CN101184494B - 制备和分离磷脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备式CH2OR1 CHOR2CH2O-P(＝O)-OCH2-CH(NH2)-COOH X的磷脂酰丝氨酸的方法，其中R1和R2独立地表示饱和的、单不饱和的和/或多不饱和的酰基C10-C30，X＝OH或OM，其中M＝碱或碱土金属、铵、烷基铵(包括内盐)，该方法包括通式CH2OR1CHOR2 CH2O-P(＝O)-OR3 X的磷脂酰胆碱(其中R1和R2以及X具有上述特别的含义，R3＝CH2-CH2-NH2或CH2-CH2-N+(CH3)3)与D、L或外消旋形式的丝氨酸之间的转磷脂酰化反应，该反应是通过磷脂酶D酶(PLD)催化的，其特征在于所述的反应是在包含脂族醇的含水醇介质中并且在二价金属氧化物的存在下进行的。
Description
发明目的
本发明涉及制备和纯化磷脂酰丝氨酸(PS)的方法以及借助二价金属氧化物(BMO)获得高产率的终产物。
发明领域
大脑老龄化的生理过程中发生的中枢神经系统(CNS)的功能衰退经常导致老年人的认知功能退化，这种退化依次导致行为障碍以及短暂和空间记忆的改变。
CNS活性的功能衰退与神经膜的脂类组分的生物化学和结构变化的开始有关并且与大脑酶的活性降低有关，而这种活性降低可能减少神经元突触。
磷脂酰丝氨酸(PS)是脑中主要的酸性磷脂。因此一段时间以来科学研究集中在发现用于年龄相关的认知障碍的药理学治疗方法，这种方法是基于能阻止(和/或部分重建)老龄化的神经元膜的结构和功能缺陷的磷脂。
人体的临床前和临床研究表明口服施用PS(特别是在老年人中)在学习能力以及短暂和空间记忆方面，甚至是特别的失能病理学(例如阿尔茨海默病)的情况下确定显著增加(Cenacchi T.等人；Aging Clin Exp Res；1993；5：123-133；Nunzi MG等人；Adv Exp Med Biol；1992；318：393-8)。
另外，研究表明磷脂酰丝氨酸能对抗遭受身体紧张的个体的激素皮质醇的增加(Monteleone P.等人；Neuroendocrinology；1990；52(3)：243-8)，从而减少葡萄糖的代谢并且在剧烈的身体努力后获得更大的功能恢复。
本发明涉及PS的合成和纯化方法以及PS作为活性成分在用于预防上述年龄相关病理学的药物(和/或食品补充剂)中和在制备适用于剧烈身体紧张的所有情况的食品补充剂中，以及在制备用于美容领域和/或作为它们包含的药物的控释系统的脂质体中的用途。
科学文献和专利中已知的制备和纯化PS的方法描述了将磷脂酰胆碱(PC)向PS的酶转化，该转化是通过酶磷脂酶D(PLD)催化的转磷脂酰化反应，主要通过有机溶剂对PS的萃取进行随后的纯化。
近年来，多种方法经完善后用于合成PS，这些方法是通过在水/有机溶剂的两相体系或在含水介质中的酶转化实现的。
EP0776976描述了在包含水/甲苯的体系中酶制备PS的方法，其中有机相包含形成PS的起始磷脂，水相包含羟基接受体并且合成反应在粗制磷脂酶D的存在下发生在水/溶剂界面，所述的粗制磷脂酶D是从产生PLD的微生物菌株的发酵培养液中获得的。
1990年，研究者首次尝试避开两相体系，因为两相体系需要大量溶剂，而这些溶剂难以除去，因此导致制备和纯化PS的高成本(Comfurius P.等人，Journal of Lipid Research 1990，31：1719-1721)。
因此，用能将起始磷脂以胶束形式分散的洗涤剂/表面活性剂替代有机溶剂，以便在含水介质中引发独特的合成的酶反应。
事实上，EP1048738涉及在给定浓度的特别的洗涤剂和钙盐的存在下在含水介质中酶合成PS的方法，其中该含水介质通过有机溶剂使其完全没有任何污染。
DE19917249描述了在除了加入氯化钙盐(CaCl2)不使用表面活性剂的含水介质中酶制备PS的方法，然而，不能确定酶转化百分数以及获得的PS的纯度。
