JP7222551B2 - 環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法 - Google Patents
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Description
(1) リゾ型リン脂質とホスホリパーゼDとをナトリウム塩の存在下において水性媒体中において反応させる工程、及び得られた反応液にエチルアルコールを添加することにより生じる沈殿または上層液を回収する工程を含む、環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
(2) リゾ型リン脂質が、大豆由来のリゾ型リン脂質である、(1)に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
(3) リゾ型リン脂質とホスホリパーゼDとをナトリウム塩の存在下において水性媒体中において反応させる工程が、リゾ型リン脂質とホスホリパーゼDとを酢酸ナトリウム-酢酸緩衝液中において反応させる工程である、(1)又は(2)に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
(4) リゾ型リン脂質とホスホリパーゼDとをナトリウム塩の存在下において水性媒体中において反応させる工程が、リゾ型リン脂質とホスホリパーゼDとを、キレート剤を含有する酢酸ナトリウム-酢酸緩衝液中において反応させる工程である、(1)から(3)の何れか一に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
(5) キレート剤がEDTAである、(4)に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
(6) 反応液にエチルアルコールを添加することにより生じる沈殿を回収する、(3)から(5)の何れか一に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
(7) リゾ型リン脂質とホスホリパーゼDとをナトリウム塩の存在下において水性媒体中において反応させる工程が、リゾ型リン脂質とホスホリパーゼDとをクエン酸ナトリウム-クエン酸緩衝液中において反応させる工程である、(1)又は(2)に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
(8) 反応液にエチルアルコールを添加することにより生じる上層液を回収する、(7)に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
本発明による環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法は、リゾ型リン脂質とホスホリパーゼDとをナトリウム塩の存在下において水性媒体中において反応させる工程、及び得られた反応液にエチルアルコールを添加することにより生じる沈殿または上層液(上清)を回収する工程を含むことを特徴とする。本発明の方法は、クロロホルム、メチレンクロライド、トルエン、エチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサン等の有機溶(エチルアルコール以外の有機溶媒)を使用することなく実施できる。
(方法1)酢酸ナトリウム-酢酸緩衝液あるいはクエン酸ナトリウム-クエン酸緩衝液(pH4.0~7.0、好ましくはpH5.0~6.0)にリゾ型リン脂質(大豆リゾレシチンなど)、を添加して分散溶解する。この溶液にホスホリパーゼDを、所望により少量の精製水に分散した後に、添加する。得られた混合液を25℃~50℃で5~30時間撹拌する。
(方法2)EDTAを含有する酢酸ナトリウム-酢酸緩衝液(pH4.0~7.0、好ましくはpH5.0~6.0)にリゾ型リン脂質(大豆リゾレシチンなど)を添加して分散溶解する。この溶液にホスホリパーゼDを、所望により少量の精製水に分散した後に、添加する。得られた混合液を25℃~50℃で5~30時間撹拌する。
本発明の一例においては、エチルアルコールの添加(1回目の添加)により生じた沈殿物を、遠心操作(例えば、3000回転、5分間)により回収し、これを精製水に溶解する。本発明の一例においては、得られた溶液にエチルアルコールを添加(2回目の添加)して生じた沈殿物を、遠心操作(例えば、3000回転、5分間)により回収してもよい。
また本発明の別の例においては、エチルアルコールを添加して攪拌を行った後、静置し下層部を分液除去して上層液を得ることができる。この上層液を回収して減圧濃縮を行いエタノールを除去した後に、精製水に溶解後、凍結乾燥を行い環状リゾホスファチジン酸ナトリウムを含有する粉末を得ることができる。
所望により、上記で回収された環状リゾホスファチジン酸ナトリウムは精製水に溶解後に凍結乾燥して環状リゾホスファチジン酸ナトリウムを含有する粉末を得ることができる。
