PT1890706E

PT1890706E - Processo para a preparação e isolamento de fosfátidos

Info

Publication number: PT1890706E
Application number: PT06753893T
Authority: PT
Inventors: Anna Maria Zanellato; Mara Pittarello; Antonio Gambillara; Susanna Vaccaro
Original assignee: Fidia Farmaceutici
Priority date: 2005-05-30
Filing date: 2006-05-26
Publication date: 2012-05-25
Also published as: EP1890706A2; IL187749A0; PL1890706T3; MX2007015064A; EP1890706B1; HK1119584A1; AU2006254376B2; US7759095B2; BRPI0611316A2; AU2006254376A1; CN101184494A; ES2382748T3; BRPI0611316B8; CA2610575C; EP2431020B1; IL187749A; WO2006128639A2; BRPI0611316B1; NO20076158L; KR20080011678A

Description

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DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO E ISOLAMENTO DE FOSFATIDOS"

OBJECTO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a processos para a produção e purificação de fosfatidilserina (PS), para obter o produto final com um rendimento elevado por meio de óxidos de metais bivalentes (BMP).

CAMPO DA INVENÇÃO 0 declínio funcional do Sistema Nervoso Central (CNS), que ocorre durante o processo fisiológico do envelhecimento cerebral muitas vezes causa deterioração das funções cognitivas em idosos que podem, por sua vez, causar distúrbios e alterações comportamentais da memória temporal e espacial.

Este declínio na actividade funcional do CNS está ligado tanto com o aparecimento de alterações bioquímicas e estruturais na composição lipídica das membranas neuronais quanto com a actividade reduzida das enzimas cerebrais que podem reduzir as sinapses neuronais. A fosfatidilserina (PS) é o principal fosfolípido ácido no cérebro. A investigação científica tem sido focada, por conseguinte, durante algum tempo, em encontrar um tratamento farmacológico para os distúrbios cognitivos relacionados com 2 a idade, com base em fosfolípidos que podem evitar (e/ou parcialmente reconstruir) o défice estrutural e funcional de membranas neuronais em envelhecimento.

Estudos pré-clinicos e clínicos em seres humanos demonstraram que a administração de PS por via oral pode, especialmente no idoso, determinar um aumento significativo na capacidade de aprendizagem e memória espacial e temporal, mesmo no caso de patologias particularmente incapacitantes tais como a doença de Alzheimer (Cenacchi T. et alAging Clin Exp Res, 1993, 5:123-133; Nunzi MG et al.; Exp Med Adv. Biolf 1992; 318:393-8).

Além disso, foi demonstrado que a fosfatidilserina é capaz de combater o aumento da hormona cortisol em indivíduos que sofre de stresse físico (Monteleone P. et al. ; Neuroendocrínology-, 1990; 52 (3):243-8), deste modo reduzindo o catabolismo da glicose, com uma maior recuperação funcional após intenso esforço físico. A presente invenção refere-se a um processo para a síntese e purificação de PS e à utilização de PS como o princípio activo em fármacos (e/ou suplementos alimentares), para a prevenção das patologias relacionadas com a idade acima citadas, e na preparação de suplementos alimentares indicados para todos os casos de stresse físico intenso e, além disso, na produção de lipossomas para utilização no campo da cosmética e/ou como um sistema de libertação controlada para os fármacos que eles contêm. 3

Os processos para a produção e purificação de PS já conhecidos da literatura cientifica e patentes descrevem a conversão enzimática de fosfatidilcolina (PC) em PS por uma reacção de transfosfatidilação catalisada pela enzima fosfolipase D (PLD), com subsequente purificação provocada principalmente pela extracção da PS com solventes orgânicos.

Nos últimos anos, vários processos foram aperfeiçoados para a sintetização de PS por meio de conversão enzimática em sistemas de duas fases de água/solvente orgânico ou num meio aquoso. 0 documento EP 0776976 descreve um processo para a preparação enzimática de PS num sistema constituído por água/tolueno, em que a fase orgânica contém o fosfolípido de partida a partir do qual é formada a PS, a fase aquosa contém o aceitador de hidroxilo e a reacção de síntese ocorre na interface água/solvente na presença de fosfolipase D em bruto a partir de caldos de fermentação de estirpes de microrganismos que produzem PLD.

Pela primeira vez, em 1990, os investigadores tentaram contornar o sistema de duas fases porque o mesmo exigia grandes quantidades de solvente que era depois difícil de eliminar, consequentemente, com custos elevados para a produção e purificação da PS (Comfurius P. et al., Journal of Lipid Research 1990, 31: 1719-1721). O solvente orgânico foi, portanto, substituído por um detergente/tensioactivo capaz de dispersar o fosfolípido de 4 partida na forma de micelas, a fim de ocasionar a reacção enzimática de sintese exclusivamente num meio aquoso.

