JP2008545420A

JP2008545420A - ホスファチドの調製および単離方法

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Publication number: JP2008545420A
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Inventors: アンナマリアザネラト、; マラピッタレロ、; アントニオガンビララ、; スザンナヴァカロウ、
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Abstract

式（Ｉ）（式中、Ｒ１およびＲ２は独立して飽和、単不飽和または多不飽和アシルＣ１０〜Ｃ３０を表し、ＸはＯＨまたはＯＭ（ここで、Ｍはアルカリもしくはアルカリ土類金属、アンモニウム、またはアルキルアンモニウム（内塩を含む））を表す。）で示されるホスファチジルセリンを調製する方法であって、式（ＩＩ）（式中、Ｒ１およびＲ２は先に特定した意味を有し、Ｒ３＝ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２またはＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３である。）で示されるホスファチジルコリンと、Ｄ、Ｌまたはラセミ型のセリンとの間の、ホスホリパーゼＤ酵素（ＰＬＤ）により触媒されたホスファチジル交換反応を含み、該反応が、脂肪族アルコールを含む含水アルコール媒体中で二価金属酸化物の存在下に行われることを特徴とする方法。

Description

本発明は、二価金属酸化物（ＢＭＯ）により最終生成物を高収率で得るための、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を生成および精製するための方法に関する。

大脳老化の生理的工程中に生じる中枢神経系（ＣＮＳ）の機能的減退は、しばしば、老齢者において認知機能の劣化を引き起こし、それが、行動障害および、一過性および空間記憶の変調を引き起こすことがある。

ＣＮＳ活性におけるこの機能的減退は、ニューロン膜の脂質組成の生化学的および構造的変化の発症と、ニューロンシナプスを減少させ得る脳酵素の活性低下との両方に関連する。

ホスファチジルセリン（ＰＳ）は、脳における主要な酸性リン脂質である。従って、科学的検討は、しばらくの間は、老化しつつあるニューロン膜の構造的および機能的欠点を予防（および／または部分的に再構築）することができるリン脂質に基づく、加齢による認知障害用の薬理学的療法を発見することに集中されていた。

ヒトにおける臨床前および臨床研究により、アルツハイマー病のような特に無能力化性の病変の場合でも、ＰＳを経口的に投与することは、特に老人において、学習能力並びに一過性および空間的記憶の有意な増加を決めることが示された（ＣｅｎａｃｃｈｉＴ．ｅｔａｌ．；ＡｇｉｎｇＣｌｉｎＥｘｐＲｅｓ；１９９３；５：１２３−１３３；ＮｕｎｚｉＭＧｅｔａｌ．；ＡｄｖＥｘｐＭｅｄＢｉｏｌ；１９９２；３１８：３９３−８）。

さらに、ホスファチジルセリンは、身体的ストレスを受けている被験者におけるホルモンであるコルチゾールの増加を抑えることができ（ＭｏｎｔｅｌｅｏｎｅＰ．ｅｔａｌ．；Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ；１９９０；５２（３）：２４３−８）、それにより、グルコースの異化が低下し、強度の身体的努力の後の機能の回復が著しくなることが示された。

本発明は、ＰＳを合成し精製するための方法、並びに、前記年齢関連病変の予防のための薬剤（および／または食品サプリメント）における有効成分としての、および、強度の身体的ストレスの全てのケースのために提供される食品サプリメントの調製における、さらに、化粧の分野において用いるためのおよび／またはそれらが含む薬剤の制御放出系としてのリポソームの生成における、ＰＳの使用に関する。

科学文献および特許から既に知られているＰＳを生成および精製するための方法は、酵素ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）により触媒されるホスファチジル交換反応によりホスファチジルコリン（ＰＣ）をＰＳに酵素的転化し、続いて、ＰＳを有機溶媒で抽出することにより主に成される精製を記載している。

近年、水／有機溶媒の二相系中または水性媒体中での酵素的転化によりＰＳを合成するための種々の方法が完成されている。

ＥＰ０７７６９７６は、水／トルエンからなる系中でＰＳを酵素的に調製する方法であって、有機相がそれからＰＳが形成される開始リン脂質を含み、水相がヒドロキシ受容体を含み、合成反応が、ＰＬＤを生成する微生物の菌株の発酵ブロスからの粗ホスホリパーゼＤの存在下に水／溶媒界面において起こる方法を記載している。

二相系は多量の溶媒を必要とし、それは除去が困難であり、結果としてＰＳの生成および精製のための費用が高くなるので、研究者らは、１９９０年に初めて、二相系を避けることを試みた（ＣｏｍｆｕｒｉｕｓＰ．ｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｉｐｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ１９９０，３１：１７１９−１７２１）。

従って、有機溶媒が、もっぱら水性媒体中で酵素による合成反応を引き起こすために開始リン脂質をミセル状に分散することができる洗剤／界面活性剤で置き換えられた。

実際、ＥＰ１０４８７３８は、所定濃度の特定の洗剤およびカルシウム塩の存在下に、有機溶媒が全く混入されていない水性媒体中において、ＰＳを酵素的に合成するための方法に関する。

ＤＥ１９９１７２４９は、もっぱら塩化カルシウム塩（ＣａＣｌ₂）のみを添加して、界面活性剤を用いることなく水性媒体中でＰＳを酵素的に生成するための方法を記載しているが、酵素的転化の割合および得られたＰＳの純度は特定されていない。

ＥＰ１３１０５６３は、洗剤および／またはカルシウム塩を用いることなく水相中でＰＳを調製するための方法であって、水中のリン脂質、ヒドロキシ受容体およびＰＬＤからなる開始混合物を均質化して、二層リン脂質膜に類似の構造を有する最終的均質物を得、続いて、ホスファチジル交換反応を行うことができる方法を開示している。