EP1310563公开了在不使用洗涤剂和/或钙盐的水相中制备PS的方法，该方法是基于在水中将包含磷脂、羟基接受体和PLD的起始混合物匀浆，得到与双层磷脂膜结构相似的最终匀浆，其中转磷脂酰化反应可以随后发生。
EP1427839描述了在不包含洗涤剂但存在金属离子的水中酶合成磷脂(包括PS)，所述的金属离子是由配制/溶解在水中的相应盐释放获得。所述的方法发生在两个不同相中，其中从磷脂混合物开始，第一个酶水解反应由PLD催化，产生磷脂酸，随后是第二个转磷脂酰化反应，其中在过量丝氨酸的存在下形成PS。
最后，EP12312134要求了在水中酶合成PS的方法，该方法使用由Streptoverticillium hachijoense菌株产生并且纯化得到的酶PLD的级分，在最终制备PS中获得更高产率。
关于PS(通过在含水介质/有机溶剂或含水介质中的转磷脂酰化获得)的纯化，EP1213294要求了纯化方法，该方法是基于使用包含水/极性溶剂(例如异丙醇)的混合物，以从包含上述磷脂的溶液中萃取磷脂，该溶液依次用烃溶剂(例如甲苯)表示，而EP0922707涉及使用有机溶剂二相体系(例如庚烷和甲醇)从磷脂混合物中萃取/纯化PS的方法。
本发明涉及制备和纯化磷脂酰丝氨酸(PS)的方法，由于通过二价金属氧化物(BMO)的特别作用将PC有效转化为PS，这些方法获得了非常高产率的终产物。
另外，酶PLD催化的转磷脂酰化方法使得高百分数的PC转化为PS，而且该方法与酶反应发生的介质无关。
因此，本发明涉及由PLD和BMO催化制备PS的方法，该方法的特征在于其是
在包含水/脂族醇的含水醇介质中，或
在包含水/极性非质子溶剂的非质子介质中，或
在包含水/有机溶剂的两相体系中进行。
发明详述
本发明涉及制备PS(式I)的方法，其中转磷脂酰化是在BMO的存在下由酶PLD催化进行的，从而实现磷脂酰基部分由磷脂酰胆碱(PC)(式II)转移到丝氨酸上(在这种情况下表示羟基接受体)；该酶反应提供了在很高程度上将PC转化为PS，而且这与酶反应发生的介质无关。因此所述的反应可以
在包含水/脂族醇但不形成两相体系的含水醇介质中，或
在包含水/极性非质子溶剂但不形成两相体系的非质子介质中，或
在包含水/有机溶剂的两相体系中进行。
式I
其中R1和R2独立地表示饱和的、单不饱和的和/或多不饱和的酰基C10-C30，X＝OH或OM，其中M＝碱或碱土金属、铵、烷基铵(包括内盐)。
式II
其中R1和R2以及X具有上述定义的含义，并且R3＝CH2-CH2-NH2或CH2-CH2-N+(CH3)3。
令人惊讶地发现BMO剧烈地改变由起始磷脂酰胆碱表示的反应底物，测定这种变化以便酶PLD作用显著地增加了PS的最终产率，因此使工业规模制备PS具有很大优势。这种基本改变发生在底物本身结构中，而与酶反应发生的介质无关。事实上，BMO能使PC小泡裂开从而使得酶在其中穿透，因此通过穿透进入小泡确定PC转化为PS的百分数的增加，PLD酶还可以作用于先前亲水溶液(例如包含酶本身的溶液)无法穿透的小泡内的脂质层。
根据本发明，在含水醇和非质子介质中以及在两相体系中试验了多种二价金属氧化物，例如氧化钙(CaO)、氧化镁(MgO)和氧化锌(ZnO)，相比使用相同方法但在氯化钙(CaCl2)的存在下的方法获得的结果，它们如下面实施例显示的那样给出了很好的结果。
事实上，已知钙盐、并且特别是CaCl2作为钙离子的来源加入到转磷脂酰化反应发生的介质中(Comfurius P.等人，Journal of Lipid Research1990，31：1719-1721；Comfurius P.等人，Biochim Biophys Acta，1977，488：36-42)，促进PLD酶的催化活性并且因此增加了磷脂酰胆碱转化为PS(Okawa Y.等人；J Biochem.；1975；78：363-372)。
为了区别和阐明BMO是完全不同于金属盐并且演示它们在新制备体系中的效率(这是本发明的目的)，申请人已经进行了将在钙盐的存在下和在BMO的存在下由PC转化为PS所获得的不同产率进行比较的试验。
如从获得的结果中看到，磷脂酰胆碱转化为PS的产率一致证明不仅完全不一样，而且显然且显著高于由CaCl2获得的产率。