Com efeito, o documento EP 1048738 refere-se a um processo para a sintese enzimática da PS num meio aquoso absolutamente livre de qualquer contaminação por solventes orgânicos, na presença de concentrações dadas de detergentes específicos e sais de cálcio. O documento DE 19917249 descreve um método para a produção enzimática de PS num meio aquoso sem a utilização de tensioactivos, exclusivamente com a adição de sal cloreto de cálcio (CaCl2) , no entanto, a percentagem de conversão enzimática e o grau de pureza da PS obtida não são especificados. 0 documento EP 1310563 divulga um processo para a preparação de PS numa fase aquosa, sem utilizar detergentes e/ou sais de cálcio, com base na homogeneização da mistura de partida que consiste em fosfolipido, aceitador de hidroxilo e PLD em água, para dar um homogeneizado final com uma estrutura semelhante à de uma membrana de fosfolipido bi-lamelar em que a reacção de transfosfatidilação pode subsequentemente ocorrer. O documento EP 1427839 descreve a sintese enzimática de fosfolipidos, incluindo a PS, em água, sem detergentes, mas na presença de iões metálicos que são libertados dos sais correspondentes, quando os mesmos são preparados/dissolvidos em água. 0 referido processo ocorre em duas fases distintas, 5 em que, a partir de misturas de fosfolipidos, uma primeira reacção de hidrólise enzimática é catalisada por PLD para produzir o ácido fosfatidico, seguido por uma segunda reacção de transfosfatidilação na qual a PS é formada na presença de um excesso de serina. 0 documento WO 00/77183 divulga um método para conduzir uma transfosfatidilação catalisada por enzima ou hidrólise de um fosfolipido, que compreende dissolver a referida enzima num meio aquoso que contém (i) uma suspensão lipossomal do referido fosfolipido, (ii) um reagente que contém hidroxilo seleccionado de água, um álcool ou um derivado de álcool, e (iii) quando exigido pela enzima, um catião metálico bivalente, adição de sílica gel ao referido meio, e agitação da mistura resultante. O catião metálico bivalente é preferencialmente o cálcio. Apenas o cloreto de cálcio é exemplificado.

Por último, o documento EP 12312134 reivindica um processo para a síntese enzimática de PS utilizando, em água, uma fracção da enzima PLD produzida e purificada a partir da estirpe Streptoverticillium hachijoense para um rendimento mais abundante na produção final de PS.

No que diz respeito à purificação de PS (obtida por transfosfatidilação num meio aquoso/solvente orgânico ou num meio aquoso), o documento EP 1213294 reivindica um processo de purificação com base na utilização de uma mistura que consiste em água/solvente orgânico polar (tal como isopropanol) para extrair o fosfolipido acima mencionado a 6 partir da solução que o contém, que é por sua vez representada por um solvente de hidrocarboneto (tal como tolueno), enquanto o documento EP 0922707 refere-se a um processo para a extracção/purificação de PS a partir de uma mistura de fosfolípidos, utilizando um sistema difásico de solventes orgânicos, tais como heptano e metanol. A presente invenção refere-se a processos para a produção e purificação de fosfatidilserina (PS), que proporciona o produto final com um rendimento muito elevado, graças a uma conversão eficiente de PC em PS pela acção especifica de Óxidos de Metais Bivalentes (BMO, do inglês, Bivalent Metal Oxides).

Além disso, o processo de transfosfatidilação catalisada pela enzima PLD, permite que uma elevada percentagem de PC seja convertida em PS, independentemente do meio em que ocorre a reacção enzimática.

Desse modo, a presente invenção refere-se a um processo para a produção de PS catalisada por PLD e BMO, cujo processo é caracterizado pelo facto de ser realizado num meio hidroalcoólico que consiste em água/álcoois alifáticos, ou num meio aprótico que consiste em água/solventes polares apróticos, ou num sistema de duas fases que consiste em água/solventes orgânicos. 7

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de PS (fórmula I), no qual uma transfosfatidilação é levada a cabo pela enzima PLD, na presença de BMO, alcançando assim a transferência de uma unidade de fosfatidil da fosfatidilcolina (PC) (fórmula II) para serina (que neste caso representa o aceitador de hidroxilo); esta reacção enzimática fornece a conversão de PC em PS, num grau muito elevado, independentemente do meio em que ocorre a reacção enzimática. A referida reacção pode, portanto, ocorrer: • num meio hidroalcoólico que consiste em água/álcoois alifáticos que não formam um sistema de duas fases, ou • num meio aprótico que consiste em água/solventes polares apróticos que não formam um sistema de duas fases, ou • num sistema de duas fases que consiste em água/solventes orgânicos.

Fórmula I CH20R1 1 CHOR2

I

CH20-P(=O)-0CH2-CH(NH2)-C00H

I

X

e R2 independentemente representam um acilo Cio-C30 mono-insaturado e/ou poli-insaturado, X=OH ou OM em que R1 saturado, onde M=metal alcalino ou alcalino terroso, amónio, alquilamónio (incluindo o sal interno). CHjOR1 CHOR2 CH20-P(=0)-0r3

X em que R1 e R2 e X significam como definido acima e R3 = CH2-CH2-NH2 ou CH2-CH2-N+(CH3) 3.

Surpreendentemente, constatou-se que o BMO drasticamente modifica o substrato da reacção representada pela fosfatidilcolina de partida, que determina uma mudança tal que a acção da enzima PLD aumenta, de forma significa, em termos de rendimento final em PS, permitindo assim uma produção altamente vantajosa de PS numa escala industrial. Esta mudança substancial ocorre na estrutura do próprio substrato, independentemente do meio no qual a reacção enzimática tem lugar. Com efeito, o BMO favorece a fissuração das vesículas de PC e, desse modo, a penetração da enzima no mesmo, determinando um aumento da percentagem de conversão de PC em PS uma vez que, ao penetrar no interior das vesículas, a enzima PLD pode também actuar sobre a camada lipídica dentro da vesícula, que não podia ser penetrada anteriormente por soluções hidrofílicas, tais como aquelas que contêm a própria enzima. 9

De acordo com a invenção, foram testados vários óxidos metálicos bivalentes, tal como óxido de cálcio (CaO), óxido de magnésio (MgO) e óxido de zinco (ZnO), tanto em meio hidroalcoólico como aprótico, bem como em sistemas de duas fases nos quais deram resultados excelentes, como apresentado nos exemplos a seguir, em comparação com os resultados obtidos por meio dos mesmos processos, mas na presença de cloreto de cálcio (CaCl2) .