ＥＰ１４２７８３９は、洗剤を用いないが、水中で調製／溶解したときに対応する塩から放出される金属イオンの存在下における、水中でのＰＳを含むリン脂質の酵素的合成を記載している。この方法は２つの異なる相において行われ、リン脂質の混合物から出発して、第１の酵素的加水分解反応がＰＬＤにより触媒されてホスファチジン酸を生成し、続いて、過剰のセリンの存在下にＰＳが形成される第２のホスファチジル交換反応が行われる。

最後に、ＥＰ１２３１２１３４は、ＰＳの最終的生成においてより充分な収率を得るためにストレプトバーチシリウム・ハチジョウエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｈａｃｈｉｊｏｅｎｓｅ）菌株から生成され精製された酵素ＰＬＤのフラクションを水中で用いてＰＳを酵素的に合成するための方法を主張している。

ＰＳ（水性媒体／有機溶媒中または水性媒体中のいずれかにおいてホスファチジル交換することにより得られる）の精製に関して、ＥＰ１２１３２９４は、水／有機溶媒（例えばイソプロパノール）からなる混合物を用いて前記リン脂質を含む溶液からそれを抽出し続いて炭化水素溶媒（例えばトルエン）に代える精製方法を主張しており、一方、ＥＰ０９２２７０７は、ヘプタンとメタノールのような有機溶媒の二相系を用いてリン脂質の混合物からＰＳを抽出／精製する方法に関する。

本発明は、二価金属酸化物（ＢＭＯ）の特定の作用によりＰＣがＰＳに効率的に転化する結果、最終生成物を非常に高い収率で得る、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を生成および精製するための方法に関する。

さらに、酵素ＰＬＤにより触媒されるホスファチジル交換工程により、その中で酵素反応が生じる媒体に拘わらず、高い割合のＰＣをＰＳに転化することが可能になる。

従って、本発明は、水／脂肪族アルコールからなる含水アルコール媒体中、または水／極性非プロトン性溶媒からなる非プロトン性媒体中、または水／有機溶媒からなる二相系中において行われることを特徴とする、ＰＬＤおよびＢＭＯにより触媒されるＰＳを生成する方法に関する。

本発明は、ＢＭＯの存在下において酵素ＰＬＤによりホスファチジル交換を行い、それにより、ホスファチジルコリン（ＰＣ)（式ＩＩ）からセリン（この場合、ヒドロキシ受容体を表す）へのホスファチジル部分の転移を達成し；この酵素反応が、その中でその酵素反応が生じる媒体に拘わらず、ＰＣのＰＳへの非常に高度の転化を提供する、ＰＳ（式Ｉ）を調製する方法に関する。従って、前記反応は：
・二相系を形成しない水／脂肪族アルコールからなる含水アルコール媒体中、
・二相系を形成しない水／極性非プロトン性溶媒からなる非プロトン性媒体中、または
・水／有機溶媒からなる二相系中において起こる。

（式Ｉ）

（式中、Ｒ¹およびＲ²は独立して飽和、単不飽和および／または多不飽和アシルＣ₁₀〜Ｃ₃₀を表し、ＸはＯＨまたはＯＭ（ここで、Ｍはアルカリもしくはアルカリ土類金属、アンモニウム、またはアルキルアンモニウム（内塩を含む））を表す。）
（式ＩＩ）

（式中、Ｒ¹およびＲ²並びにＸは先に定義したような意味を有し、Ｒ³はＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ₂またはＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｎ⁺（ＣＨ₃）₃を表す。）
驚くべきことに、ＢＭＯは、開始ホスファチジルコリンにより代表される反応基質を劇的に修飾して、ＰＳの最終的収率に換算した酵素ＰＬＤの作用が著しく増加するように変化を提供し、それにより産業的規模でのＰＳの高度に有利な生成を可能にすることが発見された。この本質的変化は、酵素的反応がその中で起こる媒体に拘わらず、基質そのものの構造において生じる。実際、酵素そのものを含む溶液のような親水性溶液によっては以前は貫通することができなかったＰＣ小胞の中に貫通することによりＰＬＤ酵素がＰＣ小胞の内側の脂質層に作用することができるので、ＢＭＯはＰＣ小胞の分裂、およびそれによるその中への酵素の貫通に有利であり、ＰＣのＰＳへの転化の割合を増加させる。

本発明によれば、酸化カルシウム（ＣａＯ）、酸化マグネシウム（ＭｇＯ）および酸化亜鉛（ＺｎＯ）のような種々の二価金属酸化物を、含水アルコール性および非プロトン性媒体、並びに二相系の両方において試験し、それらにおいて、塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂）の存在を除いて同じ手順により得られた結果と比べて、以下の実施例に示すように、優れた結果が得られた。

実際、ホスファチジル交換反応がその中で起こる媒体に添加されるカルシウムイオンの供給源としてのカルシウム塩、特にＣａＣｌ₂（ＣｏｍｆｕｒｉｕｓＰ．ｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｉｐｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ１９９０，３１：１７１９−１７２１；ＣｏｍｆｕｒｉｕｓＰ．ｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，１９７７，４８８：３６−４２）は、ＰＬＤ酵素の触媒活性を促進し、それにより、ホスファチジルコリンのＰＳへの転化を増加させることが知られている。

ＢＭＯが金属塩と完全に異なることを識別し明確化するため、および本発明の課題である新規生成系におけるその効果を示すために、出願人は、カルシウム塩の存在下およびＢＭＯの存在下におけるＰＣのＰＳへの転化における異なる収率を比較する実験を行った。

得られた結果から理解することができるように、ホスファチジルコリンのＰＳへの転化の収率は、一貫して、ＣａＣｌ₂を用いて得られたものと全く異なるのみならず、それよりも決定的かつ著しく高いことがわかった。