除了上述的氧化物，在制备PS的新方法中可以使用多种不同BMO，例如元素表中的氧化锰、二价铁氧化物、氧化钴、氧化铜和其它二价金属氧化物。
本发明方法可以在其中进行的溶剂的实例是脂族醇，例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇；非质子极性溶剂，例如二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺、乙腈、N-甲基-吡咯烷酮；以及有机溶剂，例如正己烷、甲苯、正丁醇、苯。
优选的醇是异丙醇，优选非质子溶剂是DMSO并且优选的有机溶剂是己烷。
实施例1描述了在包含乙酸盐缓冲液的起始溶液(其中溶解了CaO(或MgO或ZnO))中加入包含给定百分数的异丙醇的含水醇介质开始，将PC转化为PS，将该方法与在相同含水醇介质中但在CaCl2盐的存在下进行的PS制备方法相比较。
可用于本方法的醇(特别是异丙醇)的百分数(以占起始缓冲液体积的％体积表示)可以从0.1至50％不同，优选从1.25％至20％，并且最优选10％，在包含一定浓度BMO(特别是CaO)的含水醇介质中其浓度在0.1至1M之间不同，优选在0.3至0.6M之间并且最优选等于0.54M。
PC转化为PS的最高产率是90％，这远高于在相同的制备方法中但在CaCl2的存在下获得的产率。
另一方面，实施例2演示了通过在包含给定摩尔浓度的CaO(或MgO或ZnO)的起始缓冲液中加入给定量的DMSO(以占所用缓冲液体积的％体积表示)获得PC/PS转化的产率高于80％是可能的，并且上述的PS产率是非常不同于在相同制备方法中但在CaCl2的存在下获得的产率。
所用的非质子溶剂(特别是DMSO)的百分数可以从0.1至50％不同，优选从1.25至10％，并且最优选1.25％，在包含一定浓度BMO(特别是CaO)的非质子介质中其浓度在0.1至1M之间不同，优选在0.3至0.6M之间并且更优选等于0.33M。
转磷脂酰化的酶反应甚至是在包含水/有机溶剂的两相体系中能获得很高的PC/PS转化产率。
实施例3描述了在包含水/己烷的两相体系中并且再次在CaO、MgO和ZnO的存在下PS的制备。在新方法中所用溶剂的量(这是本发明的目的)是很少的(如下文所演示的)，如此少量以至于制备成本有限并且从终产物中除去溶剂并不困难。
在所述方法中使用的溶剂的浓度可以从0.1至40％v/v(以占起始缓冲液体积的％体积表示)不同，优选从1至5％v/v，并且最优选1.25％v/v和2.5％v/v，在一定浓度BMO(特别是CaO)的存在下其浓度在0.1至1M之间不同，优选在0.3至0.6M之间并且最优选等于0.54M。
在这种情况下PC转化为PS的最高产率也高于80％，并且非常不同于在相同方法中但在CaCl2的存在下获得的产率。
转磷脂酰化反应可以在不同温度下进行，温度范围在20至70℃之间，优选45或55℃。
起始磷脂底物是由纯化形式或作为原料存在的动物和/或植物源的天然的或合成的磷脂酰胆碱表示，磷脂酰胆碱的起始浓度范围在10至500mg/mL之间，优选在200至300mg/mL之间。
与醇、非质子溶剂或有机溶剂混合/联合以获得含水醇、非质子或两相最终介质的起始含水介质由水或未缓冲的盐水溶液或例如由乙酸钠三水合物和乙酸在浓度0.02至0.2M之间形成的缓冲液表示。
羟基接受体由丝氨酸表示，其可以以D、L或外消旋形式存在。丝氨酸的最佳浓度(优选以L形式表示)可以在1g/g(gg)起始磷脂至至多5gg不同，优选在2gg至3gg(起始磷脂)。
缓冲液的最佳pH可以在4至9之间不同，因为这取决于所用PLD的来源，但优选在5至6之间，并且如果使用从微生物Streptoverticilliumhachijoense发酵得到的PLD，最优选pH等于5.6。
所述的酶可以以纯化的或部分纯化的形式使用，或者以从其培养液中简单过滤微生物之后的非纯化的形式使用。