Com efeito, sabe-se que os sais de cálcio e, em particular CaCl2, como fontes de iões de cálcio adicionados ao meio no qual ocorre a reacção de transfosfatidilação (Comfurius P. et al., Journal of Lipid Research 1990, 31:1719-1721; Comfurius P. et al., Biochim Biophys Acta, 1977, 488:36-42), promovem a actividade catalítica da enzima PLD e, desse modo, aumentam a conversão de fosfatidilcolina em PS (Okawa Y. et al.; J Biochem.; 1975; 78:363-372). A fim de diferenciar e esclarecer que os BMOs são completamente diferentes dos sais de metal e para demonstrar a sua eficácia nos novos sistemas de produção que são o objecto da presente invenção, o Requerente realizou experiências que comparam os rendimentos diferentes da conversão de PC em PS, na presença de sais de cálcio e na presença de BMO.

Como pode ser visto dos resultados obtidos, o rendimento da conversão de fosfatidilcolina em PS consistentemente comprovou ser não apenas muito diferente, 10 mas também decidida e significativamente maior do que o obtido com CaCÍ2.

Além dos óxidos acima descritos, vários BMOs diferentes podem ser utilizados no novo processo para a produção de PS, tal como óxido de manganês, óxido de ferro bivalente, óxido de cobalto, óxido de cobre e todos os óxidos de metais bivalentes restantes na Tabela de Elementos.

Exemplo de solventes em que o processo da presente invenção pode ser realizado são álcoois alifáticos, tais como metilo, etilo, n-propilo, isopropanóis; solventes polares apróticos, tais como dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida, acetonitrilo, N-metil-pirrolidona; e solventes orgânicos, tais como n-hexano, tolueno, n-butanol, benzeno. O álcool preferido é o isopropanol, o solvente aprótico preferido é DMSO e o solvente orgânico preferido é hexano. O Exemplo 1 descreve a conversão de PC em PS a partir de meio hidroalcoólico de partida contendo percentagens dadas de isopropanol adicionadas a uma solução de partida que consiste em tampão acetato em que o CaO (ou MgO ou ZnO) foi dissolvido, em comparação com o processo de produção de PS executado no mesmo meio hidroalcoólico, mas na presença do sal CaCl2. A percentagem de álcool (isopropanol, em particular) que pode ser utilizado no presente processo (expresso como % 11 em volume sobre o volume do tampão de partida) pode variar de 0,1 a 50%, preferencialmente de 1,25-20%, e mais preferencialmente 10%, num meio hidroalcoólico contendo uma concentração de BMO (em particular, CaO) que varia entre 0,1 e 1 M, preferencialmente entre 0,3 e 0,6 M e mais preferencialmente igual a 0,54 M. 0 rendimento máximo da conversão de PC em PS é de 90%, o que está longe do rendimento obtido pelo mesmo processo de produção, mas na presença de CaCl2· 0 Exemplo 2, por outro lado, demonstra que é possível obter rendimentos ainda mais elevados do que 80% da conversão de PC/PS, por meio da adição de quantidades dadas de DMSO (expressas como % em volume do volume de tampão utilizado) à solução de tampão de partida que contêm as concentrações molares dadas de CaO (ou MgO ou ZnO) , e que os rendimentos acima referidos de PS são muito diferentes daqueles obtidos pelo mesmo processo de produção, mas na presença de CaCl2. A percentagem de solvente aprótico (e DMSO em particular) a ser utilizada pode variar de 0,1 a 50%, preferencialmente de 1,25 a 10%, e mais preferencialmente ser de 1,25%, num meio aprótico, contendo uma concentração de BMO (CaO em particular) que varia entre 0,1 e 1 M, preferencialmente entre 0,3 e 0,6 M, e ainda mais preferencialmente, pode ser igual a 0,33 M. 12 A reacção enzimática de transfosfatidilação dá um rendimento muito elevado de conversão de PC/PS, mesmo num sistema de duas fases que consiste em água/solvente orgânico. 0 Exemplo 3 descreve a produção de PS num sistema de duas fases que consiste em água/hexano, novamente na presença de CaO, MgO e ZnO. A quantidade de solvente utilizada nos novos processos, que são o objecto da presente invenção é muito baixa (tal como demonstrado mais adiante) , tão baixa que os custos de produção são limitados e não é difícil eliminar o solvente do produto final. A concentração de solvente a ser utilizada no referido processo pode variar de 0,1 a 40% v/v (expressa como % em volume sobre o volume do tampão de partida), preferencialmente de 1 a 5% v/v, e mais preferencialmente 1,25% v/v 2,5% v/v, na presença de BMO (e CaO em particular), numa concentração que varia entre 0,1 e 1 M, preferencialmente entre 0,3 e 0,6 Me mais preferencialmente igual a 0,54 M.