前述の酸化物に加えて、ＰＳを生成するための新しい方法において、酸化マンガン、二価酸化鉄、酸化コバルト、酸化銅、および元素周期表の全ての残りの二価金属酸化物のような種々の異なるＢＭＯを用いることができる。

本発明の方法をその中で実施することができる溶媒の例は、脂肪族アルコール、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピルおよびイソプロパノール；非プロトン性極性溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド、アセトニトリルおよびＮ−メチルピロリドン；および有機溶媒、例えば、ｎ−ヘキサン、トルエン、ｎ−ブタノールおよびベンゼンである。

好ましいアルコールはイソプロパノール、好ましい非プロトン性溶媒はＤＭＳＯ、および好ましい有機溶媒はヘキサンである。

実施例１は、ＣａＯ（またはＭｇＯもしくはＺｎＯ）が溶解された酢酸塩緩衝剤からなる開始溶液に添加された所定割合のイソプロパノールを含む開始含水アルコール媒体から出発したＰＣのＰＳへの転化を、ＣａＣｌ₂塩の存在を除いて同じ含水アルコール媒体中で行われたＰＳ生成工程と比較して説明している。

本発明の方法で用いることができるアルコール（特にイソプロパノール）の割合（開始緩衝剤の体積に基づく体積％として表す）は、０．１〜１Ｍ、好ましくは０．３〜０．６Ｍ、最も好ましくは０．５４Ｍの濃度のＢＭＯ（特に、ＣａＯ）を含有する含水アルコール媒体中において０．１〜５０％、好ましくは１．２５〜２０％、最も好ましくは１０％であり得る。

ＰＣのＰＳへの転化の最大収率は９０％であり、これは、ＣａＣｌ₂の存在を除いて同じ生成工程により得られた収率からかなり離れている。

一方、実施例２は、所定モル濃度のＣａＯ（またはＭｇＯもしくはＺｎＯ）を含む開始緩衝剤溶液に所定量（用いた緩衝剤の体積に基づく体積％として表す）のＤＭＳＯを添加することにより、ＰＣ／ＰＳの転化の８０％を超える収率を得ることができること、およびＰＳの前記収率が、ＣａＣｌ₂の存在を除いて同じ生成工程により得られたものとかなり異なることを示している。

用いられる非プロトン性溶媒（および特にＤＭＳＯ）の割合は、０．１〜１Ｍ、好ましくは０．３〜０．６Ｍ、最も好ましくは０．３３Ｍの濃度のＢＭＯ（特に、ＣａＯ）を含有する非プロトン性媒体中において０．１〜５０％、好ましくは１．２５〜１０％、最も好ましくは１．２５％であり得る。

ホスファチジル交換の酵素的反応は、水／有機溶媒からなる二相系においてもＰＣ／ＰＳ転化の非常に高い収率を与える。

実施例３は、この場合もＣａＯ、ＭｇＯおよびＺｎＯの存在下における、水／ヘキサンからなる二相系中におけるＰＳの生成を記載している。本発明の課題である新規方法において用いられる溶媒の量は非常に低く（以下に示すように）、生成コストが限定され最終生成物から溶媒を除去することが困難ではない程度に低い。

前記方法で用いられる溶媒の濃度は、０．１〜１Ｍ、好ましくは０．３〜０．６Ｍ、最も好ましくは０．５４Ｍの濃度でのＢＭＯ（および特にＣａＯ）の存在下において０．１〜４０体積％（開始緩衝剤の体積に基づく体積％として表される）、好ましくは１〜５体積％、最も好ましくは１．２５体積％および２．５体積％であり得る。

この場合にも、ＰＣのＰＳへの転化の最大収率は８０％であり、ＣａＣｌ₂の存在を除いて同じ工程により得られたものと全く異なっていた。

ホスファチジル交換反応は、２０〜７０℃の異なる温度、好ましくは４５℃または５５℃で行うことができる。

開始ホスファチド基質は、１０〜５００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２００〜３００ｍｇ／ｍｌの開始濃度で精製状態でまたは原料として存在する天然または合成の動物および／または植物起源のホスファチジルコリンにより代表される。

含水アルコール性、非プロトン性または二相性最終媒体を得るためにアルコール、非プロトン性溶媒または有機溶媒と混合／組み合わされる開始水性媒体は、水もしくは非緩衝生理食塩水溶液、または例えば酢酸ナトリウム三水和物および酢酸により０．０２〜０．２Ｍの濃度で形成される緩衝溶液により代表される。

ヒドロキシル受容体は、Ｄ、Ｌまたはラセミ型で存在し得るセリンにより代表される。好ましくはＬ型であるセリンの最適濃度は、１〜５ｇ／ｇ（ｇｇ）開始ホスファチド、好ましくは２〜３ｇｇ／ｇｇホスファチドの間で変化し得る。

緩衝溶液の最適ｐＨは、用いられるＰＬＤの起源に依存するので４〜９の間で変化し得るが、好ましくは５〜６であり、最も好ましくは、微生物ストレプトバーチシリウム・ハチジョウエンスから誘導された発酵起源のＰＬＤを用いる場合は５．６である。

前記酵素は、精製または部分的精製状態で、または培養ブロスから微生物を簡単に濾過した後の非精製状態で用いることができる。

実施例４（および図１）は、ＰＬＤの触媒活性を妨害する異なる性質の蛋白により実質的に汚染されていない酵素を得るための、ＰＬＤの部分的精製のための新規系、すなわち、長い方法は過剰の産業的費用を生み出し結果的に産業的規模での実現可能性を欠くことになるので、含まれるステップがあまり多くない方法を記載している。