实施例4(和图1)描述了用于部分纯化PLD以获得酶的新体系，该酶基本上没有被可能干扰PLD催化活性的不同性质的蛋白污染，描述了没有涉及太多步骤的方法，因为冗长的方法会导致过度的工业成本从而缺乏工业规模制备的可行性。
实施例4描述的部分纯化的酶用实施例3描述的制备方法试验，与非纯化形式(简单除去产酶微生物之后)的酶和高纯化的酶制备(使用离子交换色谱树脂和直接识别PLD酶的单/多克隆抗体获得的，但是还可以使用本领域技术人员熟知的所有纯化方法)相比较：对于所有试验的酶制备(纯化的、部分纯化的和非纯化的)，PC/PS转化百分数是相等的。
为了确保PC转化为PS高于80％，PLD的最佳量范围在1至100单位/g起始磷脂，因为这取决于所用PLD的来源。例如，当使用Streptoverticillium hachijoense的PLD时，最佳浓度范围在1至10单位/g磷脂之间不同。
本发明的另外的目的是从转磷脂酰化反应发生的介质中残留的丝氨酸、PC和PLD(这些表示杂质)中分离和纯化PS。
为了分离和纯化PS，开发了下面方法。
1.在转磷脂酰化反应后，通过向反应介质(其中存在新产生的磷脂)中加入浓度2至6％(优选5％)的氯化钠溶液来分离PS：因此获得两相，因为PS在该溶液中不溶而残留组分(大部分是可溶的)主要留在下层清液中。然后通过分离并且除去下层清液来获得沉积于反应介质上层部分的PS。
或者，启动新的PS分离和纯化方法是可能的(本发明目的)，该方法是通过过滤反应介质中的PS包涵体以立即除去所有残留组分。然后加入NaCl溶液。形成两相并且除去上层清液，因为PS存在于下层清液中。NaCl洗涤可以重复两次或多次，如果需要调节盐浓度。如实施例5演示的，这些洗涤操作能完全除去该方法中使用的醇类、非质子和有机溶剂，以制备上述的PS。随后在用螯合剂处理反应介质中存在的离子，用乙醇溶液(百分数50至100％，优选95％)或用在水中的酮溶剂(例如丙酮)混合物(百分数50至95％)沉淀/洗涤产物；乙醇洗涤可以重复数次(如果需要调节乙醇的百分数)。最后，用90至100％的乙醇进行最后的洗涤，之后终产物可以或不可以干燥。
2.在转磷脂酰化反应后，通过使用孔径例如能透过小分子同时能截留大分子的多孔膜的超滤法实现PS的分离和纯化。基于这个原因，优选使用孔径小至足以截留分子量为100,000/300,000道尔顿或更大的分子的滤膜。
用于PS的分离和纯化的所述的方法能除去酶反应后留下的并且起初包含在转磷脂酰化介质中的底物残留物，例如丝氨酸、PC、无机盐、PC释放的胆碱、PA、盐/氧化物，总之所述的方法能从PLD酶中完全纯化PS，正如实施例5演示的没有残留痕量PLD酶。因此获得最终PS具有很高的纯度。
一些抗氧化剂(例如抗坏血酸和/或维生素E)可以包括在制备和纯化PS的方法中。
下列实施例更详细地公开了本发明。
实施例1
在包含0.54M CaO、MgO和ZnO或0.54M CaCl2的含水醇介质(在异丙醇的存在下)中从植物PC制备PS
制备两种不同的含水醇溶液，该溶液是通过在包含0.54M CaO(或MgO或ZnO)的乙酸盐缓冲液中加入两种浓度的异丙醇(等于起始缓冲液体积的1.25和10％)形成的，与通过相同方法但在0.54M CaCl2盐的存在下制备PS相比较。
将试验氧化物和氯化钙溶于40mL 0.2M乙酸盐缓冲液(pH5.6)中，然后加入0.5mL异丙醇以达到1.25％v/v(仅对于CaO)，或者加入4mL异丙醇以达到10％v/v(醇也可以在丝氨酸溶解后加入到包含BMO的缓冲液中)。
将产生的溶液在装有冷凝器的夹套反应器中搅拌约10分钟，然后在温度为55℃下加入20g L-丝氨酸，搅拌直至完全溶解。随后，加入10g大豆磷脂酰胆碱并且搅拌10分钟。然后按每gg PC加入5.5U PLD酶并且将混合物在55℃下搅拌24-48小时。
最后，取出每个产物的样品并且通过薄层色谱法(TLC)试验PC成功转化为PS。
PC转化为PS的产率：
反应后存在的产物分布，以在转磷脂酰化方法后获得的PA(PC释放出的磷脂酸，作为PLD作用的结果)和PS的百分数表示。PA和PC被认为是反应的残留物。
