 추가로 첨가하여 층 분리하는 단계; 및
4) 상기 층 분리된 반응물로부터 물층을 회수하여 물 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 식품원료로 이용가능한 콜린알포세레이트 제조방법.
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제1항에 있어서, 상기 다공성 아크릴 수지(macroporous acrylic resin)를 고정화 담체로 사용한 칸디다 안타르크티카 리파아제 B 효소량은 포스파티딜콜린 중량 대비 5 내지 15 중량%인 것을 특징으로 하는 식품원료로 이용가능한 콜린알포세레이트 제조방법.
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제1항에 있어서, 상기 가수분해 반응은 상기 물과 헥산의 혼합용매 내 물의 양은 포스파티딜콜린 중량 대비 100 내지 200 중량%이고, 상기 리파아제 B 효소량은 포스파티딜콜린 중량 대비 5 내지 10 중량%이며, 50 내지 55℃에서 4 내지 6시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 식품원료로 이용가능한 콜린알포세레이트 제조방법.
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제1항에 있어서, 상기 4) 단계의 물 분획물을 수득하는 단계는 헥산층에 존재하는 유리지방산을 제거하기 위한 것을 특징으로 하는 식품원료로 이용가능한 콜린알포세레이트 제조방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210057630A (ko) * 2019-11-12 2021-05-21 주식회사 뉴로바이오로직스 유지를 이용한 콜린알포세레이트 조성물의 제조 방법 및 그 조성물
KR102531373B1 (ko) * 2022-02-21 2023-05-12 이광미 난황 레시틴으로부터 콜린 알포세레이트를 제조하는 방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102277393A (zh) * 2011-08-18 2011-12-14 河南工业大学 一种酶催化醇解制备溶血磷脂酰胆碱的方法
US20120244583A1 (en) * 2011-03-24 2012-09-27 Yuanfa Liu Method for Preparing High Purity L-alpha Glycerylphosphorylcholine

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120244583A1 (en) * 2011-03-24 2012-09-27 Yuanfa Liu Method for Preparing High Purity L-alpha Glycerylphosphorylcholine
US8658401B2 (en) 2011-03-24 2014-02-25 Jiannan University Method for preparing high purity L-α glycerylphosphorylcholine
CN102277393A (zh) * 2011-08-18 2011-12-14 河南工业大学 一种酶催化醇解制备溶血磷脂酰胆碱的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Food Chemistry, Vol. 190, pp. 201-206 (2016.05.20.)* *
J. Chem. Technol. Biotechnol., Vol. 88, pp. 1859-1863 (2013.)* *
JAOCS, Vol. 70, pp. 111-117 (1993.) *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210057630A (ko) * 2019-11-12 2021-05-21 주식회사 뉴로바이오로직스 유지를 이용한 콜린알포세레이트 조성물의 제조 방법 및 그 조성물
KR102433277B1 (ko) 2019-11-12 2022-08-31 주식회사 에임헬스 유지를 이용한 콜린알포세레이트 조성물의 제조 방법
KR102531373B1 (ko) * 2022-02-21 2023-05-12 이광미 난황 레시틴으로부터 콜린 알포세레이트를 제조하는 방법

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