非精製状態で存在する酵素（生成体である微生物を簡単に除去した後のもの）と比較して、および高度に精製された酵素製剤（ＰＬＤ酵素を指向したイオン交換クロマトグラフィー樹脂およびモノ／ポリクローナル抗体を用いて得られるが、当業者に知られている全ての精製法を用いて精製することもできる）と比較して、実施例３に記載の生成法において実施例４に記載の部分的精製酵素を試験したところ：ＰＣ／ＰＳ転化の割合は、試験した全ての酵素製剤（精製、部分的精製および非精製）について等しかった。

ＰＣのＰＳへの８０％を超える転化率を確保するためのＰＬＤの最適量は、用いられるＰＬＤの起源に依存するので、１〜１００単位（unit）／ｇ開始ホスファチドの範囲である。例えば、ストレプトバーチシリウム・ハチジョウエンスからのＰＬＤを用いた場合、最適濃度は１〜１０単位／ｇホスファチドの範囲で変化する。

本発明のもう一つの目的は、ホスファチジル交換反応がその中で起こる媒体中に残っているセリン、ＰＣおよびＰＬＤ（不純物を表す）からＰＳを分離および精製するための方法である。

ＰＳを分離および精製するために、以下の方法を開発した。

１．酵素的ホスファチジル交換反応の終りに、新しく生成されたリン脂質がその中に存在する反応媒体に、塩化ナトリウムの溶液を２〜６％（好ましくは５％）の濃度で添加することによりＰＳを分離するが：ＰＳはこの溶液に不溶性のままであり、一方、残渣成分（ほとんど溶解性である）は大部分は沈降体（subnatant）中に残っているので、２つの相が得られる。反応媒体の上部に溜まっているＰＳを、次に、沈降体を分離および除去することにより単離する。

別の手順として、反応媒体中のＰＳ含有体を濾過して直ちに全ての残渣成分を除去することにより、本発明の対象であるＰＳを分離および精製する新規方法を開始することができる。次に、ＮａＣｌの溶液を添加する。２つの相が形成され、ＰＳは沈降体中に見つかるので、上澄みを除去する。要すれば、ＮａＣｌ洗浄を２回以上繰り返して塩濃度を調節することができる。これらの洗浄手順は、実施例５に示すように、前述のＰＳを生成する方法において用いられるアルコール、非プロトン性および有機溶媒の完全な除去を可能にする。続いて、反応媒体中に存在するイオンをキレート化剤で処理した後、生成物を、エタノール溶液（５０〜１００％、好ましくは９５％の濃度）を用いて、または水中にケトン溶媒（例えば、アセトン）を含む混合物（５０〜９５％の濃度）を用いて沈降／洗浄し；エタノールでの洗浄は数回繰り返すことができる（要すれば、存在するエタノールの濃度を調節する）。最後に、エタノールを９０〜１００％の濃度で用いて最終的洗浄を行い、その後、最終生成物を乾燥してよいし乾燥しなくてもよい；
２．ホスファチジル交換酵素的反応の最後に、小さな分子は通過させるが大きな分子は捕捉するような孔寸法の多孔質膜を用いて、ＰＳの分離および精製を限外濾過により行う。この理由から、分子量が１０００００／３０００００ダルトン以上の分子を捕捉するように充分に小さな孔を有するフィルターを用いることが好ましい。

ＰＳの単離および精製のための前記手順は、酵素的反応の後に残り最初はホスファチジル交換媒体中に含まれていたセリン、ＰＣ、鉱物塩、ＰＣから放出される塩素、ＰＡ、塩／酸化物のような物質の残渣の除去を可能にし、特に、ＰＳを、実施例５に示すようにその痕跡が残らないように、ＰＬＤ酵素から完全に精製することを可能にする。このように得られた最終的ＰＳは純度が非常に高い。

アスコルビン酸および／またはビタミンＥのような酸化防止剤を、ＰＳの調製および精製の方法に含ませることができる。

本発明を、以下の実施例により詳細に開示する。

（実施例１）
０．５４ＭのＣａＯ、ＭｇＯおよびＺｎＯまたは０．５４ＭのＣａＣｌ₂を用いる、含水アルコール媒体（イソプロパノールが存在）中における植物性ＰＣからのＰＳの調製
０．５４ＭのＣａＣｌ₂塩の存在を除いて同じ手順によるＰＳの調製と比較して、０．５４ＭのＣａＯ（またはＭｇＯもしくはＺｎＯ）を含む酢酸塩緩衝剤中の２種の濃度のイソプロパノール（開始緩衝剤の体積の１．２５および１０％に相当）から、２種の異なる含水アルコール溶液を調製した。

試験した酸化物および塩化カルシウムを、０．２Ｍ酢酸塩緩衝剤（ｐＨ５．６）４０ｍｌに溶解し、次に、そこに、イソプロパノール０．５ｍｌを加えて１．２５体積％（ＣａＯの場合のみ）とする、またはイソプロパノール４ｍｌを加えて１０体積％（セリンの可溶化後にＢＭＯ含有緩衝剤にアルコールを添加することもできる）とする。

得られる溶液を、凝縮器を有するジャケット付き反応器中で約１０分間攪拌し、次に、Ｌ−セリン２０ｇを温度５５℃で添加し、完全に溶解するまで攪拌する。続いて、大豆ホスファチジルコリン１０ｇを加え、１０分間攪拌する。次に、ＰＣ１ｇｇ当たり５．５ＵのＰＬＤ酵素を加え、混合物を５５℃で２４〜４８時間攪拌する。

最後に、各生成物のサンプルを採取し、ＰＣのＰＳへの成功した変換を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により試験する。

ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ホスファチジル交換工程の後に得られるＰＡ（ＰＬＤの作用の結果としてＰＣにより放出されるホスファチジン酸）およびＰＳの％として表される、反応の最後に存在する生成物の分布。ＰＡおよびＰＣは、反応からの残渣と考えられる。