1M酢酸ナトリウム-酢酸緩衝液(pH5.5)100mlに大豆リゾレシチン(LPC70)10gを添加して分散溶解した。この溶液にホスホリパーゼD(名糖産業社製;アクチノマジューラ由来)400mgを少量の精製水に分散した後に添加し、40℃で16時間攪拌した。反応後100mlのエチルアルコールを添加して生じた沈殿物を3000回転、5分間遠心分離を行い回収して50mlの精製水に溶解した。これに50mlのエチルアルコールを添加して生じた沈殿物を3000回転、5分間遠心分離を行って回収し30mlの精製水に溶解後凍結乾燥して環状リゾホスファチジン酸ナトリウムを含有する4.2gの粉末を得た。
10mMのEDTAを含有する1M酢酸ナトリウム-酢酸緩衝液(pH5.5)100mlに大豆リゾレシチン(LPC70)10gを添加して分散溶解した。この溶液にホスホリパーゼD(名糖産業社製;アクチノマジューラ由来)400mgを少量の精製水に分散した後に添加し、40℃で16時間攪拌した。反応後100mlのエチルアルコールを添加して生じた沈殿物を3000回転、5分間遠心分離を行って50mlの精製水に溶解した。これに50mlのエチルアルコールを添加して生じた沈殿物を3000回転、5分間遠心分離を行って回収し35mlの精製水に溶解後凍結乾燥して4.0gの粉末を得た。
1Mクエン酸ナトリウム・クエン酸バッファー(pH6.0)100mlに10gのホワイトリゾ(辻製油社製)を溶解させ、アクチノマジューラ由来ホスホリパーゼD(名糖産業社製)200mgを添加して40℃で16時間酵素反応を行った。反応液に100mlの99%エタノールを添加して攪拌を行った後、室温に1時間静置し下層部を分液除去して上層液135mlを得た。この上層液を回収してロータリーエバポレーターで減圧濃縮を行いエタノールを除去した後40mlの精製水に溶解後凍結乾燥を行い環状リゾホスファチジン酸ナトリウムを含有する粉末5.2gを得た。
1Mクエン酸ナトリウム・クエン酸バッファー(pH6.0)100mlに10gの辻製油社製大豆リゾレシチン(LPC70)を溶解させ、アクチノマジューラ由来ホスホリパーゼD(名糖産業社製)200mgを添加して40℃で16時間酵素反応を行った。反応液に100mlの99%エタノールを添加して攪拌を行った後、室温に1時間静置し下層部を分液除去して上層液135mlを得た。この上層液を回収してロータリーエバポレーターで減圧濃縮を行いエタノールを除去した後40mlの精製水に溶解後凍結乾燥を行い環状リゾホスファチジン酸ナトリウムを含有する粉末4.5gを得た。
実施例1、実施例3および実施例4で得られた環状リゾホスファチジン酸ナトリウムを含有する粉末10mgを秤量し1mlのクロロホルム:メタノール:水(60:30:5、V/V)に溶解した。得られた溶液をメルク社シリカゲル薄層プレートに5マイクロリットルをスポットして、クロロホルム:メタノール:酢酸:水(60:30:3:5、V/V)の混合溶媒で展開した。その後、プレートを乾燥し、3%酢酸銅を含有する8%リン酸、2%硫酸溶液を噴霧して150℃で3分間加温して環状リゾホスファチジン酸ナトリウムのスポットを確認した。特許第593338号記載の方法で調製した環状リゾホスファチジン酸ナトリウムを対照にした。
図1に示したように実施例1で得た環状リゾホスファチジン酸ナトリウムは、対照の特許第593338号記載の方法で調製した環状リゾホスファチジン酸ナトリウムとRf値が同一であった。
Claims (5)
- リゾ型リン脂質とホスホリパーゼDとを酢酸ナトリウム-酢酸緩衝液中において反応させる工程、及び得られた反応液にエチルアルコールを添加することにより生じる沈殿を回収する工程を含む、環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
- リゾ型リン脂質とホスホリパーゼDとを酢酸ナトリウム-酢酸緩衝液中において反応させる工程が、リゾ型リン脂質とホスホリパーゼDとを、キレート剤を含有する酢酸ナトリウム-酢酸緩衝液中において反応させる工程である、請求項1に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
- キレート剤がEDTAである、請求項2に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
- リゾ型リン脂質とホスホリパーゼDとをクエン酸ナトリウム-クエン酸緩衝液中において反応させる工程、及び得られた反応液にエチルアルコールを添加することにより生じる上層液を回収する工程を含む、環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
- リゾ型リン脂質が、大豆由来のリゾ型リン脂質である、請求項1から4の何れか一項に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
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