用1.25％v/v异丙醇，在CaO的存在下获得的PC转化为PS的产率：
PA 8.0％
PS 85.5％
PC 6.5％
用10％v/v异丙醇，在CaO的存在下获得的PC转化为PS的产率：
PE-OH 4.0％
PA 3.5％
PS 89.5％
PC 3.0％
用10％v/v异丙醇，在CaCl2的存在下获得的PC转化为PS的产率：
PE-OH 15.8％
PA 10.7％
PS 70.1％
PC 3.4％
用10％v/v异丙醇，在MgO的存在下获得的PC转化为PS的产率：
PE-OH 9.0％
PA 4.5％
PS 84.0％
PC 2.5％
用10％v/v异丙醇，在ZnO的存在下获得的PC转化为PS的产率：
PE-OH 10.0％
PA 8.0％
PS 80.0％
PC 2.0％
(在转磷脂酰化反应过程中产物定义为PE-OH，因为反应是在醇的存在下发生的)。
实施例2
在包含0.33M CaO、MgO和ZnO或0.33M CaCl2的非质子介质(在DMSO的存在下)中从植物PC制备PS
使用浓度占起始缓冲液体积的1.25至10％之间不同的DMSO，在所有情况下在0.33M CaO(或MgO或ZnO)的存在下，与通过相同方法但在CaCl2盐的存在下制备PS相比较。
将试验的氧化钙和氯化钙溶于40mL 0.2M，pH5.6乙酸盐缓冲液中。将获得的溶液在装有冷凝器的夹套反应器中搅拌。约10分钟搅拌后，在温度为45℃时加入20g L-丝氨酸并且继续搅拌直至完全溶解。
随后，加入10g大豆PC和0.5mL DMSO(相应于1.25％v/v)或4mLDMSO(相应于10％v/v)并且搅拌混合物(如先前实施例，可以在方法起始阶段并且在BMO溶解后加入DMSO)。10分钟后按每gg PC加入5.5UPLD酶并且将混合物在45℃下搅拌24-48小时。
随后，在反应完成后取出获得的各自产物的样品并且试验PC成功转化为PS。
PC转化为PS的产率：
用1.25％v/v DMSO，在CaO的存在下获得的PC转化为PS的产率：
PA 7.1％
PS 86.3％
PC 6.6％
用1.25％v/v DMSO，在CaCl2的存在下获得的PC转化为PS的产率：
PA 8.1％
PS 66.7％
PC 25.2％
用10％v/v DMSO，在CaCl2的存在下获得的PC转化为PS的产率：
PA 6％
PS 69％
PC 25％
用10％v/v DMSO，在CaO的存在下获得的PC转化为PS的产率：
PA 7.5％
PS 72.5％
PC 20％
用10％v/v DMSO，在MgO的存在下获得的PC转化为PS的产率：
PA 9.0％
PS 71.0％
PC 20％
用10％v/v DMSO，在ZnO的存在下获得的PC转化为PS的产率：
PA 8.5％
PS 71.5％
PC 20％
实施例3a
在包含0.54M CaO、MgO和ZnO或0.54M CaCl2的两相体系(在有机溶剂、己烷的存在下)中从植物PC制备PS
制备包含0.54M CaO(或MgO或ZnO)的乙酸盐缓冲液的两相体系，然后加入等于缓冲液起始体积1.25％量的己烷，与如果相同制备方法但在0.54M CaCl2的存在下制备PS相比较。
然后将试验的氧化物和氯化钙溶于40mL 0.2M乙酸盐缓冲液(pH5.6)中，然后加入0.5mL己烷以达到1.25％v/v(选择的有机溶剂可以在丝氨酸溶解前或后加入到包含BMO的缓冲液中)。
将获得的溶液在装有冷凝器的夹套反应器中搅拌。
然后按实施例1描述的继续操作。
最后，取出获得的每个产物的样品并且试验PC成功转化为PS。
PC转化为PS的产率：
用1.25％v/v己烷，在CaO的存在下获得的PC转化为PS的产率：
PA 7.5％
PS 87.0％
PC 5.5％
用1.25％v/v己烷，在CaCl2的存在下获得的PC转化为PS的产率：
PA 8.1％
PS 68.4％
PC 23.5％
用1.25％v/v己烷，在MgO的存在下获得的PC转化为PS的产率：
PA 8.5％
PS 82.5％
PC 9.0％
用1.25％v/v己烷，在ZnO的存在下获得的PC转化为PS的产率：