ＣａＯの存在下に１．２５体積％のイソプロパノールを用いて得られる、ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ＰＡ８．０％
ＰＳ８５．５％
ＰＣ６．５％
ＣａＯの存在下に１０体積％のイソプロパノールを用いて得られる、ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ＰＥ−ＯＨ４．０％
ＰＡ３．５％
ＰＳ８９．５％
ＰＣ３．０％
ＣａＣｌ₂の存在下に１０体積％のイソプロパノールを用いて得られる、ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ＰＥ−ＯＨ１５．８％
ＰＡ１０．７％
ＰＳ７０．１％
ＰＣ３．４％
ＭｇＯの存在下に１０体積％のイソプロパノールを用いて得られる、ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ＰＥ−ＯＨ９．０％
ＰＡ４．５％
ＰＳ８４．０％
ＰＣ２．５％
ＺｎＯの存在下に１０体積％のイソプロパノールを用いて得られる、ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ＰＥ−ＯＨ１０．０％
ＰＡ８．０％
ＰＳ８０．０％
ＰＣ２．０％
（ＰＥ−ＯＨと定義される生成物は、反応がアルコールの存在下に起こるので、ホスファチジル交換反応中に形成される）
（実施例２）
０．３３ＭのＣａＯ、ＭｇＯおよびＺｎＯまたは０．３３ＭのＣａＣｌ₂を用いる、非プロトン性媒体（ＤＭＳＯが存在）中における植物性ＰＣからのＰＳの調製
ＣａＣｌ₂塩の存在を除いて同じ手順によるＰＳの調製と比較して、全ての場合に０．３３ＭのＣａＯ（またはＭｇＯもしくはＺｎＯ）の存在下において、開始緩衝剤の体積に換算して１．２５〜１０％の間で変化する異なる濃度でＤＭＳＯを用いた。

試験した酸化カルシウムおよび塩化カルシウムを、０．２Ｍ酢酸塩緩衝剤４０ｍｌにｐＨ５．６で溶解した。このように得られた溶液を、凝縮器を有するジャケット付き反応器中で攪拌する。約１０分間攪拌後、Ｌ−セリン２０ｇを温度４５℃で添加し、次に、完全な可溶化が達成されるまで攪拌を続ける。

続いて、大豆ＰＣ１０ｇおよびＤＭＳＯ０．５ｍｌ（１．２５体積％に相当）またはＤＭＳＯ４ｍｌ（１０体積％に相当）を加え、混合物を攪拌する（先の実施例におけるように、ＢＭＯの可溶化後に、方法の開始相中にＤＭＳＯを加えてよい）。１０分後、ＰＣ１ｇｇ当たり５．５ＵのＰＬＤ酵素を加え、混合物を４５℃で２４〜４８時間攪拌する。

続いて、反応の最後に、それぞれの生成物のサンプルを採取し、ＰＣのＰＳへの成功した変換を試験する。

ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ＣａＯの存在下に１．２５体積％のＤＭＳＯを用いて得られる、ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ＰＡ７．１％
ＰＳ８６．３％
ＰＣ６．６％
ＣａＣｌ２の存在下に１．２５体積％のＤＭＳＯを用いて得られる、ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ＰＡ８．１％
ＰＳ６６．７％
ＰＣ２５．２％
ＣａＣｌ₂の存在下に１０体積％のＤＭＳＯを用いて得られる、ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ＰＡ６％
ＰＳ６９％
ＰＣ２５％
ＣａＯの存在下に１０体積％のＤＭＳＯを用いて得られる、ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ＰＡ７．５％
ＰＳ７２．５％
ＰＣ２０％
ＭｇＯの存在下に１０体積％のＤＭＳＯを用いて得られる、ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ＰＡ９．０％
ＰＳ７１．０％
ＰＣ２０％
ＺｎＯの存在下に１０体積％のＤＭＳＯを用いて得られる、ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ＰＡ８．５％
ＰＳ７１．５％
ＰＣ２０％
（実施例３ａ）
０．５４ＭのＣａＯ、ＭｇＯおよびＺｎＯまたは０．５４ＭのＣａＣｌ₂を用いる、二相系（有機溶媒のヘキサンが存在）中における植物性ＰＣからのＰＳの調製
０．５４ＭのＣａＣｌ₂の存在を除いて同じ生成手順によるＰＳの調製と比較して、０．５４ＭのＣａＯ（またはＭｇＯもしくはＺｎＯ）を含む酢酸塩緩衝剤からなる二相系を調製し、次に、緩衝剤の開始体積の１．２５％に相当する量のヘキサンを加えた。

次に、試験した酸化物および塩化カルシウムを、０．２Ｍ酢酸塩緩衝剤（ｐＨ５．６）４０ｍｌに溶解し、次に、そこに、ヘキサン０．５ｍｌを加えて１．２５体積％（セリンの可溶化の前または後に、ＢＭＯを含む緩衝剤に、選択される有機溶媒を加えることができる）とする。

このように得られた溶液を、凝縮器を有するジャケット付き反応器中で攪拌する。

次に、実施例１に記載のような手順を続ける。

最後に、得られた各生成物のサンプルを採取し、ＰＣのＰＳへの成功した変換について試験する。

ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ＣａＯの存在下に１．２５体積％のヘキサンを用いて得られる、ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ＰＡ７．５％
ＰＳ８７．０％
ＰＣ５．５％
ＣａＣｌ２の存在下に１．２５体積％のヘキサンを用いて得られる、ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ＰＡ８．１％
ＰＳ６８．４％
ＰＣ２３．５％
ＭｇＯの存在下に１．２５体積％のヘキサンを用いて得られる、ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ＰＡ８．５％
ＰＳ８２．５％
ＰＣ９．０％
ＺｎＯの存在下に１．２５体積％のヘキサンを用いて得られる、ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ＰＡ１１．０％
ＰＳ８０．０％
ＰＣ９．０％
（実施例３ｂ）
０．５４ＭのＣａＯまたは０．５４ＭのＣａＣｌ₂を用いる、二相系（有機溶媒のヘキサンが存在）中における植物性ＰＣからのＰＳの調製
０．５４ＭのＣａＣｌ₂の存在を除いて同じ生成工程によるＰＳの調製と比較して、０．５４ＭのＣａＯを含む酢酸塩緩衝剤からなる二相系を調製し、次に、緩衝剤の開始体積の２．５％に相当する量のヘキサンを加えた。この時点から先は、手順は実施例３ａにおけると同じである。

ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ＣａＯの存在下に２．５体積％のヘキサンを用いて得られる、ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ＰＡ７．５％
ＰＳ８６．０％
ＰＣ６．５％
ＣａＣｌ２の存在下に２．５体積％のヘキサンを用いて得られる、ＰＣのＰＳへの転化の収率：
ＰＡ１０．０％
ＰＳ６５．０％
ＰＣ２５．０％
（実施例４）
ＰＬＤ酵素の部分的精製
新規生成方法で用いられるＰＬＤ酵素は、以下の工程により部分的に精製することができる：
・孔寸法が０．２μｍであるフィルター（好ましくは、ポリエーテルスルホン膜：ＰＥＳを有する）を通過する接線流マイクロ濾過による生成物質の除去；
・分子分画（cut-off）が１００００Ｄであるフィルター（好ましくは、ＰＥＳ中）を通過する接線流限外濾過
・分子分画（cut-off）が３０００００Ｄである膜（好ましくは、ＰＥＳ中）を有するフィルターを通過する接線流限外濾過
・分子分画が１００００Ｄである膜（好ましくは、ＰＥＳ中）を通過する接線流限外濾過により酵素を再濃縮し、それをＴＲＩＳ−ＨＣＬ緩衝剤（５０ｍＭ、ｐＨ＝８）に対して透析する
図１は、酵素そのものを生成する物質から精製されただけの発酵ブロス（broth）の分析（図２）と比較して、前述のように部分的に精製された酵素ＰＬＤのクロマトグラフィー分析からの発見を示している。

（実施例５ａ）
方法１によるＰＳの分離および精製
ＰＳをその中で調製した反応媒体に、１．５倍体積（開始反応体積に基づく）のＮａＣｌの５％溶液を補足し、混合物を温度３０℃で少なくとも３０分間攪拌する。反応媒体の上部に溜まったＰＳを、次に、沈降体（subnatant）を分離および除去することにより単離する。上澄み（ＰＳ）に、４倍体積のＮａＣｌの３％溶液を補足し、３０±１０℃で少なくとも３０分間攪拌する。それに続いて、上澄みを分離および除去し（この工程を２回繰り返した）、一方、沈降体（ＰＳに代表される）に、酢酸塩緩衝剤（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）中で調製されたＥＤＴＡ（エチレンジアミノ四酢酸）の溶液（濃度４０ｇｇ／リッター）を２倍体積で加える。

このように得られた混合物を攪拌することによりさらに混合（２５±１０℃で少なくとも１時間）した後、ｐＨを７／７．５に調節し、２倍体積（ＥＤＴＡの体積に基づく）の９５％エタノールを加え、混合物を２５±１０℃で少なくとも１時間攪拌する。

ＰＳの沈降期間後、それを集め、ＰＳは含水アルコール相に溶解しないので上澄み（水中のエタノールからなる相）を除去する。エタノール／水（エタノールの割合が７０〜９５％）での洗浄を繰り返し、その後、１００％エタノールでの最終的洗浄を行い、最終工程として、ＰＳを乾燥することができる。

最終生成物：０．５４ＭのＣａＯを用い実施例３に記載のように調製されたＰＳを用い方法１に従って単離された脂質フラクションの分布
ＰＡ５．８％
ＰＳ９４．２％
（実施例５ｂ）
方法１によるＰＳの分離および精製
ＰＳをその中で調製した反応媒体に、１．５倍体積（開始反応体積に基づく）のＮａＣｌの５％溶液を補足し、混合物を温度２０℃で少なくとも３０分間攪拌する。反応媒体の上部に溜まったＰＳを、次に、沈降体（subnatant）を分離および除去することにより単離する。上澄み（ＰＳ）に、３倍体積のＮａＣｌの３％溶液を補足し、２０±１０℃で少なくとも３０分間攪拌する。それに続いて、上澄みを分離および除去し（この工程を３回繰り返した）、一方、沈降体（ＰＳに代表される）に、酢酸塩緩衝剤（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）中で調製されたＥＤＴＡの溶液（濃度３０ｇｇ／リッター）を３倍体積で加える。

このように得られた混合物を攪拌することによりさらに混合（２０±１０℃で少なくとも１時間）した後、ｐＨを７／７．５に調節し、２倍体積（ＥＤＴＡの体積に基づく）の１００％エタノールを加え、混合物を２０±１０℃で少なくとも１時間攪拌する。

ＰＳの沈降期間後、それを集め、上澄み（水中のエタノールからなる相）を除去する。エタノール／水（エタノールの割合が７０％）での洗浄を繰り返し、その後、１００％エタノールでの最終的洗浄を行い、最終工程として、ＰＳを乾燥することができる。

最終生成物：０．５４ＭのＣａＯを用い実施例３に記載のように調製されたＰＳを用い方法１に従って単離された脂質フラクションの分布
ＰＡ６．８％
ＰＳ９３．２％
（実施例５ｃ）
方法１によるＰＳの分離および精製
ＮａＣｌ溶液を加える前に、ＰＳを濾過して反応媒体の全ての残渣成分を直ちに除去する。次に、ＮａＣｌを加え、実施例５ａに記載のように単離および精製工程を続ける。