Neste caso também o rendimento máximo da conversão de PC em PS foi superior a 80%, muito diferente daquele obtido pelo mesmo processo, mas na presença de CaCl2. A reacção de transfosfatidilação pode ser conduzida a temperaturas diferentes, que variam entre 20 e 70 °C, preferencialmente a 45 ou 55 °C. 13 O substrato de fosfatido de partida é representado por fosfatidilcolina de origem animal e/ou vegetal, natural ou sintética, presente na forma purificada ou como matéria-prima, em concentrações de partida que variam entre 10 e 500 mg/mL, preferencialmente entre 200 e 300 mg/mL. O meio aquoso de partida para ser misturado/associado com o álcool, o solvente aprótico ou o solvente orgânico para obter um meio final hidroalcoólico, aprótico ou de duas fases, é representado por água ou uma solução salina não tamponada ou uma solução tamponada formada, por exemplo, por acetato tri-hidrato de sódio e ácido acético em concentrações entre 0,02 e 0,2 M. O aceitador de hidroxilo é representado por serina, que podem estar presente na forma D, L ou racémica. A concentração óptima de serina, preferencialmente na forma L, pode variar entre 1 g/g (gg) de fosfatido de partida, até 5 gg, preferencialmente entre 2 e 3 gg/gg de fosfatido. 0 pH óptimo da solução tampão pode variar entre 4 e 9 porque depende da origem da PLD utilizada, mas, preferencialmente entre 5 e 6, e mais preferencialmente igual a 5,6, se for utilizada uma PLD de origem fermentativa derivada do microrganismo Streptoverticillium hachijoense. A referida enzima pode ser utilizada na forma purificada ou parcialmente purificada, ou numa forma não purificada após filtração simples do microrganismo do seu caldo de cultura. 14 0 Exemplo 4 (e a Figura 1) descreve um novo sistema para a purificação parcial de PLD para obter uma enzima que não é substancialmente contaminada por proteínas de uma natureza diferente, que possam interferir com a actividade catalítica da PLD, um processo que não envolve muitas etapas, uma vez que processos demorados resultam em custos industriais excessivos e uma consequente falta de viabilidade numa escala industrial. A enzima parcialmente purificada descrita no Exemplo 4 foi testada no processo de produção descrito no Exemplo 3, em comparação com uma enzima presente na forma não purificada (após simples eliminação do microrganismo produtor) e com preparações enzimáticas altamente purificadas (obtidas utilizando resinas cromatográficas de troca iónica e anticorpos mono/policlonais dirigidos para a enzima PLD, mas que também podem ser purificados utilizando todos os métodos de purificação conhecidos de um especialista na técnica): a percentagem de conversão de PC/PS foi igual para todas as preparações enzimáticas testadas (purificadas, parcialmente purificadas e não purificadas). A quantidade óptima de PLD para assegurar mais de 80% de conversão de PC em PS varia entre 1 e 100 unidades/g de fosfátidos de partida, porque depende da origem da PLD utilizada. Por exemplo, quando é utilizada a PLD de Streptovertícillium hachíjoense, a concentração óptima varia entre 1 e 10 unidades/g de fosfatido. 15

Alguns antioxidantes, tais como ácido ascórbico e/ou vitamina E podem ser incluídos no processo de preparação e purificação de PS. A invenção é divulgada em mais detalhe nos exemplos a seguir.

Exemplo 1

Preparação de PS a partir de PC vegetal num meio hidroalcoólico (pela presença de isopropanol) com CaO, MgO e ZnO 0,54 M ou com CaCl2 0, 54 M

Duas soluções hidroalcoólicas diferentes foram preparadas, formadas por duas concentrações de isopropanol (iguais a 1,25 e 10% do volume do tampão de partida) em tampão acetato contendo CaO (ou MgO ou ZnO) 0,54 M, em comparação com a preparação de PS pelo mesmo procedimento, mas na presença de sal CaCl2, 0,54 M.

Os óxidos testados e cloreto de cálcio são dissolvidos em 40 mL de tampão acetato 0,2 M (pH 5,6) ao qual são depois adicionados 0,5 mL de isopropanol, de modo a obter 1,25% v/v (apenas para CaO) , ou 4 mL de isopropanol, a fim de atingir 10% v/v (os álcoois podem também ser adicionados ao tampão contendo BMO depois da solubilização da Serina).

As soluções resultantes são agitadas num reactor revestido com condensador durante cerca de 10 minutos, em seguida, 20 g de L-serina são adicionados a uma temperatura de 55 °C, com agitação até a completa dissolução. 16

Subsequentemente, 10 g de fosfatidilcolina de soja são adicionados e agitados durante 10 minutos. 5,5 U de enzima PLD por gg de PC são então adicionadas e a mistura é agitada durante 24-48 horas a 55 °C.

Finalmente, é tomada uma amostra de cada produto e a transformação bem sucedida de PC em PS é testada por Cromatografia de Camada Fina (TLC).

Rendimento da conversão de PC em PS: distribuição dos produtos presentes no final da reacção, expressa como % de PA (ácido fosfatidico libertado pela PC como um resultado da acção de PLD) e PS obtida a seguir o processo de transfosfatidilação. PA e PC devem ser consideradas resíduos da reacção.