PA 11.0％
PS 80.0％
PC 9.0％
实施例3b
在包含0.54M CaO或0.54M CaCl2的两相体系(在有机溶剂、己烷的存在下)中从植物PC制备PS
制备包含0.54M CaO乙酸盐缓冲液的两相体系，然后加入等于缓冲液起始体积2.5％量的己烷，与通过相同制备方法但在0.54M CaCl2的存在下制备PS相比较。从这点开始，操作与实施例3a相同。
PC转化为PS的产率：
用2.5％v/v己烷，在CaO的存在下获得的PC转化为PS的产率：
PA 7.5％
PS 86.0％
PC 6.5％
用2.5％v/v己烷，在CaCl2的存在下获得的PC转化为PS的产率：
PA 10.0％
PS 65.0％
PC 25.0％
实施例4
PLD酶的部分纯化
在新的制备方法中使用的PLD酶可以通过下面步骤部分纯化：
●通过切向流微过滤穿过孔径为0.2μm的滤膜(优选聚醚砜膜：PES)除去产生的试剂；
●切向流超滤穿过分子截留为10,000D的滤膜(优选PES)；
●切向流超滤穿过分子截留为30,000D的滤膜(优选PES)；
●最终切向流超滤穿过分子截留为10,000D的滤膜(优选PES)以再浓缩酶并且用50mM pH＝8的TRIS-HCL缓冲液透析。
图1显示的是上述部分纯化的酶PLD的色谱分析的发现，与从产生酶本身的试剂中单独纯化的发酵培养液的分析相比(图2)。
实施例5a
根据方法1的PS的分离和纯化
向已完成制备PS的反应介质中补充1.5体积(占起始反应体积)的5％NaCl溶液，并且将混合物在温度为30℃下搅拌至少30分钟。然后通过分离和除去下层清液来分离沉积于反应介质上层部分的PS。向上清液(PS)中补充4体积的3％NaCl溶液，并且在30±10℃下搅拌至少30分钟。随后，分离并且除去上清液(该步骤重复2次)，同时向下层清液(由PS表示)中加入2体积的在0.1M pH7.5的乙酸盐缓冲液中制备的EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(浓度为40gg/升)。
进一步搅拌混合(在25±10℃下至少1小时)后，获得混合物，将pH调至7/7.5并且加入2体积(占EDTA的体积)的95％乙醇，在25±10℃下将混合物搅拌至少1小时。
在PS沉淀一段时间后，收集PS并且除去上清液(包含在水中的乙醇的相)，因为PS不溶于含水醇相。用乙醇/水(乙醇百分比为70-95％)反复洗涤，然后用100％乙醇进行最后洗涤，并且作为最后一步，可以干燥PS。
终产物：方法1分离的脂类部分的分布，并且如实施例3描述的用0.54M CaO制备PS。
PA 5.8％
PS 94.2％
实施例5b
根据方法1的PS的分离和纯化
向已完成制备PS的反应介质中补充1.5体积(占起始反应体积)的5％NaCl溶液，并且将混合物在温度为20℃下搅拌至少30分钟。然后通过分离和除去下层清液来分离沉积于反应介质上层部分的PS。向上清液(PS)中补充3体积的3％NaCl溶液，并且在20±10℃下搅拌至少30分钟。随后，分离并且除去(该步骤重复3次)上清液，同时向下层清液(由PS表示)中加入3体积的在0.1M pH7.0的乙酸盐缓冲液中制备的EDTA溶液(浓度为30gg/升)。
进一步搅拌混合(在20±10℃下至少1小时)后，获得混合物，将pH调至7/7.5并且加入2体积(占EDTA的体积)的100％乙醇，在20±10℃下将混合物搅拌至少1小时。
在PS沉淀一段时间后，收集PS并且除去上清液(包含在水中的乙醇的相)。用乙醇/水(乙醇百分比为70％)反复洗涤，然后用100％乙醇进行最后洗涤，并且作为最后一步，可以干燥PS。
终产物：方法1分离的脂类部分的分布，并且如实施例3描述的用0.54M CaO制备PS。
PA 6.8％
PS 93.2％
实施例5c
根据方法1的PS的分离和纯化
在加入NaCl溶液前，将PS过滤以立即除去反应介质的所有残留组分。然后加入NaCl并且如实施例5a描述的继续分离和纯化方法。