最終再生物：０．５４ＭのＣａＯを用い実施例３に記載のように調製されたＰＳを用い方法１に従って単離された脂質フラクションの分布
ＰＡ５．０％
ＰＳ９５．０％
ホスファチジル交換反応の後、得られた生成物のＴＬＣ分析（ＶｉｔｅｌｌｏＦ．ｅｔａｌ．；ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇ；１９７８；１６６（２）：６３７−４０）は、残渣セリンの濃度が２％であることを示す。

この相におけるＰＬＤの量は最先端の方法（ＡｕｒｉｃｈＩ．ｅｔａｌ．；ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ；１９９９；２６８：３３７−３４２）により決め、２Ｕ／gであるとわかった。

セリン濃度を先に記載のようにＰＳを精製する方法の最後に再び測定し、０．２％以下であるとわかった。

ＰＬＤ酵素の残渣活性も再び決めたところ、この方法による決定の限界を下回ることがわかった。

ＰＳを調製する方法（実施例３に記載）において用いられる有機溶媒が最少量でも全く存在しないことを示し、それにより本発明の新規性および進歩性を確認するために、出願人は、アルコール溶液添加の直前の相において実施例５に記載の部分的精製ＰＳを分析した。

この分析は、欧州薬局方５．０、セクション２．４．２４：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｏｆｒｅｓｉｄｕａｌｓｏｌｖｅｎｔｓに記載の「Ｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｗｉｔｈｓｔａｔｉｃｈｅａｄ−ｓｐａｃｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎ」の既知の技術により行った。

検定クロマトグラム（図３）は、試験生成物１００ｍｇに匹敵する、各々１０００ｐｐｍの酢酸エチルおよびｎ−ヘキサンからなる標準を用いて得られた。

図４は、方法１に従って精製したＰＳ中に、ｎ−ヘキサンが全く存在しないことを示している。

（実施例６）
方法２によるＰＳの分離および精製
ＰＳをその中で調製した反応媒体に、１．５倍体積（開始反応体積に基づく）のＮａＣｌの５％溶液を補足し、全体を４５℃で少なくとも３０分間攪拌し、続いて、ＰＳの分離を少なくとも１時間続けた。

２つの相が形成され：それらを分離し、沈降体を廃棄し、一方、上澄みに、水中で調製されたＥＤＴＡ２２ｇｇ／リッターの溶液を２．５倍体積で補足する。温度が一旦２８℃に達すると、限外濾過を行う。好ましくは、分子量が１０００００／３０００００ダルトンの分子を捕捉する寸法の孔を有するフィルターを用いるべきである。

次に、最終生成物を凍結乾燥することができる。

最終生成物：０．５４ＭのＣａＯを用い例えば実施例１に従って調製されたＰＳを用い方法２に従って単離された脂質フラクションの分布
ＰＡ６．０％
ＰＳ９４．０％
セリンの濃度を、先に記載のＰＳ精製方法の終りに測定すると、０．２％以下であると分かり、一方、ＰＬＤ酵素の残渣活性をさらに決定すると、それがこの方法による決定の限界を下回ることが示された。

部分的に精製された酵素ＰＬＤのクロマトグラフィー分析結果を示している。酵素そのものを生成する物質から精製されただけの発酵ブロス（broth）についてのクロマトグラフィー分析結果を示している。各々１０００ｐｐｍの酢酸エチルおよびｎ−ヘキサンからなる標準を用いて得られる検定クロマトグラムの図である。方法１に従って精製したＰＳ中にｎ−ヘキサンが全く存在しないことを示すクロマトグラムの図である。

Claims

下記式で示されるホスファチジルセリンを調製する方法であって：

（式中、Ｒ¹およびＲ²は独立して飽和、単不飽和または多不飽和アシルＣ₁₀〜Ｃ₃₀を表し、ＸはＯＨまたはＯＭ（ここで、Ｍはアルカリもしくはアルカリ土類金属、アンモニウム、またはアルキルアンモニウム（内塩を含む））を表す。）
下記一般的で示されるホスファチジルコリン：