Rendimento da conversão de PC em PS obtido com isopropanol, 1,25% v/v, na presença de CaO: PA 8,0% PS 85,5% PC 6,5%

Rendimento da conversão de PC em PS obtido com isopropanol, 10% v/v, na presença de CaO: PE-OH 4,0% PA 3,5% PS 89,5% 17 PC 3,0% 17 Rendimento da isopropanol, 10% v/v, conversão de PC em na presença de CaCl2:

PS obtido com PE-OH 15,8% PA 10,7% PS 70,1% PC 3,4%

Rendimento da conversão de PC em PS obtido com isopropanol, 10% v/v, na presença de MgO: PE-OH 9,0% PA 4,5% PS 84,0% PC 2,5% conversão de PC na presença de ZnO:

Rendimento da isopropanol, 10% v/v, PE-OH 10,0% PA 8,0% PS 80,0% PC 2,0% em PS obtido com ocorre na (o produto definido como PE-OH forma-se durante a reacção de transfosfatidilação porque a reacção presença de álcool). 18

Exemplo 2

Preparação de PS a partir de PC vegetal num meio aprótico (pela presença de DMSO) com CaO, MgO e ZnO 0,33 M ou com CaC12 0, 33 M DMSO foi utilizado em concentrações diferentes variando entre uma percentagem de 1,25 e 10% em termos do volume de tampão de partida, em todos os casos na presença de CaO (ou MgO ou ZnO) 0,33 M em comparação com a preparação de PS pelo mesmo processo, mas na presença do sal CaCl2.

Os óxidos de cálcio testados e cloreto de cálcio são dissolvidos em 40 mL de tampão acetato 0,2 M, a um pH 5,6. As soluções assim obtidas são agitadas num reactor revestido com condensador. Após cerca de 10 minutos de agitação, 20 g de L-serina são adicionados a uma temperatura de 45 °C e, depois, a agitação é continuada até a solubilização completa ser alcançada.

Subsequentemente, 10 g de PC de soja e 0,5 mL de DMSO (correspondente a 1,25% v/v) ou 4 mL de DMSO (correspondente a 10% v/v) são adicionados e a mistura é agitada (o DMSO pode ser adicionado durante a fase de arranque do processo, depois da solubilização do BMO, como no Exemplo anterior). Dez minutos mais tarde, 5,5 U de enzima PLD por gg de PC são adicionadas, e a mistura é agitada durante 24-48 horas a 45 °C. 19

Subsequentemente, amostras dos respectivos produtos obtidos são tomadas no final da reacção e testadas quanto à transformação bem sucedida de PC em PS.

Rendimento da conversão de PC em PS:

Rendimento da conversão de PC em PS obtido com DMSO a 1,25% v/v, na presença de CaO: PA 7,1% PS 86,3% PC de 6,6%

Rendimento da conversão de PC em PS obtido com DMSO a 1,25% v/v, na presença de CaCÍ2: PA 8,1% PS 66,7% PC 25,2%

Rendimento da conversão de PC em PS obtido com DMSO a 10% v/v, na presença de CaCÍ2: PA 6% PS 69% PC 25%

Rendimento da conversão de PC em PS obtido com DMSO a 10% v/v, na presença de CaO: PA 7,5 20 PS 72,5% PC 20%

Rendimento da conversão de PC em PS obtido com DMSO a 10% v/v, na presença de MgO: PA 9,0% PS 71,0% PC 20%

Rendimento da conversão de PC em PS obtido com DMSO a 10% v/v, na presença de ZnO: PA 8,5% PS 71,5% PC 20%

Exemplo 3 a

Preparação de PS a partir de PC vegetal num sistema de duas fases (pela presença do solvente orgânico, hexano) com CaO, MgO e ZnO 0,54 M ou com CaCl2 0, 54 M

Um sistema de duas fases que consiste em tampão acetato contendo CaO (ou MgO ou ZnO) 0,54 M foi preparado e, em seguida, uma quantidade de hexano igual a 1,25% do volume de partida do tampão foi adicionada, em comparação com a preparação de PS pelo mesmo processo de produção, mas na presença de CaCl2, 0,54 M. 21

Os óxidos testados e cloreto de cálcio são, depois dissolvidos em 40 mL de tampão acetato 0,2 M (pH 5,6) aos quais uma quantidade de hexano igual a 0,5 mL é depois adicionada a fim de alcançar 1,25% v/v (o solvente orgânico de eleição pode ser adicionado ao tampão contendo o BMO antes ou depois da solubilização da serina).

As soluções assim obtidas são agitadas num reactor revestido com condensador. O procedimento então continua como descrito no Exemplo 1.

Finalmente, uma amostra de cada produto obtido é tomada e testada para a transformação bem sucedida de PC em PS.

Rendimento da conversão de PC em PS:

Rendimento da conversão de PC em PS obtido com hexano a 1,25% v/v, na presença de CaO: PA 7,5% PC 87,0% PS 5,5%

Rendimento da conversão de PC em PS obtido com hexano a 1,25% v/v, na presença de CaCl2: PA 8,1% PC 68,4% PS 23,5% 22

Rendimento da conversão de PC em PS obtido com hexano a 1,25% v/v, na presença de MgO: PA 8,5% PC 82,5%, PS 9,0%

Rendimento da conversão de PC em PS obtido com hexano 1,25% v/v, na presença de ZnO: PA 11,0% PC 80,0%, PS 9,0%

Exemplo 3 b

Preparação de PS a partir de PC vegetal num sistema de duas fases (pela presença do solvente orgânico, hexano) com

CaO 0,54 M ou com CaCl2 0, 54 M

Um sistema de duas fases que consiste em tampão acetato contendo CaO 0,54 M foi preparado e depois, uma quantidade de hexano igual a 2,5% do volume de partida do tampão foi adicionada, em comparação com a preparação de PS pelo mesmo processo de produção, mas na presença de CaCl2, 0,54 Μ. A partir deste ponto, o procedimento é o mesmo que no Exemplo 3 a.