终产物：方法1分离的脂类部分的分布，并且如实施例3描述的用0.54M CaO制备PS。
PA 5.0％
PS 95.0％
在转磷脂酰化反应后，获得的产物的TLC分析(Vitello F.等人；JChromatog；1978；166(2)：637-40)显示残留丝氨酸的浓度为2％。
在该相中PLD的量通过描述的技术方法(Aurich I.等人；Anal Biochem；1999；268：337-342)确定并且显示为2 U/g。
丝氨酸浓度在先前描述的PS纯化方法完成后再次测定并且显示为低于/等于0.2％。
PLD酶的残留活性也再次测定并且显示为低于该方法的检测限。
为了证明完全不存在甚至最小痕量的有机溶剂(在制备PS方法中(实施例3描述的)使用该溶剂)，因此采用新颖的并且创造的本发明步骤，申请人在邻近加入醇溶液之前的时期分析实施例5描述的部分纯化的PS。
如欧洲药典5.0，第2.4.24部分：残留溶剂的鉴定与控制中描述的通过已知的“静止顶空注射气相色谱”技术进行该分析。
校正色谱图(图3)是通过使用包含乙酸乙酯和正己烷(每个相应于1000ppm，相当于100 mg试验产物)的标准样品获得的。
图4显示方法1纯化的PS中完全不存在正己烷。
实施例6
根据方法2的PS的分离和纯化
向已完成制备PS的反应介质中补充1.5体积(占起始反应体积)的5％NaCl溶液，并且将整体在45℃下搅拌至少30分钟，然后PS的分离持续至少1小时。
两相的形成：将其分离并且丢弃下层清液，同时向上清液中补充2.5倍体积的在水中制备的EDTA溶液(浓度为22gg/L)。一旦温度达到28℃，进行超滤。优选使用孔径能截留分子量为100,000/300,000道尔顿的分子的滤膜。
然后可以冷冻干燥终产物。
终产物：方法2分离的脂类部分的分布，并且例如实施例1描述的用0.54M CaO制备PS。
PA 6.0％
PS 94.0％
丝氨酸浓度在先前描述的PS纯化方法完成后测定并且显示为低于/等于0.2％，同时进一步测定PLD酶的残留活性并且显示为低于该方法的检测限。
Claims (28)
1.制备下式的磷脂酰丝氨酸的方法
其中R1和R2独立地表示饱和的、单不饱和的或多不饱和的酰基C10-C30，X＝OH或OM，其中M＝碱或碱土金属、铵、烷基铵，该方法包括下式化合物与D、L或外消旋形式的丝氨酸之间的转磷脂酰化反应
其中R1和R2以及X具有上述特别的含义，并且R3＝CH2-CH2-NH2或CH2-CH2-N+(CH3)3，该反应是通过磷脂酶D酶(PLD)催化的，
其特征在于所述的反应是在包含脂族醇的含水醇介质中并且在二价金属氧化物的存在下进行的。
2.制备下式的磷脂酰丝氨酸的方法
该方法包括下式化合物与D、L或外消旋形式的丝氨酸之间的转磷脂酰化反应
其中R1、R2、R3和X具有与权利要求1中给出的相同含义，
其特征在于所述的反应是在包含非质子极性溶剂的介质中并且在二价金属氧化物的存在下进行的。
3.制备下式的磷脂酰丝氨酸的方法
该方法包括下式化合物与D、L或外消旋形式的丝氨酸之间的转磷脂酰化反应
其中R1、R2、R3和X具有与权利要求1中给出的相同含义，
其特征在于所述的反应是在包含水/有机溶剂形成的两相体系的介质中并且在二价金属氧化物的存在下进行的。
4.权利要求1的方法，其中脂族醇选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇。
5.权利要求4的方法，其中脂族醇是异丙醇，其浓度在0.1至50％之间，以占起始缓冲液体积的％体积表示。
6.权利要求5的方法，其中异丙醇的浓度是10％。
7.权利要求2的方法，其中非质子极性溶剂选自二甲亚砜、乙腈、二甲基甲酰胺和N-甲基-吡咯烷酮。
8.权利要求7的方法，其中非质子极性溶剂是二甲亚砜，其浓度在0.1至50％之间，以占起始缓冲液体积的％体积表示。
9.权利要求8的方法，其中二甲亚砜的浓度是1.25％。
10.权利要求3的方法，其中有机溶剂选自正己烷、甲苯、苯和正丁醇。
11.权利要求10的方法，其中有机溶剂是正已烷，其浓度在0.1至40％之间，以占起始缓冲液体积的％体积表示。