（式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＸは先に特定した意味を有し、Ｒ³＝ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ₂またはＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｎ⁺（ＣＨ₃）₃である。）
と、Ｄ、Ｌまたはラセミ型のセリンとの間の、ホスホリパーゼＤ酵素（ＰＬＤ）により触媒されたホスファチジル交換反応を含み、該反応が、脂肪族アルコールを含む含水アルコール媒体中で二価金属酸化物の存在下に行われることを特徴とする方法。
前記反応が、非プロトン性極性溶媒を含む媒体中で二価金属酸化物の存在下に生じる、請求項１に記載の方法。
前記反応が、水／有機溶媒により形成される２相系からなる媒体中で二価金属酸化物の存在下に行われる、請求項１に記載の方法。
脂肪族アルコールが、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールから選択される、請求項１に記載の方法。
脂肪族アルコールが、開始緩衝剤の体積を基準にした体積％で表して０．１〜５０％の間の濃度のイソプロパノールである、請求項４に記載の方法。
イソプロパノール濃度が１０％である、請求項５に記載の方法。
非プロトン性極性溶媒が、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、ジメチルホルムアミドおよびＮ−メチル−ピロリドンから選択される、請求項２に記載の方法。
非プロトン性極性溶媒が、開始緩衝剤の体積を基準にした体積％で表して０．１〜５０％の間の濃度のジメチルスルホキシドである、請求項７に記載の方法。
ジメチルスルホキシド濃度が１．２５％である、請求項８に記載の方法。
有機溶媒が、ｎ−ヘキサン、トルエン、ベンゼンおよびｎ−ブタノールから選択される、請求項３に記載の方法。
有機溶媒が、開始緩衝剤の体積を基準にした体積％で表して０．１〜４０％の間の濃度のｎ−ヘキサンである、請求項１０に記載の方法。
ｎ−ヘキサン濃度が１．２５％または２．５％である、請求項１１に記載の方法。
二価金属酸化物が、０．１〜１Ｍの間の濃度のカルシウム、マグネシウムまたは亜鉛の酸化物である、先の請求項に記載の方法。
選択された酸化物の濃度が０．３３または０．５４Ｍである、請求項１３に記載の方法。
セリンの濃度が、１〜５ｇｇ／ｇｇホスファチジルコリンの範囲である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
セリンの濃度が、２〜３ｇｇ／ｇｇホスファチジルコリンの範囲である、請求項１５に記載の方法。
ホスファチジルコリンが、開始濃度が１０〜５００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２００〜３００ｍｇ／ｍｌであり、精製状態でまたは原料として存在する、動物および／または植物起源の天然または合成のものである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
ホスファチジル交換反応が、２０℃〜６０℃の温度、好ましくは４５℃で起こる、先の全ての請求項のいずれかに記載の方法。
ホスファチジル交換反応が、２０℃〜６０℃の温度、好ましくは５５℃で起こる、先の全ての請求項のいずれかに記載の方法。
酵素ＰＬＤが、精製、半精製または非精製状態で用いられる、微生物ストレプトバーチシリウム・ハチジョウエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｈａｃｈｉｊｏｅｎｓｅ）から誘導された発酵起源のものである、先の全ての請求項のいずれかに記載の方法。
使用されるＰＬＤの濃度が１〜１００単位／ｇホスファチジルコリンの間で変化する、請求項２０に記載の方法。
使用されるＰＬＤの濃度が１〜１０単位／ｇホスファチジルコリンの間で変化する、請求項２１に記載の方法。
先の全ての請求項のいずれかにより生成されたホスファチジルセリン（ＰＳ）を精製するための、以下の工程を含んでなる方法：
Ｉ）生成されたＰＳを含む反応媒体に、塩化ナトリウムの生理食塩水溶液を添加し、続いて混合し、そしてＰＳを分離する工程、
ＩＩ）沈降体を集め除去する工程、
ＩＩＩ）塩化ナトリウム溶液の開始濃度を変化させて工程ＩおよびＩＩを繰り返し、上澄みを除去する工程、
ＩＶ）ＥＤＴＡの溶液を添加して、溶液中に存在するイオンをキレート化させ、続いて混合する工程、
Ｖ）エタノールを５０〜１００％含むエタノール溶液、またはアセトンを５０〜９５％含むアセトン／水の混合物を添加し、続いて混合し、そしてＰＳを沈降させる工程、
ＶＩ）エタノールの割合を変化させて工程Ｖを繰り返す工程、
ＶＩＩ）エタノールを９０〜１００％含むエタノール溶液を添加する工程、
ＶＩＩＩ）上澄みを集め除去する工程、および
ＩＸ）得られた最終生成物を乾燥する工程。
請求項１〜２２のいずれかにより生成されたホスファチジルセリン（ＰＳ）を精製するための、以下の工程を含んでなる方法：
Ｉ）先に濾過されたＰＳに、塩化ナトリウムの生理食塩水溶液を添加し、続いて混合し、そしてＰＳを分離する工程、
ＩＩ）上澄みを集め除去する工程、
ＩＩＩ）塩化ナトリウム溶液の開始濃度を変化させて工程ＩおよびＩＩを繰り返し、上澄みを除去する工程、
ＩＶ）ＥＤＴＡの溶液を添加して、溶液中に存在するイオンをキレート化させ、続いて混合する工程、
Ｖ）エタノールを５０〜１００％含むエタノール溶液、またはアセトンを５０〜９５％含むアセトン／水の混合物を添加し、続いて混合し、そしてＰＳを沈降させる工程、
ＶＩ）エタノールの割合を変化させて工程Ｖを繰り返す工程、
ＶＩＩ）エタノールを９０〜１００％含むエタノール溶液を添加する工程、
ＶＩＩＩ）上澄みを集め除去する工程、および
ＩＸ）得られた最終生成物を乾燥する工程。
請求項１〜２２のいずれかにより生成されたホスファチジルセリン（ＰＳ）を精製するための、以下の工程を含んでなる方法：
Ｉ）生成されたＰＳを含む反応媒体に、塩化ナトリウムの生理食塩水溶液を添加し、続いて混合し、そしてＰＳを分離する工程、
ＩＩ）沈降体を集め除去する工程、
ＩＩＩ）塩化ナトリウムの生理食塩水溶液を添加し、多孔質膜を通して限外濾過を行う工程、および
ＩＶ）最終生成物を乾燥する工程。
先の全ての請求項のいずれかに記載のように生成され精製されたホスファチジルセリンを含む医薬組成物。
大脳老化に関連する病理を予防および治療するための薬剤を調製するための、先の全ての請求項のいずれかに記載のように生成され精製されたホスファチジルセリンの使用。
食品サプリメントの調製のための、先の全ての請求項のいずれかに記載のように生成され精製されたホスファチジルセリンの使用。
化粧分野で用いるためおよび薬剤の制御放出用の系としてのリポソームを調製するための、先の全ての請求項のいずれかに記載のように生成され精製されたホスファチジルセリンの使用。
微生物ストレプトバーチシリウム・ハチジョウエンスから誘導された酵素ＰＬＤを精製し、以下の工程を含んでなる、請求項２０に記載の方法：
Ｉ）孔寸法が０．２μｍの精密濾過により、生成した物質を除去する工程、
ＩＩ）１００００Ｄの分子分画のフィルターを通して限外濾過する工程、
ＩＩＩ）３０００００Ｄの分子分画の膜を有するフィルターを通して限外濾過する工程、および
ＩＶ）１００００Ｄの分子分画の膜を通して限外濾過して、酵素を再濃縮すると共に、それを酸性緩衝剤に対して透析する工程。