Rendimento da conversão de PC em PS: 23

Rendimento da conversão de PC em PS obtido com hexano a 2,5% v/v, na presença de CaO: PA 7,5% PS 86,0% PC 6,5%

Rendimento da conversão de PC em PS obtido com hexano a 2,5% v/v, na presença de CaC12: PA 10,0% PS 65,0% PC 25,0%

Exemplo 4

Purificação parcial da enzima PLD A enzima PLD utilizada no novo processo de produção pode ser parcialmente purificada através das seguintes etapas: • eliminação do agente de produção por microfiltração de fluxo tangencial através de filtros (preferencialmente com membranas de polietersulfona: PES) com um tamanho de poro de 0,2 pm; • ultrafiltração de fluxo tangencial através de filtros (preferencialmente em PES) com um corte molecular de 10.000 D; • ultrafiltração de fluxo tangencial através de filtros com membranas (preferencialmente em PES) com um corte molecular de 300.000 D; 24 • ultrafiltração de fluxo tangencial final através de membranas (preferencialmente em PES) com um corte molecular de 10.000 D para reconcentrar da enzima e dialisar a mesma contra o tampão Tris-HCl, 50 mM pH=8 . A Figura 1 ilustra os resultados da análise cromatográfica da enzima PLD parcialmente purificada como descrito acima, em comparação com a análise de um caldo de fermentação purificado unicamente a partir do agente que produz a própria enzima (Figura 2).

Exemplo 5 a

Separação e purificação de PS de acordo com o método 1. O meio de reacção em que a PS foi preparada é suplementado com 1,5 volumes (em termos do volume de reacção de partida) de uma solução a 5% de NaCl, e a mistura é agitada a uma temperatura de 30 °C durante pelo menos 30 minutos. A PS, que foi depositada na parte superior do meio de reacção, é então isolada por separação e eliminação do subnadante. O sobrenadante (PS) é suplementado com 4 volumes de uma solução a 3% de NaCl e agitado a 30 ± 10 °C durante pelo menos 30 minutos. Em seguida, o sobrenadante é separado e eliminado (esta etapa foi repetida 2 vezes), enquanto ao subnadante (representado por PS) são adicionados 2 volumes de uma solução de EDTA (ácido etileno diaminotetracético) (a uma concentração de 40 gg/litro) preparada num tampão acetato, 0,1 M pH 7,5. 25

Após mistura adicional (a 25 ± 10 °C durante pelo menos 1 hora) por agitação da mistura assim obtida, o pH é ajustado em 7/7,5 e 2 volumes (em termos do volume de EDTA) de etanol a 95% são adicionados, com agitação da mistura a 25 ± 10 °C durante pelo menos 1 hora.

Após um período de sedimentação da PS, a mesma é recolhida e o sobrenadante (a fase que consiste em etanol em água) é eliminado porque a PS não se dissolverá na fase hidroalcoólica. A lavagem com etanol/água (com uma percentagem de etanol de 70-95%) foi repetida após o que uma lavagem final com etanol a 100% é realizada e, como uma etapa final, a PS pode ser seca.

Produto final: distribuição das fracções lipídicas isoladas de acordo com o método 1, com a PS preparada como descrito no Exemplo 3 com CaO 0,54 M. PA 5,8% PS 94,2%

Exemplo 5 a

Separaçao e purificação de PS de acordo com o método 1. O meio de reacção em que a PS foi preparada é suplementado com 1,5 volumes (em termos do volume de reacção de partida) de uma solução a 5% de NaCl, e a mistura é agitada a uma temperatura de 20 °C durante pelo menos 30 minutos. A PS, que foi depositada na parte superior do meio 26 de reacção, é então isolada por separação e eliminação do subnadante. 0 sobrenadante (PS) é suplementado com 3 volumes de uma solução a 3% de NaCl e agitada a 20 ± 10 °C durante pelo menos 30 minutos. Em seguida, o sobrenadante é separado e eliminado (esta etapa foi repetida 3 vezes), enquanto ao subnadante (representado por PS) são adicionados 3 volumes de uma solução de EDTA (a uma concentração de 30 gg/litro), preparada num tampão acetato, 0,1 M pH 7,0.

Após mistura adicional (a 20 ± 10 °C durante pelo menos 1 hora) por agitação da mistura assim obtida, o pH é ajustado em 7/7,5 e 2 volumes (em termos do volume de EDTA) de etanol a 100% são adicionados, com agitação da mistura a 20 ± 10 °C durante pelo menos 1 hora.

Após um período de sedimentação da PS, a mesma é recolhida e o sobrenadante (a fase que consistem em etanol em água) é eliminado. A lavagem com etanol/água (com uma percentagem de etanol de 70%) foi repetida após o que uma lavagem final com etanol a 100% é realizada e, como uma etapa final, a PS pode ser seca.