12.权利要求11的方法，其中正己烷的浓度是1.25％或2.5％。
13.权利要求1-3中任意一项的方法，其中二价金属氧化物是钙或镁或锌的氧化物，其浓度在0.1至1M之间。
14.权利要求13的方法，其中所选的氧化物的浓度是0.33或0.54M。
15.权利要求1-3中任意一项的方法，其中化合物是磷脂酰胆碱并且丝氨酸的浓度范围在1至5g/g磷脂酰胆碱之间。
16.权利要求15的方法，其中丝氨酸的浓度范围在2至3g/g磷脂酰胆碱之间。
17.权利要求1-3中任意一项的方法，其中化合物是磷脂酰胆碱并且磷脂酰胆碱是以纯化形式或作为原料存在的动物和/或植物来源的天然的或合成的，其起始浓度在10至500mg/mL之间。
18.权利要求1-3中任意一项的方法，其中化合物是磷脂酰胆碱并且磷脂酰胆碱是以纯化形式或作为原料存在的动物和/或植物来源的天然的或合成的，其起始浓度在200至300mg/mL之间。
19.权利要求1-3中任意一项的方法，其中转磷脂酰化反应是在温度为20℃至60℃之间发生的。
20.权利要求1-3中任意一项的方法，其中转磷脂酰化反应是在温度为45℃下发生的。
21.权利要求1-3中任意一项的方法，其中转磷脂酰化反应是在温度为55℃下发生的。
22.权利要求1-3中任意一项的方法，其中酶PLD是衍生自微生物Streptoverticillium hachijoense的发酵来源的酶，该酶以纯化的、部分纯化的或未纯化的形式使用。
23.权利要求22的方法，其中化合物是磷脂酰胆碱并且所用的PLD的浓度在1至100单位/g磷脂酰胆碱之间不同。
24.权利要求23的方法，其中所用的PLD的浓度在1至10单位/g磷脂酰胆碱之间不同。
25.权利要求22的方法，其中衍生自微生物Streptoverticilliumhachijoense的酶PLD的纯化涉及下面步骤：
I)通过孔径为0.2μm的微过滤除去产生的试剂；
II)用分子截留为10,000D的滤膜超滤；
III)用分子截留为300,000D的滤膜超滤；
IV)用分子截留为10,000D的滤膜超滤以再浓缩酶并且用50mMTris.HCl，pH 8缓冲液透析。
26.纯化根据权利要求1-24中任意一项制备的磷脂酰丝氨酸(PS)的方法，并且该方法涉及下面步骤：
I)在先前已过滤的PS中加入氯化钠盐水溶液，随后混合并且分离PS；
II)收集并且除去上清液；
III)重复步骤I和II，改变氯化钠溶液的起始浓度并且除去上清液；
IV)加入EDTA溶液以螯合溶液中存在的离子，并且随后混合；
V)加入包含乙醇百分数为50至100％的乙醇溶液或包含丙酮百分数为50至95％的丙酮/水的混合物，随后混合并且沉淀PS；
VI)重复步骤V，改变乙醇的百分数；
VII)加入包含乙醇百分数在90至100％的乙醇溶液；
VIII)收集并且除去上清液；
IX)干燥获得的终产物。
27.纯化根据权利要求1-24中任意一项制备的磷脂酰丝氨酸(PS)的方法，该方法涉及下面步骤：
I)在包含已完成制备的PS的反应介质中加入氯化钠盐水溶液，随后混合并且分离PS；
II)收集并且除去下层清液；
III)加入氯化钠盐水溶液并且通过多孔膜进行超滤；
IV)干燥终产物。
28.纯化根据权利要求1-24中任意一项制备的磷脂酰丝氨酸(PS)的方法，并且该方法涉及下面步骤：
I)在包含已完成制备的PS的反应介质中加入氯化钠盐水溶液，随后混合并且分离PS；
II)收集并且除去下层清液；
III)重复步骤I和II，改变氯化钠溶液的起始浓度并且除去上清液；
IV)加入EDTA溶液以螯合溶液中存在的离子，并且随后混合；
V)加入包含乙醇百分数为50至100％的乙醇溶液或包含丙酮百分数为50至95％的丙酮/水的混合物，随后混合并且沉淀PS；
VI)重复步骤V，改变乙醇的百分数；
VII)加入包含乙醇百分数为90至100％的乙醇溶液；
VIII)收集并且除去上清液；
IX)干燥获得的终产物。
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