Produto final: distribuição das fracções lipídicas isolado de acordo com o método 1, com a PS preparada como descrito no Exemplo 3 com CaO 0,54 M. PA 6,8% PS 93,2% 27

Exemplo 5 c

Separaçao e purificação de PS de acordo com o método 1.

Antes de adicionar a solução de NaCl, a PS é filtrada para eliminar imediatamente todos os componentes residuais do meio de reacção. Em seguida NaCl é adicionado e o processo de isolamento e purificação continua como descrito no Exemplo 5 a.

Produto final: distribuição das fracções lipidicas isoladas de acordo com o método 1, com a PS preparada como descrito no Exemplo 3 com CaO 0,54 M. PA 5,0% PS 95,0%

Depois da reacção de transfosfatidilação, a análise por TLC do produto obtido (Vitello F. et al.; J Chromatog; 1978; 166 (2) :637-40) apresenta uma concentração de 2% de resíduo serina. A quantidade de PLD nesta fase foi determinada por métodos do estado da técnica (Aurich I. et al.; Anal Biochem; 1999; 268:337-342) e comprovou ser de 2U/g. A concentração de serina foi medida novamente no final do processo para a purificação de PS descrito anteriormente e comprovou ser inferior/igual a 0,2%. 28 A actividade do resíduo da enzima PLD também foi determinada novamente e provou ser abaixo do limite para a determinação por meio deste método.

Para demonstrar a ausência total de até o mais pequeno traço de solvente orgânico utilizado no processo de preparação de PS (descrito no Exemplo 3) e, desse modo, confirmar a inovação e etapa inventiva da presente invenção, o Requerente analisou a PS parcialmente purificada descrita no Exemplo 5, na fase imediatamente anterior à adição da solução alcoólica.

Esta análise foi realizada com a conhecida técnica de “Gas Chromatography with static head-space injection", tal como descrito na Farmacopeia Europeia 5,0, secção 2.4.24: Identificação e controlo de solventes residuais. O cromatograma de calibração (Figura 3) foi obtido utilizando um padrão consistindo em acetato de etilo e n-hexano correspondente a 1000 ppm de cada, o equivalente a 100 mg do produto de teste. A Figura 4 mostra a ausência total de n-hexano na PS purificada de acordo com o Método 1.

Exemplo 6

Separaçao e purificação de PS de acordo com o método 2. O meio de reacção em que a PS foi preparada é suplementado com 1,5 volumes (em termos do volume de reacção 29 de partida) de uma solução de 5% de NaCl e o conjunto é agitado a 45 °C durante pelo menos 30 minutos, seguido por um periodo de separação da PS de pelo menos 1 hora.

Duas fases são formadas: estas são separadas e o subnadante é descartado, enquanto que o sobrenadante é suplementado com 2,5 volumes de uma solução de EDTA 22 gg/litro, preparada em água. Uma vez que uma temperatura de 28 °C tenha sido atingida, a ultrafiltração é realizada. Preferencialmente, devem ser utilizados filtros que têm poros de um tamanho que irá aprisionar moléculas com um peso molecular de 100.000/300.000 Daltons. 0 produto final pode então ser liofilizado.

Produto final: distribuição das fracções lipidicas isoladas de acordo com o método 2, com PS preparada, por exemplo, de acordo com o Exemplo 1 com CaO 0,54 M. PA 6,0% PS 94,0% A concentração de serina foi medida no final do processo de purificação da PS descrito anteriormente e comprovou ser inferior/igual a 0,2%, enquanto outra determinação da actividade do residuo da enzima PLD mostrou estar abaixo do limite para determinação por este método. 30

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora muito cuidado tenha sido tomado na compilação das referências, erros e omissões não podem ser excluídos e o EPO nega qualquer responsabilidade neste sentido.

Documentos de Patente citados na descrição EP 0776976 A [0010] EP 1048738 A [0013] DE 19917249 [0014] EP 1310563 A [0015] EP 1427839 A [0016] WO 0077183 A [0017] EP 1231213 A [0018] EP 1213294 A [0019] EP 0922707 A [0019]

Literatura não relacionada com patente citada na descrição • CENACCHI T. et al. Aging Clin Exp Res, 1993, vol. 5, 123-133 [0005] • NUNZI MG et al. Adv Exp Med Biol, 1992, vol. 318, 393-8 [0005] • MONTELEONE P. et al. Neuroendocrinology, 1990, vol. 52 (3), 243-8 [0006] • COMFURIUS P. et al. Journal of Lipid Research, 1990, vol. 31, 1719-1721 [0011] [0026] • COMFURIUS P. et al. Biochim Biophys Acta, 1977, vol. 488, 36-42 [0026] • OKAWA Y. J Biochem., 1975, vol. 78, 363-372 [0026] • VITIELLO F. et al. J Chromatog;, 1978, vol. 166 (2), 637-40 [0087] • AURICH I. et al. Anal Biochem, 1999, vol. 268, 337-342 [0088]

Claims

REIVINDICAÇÕES Processo para a preparação de uma fosfatidilserina de fórmula ch2or‘ CHOR2 I CH2O-P(=O)-0CH2-CH(NH2)-COOH X em que R1 e R2 independentemente representam um acilo Ci0-C30 saturado, mono-insaturado e/ou poli-insaturado, X=OH ou OM onde M=metal alcalino ou alcalino terroso, amónio, alquilamónio (incluindo o sal interno) incluindo a reacção de transfosfatidilação entre um composto da fórmula qeral ch2or‘ I CHOR2 'cHzO-pc-o-or^ X em que R1 e R2 e X têm os significados especificados acima e R3 = CH2-CH2-NH2 ou CH2-CH2-N+ (CH3) 3 e Serina na forma D, L ou racémica catalisada pela enzima fosfolipase D (PLD), caracterizado pelo facto da referida reacção ser levada a cabo num meio hidroalcoólico que contém um álcool alifático e na presença de óxido de metal bivalente. Processo para a preparação de fosfatidilserina de fórmula
2 CHzOR1 CHOR2 lCH20-P(=0)-OCH2-CH(NH2)-COOH X que inclui a reacção de transfosfatidilação entre um composto da fórmula geral CH2ORl CHOR2 CH20-P(=0)-0R3 X em que R1, R2, Reivindicação R3 e X têm os mesmos significados dados na Ϊ, e Serina na forma D, L ou racémica, catalisada pela enzima fosfolipase D (PLD), caracterizado pelo facto da referida reacção ocorrer num meio que contém um solvente polar aprótico e na presença de um óxido de metal bivalente.
3. Processo para a preparação de fosfatidilserina de fórmula CH2ORl CHOR2 I CH2O-P(=O)-0CH2-CH(NH2)-C0OH X que inclui a reacção de transfosfatidilação entre o composto da fórmula geral 3 ch2or' I CHOR2 CH2O-P(=O)-0R3 X em que R1, R2, R3 e X têm os mesmos significados dados na Reivindicação 1, e Serina na forma D, L ou racémica, catalisada pela enzima fosfolipase D (PLD), caracterizado pelo facto da referida reacção ser levada a cabo num meio que consiste num sistema de duas fases formado por água/solvente orgânico e na presença de óxido de metal bivalente.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que os álcoois alifáticos são seleccionados de metanol, etanol, n-propanol, isopropanol.
5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que o álcool alifático é isopropanol numa concentração entre 0,1 e 50% expressa como uma % em volume sobre o volume do tampão de partida.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que a concentração de isopropanol é de 10%.
7. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que os solventes polares apróticos são seleccionados de dimetilsulfóxido, acetonitrilo, dimetilformamida e N-metil-pirrolidona. 4
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que o solvente polar aprótico é dimetilsulfóxido numa concentração entre 0,1 e 50% expresso como uma % em volume sobre o volume do tampão de partida.
9. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que a concentração de dimetilsulfóxido é de 1,25%
• 10 . Processo de acordo com a reivindicação 3, em que os solventes orgânicos são seleccionados de n- hexano, tolueno, benzeno e n- -butanol
• 11 . Processo de acordo com a reivindicação 10, em que o solvente orgânico é n-hexano numa concentração entre 0,1 e 40% expresso como % em volume sobre o volume do tampão de partida.
12. Processo de acordo com a reivindicação 11, em que a concentração de n-hexano é de 1,25% ou 2,5%.
13. Processo de acordo com as reivindicações anteriores, em que o óxido de metal bivalente é óxido de cálcio, ou de magnésio ou de zinco numa concentração entre 0,1 e 1 M.
14. Processo de acordo com a reivindicação 13, em que a concentração dos óxidos seleccionados é de 0,33 ou 0,54 M.
15. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3, em que o composto é fosfatidilcolina e a concentração de serina varia entre 1 e 5 g/g de fosfatidilcolina. 5
16. Processo de acordo com a reivindicação 15, em que a concentração de serina varia entre 2 e 3 g/g de fosfatidilcolina.
17. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3, em que o composto é fosfatidilcolina e a fosfatidilcolina é de origem animal e/ou vegetal, natural ou sintética, presente na forma purificada como matéria-prima, a uma concentração de partida entre 10 e 500 mg/mL, preferencialmente entre 200 e 300 mg/mL.
18. Processo de acordo com todas as reivindicações anteriores, em que a reacção de transfosfatidilação ocorre a uma temperatura entre 20 °C e 60 °C e, preferencialmente, a 45 °C.
19. Processo de acordo com todas as reivindicações anteriores, em que a reacção de transfosfatidilação ocorre a uma temperatura entre 20 °C e 60 °C e, preferencialmente, a 55 °C.
20. Processo de acordo com todas as reivindicações anteriores, em que a enzima PLD é de origem fermentativa derivada do microrganismo Streptoverticillium hachijoense, utilizado na forma purificada, parcialmente purificada ou não purificada.
21. Processo de acordo com a reivindicação 20, em que o composto é fosfatidilcolina e a concentração de PLD que é utilizada varia entre 1 e 100 unidades/g de fosfatidilcolina. 6
22. Processo de acordo com a reivindicação 21, em que a concentração de PLD que é utilizada varia entre 1 e 10 unidades/g de fosfatidilcolina.
23. Processo de acordo com a reivindicação 20, em que a enzima PLD derivada do microrganismo Streptoverticillium hachíjoense é purificada envolvendo as etapas de: I) eliminação do agente de produção por microfiltração com um tamanho de poro de 0,2 pm; II) ultrafiltração através de filtros com um corte molecular de 10.000 D; III) ultrafiltração através de filtros com membranas com um corte molecular de 300.000 D; IV) ultrafiltração através de membranas com um corte molecular de 10.000 D para reconcentrar a enzima e dialisar a mesma contra o tampão.